柏科植物雌球果发育的研究

在裸子植物系统学研究中，雌球果的形态与结构是最重要的性状之一。山于不同学者对裸子植物雌性生殖构造的形态学本质有着不同的见解，从而导致对该类群植物系统发育研究结果的差异。柏科在裸子植物中是唯一一个广布于南北两半球的科，前人对该科雌球果发育的研究涉及很少，为了进一步了解柏科植物雌球果的形态学本质，并为裸子植物传粉生物学和系统学的研究提供重要资料，本文选取了分布于北半球柏科中的7个属14个种，应用扫描电镜、半薄切片、石蜡切片及整体透明等方法，对其雌球果各部分的形态发生与发育过程作了详尽的研究，同时对传粉前后雌球果中的维管系统作了深入的分析。主要结果归纳如下： 1)雌球花苞片的形态、结构和排列方式等与叶相似;但传粉后，随着苞片基部的居间生长，其形态结构变得多样化： 2)在柏科了个属中，均未观察到种鳞发育，成熟球果的苞鳞得到充分发育; 3)各苞片腋内的胚珠发育过程，几乎是同时发育或呈向顶发育过程; 4)在圆柏属和柏木属球果顶端的苞片腋内也有胚珠发育，其它各属雌球花顶端的1-2对苞片腋内均没有胚珠发育; 5)在柏木属中，每一苞片腋内形成的胚珠数目较多，一般排成2-3行，同～苞片腋内的胚珠呈向基发育，同一行胚珠为离心发育; 6)圆柏属的雌球果发育呈现多种式样，其中包括由数枚侧生胚珠过渡到一枚顶生胚珠等情况; 7)柏科植物雌球花的维管系统在传粉前较为简单，即在苞片内仅具单一的维管束延伸到顶端，与营养芽相似。传粉后随着苞片基部的居间生长，其维管系统也随之复杂化。主要是在苞鳞内有新的维管束形成，一般是在苞鳞中间维管束的两侧各发出一束维管束，这两束维管束由球果轴发出的位置略高于中间一束，并在苞鳞基部迅速分枝，形成不同的排列式样。 成熟球果维管系统的排列方式与球果和苞鳞的形态有关，通常可分为三类：(1)具球形球果的种类，包括圆柏属、扁柏属、柏木属和福建柏属，其苞鳞内辐射状分枝的维管束形成两组，即～个具有木质部倒转的近轴系列和一个维管束J下常排列的远轴系列;(2)在苞鳞中只形成一组倒转的维管束，如侧柏属和翠柏属：(3)崖柏属雌球果的苞鳞中没有倒转的维管束形成。 观察结果表明：柏科植物雌球果均为复轴性构造，其球果中胚珠着生在球果轴上是由于苞片腋内种鳞退化的结果，因而不支持柏科植物雌球果的种鳞与苞鳞完全合生的观点。 通过对柏科植物雌球果发育的研究结果，也为探讨松杉类植物雌球果的演化趋势提供了重要线索。长期以来，众多研究者均认为，松杉类植物雌球果的演化趋势是种鳞和苞鳞逐渐合并的过程，但从柏科植物雌球果苞鳞腋内种鳞退化现象的发现表明，松杉类植物雌球果的演化趋势可能是一种种鳞逐渐退化的过程。柏科的种鳞已完全退化，而苞鳞则相对发育。 依据雌球果发育中胚珠发育顺序及苞鳞数目等特征，认为福建柏属最原始，而圆柏属则较为进化，其它各属则介于上述两属之间。 江泽平和王豁然(1997)提出，柏木亚科和澳洲柏亚科的主要区别在于球果可育苞鳞的着生位置，如前者球果顶部苞鳞没有胚珠发育，而后者则是球果顶部苞鳞腋内有胚珠发育。这一观点显然与柏木属和圆柏属的多数雌球果顶部的苞鳞腋内有种子产生的情况不相符合。 依据本文的研究的结果及前人对柏科和相近类群的研究资料，赞同保留独立的柏科和杉科;另外，以往侧柏曾被置于崖柏属中，但依据其雌球果苞鳞中有倒转的维管束发育，崖柏属的崖柏和北美香柏雌球果的苞鳞中均无倒转的维管束发育，我们支持其独立为侧柏属。

