Funktionelle Analyse der Plasmamembran-Ca 2+-ATPase 2 -PMCA2- in Modellen der Neurodegeneration

Calcium (Ca2+) ist ein ubiquitär vorkommendes Signalmolekül, das an der Regulation zahlreicher zellulärer Prozesse, von der Proliferation bis zum programmierten Zelltod, beteiligt ist. Daher müssen die intrazellulären Ca2+-Spiegel streng kontrolliert werden. Veränderungen der Ca2+-Homöostase während der altersassoziierten Neurodegeneration können dazu beitragen, dass Neuronen vulnerabler sind. So wurden erhöhte Ca2+-Konzentrationen in gealterten Neuronen, begleitet von einer erhöhten Vulnerabilität, beobachtet (Hajieva et al., 2009a). Weiterhin wird angenommen, dass der selektive Untergang von dopaminergen Neuronen bei der Parkinson Erkrankung auf eine erhöhte Ca2+-Last zurückzuführen sein könnte, da diese Neuronen einem ständigen Ca2+-Influx,rnaufgrund einer besonderen Isoform (CaV 1.3) spannungsgesteuerter Ca2+-Kanäle des L-Typs, ausgesetzt sind (Chan et al., 2007). Bislang wurden die molekularen Mechanismen, die einem Ca2+-Anstieg zu Grunde liegen und dessen Auswirkung jedoch nicht vollständig aufgeklärt und daher in der vorliegenden Arbeit untersucht. Um Veränderungen der Ca2+-Homöostase während der altersassoziiertenrnNeurodegeneration zu analysieren wurden primäre Mittelhirnzellen aus Rattenembryonen und SH-SY5Y-Neuroblastomazellen mit dem Neurotoxin 1-Methyl-4-Phenyl-Pyridin (MPP+), das bei der Etablierung von Modellen der Parkinson-Erkrankung breite Anwendung findet, behandelt. Veränderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration wurden mit einem auf dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-basierten Ca2+-Indikator,rn„Cameleon cpYC 3.6“ (Nagai et al., 2004), ermittelt. Dabei wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass MPP+ die Abregulation der neuronenspezifischen ATP-abhängigen Ca2+-Pumpe der Plasmamembran (PMCA2) induziert, die mit der Ca2+-ATPase des endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und dem Na+/Ca2+-Austauscher (NCX) das zelluläre Ca2+-Effluxsystem bildet, was zu einer erhöhten zytosolischen Ca2+-Konzentration führt. Die PMCA2-Abnahme wurde sowohl auf Transkriptionsebene als auch auf Proteinebene demonstriert, während keine signifikanten Veränderungen der SERCA- und NCX-Proteinmengen festgestellt wurden. Als Ursache der Reduktion der PMCA2-Expression wurde eine Abnahme des Transkriptionsfaktors Phospho-CREB ermittelt, dessen Phosphorylierungsstatus abhängig von der Proteinkinase A (PKA) war. Dieser Mechanismus wurde einerseits unter MPP+-Einfluss und andererseits vermittelt durch endogene molekulare Modulatoren gezeigt. Interessanterweise konnten die durch MPP+ induzierte PMCA2-Abregulation und der zytosolische Ca2+-Anstieg durch die Aktivierung der PKA verhindert werden. Parallel dazu wurde eine MPP+-abhängige verringerte mitochondriale Ca2+-Konzentration nachgewiesen, welche mit einer Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials korrelierte. Darüber hinaus kam es als Folge der PMCA2-Abnahme zu einem verminderten neuronalen Überleben.rnVeränderungen der Ca2+-Homöostase wurden auch während der normalen Alterung inrnprimären Fibroblasten und bei Mäusen nachgewiesen. Dabei wurden verringerte PMCA und SERCA-Proteinmengen in gealterten Fibroblasten, einhergehend mit einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration demonstriert. Weiterhin wurden verringerte PMCA2-Proteinmengen im Mittelhirn von gealterten Mäusen (C57B/6) detektiert.rnDer zelluläre Ca2+-Efflux ist somit sowohl im Zuge der physiologischen Alterung als auch in einem altersbezogenen Krankheitsmodell beeinträchtigt, was das neuronale Überleben beeinflussen kann. In zukünftige Studien soll aufgeklärt werden, welche Auswirkungen einer PMCA2-Reduktion genau zu dem Verlust von Neuronen führen bzw. ob durch eine PMCA2-Überexpression neurodegenerative Prozesse verhindert werden können.

Analyse humaner regulatorischer T-Zellen im humanisierten Mausmodell

Regulatorische T-Zellen sind essentiell für die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz. Hierbei sorgen diese hocheffektiven Suppressorzellen für ein immunologisches Gleichgewicht, indem sie Immunantworten gegen Autoantigene sowie harmlose Nahrungs- und Umweltantigene verhindern. Andererseits können diese bei chronischen Infekten Immunantworten reduzieren sowie effektive Antitumor-Immunantworten hemmen. Aufgrund ethischer Erwägungen ist die Erforschung regulatorischer T-Zellen und deren Rolle bei der Tumorentwicklung weitestgehend auf Mausmodelle oder humane in vitro oder ex vivo Analysen beschränkt. Um diese Limitationen zu überwinden und translationale immunologische Experimente zu ermöglichen, wurde hier ein humanisiertes Mausmodell verwendet. T- und B-Zell-defiziente NOD-scid IL2Rgammanull (NSG) Mäuse wurden mit humanen CD34+ hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut rekonstituiert. Aus diesen Stammzellen entstanden in den Tieren vielfältige humane Immunzellen. Im murinen Thymus der NSG Tiere entwickelten sich CD4+ und CD8+ einzelpositive T-Zellen, welche als funktionelle Effektorpopulationen in die Peripherie auswanderten. Humane regulatorische T-Zellen (CD4+ CD25+ Foxp3+ CD127-) entwickelten sich ebenfalls im murinen Thymus der Tiere und machten ca. 10% der humanen peripheren CD4+ T-Zellen in den Mäusen aus. Diese humanen regulatorischen T-Zellen zeigten vorwiegend einen HLA-DR+ Phänotyp, welcher mit höchster Suppressivität assoziiert ist. Weiter verhielten sich die regualtorischen T-Zellen anergisch und bewiesen ihre Funktionalität unter anderem durch die Inhibition der Proliferation von Effektor-T-Zellen in vitro. rnSubkutan injizierte Tumorzellen eines humanen undifferenzierten pleomorphen Sarkoms wurden in den humanisierten Mäusen nicht abgestoßen und der Tumor konnte, trotz Infiltration humaner Immunzellen, ungehindert wachsen. Als mögliche Ursache hierfür zeigte sich die selektive Akkumulation regulatorischer T-Zellen im Tumor. Zusammen mit dem erhöhten Anteil humaner regulatorischer T-Zellen in der Peripherie, weisen diese Beobachtungen deutliche Parallelen mit Befunden aus humanen Patienten auf. Dies bietet somit erstmalig die Option in vivo die Rolle humaner regulatorischer T-Zellen im undifferenzierten pleomorphen Sarkom zu analysieren. Die hier gezeigten Daten machen deutlich, dass es das humanisierte Mausmodell ermöglicht, die Entstehung und Funktion humaner regulatorischer T-Zellen in vivo zu analysieren, deren Bedeutung in klinisch relevanten Modellen zu charakterisieren und somit innovative Therapien zu etablieren.

