Análisis comparativo de tres técnicas de derivación de células madre

Las células madre embrionarias (Embryonic Stem Cells; ESC) son células pluripotentes que presentan la capacidad de dividirse indefinidamente a la vez que mantienen la habilidad para diferenciarse a cualquier tipo celular. Aunque de manera rutinaria se derivan a partir de la masa celular interna de embriones en estadio de blastocisto, también pueden derivarse a partir de embriones en estadios precompactacionales y de embriones reconstruidos por procesos de transferencia nuclear. Debido a que durante el desarrollo embrionario temprano, momento en el que se derivan las ESC, tienen lugar profundos cambios de metilación en el genoma, tanto la derivación como el cultivo se consagran como técnicas que pueden alterar los patrones de metilación en genes regulados por impronta genómica. Con el objetivo de analizar la estabilidad epigenética de embriones preimplantacionales y ESC murinas, en este trabajo se ha optimizado un protocolo de anàlisis de los niveles de metilación mediante pirosecuenciación. Para ello se han seleccionado tres genes regulados por impronta genómica (H19/Igf2, Snrpn and Peg3), dos genes relacionados con el mantenimiento de pluripotencia en ESC (Oct4, Nanog y Sox2) y dos genes marcadores de diferenciación temprana (Cdx2 y Gata6). Nuestros resultados muestran que algunos grupos de embriones preimplantacionales presentan una hipo e hipermetilación en las regiones diferencialmente metiladas (Differentially Methylated Regions, DMRs) de los genes Snrpn y Peg3. Además, la línea de ESC analizada presentó anomalías en los tres genes regulados por impronta genómica. No obstante, el hecho de que esta línea fuera inestable a nivel cariotípico no permite establecer una relación entre el cultivo in vitro o la técnica de derivación y la inestabilidad epigenética demostrada. Por todo esto, parece pertinente analizar tanto la integridad epigenética como la estabilidad cromosómica de ESC antes de proceder a realizar ensayos clínicos en humanos.

Serrated polyps of the large intestine: a molecular study comparing sessile serrated adenomas and hyperplastic polyps.

AIMS: To compare the molecular profile of a series of sessile serrated adenomas (SSAs) and hyperplastic polyps (HPs), in order to distinguish these lesions, SSAs having a potential role in the genesis of serrated adenocarcinomas through a serrated pathway in which methylation plays a key role. METHODS AND RESULTS: Twelve HPs and sixteen SSAs of the right and left colon were investigated for microsatellite instability, DNA mismatch repair genes, p53, p16, and beta-catenin expression, MLH1 and p16 (CDKN2A) gene methylation, and KRAS and BRAF mutations. Both SSAs and HPs were microsatellite stable. MLH1 and MSH2 protein silencing, aberrant cytoplasmic expression and methylation of p16 were found to be exclusive to right-sided SSAs. The MLH1 promoter gene was frequently methylated in right-sided SSAs in contrast with HPs. Abnormal p53 and beta-catenin expression was present in both SSAs and HPs. BRAF and KRAS mutation were mutually exclusive, but KRAS mutation was present only in left-sided SSAs and HPs. CONCLUSIONS: HPs and SSAs may be related lesions. However, at least right-sided SSAs differ from left-sided SSAs and HPs in the occurrence of MLH1 and p16 methylation, supporting the hypothesis that SSAs could be precursors of serrated adenocarcinomas.

Fifteen years of molecular lymphangiogenesis - an interview with Kari Alitalo by Tatiana Petrova.

Kari Alitalo is one of the leaders in the field of lymphangiogenesis. Research from his laboratory has contributed to the transformation of a largely descriptive field into a dynamic discipline, which now holds promise for the treatment of cancer, inflammation and vascular dysfunction. The interview intends to provide historical insights into these changes and hopefully inspiration to the young generation of vascular biologists.