真菌诱导子对青蒿发根生长和青蒿素生物合成的影响及开花与青蒿素生物合成的相关性研究

本论文主要包括以下两部分内容： 一、真菌诱导子对青蒿发根生长和青蒿素生物合成的影响 用3种真菌诱导子[大丽花轮枝孢（Verticillium dahliae Kleb.）、葡枝根霉(Rhizopus stolonifer (Ehrenb. ex Fr.) Vuill)和束状刺盘孢(Colleto trichumdematium (Pers.) Grove)]分别处理青蒿(Ar temisia annuaL．)的发根，这3种真菌诱导子均能促进发根中青蒿素的合成，其中以大丽花轮枝孢的诱导效果最好;对细胞生长均没有明显影响。经大丽花轮枝孢处理的发根中青蒿素含量达1. 12 mg/gDW，比对照(0. 77 mg/g DW)提高45%。诱导子的作用效果与诱导子浓度、诱导子作用时间及发根的生长状态有关。对大丽花轮枝孢来说，诱导子作用的最适浓度为每毫升培养基含糖0.4 mg;发根在指数生长末期对诱导作用最敏感：在加入诱导子4d后收获发根，发根中的青蒿素含量最高。 二、早花基因FPF1、co对青蒿开花时间的影响及开花与青蒿素生物合成的相关性 1．将来源于拟南芥的早花基因Flowering Promoting Factorl (FPFl)插入到植物表达载体pBI121中，构建CaMV 35S启动子控制下含FPFl基因的植物表达载体pBI121FPF/，用含有pBI121FPF/质粒的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404感染青蒿(Artemisia annua L.)叶片并诱导丛生芽，经卡那霉素筛选，获得转基因抗性植株。PCR、 PCR-Southem blot及Southern blot检测表明，外源基因FPFI已整合到青蒿基因组中：RT-PCR及RT-PCR Southern blot分析表明，外源基因在转录水平上已有表达。在短日照条件下，FPF1转基因植株的开花时间较对照提前20天左右，但提早开花的转基因植株与未开花的对照其青蒿素含量无明显差异，即提早开花并不能使开花植株的青蒿素含量有所提高，开花与青蒿素合成之间可能没有直接的关系。 2．将拟南芥的早花基因CONSTANS (CO)置于CaMV 35S启动子之下，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404介导转入青蒿(Artemisia annuaL．)，使之在青蒿中表达，并得到了抗性植株。PCR、PCR-Southem blot及Southemblot检测表明，外源基因co已整合到青蒿基因组中;RT-PCR及RT-PCR Southemblot分析表明，外源基因在转录水平上已有表达。在短日照条件下，co转基因植株的开花时间较对照提前2周左右，但提早开花的转基因植株的青蒿素含量与未丌花的对照无明显差异，即植株开花前青蒿素含量的提高并不是由于开花本身引起的，再次证明，开花与青蒿素合成之间可能没有直接的关系。

烟草和衣藻中ftsZ 基因的克隆及功能分析

作为一种广泛存在于原核细胞中的原始的细胞骨架蛋白，FtsZ在植物中的发现为我们研究植物细胞中质体的分裂机制提供了可能。已有的研究证明了FtsZ与质体的分裂和形态维持有关，但高等植物中FtsZ在质体分裂和形态维持中的作用机制仍不十分清楚，同时高等植物中多个ftsZ成员的存在也使得对FtsZ功能的研究更加复杂。我们从烟草中克隆了两个ftsZ基因，序列和谱系分析表明二者均属于高等植物中的FtsZl基因家族，这也是首次在高等植物中发现多个FtsZl家族的成员。杂交分析表明ftsZ在烟草基因组中是以多拷贝形式存在，并且这两个基因具有相似的表达谱，这些结果暗示着高等植物中FtsZ在质体分裂中的作用更为复杂。GFP标记的原核定位表明二者具有与原核FtsZ类似的功能。此外，利用反义和正义表达的方法研究了二者在烟草质体分裂和形态维持中的作用。反义转化并未对烟草细胞叶绿体的数目和形态造成明显的影响，相反，二者的正义表达均导致细胞中叶绿体数目和形态上的明显变化，这一结果预示着二者在控制质体分裂和形态方面可能具有不同的功能。同时，这些结果也为高等植物中多样化的FtsZ可能具有除质体分裂之外的功能，如质体骨架．提供了证据。 　利用简并引物PCR和RACE从衣藻中扩增得到了一个ftsZ基因的部分cDNA序列，命名为CrFtsZ。序列分析表明该基因编码的蛋白具有FtsZ的典型特点，但同时还有一个与目前已知FtsZ均不同的突出c-末端：分子谱系分析认为CrFtsZ与线粒体进化祖先a -proteobacteria中的FtsZ有着共同起源，因此CrFtsZ可能是一个控制线粒体分裂的FtsZ。此外，CrFtsZ的c-端突出序列还具有目前已知真核生物线粒体分裂相关蛋白dynamin的某些特征，考虑到FtsZ在原核细胞分裂和真核细胞器分裂中的作用，我们推测CrFtsZ可能是FtsZ向dynamin过度的一种中间进化形式。这一发现为线粒体分裂机制的起源和进化提供了新的分子证据，对于认识真核线粒体分裂机制的起源与演化具有重要意义。