La Trilogie des couleurs de M. Fermine: analyse et proposition de traduction de passages choisis

Ce mémoire est le fruit de ma passion pour la langue française, pour la littérature et pour la traduction. Mon travail porte sur une proposition de traduction, du français vers l’italien, de trois passages tirés des trois romans composant La Trilogie des couleurs de Maxence Fermine. Il s’agit de romans brefs mais intenses qui partagent le thème dominant de la couleur, ainsi que le schéma narratif et un style unique en son genre. Dans le premier chapitre, je souhaite d’abord fournir quelques informations sur la vie de l’écrivain, sur son style d’écriture et sur les thèmes principaux de ses ouvrages. Ensuite, je vais présenter La Trilogie, pour tracer le contexte général dans lequel les passages choisis s’inscrivent. Enfin, je me pencherai sur les raisons qui m'ont amenée au choix de ces passages. Dans le deuxième chapitre, je vais analyser les textes source (les passages choisis) dans le but d’identifier les éléments les plus importants (sur le plan lexical, morphosyntaxique et stylistique) à considérer très attentivement lors de la traduction. Dans le dernier chapitre, j'essaye d'analyser ma proposition de traduction à l'aide de textes spécifiques et justifie mes choix traductifs. Enfin, je vais tirer mes conclusions : dans la traduction littéraire, l’expression doit être la plus spontanée possible, tout en gardant le style de l’auteur et un certain niveau esthétique. En outre, le but de tout traducteur est celui d’atteindre un bon compromis entre une traduction orientée vers le texte source et une traduction adressée à la culture cible, ainsi que celui de créer un nouveau texte, qui doit fonctionner aussi bien que l’original, en profitant de tous les atouts de la langue cible de la même manière que l’auteur du texte source l’a fait dans sa propre langue. Mon travail a toujours été guidé par ces principes.

Das aktuelle Debattenbuch im politischen Feld : eine Analyse anhand von Fallbeispielen /// Arbeitsblätter für die Sachbuchforschung ; 19

Diese Forschungsarbeit zeigt erstmalig anhand von drei Fallbeispielen [„Lob der Disziplin. Eine Streitschrift“ von Bernhard Bueb, „Das Methusalem-Komplott“ von Frank Schirrmacher und „Deutschland schafft sich ab“ von Thilo Sarrazin] und aufbauend auf Bourdieus Theorie des politischen Feldes welche Wirkung s. g. Debattenbücher auf das gesellschaftliche Diskursfeld, die Politik und die Wissenschaft haben können. Die Arbeit gliedert sich in drei Teile. In einem ersten Schritt werden Unterschiede und Gemeinsamkeiten der Autoren und Werke herausgearbeitet. Es wird gezeigt welche Inszenierungsstrategien vorliegen und wie diese den Autor auf das Kräftemessen im politischen Feld vorbereiten. Im Anschluss wird im zweiten Schritt geklärt, wie sich der Autor im politischen Feld positioniert und welchen Einfluss er auf das bestehende Kräfteverhältnis politischer Akteure ausübt. Im letzten Schritt wird diesem Einfluss abstrahierend auf das gesellschaftliche Wirkungspotenzial von Debattenbüchern geschlossen. Unter Zuhilfenahme von Zeitungsartikeln, die bis zu 6 Monaten nach Erscheinungstermin des jeweiligen Titels, in Der Spiegel, Die Zeit und der Frankfurter Allgemeine Sonntagszeitung veröffentlicht wurden, wurde klar, dass Debattenbücher dann erfolgreich sind, wenn sie eine Meinung, die konträr zum gesellschaftlichen Konsens steht, provokativ und emotional aufbereiten und der Autor bereit ist, als Meinungsträger seine Thesen in der öffentlichen Debatte zu vertreten. So gestaltet regt das Debattenbuch – auch wenn es langfristig keinen Effekt auf das zentrale gesellschaftliche Diskursfeld hat - zur „Selbstfindung durch Emotionen“ an. Auf vermeintliche Sachlichkeit anspielend wirkt es, weil es den Lesern gesellschaftliche Konfliktherde auf emotionalem Wege bewusst werden lässt und so Impulse zur Veränderung setzt.