Obtenció de nous anàlegs amb activitat brassinoesteroide mitjançant modelització molecular i síntesi

Els brassinoesteroides són productes naturals que actuen com a potents reguladors del creixement vegetal. Presenten aplicacions prometedores en l’agricultura degut a que, aplicats exògenament, augmenten la qualitat i la quantitat de les collites. Ara bé, el seu ús s’ha vist restringit degut a la seva costosa obtenció. Aquest fet ha motivat la recerca de nous compostos actius més assequibles. En aquest projecte es planteja el disseny i obtenció de nous anàlegs seguint diferents estratègies que impliquen tant l’ús de mètodes de modelització molecular com de síntesi orgànica. La primera d’aquestes estratègies consisteix en buscar compostos actius en bases de dades de compostos comercials a través de processos de Virtual Screening desenvolupats amb mètodes computacionals basats en Camps d’Interacció Molecular. Així, es van establir i interpretar models de Relacions Quantitatives Estructura-Activitat (QSAR) emprant descriptors independents de l’alineament (GRIND) i, amb col•laboració amb la Universitat de Perugia, aquest criteri de cerca es va ampliar amb l’aplicació de descriptors FLAP de nova generació. Una altra estratègia es va basar en intentar substituir l’esquelet esteroide dels brassinoesteroides per una estructura equivalent, fixant com a cadena lateral el grup (R)-hexahidromandelil. S’han aplicat dos criteris: mètodes computacionals basats en models QSAR establerts amb descriptors GRIND i també en la metodologia SHOP (scaffold hopping), i, per altra banda, anàlegs proposats racionalment a partir d’un estudi efectuat sobre disruptors endocrins no esteroïdals. Sobre les estructures trobades s’hi va unir la cadena lateral comercial esmentada per via sintètica, en la qual s’ha hagut de fer un èmfasi especial en grups protectors. En total, 49 estructures es proposen per a ser obtingudes sintèticament. També s’ha treballat en l’obtenció un agonista derivat de l’hipotètic antagonista KM-01. Totes les molècules candidates, ja siguin comercials o obtingudes sintèticament, estant sent avaluades en el test d’inclinació de la làmina d’arròs (RLIT).

Identificación de variedades de vitis vinifera procedentes de diferentes regiones del mundo mediante tècnica de biologia molecular de los microsatéllites

El objetivo de este estudio se centró en analizar una colección privada de germoplasma de Vitis vinifera L., de 338 cultivares procedentes de 24 países, para caracterizarlas creando una base de datos, utilizando 11 marcadores microsatélites o SSR (Simple Sequence Repeat). Como resultado se encontraron que algunas de las muestras analizadas presentaron un perfil idéntico de SSR, indicando que se trata de una sinonimia (la misma variedad pero con diferente nombre). Se detectaron 293 perfiles únicos. Adicionalmente, 15 pares de variedades presentaron diferencias en un solo locus y otros 7 grupos difieren en 2 loci, lo cual indicaría la alta proximidad genética entre esas variedades, sin llegar a ser la misma. El germoplasma analizado cuenta con una compleja biodiversidad varietal que se debe preservar. El estudio se realizó programando para el primer año la revisión bibliográfica detallada, recolección de las hojas y el inicio de la puesta a punto de la metodología, en el segundo año se completa la puesta a punto de la metodología, se trituran las hojas y se realiza la extraccinón del ADN. El tercer año se emplea para amplificar los fragmentos de ADN por medio de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), obtener la longitud de los fragmentos con un secuenciador ABI PRISM 310, valorar resultados y realizar repeticiones. El último año se analizan los resultados obtenidos, se realizan repeticiones pertinentes y se comienza la redacción de artículos científicos.

Análisis morfométrico de la extremidad anterior en Carnivora

Durante los cuatro años de disfrute de la beca (2006 – 2009) se ha consolidado una base de datos de medidas osteológicas del esqueleto apendicular de numerosas especies del O. Carnivora. Concretamente, se han medido 364 individuos de 126 especies. Los ejemplares pertenecían a las colecciones del Phyletisches Museum (Jena, Alemania), el Museum für Naturkunde (Berlín, Alemania), el Museu de Ciències Naturals de la Ciutadella (Barcelona, España), el Múseum National d'Histoire Naturelle (París, Francia), y el Museo Nacional de Ciencias Naturales (Madrid, España). Asimismo, con estos datos se han estado preparando tres artículos sobre la morfología de ciertos elementos del esqueleto apendicular en carnívoros, dos de los cuales se encuentran actualmente en estado de revisión para su publicación científica. Dos de ellos, "Scapula, habitat and locomotion in Carnivora" y "Size and shape in the carnivore scapula", relacionan la morfología escapular con factores como el tamaño del animal, el tipo de locomoción que presenta y el hábitat en el que se encuentra; el primero mediante metodología multivariante (análisis funcional) y el segundo bajo las nuevas técnicas de morfometría geométrica. El tercer artículo, "Scaling and mechanics in the carnivore calcaneus: A comparison of natural and artificial selection", evalúa el efecto de diferentes tipos de selección, natural frente a artificial, sobre la morfología del calcáneo y su influencia en la biomecánica de este hueso. Finalmente, también se ha desarrollado un estudio experimental sobre la búsqueda de estabilidad durante la locomoción arbórea, cuyos resultados han dado lugar al artículo "The search for stability on narrow supports: An experimental study in cats and dogs", que también se halla bajo revisión actualmente.