白扦的树木年轮生态学研究

树木年轮生态学是利用树木年轮来评价生态环境及其变化的学科，其基本依据是系列年轮宽度和结构特征的变化。一般情况下，半干旱草原的环境条件不适宜树木的生长，但在我国内蒙古锡林河流域的草原沙地上，存留着一片天然白扦林，它们被认为是第四纪早期的残遗植被。鉴于锡林河流域半干旱的环境条件已接近白扦的生存界限，此片残遗白扦林可认为是进行树木年轮生态学研究的理想材料。 本文应用树木年轮生态学的方法，结合木材解剖、气候资料、历史文献记录等，研究了这片残遗白扦林中白扦的生长与环境、年龄结构与环境干扰事件、白扦年轮宽度与羊草地上生物量的关系，以及全球变暖可能对该白扦林的影响等。主要结果归纳如下： 1)依据国际树木年轮库的标准，建立了65年的白扦标准年轮年表。年表的平均序列相关系数为0.47，信噪比为14.44，平均敏感度为0.18。白扦的年轮宽度年表与上年9月、当年2、5月份的降雨量之间存在显著的正相关关系。 2)通过对白扦年轮结构的观察确认，1966、1968、1972年存在高频率的窄年轮，这些年轮通常仅有两至三层晚材细胞，因此可以认为它是一类特殊的树木年轮一浅轮。 　3)白扦的年轮分析结果显示，锡林河流域的小片白扦林可能形成于20世纪20年代末至30年代初期。白扦年表( XLPI)与大青山(HHT)油松、准格尔旗(JGB)油松以及白云敖包(BYAB)红杆云杉年表之间存在显著的正相关关系;尤其值得提出的是，在20世纪20年代，HHT、JGB和BYAB年表都同时出现明显的生长下降现象。 　4)根据相关函数的分析，羊草的生长对当年5月份、7-8月份的降雨量较为敏感，与白扦的年轮宽度之间也存在两组显著的生长关系。基于这两种生长关系和白扦年轮宽度序列，本文重建了1955-1994年的羊草地上生物量动态。 5)当地气象资料显示，近40年来锡林河流域的年平均温度和各季节平均温度都呈增加的趋势，但只有夏季平均温度与白扦的年轮宽度之间存在显著的负相关关系。本文研究也发现白扦的生长与5月份的平均温度、平均最高温度以及5、6月份的极端最高温度之间存在着显著的负相关关系。 白扦标准年轮年表的统计特征表明，锡林河流域残遗白扦年轮序列包含丰富的环境信息，适合于树木年轮生态学的研究。白扦5月份开始生长，此时的降雨是最显著的生长限制因子，从而造成了白扦年轮年表与5月份降雨量之间的显著正相关关系。8-10月份，锡林河流域的降雨为全年降雨量的1/3，由于沙地土壤可以减少地面径流和有效防止土壤水分蒸发，所以此阶段内的降雨能存留在沙地内，以供笠年白扦生长发育的需要。因此，这种降雨分布和沙地基质的特征可能是白扦在年蒸发量为降雨量4-5倍的锡林河流域仍能正常生长的主要原因。 1966、1968和1972年浅轮的出现与前年和当年的特殊气候有关。气候资料的分析表明，这三年的上年生长季末至当年生长季都干旱少雨，并且生长季后期伴随着异常高温天气，这种干旱伴随高温的气候特点是造成白扦浅轮的主要因素。因此，白扦浅轮与亚北极区针叶树浅轮的发生机理是完全不同的，为迸一步研究浅轮的形成机制提供了新线索。 白扦年表与HHT、JGB和BYAB年表之间的年轮宽度变化的同步性显示，这些年表能间接地反映30年代以前造成白扦林较小年龄结构的环境干扰事件，降雨是华北半干旱区树木最突出的生长限制因子，在20世纪20年代，HHT、JGB和BYAB年表同时出现的生长下降，反映了该时期华北地区可能发生了大范围的旱灾，这一结论也为历史资料所证明。20年代白扦林的消失以及30年代后这片天然白扦林的重新出现表明了，20年代的旱灾可能是影响白扦年龄结构的主要干扰事件，它还有可能是造成白扦成片死亡的直接原因。 在锡林河流域，7-8月份是降雨最充沛的时期。相关分析表明，建群种羊草能充分利用这一水热配比最佳的时期快速生长，但白扦对当年7-8月份的降雨反应却不敏感，而与上年8-10月份的降雨量之间有显著的正相关关系。这些都证明白扦和羊草对半干旱草原环境具有不同的适应方式。羊草地上生物量与白扦年轮宽度之间的两组显著的关系可归结于两种季节降雨分配模式，它为利用白扦年轮宽度重建羊草的地上生物量的变化奠定了基础。羊草产量的重建不仅延长了锡林河流域草产量的记录，而且还开拓了用年轮宽度重建草产量的方法。 白扦年表与温度变量之间的相关分析进一步表明，不同季节温度的升高对白扦的生长产生不同的影响，尤其是夏季温度的变化，可以直接影响白扦的生长。白扦年表与5月份温度资料之间的相关分析还揭示，用月平均最高和最低温度来替代月平均温度更能说明温度变化对树木生长的影响。5、6月份是锡林河流域白扦形成层活动较旺盛的时期，因此，这期间极端高温严重影响白扦的生长。近40年来，随着大气温度的升高，白扦受到日益严重的干旱胁迫影响。如果大气变暖的趋势继续发展下去，最终将有可能导致这片残遗白扦林从锡林河流域消失