Analyse du poème “A une passante” de Baudelaire

Il lavoro da me svolto si concentra sull’analisi testuale della poesia “A une passante” di Charles Baudelaire, contenuto all’interno della raccolta “Les fleurs du mal”, nella sezione dei “Tableaux parisiens”. Oltre ad essermi soffermata sulla da sempre affascinante, misteriosa e complessa figura e personalità del poeta, ho fornito un’interpretazione generale del sonetto, mettendo insieme punti di vista di grandi critici letterari e tenendo anche conto della visione di celebri traduttori (quali Antonio Prete e Riccardo Sonzogno), che si sono cimentati, con svariati metodi e approcci, alla traduzione della raccolta; ho poi dedicato una breve parentesi ad una visione più generale di ciò che è la traduzione e a come essa può venire concepita e distinta nei diversi ambiti. Ho analizzato nel dettaglio la figura della ‘passante’ all’interno della poesia e l’importanza che Baudelaire le attribuisce, in un’eterna alternanza tra timore reale e amore surreale. La poesia, infatti, è ricca di espressioni essenziali per comprendere la concezione della donna da parte del poeta, ma anche per l’esistenza stessa del ‘poète maudit’. Egli si trova, infatti, costretto a muoversi in uno spazio intermedio tra realtà e immaginazione, nel quale nemmeno i suoi occhi sono più capaci di distinguere ciò che il poète voyant è in grado di scorgere per definizione; per sfuggire alla piattezza e alla quotidianità parigina egli sogna allora un passaggio, un’illusione, un miracolo, un amore. E, sebbene non si tratti affatto di un incontro realmente accaduto, questa è l’unica possibilità che il poeta ha per non far svanire l’immagine di questa donna sconosciuta, che di certo l’avrebbe amato, e per non farla svanire tra la folla dalla quale ha preso vita: è solo immortalando questo momento che il ritratto della ‘passante’ potrà restare impresso per sempre nelle più grandi pagine della letteratura francese.

Etablierung eines humanisierten Mausmodells zur In-vivo-Analyse von DC-adressierenden Nanopartikeln

In dieser Arbeit wurde zunächst ein humanisiertes Mausmodell entwickelt für die Analyse von humanen DCs in vivo. Darüber hinaus wurden erste Versuche mit Nanopartikelbeladenen DCs durchgeführt, mit der Intention, durch diese Kombination humane DCs zu untersuchen. Es wurden immunsupprimierte NOD/LtSz-scid IL2R (NSG) Mäuse verwendet und mit humanen CD34+ PBSCs transplantiert. Es wurden insgesamt 14 Modelle getestet, mit einer durchschnittlichen Humanisierungsrate von 76 %. In allen Modellen konnten ab Woche sechs nach Transplantation humane CD45+ Zellen sowie humane Bund NK-Zellen und CD14+ Monozyten gefunden werden. Darüber hinaus waren myeloide DC-Vorläuferzellen, konventionelle HLA DR CD11c DCs (cDCs) und plasmazytoide DCs (pDCs) vorhanden. Humane T-Zellen konnten nicht vor Woche 18 nach Transplantation beobachtet werden. Neben der Rekonstitution humaner DCs in peripheren Organen, wurde ebenfalls nach gewebsständigen DCs, insbesondere den Langerhans Zellen (LCs) der Epidermis geschaut. Waren humane LC vorhanden, konnten diese ab Woche zwölf nach Transplantation in der murinen Epidermis detektiert werden. Diese waren konstant bis in Woche 30 nach Transplantation nachweisbar. In Hinblick auf die Etablierung der DCs in diesem humanisierten Mausmodells wurden verschiedene Einflussgrößen getestet. IL-7 führte zu keiner veränderten Hämatopoese, wohingegen Flt3L zu einer Zunahme von CD14+ Monozyten und cDCs führte. Darüber hinaus konnte eine drastische Abnahmernhumaner B-Zellen beobachtet werden. Es zeigte sich, dass der Zeitpunkt der Flt3LrnApplikation einen entscheidenen Faktor für den Effekt von Flt3L auf die Rekonstitution humaner Zellen darstellt. Für die in dieser Arbeit durchgeführten funktionellen in vivo Studien, wurden humanisierten Mäusen alloreaktive CD8+ T-Zellen appliziert. Somit sollte die Funktionalität der rekonstituierten humanen APCs getestet werden. Es wurde deutlich, dass Monozyten und DCs ihre Funktionalität erst ab Woche 14 nach Transplantation zu entwickeln schienen,rnwohingegen B-Zellen bereits zu früheren Zeitpunkten als Zielzellen für die alloreaktiven T-Zellen dienten. Dies wurde durch den Rückgang der jeweiligen Zellen nach Applikation der T-Zellen sichtbar. Zu erwähnen ist, dass das Anwachsen einer humanen Hämatopoese stark spenderabhängig ist und somit keine allgemeingültigen Aussagen hinsichtlich der in vivo Funktion getroffen werden können. Um im Gewebe verbliebende APCs zu manipulieren gibt es verschiedene Möglichkeiten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf Polystyren-basierende Nanopartikel getestet. Die verwendeten Partikel hatten eine Größe von 80 bis 160 nm und waren unfunktionalisiert oder mit Amino- bzw. Carboxy-Gruppen versehen. Zusätzlich wurden die Partikel mit BODIPY (Durchflusszytometrie und kLSM-Messungen), einem Infrarotnahem Farbstoff IR 780 (BFI-Messungen) und Platin (in vivo Messungen) beladen. Der Carboxy-funktionalisierte Partikel zeigte den geringsten Einfluss auf die Vitalität von humanen DCs, wohingegen der Amino-funktionalisierte Partikel bei steigender Konzentration toxisch wirkte. Bei unfunktionalisierten Partikeln stieg die Toxizität bei zunehmender Konzentration. Hinsichtlich der Expression diverser DC spezifischer Oberflächenmoleküle nach Beladung mit Nanopartikeln zeigte sich, dass allein der unfunktionalisierte, mit Lutensol AT50 hergestellte Partikel zu einer leichten Hochregulation von MHC-Klasse-II Molekülen führte. Die Expression von CD86 wurde im Gegenzug nur durch die Beladung mit den Amino-, bzw. Carboxy funktionalisierten Partikeln und dem unfunktionalisierten, mit SDS hergestellten Partikel leicht gesteigert. Trotz der teilweise leicht veränderten Expression von Oberflächenmarkern, konnte mit Hilfe von IFN-g ELISpots keine Beeinflussungrnder Funktion als APCs von Nanopartikel-beladenen DCs beobachtet werden. In den in vivo Untersuchungen zeigten alle vier Partikel eine konstante Zirkulation imrnOrganismus und konnten bis 96 h nach Applikation nachgewiesen werden. Alle Partikel konnten primär in der Leber detektiert werden, wobei der unfunktionalisierte, mit Lutensol AT50 hergestelle Partikel das weiteste Verbreitungsmuster zeigte. Erste Versuche im humanisierten Mausmodell zeigten keine Beeinflussung der Verteilung und Kinetik von Nanopartikeln durch die humane Hämatopoese. Mit dem in dieser Arbeit etablierten humanisierten Mausmodell ist es möglich, die Entwicklung, Differenzierung, Aktivierung und Funktionalität humaner DCs in vivo zu untersuchen. Darüber hinaus kann das gezielte Adressieren von DCs in vivo analysiert werden, was sowohl die Möglichkeit der Manipulation von DCs zur Vermeidung einer akuten GvHD bietet als auch Verwendung in anderen DC-vermittelten Therapien (z.B.Vakzinationsstudien) findet.