The carbohydrate-binding specificity and molecular modelling of Canavalia maritima and Dioclea grandiflora lectins

The carbohydrate-binding specificity of lectins from the seeds of Canavalia maritima and Dioclea grandiflora was studied by hapten-inhibition of haemagglutination using various sugars and sugar derivatives as inhibitors, including N-acetylneuraminic acid and N-acetylmuramic acid. Despite some discrepancies, both lectins exhibited a very similar carbohydrate-binding specificity as previously reported for other lectins from Diocleinae (tribe Phaseoleae, sub-tribe Diocleinae). Accordingly, both lectins exhibited almost identical hydropathic profiles and their three-dimensional models built up from the atomic coordinates of ConA looked very similar. However, docking experiments of glucose and mannose in their monosaccharide-binding sites, by comparison with the ConA-mannose complex used as a model, revealed conformational changes in side chains of the amino acid residues involved in the binding of monosaccharides. These results fully agree with crystallographic data showing that binding of specific ligands to ConA requires conformational chances of its monosaccharide-binding site.

The complement inhibitor low molecular weight dextran sulfate prevents TLR4-induced phenotypic and functional maturation of human dendritic cells.

Low molecular weight dextran sulfate (DXS) has been reported to inhibit the classical, alternative pathway as well as the mannan-binding lectin pathway of the complement system. Furthermore, it acts as an endothelial cell protectant inhibiting complement-mediated endothelial cell damage. Endothelial cells are covered with a layer of heparan sulfate (HS), which is rapidly released under conditions of inflammation and tissue injury. Soluble HS induces maturation of dendritic cells (DC) via TLR4. In this study, we show the inhibitory effect of DXS on human DC maturation. DXS significantly prevents phenotypic maturation of monocyte-derived DC and peripheral myeloid DC by inhibiting the up-regulation of CD40, CD80, CD83, CD86, ICAM-1, and HLA-DR and down-regulates DC-SIGN in response to HS or exogenous TLR ligands. DXS also inhibits the functional maturation of DC as demonstrated by reduced T cell proliferation, and strongly impairs secretion of the proinflammatory mediators IL-1beta, IL-6, IL-12p70, and TNF-alpha. Exposure to DXS leads to a reduced production of the complement component C1q and a decreased phagocytic activity, whereas C3 secretion is increased. Moreover, DXS was found to inhibit phosphorylation of IkappaB-alpha and activation of NF-kappaB. These findings suggest that DXS prevents TLR-induced maturation of human DC and may therefore be a useful reagent to impede the link between innate and adaptive immunity.

Comparison of Some Molecular-genetic Techniques for Identification of Leishmania Circulating in Natural Foci of Zoonotic Cutaneous Leishmaniasis in the Central Asia Region

Different molecular-genetic methods were used to identify a cohort of Leishmania strains from natural foci of zoonotic cutaneous leishmaniasis located in Central Asia, on the former USSR territory. The results obtained using isoenzymes, PCR, restriction fragment length polymorphisms of kDNA and molecular hybridization techniques are discussed in terms of their applicability, discrimination power and feasibility for answering questions related to molecular epidemiological research and for detecting mixed Leishmania infections

The Changing Face of the Epidemiology of Tuberculosis due to Molecular Strain Typing: A Review