抗盐、耐海水蔬菜的生物技术培育与海水无土栽培应用

本研究是以植物起源于海洋的系统进化理论和植物细胞的全能性理论为依据的。 对芹菜(Apium graveolensL．)、油菜(B. rapa, chinese group)、叶用甜菜(Beta vulgaris(L.)Koch, Cicla group)、甘蓝(B. oleraceae, acephala group)、豆瓣菜(A'asturtiumofficinale R．Br*.）、番杏（Tetragonla expansa Ait.)、菠菜(Spinacia oleracea　L．)等蔬菜种类进行大规模种质资源筛选和鉴定， 从芹菜、油菜、叶用甜菜等植物中筛选出20多种能够耐受l%NaCI或1/3海水盐度的蔬菜品系。在耐盐蔬菜品种资源筛选的基础上，为了证明用生物技术提高盐敏感蔬菜耐盐性的可行性，本研究以植物体外培养细胞体系为操作平台，对盐敏感的蔬菜一一豆瓣菜进行了生物技术改造。一方面，筛选豆瓣菜的耐盐细胞变异体并使得耐盐细胞再生植株，获得了耐1/3海水的豆瓣菜变异体;另一方面，通过将盐生植物山菠菜(Atriplex hortensisL)的耐盐相关基因，甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因转入豆瓣菜，使得BADH基因在豆瓣菜中过量表达和积累甜菜碱，提高了豆瓣菜的渗透调节能力，从而提高了豆瓣菜的耐盐性。同时，本研究还将所获得的多种抗盐、耐海水蔬菜材料以海水无土栽培的方式进行生产和应用， 取得了很好的效果。 本文的结果证明了在陆地淡水栽培的蔬菜和野生蔬菜资源中，存在着部分耐盐性较强的蔬菜种质;通过生物技术改造能够提高盐敏感蔬菜的耐盐性，并获得抗盐、耐海水的蔬菜新品系。对这些抗盐、耐海水蔬菜材料进行1/3海水无土栽培应用的成功结果表明，某些陆地蔬菜具有重新适应海洋生境的潜能。