Molekulare Analyse des Kolumnar-Gens beim Apfel (Malus x domestica)

Das Kolumnarwachstum beim Apfel (Malus x domestica) geht auf eine in den frühen 1960er Jahren entdeckte Zufallsmutation zurück. Die daraus resultierende Sprossmutante ist von großem wirtschaftlichem Interesse, da diese sehr kompakte Wuchsform unter anderem zu einer enormen Ertragssteigerung durch eine hohe Pflanzdichte der Bäume führt. Das Ziel der Arbeit ist die Entschlüsselung der molekularen Ursache dieser Mutation, die bisher weitgehend ungeklärt ist. Die Analyse wurde durch die Erstellung einer Referenzsequenz der Co-Zielregion einer kolumnaren Apfelsorte sowie durch die Konstruktion eng gekoppelter molekularer Marker realisiert. Durch die Konstruktion von genomischen Apfel-BAC-Bibliotheken mit mehrfacher Genomabdeckung und die Erstellung geeigneter Sonden wurde die Co-Region kloniert und deren Sequenz bestimmt. In Kombination zu dieser klassischen positionellen Klonierungsstrategie wurden genomische Illumina „mate pair“-Bibliotheken erstellt, sequenziert und bioinformatisch analysiert, um die genomische Region vollständig zu annotieren. Somit wurde eine vollständige genomische Referenz der Co-Region einer kolumnaren Apfelsorte erstellt, die die Grundlage für weitere Analysen bildet. Auf Basis dieser Referenz konnte die Co-Mutation in Form der Integration des LTR-Retrotransposons Gypsy-44 im kolumnaren Chromosom an Position 18,79 Mbp auf Chromosom 10 lokalisiert werden. Darüber hinaus konnten Transposon-basierende molekulare Marker erstellt werden, die eine verlässliche Genotypisierung von Apfelbäumen in Bezug auf das Kolumnarwachstum ermöglichen und dies unabhängig von der verwendeten Apfelsorte. Der genaue Wirkmechanismus von Gypsy-44, der zur Ausprägung dieses extremen Phänotyps führt, ist bislang unklar. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die molekulare Ursache für das kolumnare Wachstum aufgeklärt werden konnte und zudem die ersten molekularen Marker erstellt wurden, die eine sortenunabhängige Differenzierung zwischen kolumnaren und nicht kolumnaren Apfelbäumen ermöglichen.

Charakterisierung und funktionelle Analyse verschiedener Isoformen von Clusterin (Apolipoprotein J)

Clusterin (CLU), auch bekannt unter dem Namen Apolipoprotein J (ApoJ), wird von Zellen als hetreodimeres Glykoprotein exprimiert und in den extrazellulären Raum sezerniert. Es wird daher auch als sezerniertes CLU (sCLU) bezeichnet. Neben sCLU sind auch nicht-sezernierte Isoformen von CLU bekannt, die in der vorliegenden Arbeit erforscht wurden. Ziel dabei war es, die Expression, die Biogenese, sowie die Funktion dieser Proteine zu ergründen. Nicht-sezernierte CLU-Formen werden ausschließlich von Zellen exprimiert, die zuvor einer Stresssituation ausgesetzt wurden. Dies konnte insbesondere durch Kultur verschiedener Zelllinien bei erhöhter Temperatur oder durch Behandlung mit dem Proteasominhibitor MG 132 demonstriert werden, worauf neben sCLU auch 50 kDa bzw. 45 kDa große, nicht-sezernierte CLU-Proteine in geringen Mengen exprimiert wurden. Bezüglich der Biogenese dieser Proteine wurden mehrere Hypothesen bzw. Mechanismen diskutiert und in dieser Arbeit untersucht: alternative Translationsstartpunkte auf verschiedenen mRNAs, alternatives Splicing einzelner mRNAs sowie Retrotranslokation oder Mistranslokation von sCLU-Vorläuferproteinen. Um die Hypothesen eruieren zu können, musste zuerst eine Expressionsanalyse der bekannten CLU-mRNAs durchgeführt werden. Über 5’-RACE, semi-quantitative und quantitative PCRs wurde die Expression von vier CLU-mRNAs sowie deren Induktion auf Zellstress hin festgestellt. Variante 1 (BP211675) ist die dominante CLU-mRNA und macht über 99,5 % an CLU-mRNA in unbehandelten sowie in gestressten Zellen aus. Des Weiteren sind geringste Mengen der mRNA-Varianten 2 und 3 (NR_038335.1 und NR_045494.1) detektiert worden, deren Sequenzen sich lediglich in ihrem alternativen Exon 1 von Variante 1 unterscheiden. Schließlich konnte die Expression von Variante 1 [Δex2] festgestellt werden, welcher durch alternatives Splicing, i.e. Exon-skipping, das Exon 2 mit der ER-Signalsequenz-codierenden Region (SSCR) fehlt. HEK 293-Zellen, die transient mit je einer der rekombinanten CLU-mRNAs in Form rekombinanter cDNA transfiziert wurden, exprimierten neben großen Mengen sCLU auch geringe Mengen an den nicht-sezernierten CLU-Isoformen. Die anschließend durchgeführten in vitro Mutagenesen belegen, dass alle Isoformen ausgehend von distinkten Translationsstartpunkten aus synthetisiert werden. CLU1-449 (50 kDa) wird als prä-Proprotein von sCLU ausgehend von einem Startcodon auf Exon 2 unmittelbar vor der SSCR translatiert. Unter Zellstress-Bedingungen kann es zu einer Mistranslokation während der co-translationalen Translokation kommen, sodass Teile von CLU1-449 im Cytosol akkumulieren. CLU21-449 (50 kDa) wird ausgehend von einem CUG-Startcodon downstream der SSCR über interne Translationsinitiation gebildet. Analoges gilt für CLU34-449 (45 kDa), welches von einem AUG-Startcodon auf Exon 3 translatiert wird. CLU34-449 ist außerdem die einzige CLU-Form die von Variante 1 [Δex2] codiert wird. Somit konnten drei der in der Literatur postulierten Mechanismen zur Ent-stehung nicht-sezernierter CLU-Isoformen in gestressten Zellen verifiziert werden. Die Mistranslokation von sCLU-Vorläuferproteinen, welche entscheidend zum Auftreten der nicht-sezernierten CLU-Formen beiträgt, die Alternative Translationsinitiation an distinkten Startcodons sowie das alternative Splicing von CLU-mRNA-Variante 1. Weiterführende Experimente bestätigten, dass alle nicht-sezernierten CLU-Isoformen im Cytosol der Zellen lokalisiert sind und keine Glykosylierungen tragen. Somit konnte ein weiterer, in der Literatur kontrovers diskutierter Punkt bezüglich dieser Proteine geklärt werden. Abschließend wurde die physiologische Funktion der einzelnen CLU-Isoformen analysiert. Dabei zeigte sich, dass ausschließlich sCLU eine Chaperonaktivität zukommt, die es ermöglicht, durch Hitze denaturierte Zielproteine in Lösung zu halten. Diese Funktion konnte nicht für die cytosolischen Iso¬formen bestätigt werden. Weiterhin konnte keine Auswirkung einzelner CLU-Formen auf die intrinsische Apoptose oder auf den NF κB-vermittelten Signaltransduktionsweg festgestellt werden, obgleich entsprechende Einflüsse von anderen Arbeitsgruppen postuliert wurden. Die hier gemachten Beobachtungen werfen daher die Frage auf, ob den nicht-sezernierten, cytosolischen CLU-Isoformen überhaupt eine physiologische Funktion zukommt und stellen aktuelle Hypothesen bezüglich der Rolle von CLU bei pathophysiologischen Prozessen infrage.