About one third of the world population is infected with tubercle bacilli, causing eight million new cases of tuberculosis (TB) and three million deaths each year. After years of lack of interest in the disease, World Health Organization recently declared TB a global emergency and it is clear that there is need for more efficient national TB programs and newly defined research priorities. A more complete epidemiology of tuberculosis will lead to a better identification of index cases and to a more efficient treatment of the disease. Recently, new molecular tools became available for the identification of strains of Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), allowing a better recognition of transmission routes of defined strains. Both a standardized restriction-fragment-length-polymorphism-based methodology for epidemiological studies on a large scale and deoxyribonucleic acids (DNA) amplification-based methods that allow rapid detection of outbreaks with multidrug-resistant (MDR) strains, often characterized by high mortality rates, have been developed. This review comments on the existing methods of DNA-based recognition of M. tuberculosis strains and their peculiarities. It also summarizes literature data on the application of molecular fingerprinting for detection of outbreaks of M. tuberculosis, for identification of index cases, for study of interaction between TB and infection with the human immunodeficiency virus, for analysis of the behavior of MDR strains, for a better understanding of risk factors for transmission of TB within communities and for population-based studies of TB transmission within and between countries

Análisis descriptivo de los planes de investigación en pediatría resueltos por la Agencia Europea del Medicamento durante el periodo 2007-2009.

Análisis descriptivo de la información contenida en los Planes de Investigación Pediátricos (PIPs) resueltos por la Agencia Europea del Medicamento durante los años 2007-2009, para analizar tanto las características de los medicamentos que han presentado un PIP como las del propio plan de investigación. También se analizan los grupos terapéuticos a los que pertenecen los medicamentos incluidos en los PIPs, las edades de la población pediátrica incluidas en los PIPs y los estudios incluidos en los PIPs.

Las Bodegas españolas y su adaptación a los cambios del mercado a finales del siglo XX: análisis lingüístico de la publicidad

El sector vitivinícola español ha experimentado una serie de transformaciones en los últimos años, especialmente derivada de la caída del consumo interno y la creciente competencia en los mercados. Esto ha provocado que las bodegas españolas tuvieran que adaptarse a las nuevas circunstancias mediante la aplicación de modernas políticas de marketing. El objetivo principal del estudio es conocer el grado de aplicación de éstas, mediante la comparación y el análisis lingüístico de distintos tipos de incursiones publicitarias en medios impresos especializados, tratando aspectos como la frecuencia específica, la variación léxica, las categorías semánticas y las familias de palabras más utilizadas. La principal conclusión es que las bodegas españolas emprendieron un proceso de adaptación tardía, pasando de mensajes sencillos, sin imagen y relacionados con el sistema productivo, a otros mucho más elaborados, con imagen y nuevos términos que pretenden transmitir que estamos ante un producto de calidad.

Molecular determinants for membrane association of the hepatitis C virus NS2 protease domain

Background: Hepatitis C virus (HCV) nonstructural protein 2 (NS2) plays essential roles in particle assembly and polyprotein processing. It harbors an N-terminal membrane domain comprising three putative transmembrane s egments ( amino acids [aa] 1-93) a nd a C-terminal cysteine protease domain (aa 94-217). Given that the latter has been predicted to be membrane-associated, we aimed to identify molecular determinants for membrane association of the NS2 protease domain. Methods: A comprehensive panel of NS2 deletion constructs was analyzed by fluorescence microscopy, selective membrane extraction, and m embrane flotation assays. Candidate aa r esidues involved in membrane association were substituted by site-directed mutagenesis. Results: The NS2 protease domain alone was found to associate with membranes. Two N-terminal α-helices comprising aa 102-114 and aa 123-136 were found to m ediate this a ssociation, w ith c onserved hydrophobic and positively charged aa residues representing the key determinants. I nterestingly, m utagenesis analyses r evealed that electrostatic interactions involving a positively charged aa residue in α-helix aa 123-136 are required for membrane association. Mono- and bicistronic (i.e. NS2 c leavage-independent) HCV constructs were prepared to i nvestigate the effect o f these substitutions on RNA replication and infectious viral particle formation. Conclusions: T he NS2 protease d omain itself harbors m olecular determinants for membrane association within α-helices aa 102-114 and aa 1 23-136 which may contribute to p roper p ositioning of t he active site. These results provide new insights i nto the membrane topology and t he p oorly understood f unction of t his essential viral protease.