果实采后病害生物防治及其机理研究

　　分离和筛选了5种能有效防治采后果实病害的拮抗菌。其中，季也蒙假丝酵母(Candida guiliermondii(Cast) Langeroret Guerra)从引种拮抗菌中筛选获得，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B-912从土壤中分离筛选获得，膜醭毕赤酵母（Pichia membranefaciens hansen）从桃果实伤口上分离获得，隐球酵母(Cryptococcus albidus (Saito) Skinner)和丝孢酵母（Trichosporon sp.）从桃果实表面分离获得。本文主要研究了这些拮抗菌对桃、油桃、苹果、梨和柑桔等我国主要水果采后病害的防治效果，并对其可能的抑菌机理进行了初步研究。结果如下： 1. Sx108 CFU/mL的C．guiliermondii和P．membranefaciens悬浮液可完全抑制病菌孢子浓度为5x104个/mL时桃和油桃果实软腐病(Rhizopus stolonifer(Ehrenb.ex Fr.) Vuill.)在25℃，15℃和3℃下的发生。lx108 CFU/mL的C．albidus和Trichosporon sp.悬浮液可完全抑制孢子浓度分别为lx105个/mL和5x104个/mL时苹果灰霉病(Botrytis cinerea)和青霉病（Penicillum expansum）在23℃-25℃和1℃下的发生。C．albidus和Trichosporon sp.对梨灰、青霉病也有一定抑制效果。B-912对柑桔果实青霉病(Penicillium italicum)、绿霉病(Penicillium digitatum)和核果类果实褐腐病(Monilinia fructicola)也有极好的抑制效果。生物防治效果与拮抗菌的浓度成正比，与病菌孢子浓度成反比。 2．拮抗酵母菌在室温和冷藏条件下都能迅速在果实伤口定殖，接种酵母菌48 h后，数量可增加20倍以上。拮抗菌和病菌孢子的接种时间与生物防治效果有关，先接种拈抗菌的抑菌效果显著地好于同时或后于病菌接种的效果。 3．温度对拮抗酵母菌的抑菌活力没有明显影响，无论是在室温还是在冷藏条件下，拮抗酵母菌都有同样的抑菌效果。但拮抗细菌B-912的抑菌效果与温度有一定关系。较高的温度有利于细菌拮抗作用的发挥。 4．拮抗菌能与常规的果实采后处理措施如钙处理、化学杀菌剂、冷藏和气调贮藏相结合。酵母菌与2% CaC12配合能明显地增强其抑菌能力;拮抗菌与低浓度的杀菌剂如扑海因混合使用，可达到高浓度杀菌剂的抑病效果;C．albidus和Trichosporon sp.对果实采后气调贮藏环境有良好的适应性，它们在气调下对采后苹果、梨的灰霉病和青霉病的抑制效果比冷藏条件下的好。 5．细菌B-912的抑菌机理与其产生抗菌素有关，B-912的滤液在in vitro上能有效地抑制病菌孢子的萌发，在invivo上也能明显地抑制果实采后病害的发生。拮抗酵母菌的抑菌机理则较复杂，但主要与病菌竞争营养有关，同时，C．guilliermondii和P．membranefaciens对软腐菌的抑制还通过产生水解酶如β-1，3一葡聚糖酶和几丁酶与病原菌直接作用，并参与诱导寄主产生抗性等