Rückschritt nach dem Beitritt? : eine empirische Analyse der Qualität der Demokratie in Bulgarien nach dem EU-Beitritt

Die vorliegende Arbeit geht der Frage nach, ob die Qualität der Demokratie in Bulgarien nach dem EU-Beitritt nachgelassen hat und wenn ja, in welchen Bereichen. Ausgangspunkt für die Formulierung dieser Frage sind Medienberichte, denen zufolge Bulgarien nach dem Beitritt zur Europäischen Union Rückschritte in seiner Demokratieentwicklung, vor allem im Bereich der Rechtsstaatlichkeit, gemacht habe. Theoretische Grundlage für die Analyse ist das Konzept der defekten Demokratie von Wolfgang Merkel, Hans-Jürgen Puhle, Aurel Croissant, Claudia Eicher und Peter Thiery. Die Veränderungen des Demokratiegehalts für die Jahre des Untersuchungszeitraums (2006 bis 2011) werden anhand des Index Defekter Demokratie erfasst. Die Ergebnisse der Analyse zeigen, dass die Qualität der Demokratie in Bulgarien nach dem EU-Beitritt tatsächlich abgenommen hat. Die deutlichste Zunahme von Defekten ist dabei auf der Dimension des liberalen Rechts- und Verfassungsstaates festzustellen, was vor allem auf den Anstieg der Korruption während des Untersuchungszeitraums zurückzuführen ist.

Analyse der intrazellulären Freisetzung von Wirkstoffmodellen via konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie

In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, wie man das Potential nanopartikulärer Systeme, die vorwiegend via Miniemulsion hergestellt wurden, im Hinblick auf „Drug Delivery“ ausnutzen könnte, indem ein Wirkstoffmodell auf unterschiedliche Art und Weise intrazellulär freigesetzt wurde. Dies wurde hauptsächlich mittels konfokaler Laser-Raster-Mikrokopie (CLSM) in Kombination mit dem Bildbearbeitungsprogramm Volocity® analysiert.rnPBCA-Nanokapseln eigneten sich besonders, um hydrophile Substanzen wie etwa Oligonukleotide zu verkapseln und sie so auf ihrem Transportweg in die Zellen vor einem etwaigen Abbau zu schützen. Es konnte eine Freisetzung der Oligonukleotide in den Zellen aufgrund der elektrostatischen Anziehung des mitochondrialen Membranpotentials nachgewiesen werden. Dabei war die Kombination aus Oligonukleotid und angebundenem Cyanin-Farbstoff (Cy5) an der 5‘-Position der Oligonukleotid-Sequenz ausschlaggebend. Durch quantitative Analysen mittels Volocity® konnte die vollständige Kolokalisation der freigesetzten Oligonukleotide an Mitochondrien bewiesen werden, was anhand der Kolokalisationskoeffizienten „Manders‘ Coefficients“ M1 und M2 diskutiert wurde. Es konnte ebenfalls aufgrund von FRET-Studien doppelt markierter Oligos gezeigt werden, dass die Oligonukleotide weder beim Transport noch bei der Freisetzung abgebaut wurden. Außerdem wurde aufgeklärt, dass nur der Inhalt der Nanokapseln, d. h. die Oligonukleotide, an Mitochondrien akkumulierte, das Kapselmaterial selbst jedoch in anderen intrazellulären Bereichen aufzufinden war. Eine Kombination aus Cyanin-Farbstoffen wie Cy5 mit einer Nukleotidsequenz oder einem Wirkstoff könnte also die Basis für einen gezielten Wirkstofftransport zu Mitochondrien liefern bzw. die Grundlage schaffen, eine Freisetzung aus Kapseln ins Zytoplasma zu gewährleisten.rnDer vielseitige Einsatz der Miniemulsion gestattete es, nicht nur Kapseln sondern auch Nanopartikel herzustellen, in welchen hydrophobe Substanzen im Partikelkern eingeschlossen werden konnten. Diese auf hydrophobe Wechselwirkungen beruhende „Verkapselung“ eines Wirkstoffmodells, in diesem Fall PMI, wurde bei PDLLA- bzw. PS-Nanopartikeln ausgenutzt, welche durch ein HPMA-basiertes Block-Copolymer stabilisiert wurden. Dabei konnte gezeigt werden, dass das hydrophobe Wirkstoffmodell PMI innerhalb kürzester Zeit in die Zellen freigesetzt wurde und sich in sogenannte „Lipid Droplets“ einlagerte, ohne dass die Nanopartikel selbst aufgenommen werden mussten. Daneben war ein intrazelluläres Ablösen des stabilisierenden Block-Copolymers zu verzeichnen, welches rn8 h nach Partikelaufnahme erfolgte und ebenfalls durch Analysen mittels Volocity® untermauert wurde. Dies hatte jedoch keinen Einfluss auf die eigentliche Partikelaufnahme oder die Freisetzung des Wirkstoffmodells. Ein großer Vorteil in der Verwendung des HPMA-basierten Block-Copolymers liegt darin begründet, dass auf zeitaufwendige Waschschritte wie etwa Dialyse nach der Partikelherstellung verzichtet werden konnte, da P(HPMA) ein biokompatibles Polymer ist. Auf der anderen Seite hat man aufgrund der Syntheseroute dieses Block-Copolymers vielfältige Möglichkeiten, Funktionalitäten wie etwa Fluoreszenzmarker einzubringen. Eine kovalente Anbindung eines Wirkstoffs ist ebenfalls denkbar, welcher intrazellulär z. B. aufgrund von enzymatischen Abbauprozessen langsam freigesetzt werden könnte. Somit bietet sich die Möglichkeit mit Nanopartikeln, die durch HPMA-basierte Block-Copolymere stabilisiert wurden, gleichzeitig zwei unterschiedliche Wirkstoffe in die Zellen zu bringen, wobei der eine schnell und der zweite über einen längeren Zeitraum hinweg (kontrolliert) freigesetzt werden könnte.rnNeben Nanokapseln sowie –partikeln, die durch inverse bzw. direkte Miniemulsion dargestellt wurden, sind auch Nanohydrogelpartikel untersucht worden, die sich aufgrund von Selbstorganisation eines amphiphilen Bock-Copolymers bildeten. Diese Nanohydrogelpartikel dienten der Komplexierung von siRNA und wurden hinsichtlich ihrer Anreicherung in Lysosomen untersucht. Aufgrund der Knockdown-Studien von Lutz Nuhn konnte ein Unterschied in der Knockdown-Effizienz festgestellt werden, je nach dem, ob 100 nm oder 40 nm große Nanohydrogelpartikel verwendet wurden. Es sollte festgestellt werden, ob eine größenbedingte, unterschiedlich schnelle Anreicherung dieser beiden Partikel in Lysosomen erfolgte, was die unterschiedliche Knockdown-Effizienz erklären könnte. CLSM-Studien und quantitative Kolokalisationsstudien gaben einen ersten Hinweis auf diese Größenabhängigkeit. rnBei allen verwendeten nanopartikulären Systemen konnte eine Freisetzung ihres Inhalts gezeigt werden. Somit bieten sie ein großes Potential als Wirkstoffträger für biomedizinische Anwendungen.rn

Welche Typen von Autokratien sind leistungsfähiger und warum? : eine empirische Analyse auf Grundlage der Selektoratstheorie = Which type of autocracy performs better, and why?

Performanzunterschiede zwischen verschiedenen Autokratietypen wie Monarchien, Militär-, Ein-Parteien- und begrenzten Mehr-Parteien-Regimen sind bis auf wenige Ausnahmen bisher relativ unerforscht. Deshalb widmet sich diese Arbeit folgenden Forschungsfragen: Gibt es Performanzunterschiede zwischen verschiedenen Autokratietypen? Wenn ja, wie gestalten sich diese und wie lassen sie sich erklären? Auf Grundlage der Selektoratstheorie von Bueno de Mesquite et al. wird die Hypothese aufgestellt, dass die Performanz politischer Regime mit der Größe der Winning Coalition steigt. Da verschiedene Autokratietypen unterschiedlich große Winning Coalitions haben, wird angenommen, dass es deutliche Performanzunterschiede zwischen diesen Typen gibt. Als Performanzkriterien dienen in dieser Arbeit wirtschaftlicher Wohlstand, soziale Sicherheit und ökologische Nachhaltigkeit. Aus diesen drei Kriterien wird zusätzlich ein Indikator allgemeiner Performanz gebildet. Die empirische Untersuchung erfolgt mit den Daten des Quality-of-Governement-Datensatzes und erstreckt sich über 140 autokratische Länder im Zeitraum von 1972 bis 2010. Die Daten werden mittels Time-Series-Cross-Section-Regressionen analysiert. Die Ergebnisse der Analysen entsprechen nur teilweise den Erwartungen. Die Größe der Winning Coalition wirkt positiv auf die wirtschaftliche Wohlfahrt und die soziale Sicherheit und damit auch auf die allgemeine Performanz aus. Entgegen den Erwartungen sinkt die ökologische Performanz jedoch mit steigender Größe der Winning Coalition. Auch die Befunde bezüglich der Performanz verschiedener Autokratietypen entsprechen nicht den Erwartungen. So sind Ein-Parteien-Regime insgesamt leistungsfähiger als Mehr-Parteien-Regime, Militär-Regime und Monarchien. Militär-Regime sind leistungsfähiger als Monarchien und tendenziell auch als Mehr-Parteien-Regime.