Análisis del ciclo de vida de sistemas de tratamiento de aguas residuales: influencia de los materiales utilizados

En este proyecto se tiene como objetivo comparar una EDAR específica con otras tres, desde el punto de vista ambiental, y establecer diferentes alternativas. En particular, se ha evaluado la mejor alternativa en la obtención de energía eléctrica para la propia utilización de la planta de tratamiento de aguas residuales, a partir del biogás generado en el digestor en la línea de lodos. En este tipo de instalaciones, entre las alternativas tanto en su uso actual como en fase de desarrollo, el motor de cogeneración de electricidad y el calor es el más utilizado para obtener simultáneamente la electricidad necesaria para las instalaciones y el calor necesario para mantener el digestor de lodos a la temperatura de trabajo (36ºC aproximadamente). Las otras alternativas evaluadas en este estudio son las pilas de biogás de membrana electrolítica polimérica (en inglés Polymeric Electrolyte Membrane, PEM) y las pilas de óxidos sólidos (en inglés Solid Oxide Fuel Cells, SOFC) con una turbina de gas (sistema híbrido SOFC-GT). Por otro lado, se estudian las características de los materiales que componen los dispositivos MEC (microbial electrolysis cell) y las pilas PEM y SOFC, así como las ventajas e inconvenientes de usar estas nuevas tecnologías en el tratamiento de aguas residuales, así como la evaluación del impacto ambiental de la EDAR objeto de estudio, que se ha llevado a cabo utilizando el análisis de ciclo de vida (ACV). El ACV es una herramienta que permite comparar diferentes procesos o productos que tengan la misma función, y así evaluar la alternativa que conlleve una mejora en el medio ambiental. La metodología de ACV pretende evaluar en detalle el ciclo de vida completo de un producto o proceso. Un ACV se suele definir de tipo "cradle to grave" o "desde la cuna hasta la tumba" o bien de tipo "gate to gate", o "de puerta a puerta". En el primer caso el estudio analiza el ciclo de vida completo del sistema, dese el origen hasta el final, mientras que en el segundo caso el ACV no tiene en cuenta su disposición final (vertedero, reciclaje, etc.). Un estudio de ACV del primer tipo conlleva hacer un estudio muy detallado, que en la práctica puede resultar muy largo y laborioso por la dificultad de encontrar todos los datos necesarios. Por ello, muchos estudios de ACV que se encuentran en la literatura suelen ser del tipo "gate to gate". Además, hay que esablecer las fronteras del sistema a estudiar, ya que hay procesos que tienen muy poca contribución a las categorías de impacto ambiental. En una EDAR los principales procesos considerados en el ACV llevado a cabo son el consumo de productos químicos, de electricidad, la producción de lodos y su utilización como composta, el biogás y su utilización para producir electricidad, los residuos sólidos y las distintas emisiones al medio producidas por el propio funcionamiento de la EDAR. Las operaciones relacionadas indirectamente como el transporte de los lodos, de productos químicos, de los residuos sólidos y la infraestructura con una vida media de 30 años no influyen significativamente en los resultados, por ejemplo el transporte de los lodos con un camión a 30km contribuyen en menos de 1% en todas las categorías de impacto. De acuerdo con las normativas ISO series 14040 que regulan las pautas de un ACV, se establece una unidad funcional apropiada, o sea habitante equivalente, ya que es la más apropiada por tener en cuenta la carga contaminante en el agua a tratar, parámetro imprescindible para comparar EDARs. Redefiniendo las fronteras, se realiza un ACV del depósito del biogás sin tener en cuenta el resto de la instalación y se toma como unidad funcional m3 de biogás, en el caso concreto de obtener biogás mediante un dispositivo MEC, que maximiza la cantidad de hidrógeno en detrimento de la cantidad de metano contenido en el biogás, observándose que la contribución de un biogás con un alto contenido en hidrógeno y, por tanto bajo en metano, produce una mejora ambiental. Las categorías de impacto ambiental que tienen contribución son el calentamiento global y la oxidación fotoquímica; el dispositivo MEC hace quela contribución a estas categorías de impacto sea de un orden de magnitud inferior con respecto al biogás generado en un digestor. Además, si se produce la combustión del biogás, la única categoría de impacto que tiene contribución es la de calentamiento global; para una dispositivo MEC la contribución sigue siendo un orden de magnitud inferior con respecto al biogás de un digestor de lodos.