水稻OsRAA1基因的克隆与功能分析

FPF1（flowering promoting factor1）蛋白最早在白芥中研究发现是开花促进因子, 可能参与了赤霉素的信号传导途径。它可以和AP1和LFY蛋白协同作用，促进茎顶端分生组织向花分生组织转化。本论文将AtFPF1基因转化水稻，转基因水稻抽穗时间只有微弱的提前。然而异源表达AtFPF1却抑制了转基因水稻根的生长，促进了成苗根系的发达。这些表型类似于我们克隆的水稻OsRAA1 （Oryza sativa Root Architecture Associated 1）的功能。这是首次报道AtFPF1/OsRAA1在水稻中具有控制根系发育的功能 生物信息学分析表明水稻OsRAA1基因定位于水稻1号染色体，它编码的蛋白推测分子量为12kD和AtFPF1有58%的同源。通过RNA原位杂交和OsRAA1基因启动子调控GUS基因表达的模式，证实OsRAA1基因主要在根尖的顶端分生区和伸长区，根尖分支区和幼侧根的中柱，侧根的原基表达。同时在幼穗分支顶端，根茎结合区的边周维管束，稃片，花药与花丝的结合区也有表达。OsRAA1在玉米泛素启动子驱动下组成型表达，可以抑制水稻初生根的生长，促进不定根的形成，部分植物形成不同程度螺旋状的初生根。这些表型和野生型水稻用生长素处理的表型类似。OsRAA1组成型表达，在成苗阶段，特别是孕穗前，大大促进叶片伸长，并导致部分小花败育。光学镜检表明OsRAA1组成型表达的水稻的花丝伸长过快，部分小花花药萎缩败育。剑叶表面细胞电镜扫描表明，OsRAA1组成型表达的水稻剑叶的硅化细胞比对照植株要长。野生型水稻根系生长素处理的Northern杂交和OsRAA1基因启动子调控GUS基因表达的水稻生长素处理后GUS活性染色表明，OsRAA1基因的转录受生长素诱导。而且OsRAA1组成型表达的水稻根的向地性反应减缓。这些结果表明，OsRAA1可能参与了生长素的信号转导途径。 与此同时，从基因序列数据库中，在很多植物中寻找到很多表达片段和FPF1/OsRAA1基因同源。从已有报道和我们的结果表明，在植物中可能普遍存在一个受赤霉素和生长素调控FPF1/OsRAA1基因家族，调控着植物各个器官的发育。