Analyse zur Auswirkung der irreversiblen Wavelet-Kompression (JPEG2000) auf CT-Bildverarbeitungs- und Darstellungsalgorithmen

Der technische Fortschritt konfrontiert die medizinische Bildgebung wie keine andere Sparte der Medizin mit einem rasanten Anstieg zu speichernder Daten. Anschaffung, Wartung und Ausbau der nötigen Infrastruktur entwickeln sich zunehmend zu einem ökonomischen Faktor. Ein Verfahren, welches diesem Trend etwas entgegensetzten könnte ist die irreversible Bilddatenkompression. Sie ist seit über 10 Jahren Gegenstand vieler Studien, deren Ergebnisse sich wiederum in Empfehlungen zum Einsatz irreversibler Kompression mehrerer nationaler und internationaler Organisation, wie CAR, DRG, RCR und ESR wiederspiegeln. Tenor dieser Empfehlungen ist, dass der Einsatz von moderater irreversibler Bilddatenkompression sicher und sinnvoll ist. Teil dieser Empfehlungen sind auch Angaben über das Maß an Kompression, ausgedrückt in Kompressionsraten, welche je nach Untersuchung und anatomischer Region als sicher anwendbar gelten und keinen diagnostisch relevanten Verlust der komprimierten Bilder erzeugen.rnVerschiedene Kompressionsalgorithmen wurden vorgeschlagen. Letztendlich haben sich vor allem die beiden weit verbreiteten Algorithmen JPEG und JPEG2000 bewährt. Letzterer erfährt in letzter Zeit zunehmen Anwendung, aufgrund seiner einfacheren Handhabung und seiner umfangreichen Zusatzfunktionen.rnAufgrund rechtlich-ethischer Bedenken hat die irreversible Kompression keine breite praktische Anwendung finden können. Dafür verantwortlich ist unter anderem auch die Unklarheit, wie sich irreversible Kompression auf Nach- und Weiterverarbeitung (sog. Postprocessing) medizinischer Bilder, wie Segmentierung, Volumetrie oder 3D-Darstellung, auswirkt. Bisherige Studien zu diesem Thema umfassen vier verschiedene Postprocessing-Algorithmen. Die untersuchten Algorithmen zeigten sich bei verlustbehafteter Kompression im Bereich der erwähnten, publizierten Kompressionsraten weitgehend unbeeinflusst. Lediglich die computergestützte Messung von Stenosegraden in der digitalen Koronarangiographie kollidiert mit den in Großbritannien geltenden Empfehlungen. Die Verwendung unterschiedlicher Kompressionsalgorithmen schränkt die allgemeinernAussagekraft dieser Studienergebnisse außerdem ein.rnZur Erweiterung der Studienlage wurden vier weitere Nach- und Weiterverarbeitungsalgorithmen auf ihre Kompressionstoleranz untersucht. Dabei wurden die Kompressionsraten von 8:1, 10:1 und 15:1 verwendet, welche um die empfohlenen Kompressionsraten von CAR, DRG, RCR und ESR liegen und so ein praxisnahes Setting bieten. Als Kompressionsalgorithmus wurde JPEG2000 verwendet, aufgrund seiner zunehmenden Nutzung in Studien sowie seiner bereits erwähnten Vorzüge in Sachen Handhabung und Zusatzfunktionen. Die vier Algorithmen umfassten das 3D-Volume rendering von CT-Angiographien der Becken-Bein-Gefäße, die Computer-assistierte Detektion von Lungenrundherden, die automatisierte Volumetrie von Leberrundherden und die funktionelle Bestimmung der Ejektionsfraktion in computertomographischen Aufnahmen des Herzens.rnAlle vier Algorithmen zeigten keinen Einfluss durch irreversibler Bilddatenkompression in denrngewählten Kompressionsraten (8:1, 10:1 und 15:1). Zusammen mit der bestehenden Literatur deuten die Ergebnisse an, dass moderate irreversible Kompression im Rahmen aktueller Empfehlungen keinen Einfluss auf Nach- und Weiterverarbeitung medizinischer Bilder hat. Eine explizitere Vorhersage zu einem bestimmten, noch nicht untersuchten Algorithmus ist jedoch aufgrund der unterschiedlichen Funktionsweisen und Programmierungen nicht sicher möglich.rnSofern ein Postprocessing Algorithmus auf komprimiertes Bildmaterial angewendet werden soll, muss dieser zunächst auf seine Kompressionstoleranz getestet werden. Dabei muss der Test eine rechtlich-ethische Grundlage für den Einsatz des Algorithmus bei komprimiertem Bildmaterial schaffen. Es sind vor allem zwei Optionen denkbar, die Testung institutsintern, eventuell unter Zuhilfenahme von vorgefertigten Bibliotheken, oder die Testung durch den Hersteller des Algorithmus.

Analyse der T-Zellkreuzreaktivität bei Birkenpollenallergikern mit assoziierter Nahrungsmittelallergie

Eine Pollenallergie geht häufig mit einer sekundären Nahrungsmittelallergie einher, die durch die Kreuzreaktivität zwischen dem Pollen- und dem Nahrungsmittelallergen verursacht wird. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Kohorte von 20 Allergikern mit einer Typ I-Allergie gegen Birkenpollen und einer assoziierten Nahrungsmittelallergie gegen Haselnüsse und/oder Karotten in Bezug auf eine allergenspezifische IgE-Antwort, T-Zellantwort und vor allen Dingen hinsichtlich der T-Zellkreuzreaktivität zwischen den rekombinanten Allergenen Bet v 1, Cor a 1 und Dau c 1 charakterisiert. Verwendet wurde hierzu ein Zellkultursystem mit primären CD4+ T-Zellen ohne die Zugabe von exogenem IL-2 oder wiederholten Stimulationen. Zur Analyse der T-Zellkreuzreaktivität kamen zwei unterschiedliche Analyseverfahren zum Einsatz: zum einen der bewährte 3H-Thymidinassay und zum anderen eine neue durchflusszytometrische Methode, die auf der Verwendung von zwei unterschiedlichen Proliferationsfarbstoffen basiert.rnBei der Charakterisierung der T-Zellantwort konnte festgestellt werden, dass eine robuste Th2-Antwort vorliegt, die stark von dem Zytokin IL-5 dominiert wird, begleitet von einer signifikanten Produktion von IL-9 und IL-13, allerdings ohne die Beteiligung von IL-4.rnDes Weiteren konnte zum ersten Mal mit Hilfe eines dosisabhängigen Inhibitions-ELISA eine B-Zellkreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Cor a 1 gezeigt werden, wobei das Cor a 1-reaktive IgE prädominant ist und eine Subpopulation des Bet v 1-reaktiven IgE darstellt.rnMittels 3H-Thymidinassay konnte eine T-Zellkreuzreaktivität zwischen Bet v 1, Cor a 1 und in einem geringeren Maße zu Dau c 1 bei primären T-Zellen von Allergikern gezeigt werden. Ebenso konnte die Kreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Cor a 1 durch die neue durchflusszytometrische Methode bewiesen werden. Zusätzlich ist es mit Hilfe dieser neuen Methode nun möglich, zwischen den einzelnen T-Zellsubpopulationen zu unterscheiden, die sowohl nach primärer und sekundärer oder ausschließlich nach sekundärer Stimulation proliferieren. Es konnte festgestellt werden, dass die kreuzreaktiven T-Zellen aus der T-Zellsubpopulation hervorgehen, die bereits nach der primären Stimulations stark proliferiert haben. Somit kann also innerhalb des T-Zellrepertoires der allergischen Spender eine Prädominanz der kreuzreaktiven T-Zellsubpopulationen festgestellt werden. Eine monospezifische T-Zellsubpopulation konnte unter Verwendung der neuen Methode nicht detektiert werden.rnDas Ausmaß von Qualität und Quantität einer Kreuzreaktivität kann nun visualisiert werden, was dazu beitragen kann, das Protokoll einer SIT zu verbessern und optimal an den individuellen Patienten anzupassen, um möglicherweise eine größere Chance auf eine erfolgreiche Therapie in Aussicht zu stellen.