棉花抗黄萎病基因工程研究和防卫反应相关基因的克隆

系统获得性抗性(Systematic acquired resistance, SAR)是植物抵御病原菌侵染的最有效手段，利用基因工程技术导入SAR信号发生过程中的关键基因后，植物的SAR基因表达量提高并且对病原菌侵染的反应速度加快，因此植物的抗病性得以增强，与传统的抗病基因工程技术相比它对病原菌没有专一性，许多学者称之为广谱抗病基因工程，该领域已成为目前抗病基因工程研究的热点和前沿。 NDR1和NPR1基因在植物的SAR发生中起着重要的作用，前者功能定位在ROS(reactive oxygen species)的激活和随后的水杨酸(SA)诱导合成之间，突变株病原菌诱导后SA合成能力降低，SAR发生减弱，目前还没有对该基因进行过量表达分析的报道;后者功能定位在SAR信号转导级联反应之中的SA积累和随后的SAR基因表达之间。该突变株在病原菌侵染时不产生病程相关蛋白(PRs)，表现为感病，而对照抗病;过量表达该基因的转基因拟南芥对多种病原菌的侵染产生抗性，PR1等PRs蛋白的表达量也提高，异源表达该基因的水稻对白叶枯病的抗性也提高。本研究利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆了这两种基因，序列分析表明拟南芥Wassilewskija生态型的NDR1基因与Columbia生态型相比，共有7处碱基不同，引起编码氨基酸变化4处，而NPR1基因与报道的Wassilewskija生态型来源的NPR1基因完全相同。 我们构建了35S启动子驱动的NDR1和NPR1基因的植物组成型高效表达载体，利用农杆菌介导法转化烟草，PCR和Southern鉴定外源基因已经整合到植物基因组中。抗病性分析显示过量表达NDR1和NPR1基因的烟草对晚疫病和赤星病的抗性都有明显提高，说明这两个基因的在其它植物中异源表达后，都能提高植物对多种病原菌的抗性。 本论文提出了利用这两个基因来培育抗黄萎病棉花的设想，一方面为解决这个“世纪性”难题积累新的资料，另一方面也为其它作物的抗病基因工程提供新的经验。利用35S启动子驱动的NDR1和NPR1基因的植物组成型表达载体分别对陆地棉品种石远321进行花粉管通道法转化。同时，还探讨了这两个基因在棉花中的共转化实验，希望它们的“协同增效”能进一步提高棉花的抗病性。对其中2001年夏天在南京注射所获得的5,000粒种子在三亚进行100 g/ml卡那霉素筛选，初步鉴定分别获得转NDR1和NPR1基因株系26和24棵，PCR进一步鉴定其中分别有12和7棵为转基因阳性，转基因频率分别为0.50％和0.27％，目前利用营养钵蘸根法对其二代进行抗枯、黄萎病鉴定，结果显示有转基因植株对枯、黄萎病的抗性都明显增强，进一步的鉴定正在进行中。2002年初海南注射分别获得转NDR1和NPR1基因以及共转化种子22,000、10,500和12,500粒种子，2002年夏在中国农科院植保所黄萎菌病圃筛选抗黄萎病单株，并利用100 g/ml卡那霉素初步筛选出了一批抗性植株，每种转基因株系随机挑选5株进行PCR鉴定，结果显示为阳性。进一步的抗黄萎病鉴定和筛选以及分子分析正在进行中。 同时，本文还探讨了病原菌诱导型启动子在广谱抗病基因工程应用的可能性。根据烟草的Pr1-a启动子已知序列设计引物，PCR扩增启动子序列后,构建病原菌诱导型NPR1基因植物表达载体，并对棉花进行转化，获得种子11,500粒，利用同上的筛选方法，获得了一致的结果，目前抗黄萎病鉴定、分子检测以及生物学分析正在进行中。 最后，鉴于抗生素标记在转基因植物的应用引起了许多“安全性”争论的事实，还构建了无筛选标记的表达载体对抗虫棉进行转化，这样在生产上可以直接获得抗虫棉抗黄萎病棉花新材料，也为其它作物抗病基因工程积累经验。 本研究还提出了一种较为有效的提取高质量棉花总RNA的方法，与原来一些棉花RNA纯化方法相比，该方法所用都为常规试剂，易于重复，质量高。并且利用获得的总RNA构建了黄萎菌激发子诱导的cDNA文库，滴度测定为1╳107pfμ/μg，插入片段大小在5 00~2 000 bp范围内。 鉴于NPR1基因研究的重要性，本研究还利用简并引物PCR技术从海岛棉和陆地棉的基因组中都分离到了NPR1基因的同源片段，大小都为208 bp，与拟南芥NPR1基因的相应部分的同源性分别为66％和65％，它们之间的同源性为87％，目前该基因的全长正在分离鉴定中。 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)在植物的防御反应中起着重要的作用，通过分析已知20余种pgip基因序列的保守区，设计简并引物，PCR扩增海岛棉（Gossypium barbadense）7124 cDNA文库，得到一条长561 bp的片段，序列测定后分析确认为pgip基因的一部分。根据此序列和棉花病原菌诱导的cDNA文库载体中已知部分设计RACE引物，扩增后，5’和3’RACE分别得到666bp和906 bp的片段。序列分析表明它具有完整的编码框，产物为330 aa的蛋白质。序列分析该蛋白具有10个串联的LRR(leucine-rich repeat)区，与柑桔(Citrus)和枳(Poncirus)的pgip基因的同源性分别为69.2%和68.7%。进一步PCR扩增得到该基因的全长阅读框，并且获得了相应的基因组片段，序列分析发现该基因没有内含子。这是从棉属植物中克隆的第一个pgip基因。