Funktionelle Analyse von intrazellulären Signalwegen bei der Migration der embryonalen peripheren Gliazellen von Drosophila melanogaster

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Signalwege untersucht, die an der Migration der embryona-len peripheren Gliazellen (ePG) beteiligt sind. Der Fokus lag dabei auf Myoblast city (Mbc). Zunächst wurden dazu unterschiedliche mbc Mutanten analysiert, bei denen es zu starken glialen Migrationsdefekten kommt. Um die auftretenden Phänotypen quantitativ zu analysieren, wurde eine Methode entwickelt um die Position der Pionierglia ePG9 zu bestimmen. Dies ermöglicht es, auch sehr subtile gliale Migrationsphänotypen zu detektieren. Durch knock-down Experimente konnte gezeigt werden, dass Mbc eine zellautonome Rolle bei der glialen Migration spielt. Besonders interessant ist die Tatsache, dass während der Migration der ePG eine alternativ gespleißte Isoform benötigt wird, die bisher kaum untersucht wurde. Durch Strukturvorhersagen konnte gezeigt werden, dass sich der Bereich in dem sich die beiden Isoformen unterscheiden, in einer Region liegt, die sich zu HEAT-repeats faltet. Mbc-PB scheint somit über einen Bereich zu verfügen, der im Vergleich zu Mbc-PA, zusätzliche Interaktionen erlaubt. Zudem scheint es mehrere Phosphorylierungsstellen zu geben, die für die Inaktivierung von Mbc-PB notwendig sind. Die Kinase Wallenda konnte als Kandidat identifiziert werden, der für die Phosphorylierung von Mbc-PB verantwortlich ist. Weitere Experimente zeigten eine einen zellautonomen Einfluss von Mbc-PB auf ePG7, die indirekt die Migration der Pionierglia ePG9 beeinflusst.

Analyse der Wirkung des Naturstoffes Oxacyclododecindion in einem chronisch-inflammatorischen Krankheitsmodell

Die medikamentöse Standardtherapie entzündlich-rheumatischer Erkrankungen wie der rheumatoider Arthritis (RA) und des systemischen Lupus erythematodes (SLE) sind oft unzureichend und erlauben keine nebenwirkungsarme beziehungsweise -freie Behandlung. Daher ist es von großem Interesse für diese Indikationsgebiete, wirkungsvolle Substanzen zu entwickeln, die für eine Langzeittherapie geeignet sind. Naturstoffe wie Oxacyclododecindion (Oxa) können dabei als mögliche Leitstruktur dienen. Oxa wurde bereits in in-vitro Untersuchungen als ein potenter Inhibitor der Expression von proinflammatorischen und profibrotischen Genen identifiziert. rnZiel dieser Arbeit war es in in-vivo Modellen der RA und des SLEs das therapeutische Potential des Naturstoffes Oxa aufzuklären. Da eine Etablierung der Kollagen-induzierten Arthritis im untersuchten murinen RA-Modell, dem HLA-DR4.AE° Stamm, nicht möglich war, wurden die Untersuchungen ausschließlich im MRL Faslpr Mausstamm, einem anerkannten SLE-Modell durchgeführt. MRL Faslpr Mäuse entwickeln wie SLE-Patienten unter anderem eine schwerwiegende Glomerulonephritis. rnIn den Nieren weiblicher MRL Faslpr Mäuse konnte die Oxa-Behandlung die Expression zahlreicher proinflammatorischer Mediatoren beeinflussen, die in Zusammenhang mit der Pathogenese des humanen SLE gebracht werden. So reduziert der Naturstoff die Expression von Zytokinen wie TNFα, IFNγ und IL6 als auch Chemokinen wie CCL2, CSF-1 und RANTES auf mRNA- und Proteinebene. Dabei war die Wirkung von Oxa in den in-vivo Analysen ähnlich gut wie die des potenten Glukokortikoids Dexamethason. Die Reduktion chemotaktischer Moleküle durch die Oxa-Behandlung führte nachweislich zu einer reduzierten Akkumulation von Immunzellen. Die anti-inflammatorischen und immunmodulatorischen Effekte von Oxa waren so ausgeprägt, dass klinisch-pathologische Marker der Glomerulonephritis, wie die Ablagerung von Immunkomplexen, die vermehrte Bildung von Kollagenfasern und die Ausscheidung von Proteinen im Urin gemildert wurden. Weiterführende Untersuchungen im SLE Modell konnten neue Zielmoleküle von Oxa identifizieren, wie KIM1 und zahlreiche SLE-assoziierte microRNAs (miR 19a, 29c und 369). Diese Befunde legen nahe, dass Oxa eine vielversprechende anti-entzündliche und -fibrotische Verbindung darstellt. rnDie Entschlüsselung des Wirkmechanismus von Oxa steht erst am Anfang. Die Analysen im Rahmen dieser Arbeit zeigten jedoch, dass Oxa einen Einfluss auf die Phosphorylierung und somit Aktivierung der p38 MAPK sowie auf die mRNA-Stabilität von proinflammatorischen Zytokinen wie TNFα zu haben scheint.rn