玉米的单倍体育种及基因转化的研究

玉米的单倍体育种，是利用花药培养或孤雌生殖产生单倍体后，进行人工或自然加倍，迅速获得稳定的新品种的育种方法。单倍体育种可以缩短育种时间，单倍体培养体系如果作为转基因的受体，可保证外源基因在后代中稳定遗传，而不发生分离。因此，玉米单倍体育种无论在实践中还是在理论研究方面都具有重大的意义。 本文针对玉米花药培养中长期以来未能解决的诱导频率低、基因型之间差异大、小苗移栽不容易成活等问题，重点探讨了各种因素对玉米花药培养的影响。结果表明：不同基因型之间的诱导频率差异明显，杂交种的诱导频率比纯系高，并选择出诱导频率高达20%的材料“中0198”;接种时花药中的花粉处于单核中期时，其诱导频率最高;采用液体培养基比采用固体培养基诱导频率提高一倍;培养基中加入0.5%的活性炭，可使诱导频率由5.25%提高到9.35%;15%的蔗糖浓度对玉米的花药培养是最适宜的，培养2周后，将培养基的蔗糖浓度从15%调整为10%，将明显提高诱导频率;培养基中高浓度的KT和低浓度的BA有利于诱导体细胞胚的发生，而低浓度的KT和高浓度的BA有利于诱导芽的发生;接种前将花药在4℃条件下进行低温预处理，可将诱导频率从3.13%提高到11.71%;培养基中添加2 mg/l的多效唑，可有效地促进小苗的生根;再生植株于冬季拿到海南种植，可明显提高移栽的成活率。 在玉米孤雌生殖的实验中，将未受粉的玉米雌穗接种在成份为N6 + 2,4-D 1mg/L + NAA 1mg/L + BA 1mg/L + CH 200mg/L + colchicine 2 mg/L + sucrose 5% + agar 0.7% 的培养基上。第一轮实验共接种了三个材料的26个雌穗（约3900个未受精的子房）。每种材料均有单性结实，诱导频率由高到低分别3.06%，2.29%，1.90%。直接获得了5株再生植株，通过染色体检查，发现其中3株为单倍体（n=10），另外2株为二倍体。移栽到土壤中后，有4株成活，其中一株二倍体植株能够正常开花、结实。得到的种子播种于实验田中，表现整齐一致，有纯系的特征，而且出现了2株白化苗。通过石蜡切片初步观察了孤雌生殖的胚胎发生过程，发现胚胎发生是从胚囊里的单倍体细胞起源的。第二、三轮实验又接种了10个基因型的玉米材料，证实了上述结果。 外源基因转导是利用生物技术进行玉米育种的一个有效途径。本文首次尝试了用离体子房注射法对玉米进行基因转化。首先构建了含有开花促进因子基因FPF1及植物选择标记抗除草剂基因pat的植物表达载体pFBR，采用离体注射培养法，取授粉24小时后的玉米雌穗，剥去苞叶，在超净工作台进行微量注射，然后切成小块接种在培养基上，在光照培养箱内培养，3-4周可直接获得种子或小植株。种子萌发后进行植株抗性筛选和分子检测，共注射了3个品种的47个雌穗（约16450个子房）得到再生植株109株，其中经PPT筛选有抗性的植株为23株，占再生植株的21.1%。经PCR检测，13株植株有阳性反应。但Southern杂交检测有杂带出现。出现杂带的原因、RNA水平的分子检测、转基因后代T1代的分子检测和早开花农艺性状的观察，由于时间关系没有完成，还需要进一步的实验。实验初步证明了离体子房注射法对玉米进行基因转化的可行性，而且与田间注射法相比，此方法具有省力省时，容易控制污染，转化效率提高的优点, 克服了玉米培养再生植株受基因型限制的困境, 将为玉米分子育种的基因工程提供更易行的手段。 同时，也为子房较大的其它植物的基因转化提供了方法。

BADH基因转化番茄提高耐盐性的研究

甜菜碱是植物在盐、干旱或其它胁迫下在细胞中迅速积累的一种相容性有机小分子化合物，它在细胞中的积累与植物抗盐性的提高密切相关。甜菜碱醛脱氢酶（BADH）催化甜菜碱醛转化为甜菜碱。我们将来源于耐盐植物山菠菜（Atriplx hortensis L.）的BADH基因通过农杆菌介导法导入‘百丽春’番茄(Lycopersicon esculentum L. ‘Bailichun’)中，并获得15株转化植株，PCR、Southern和Northern检测表明，其中的6株有外源BADH基因的整合，5株中BADH基因能够正常表达，但不同植株间BADH基因的表达水平和BADH酶活力有较大差异。对叶片电导率的测定表明，转基因植株比野生型的耐盐性有较大提高。T1代分析表明，检测的两个转基因株系后代遵循孟德尔分离规律，90mmol/L NaCl胁迫下种子发芽率提高了2~4倍，幼苗的苗高、根长和须根数三个指标均明显优于对照。部分T1代植株在水培条件下能够耐受180mmol/L NaCl胁迫。 植物耐盐的另一机理就是利用液泡膜上存在的转运蛋白将细胞内的有毒离子区域化。我们将已转入编码转运蛋白基因AtNHX1的番茄品种‘Moneymaker’（L. esculentum‘Moneymaker’）株系X1OEA1通过农杆菌介导法转入山菠菜BADH基因，以期获得转双基因耐盐番茄。目前已获得转基因植株，PCR结果证明部分抗性幼苗中已整合了BADH基因，其它各项分子检测正在进行中。

几种作物非叶器官结构和功能的研究

本论文以小麦、水稻等几种重要经济作物为材料，应用透射电镜、扫描电镜、激光共聚焦显微镜以及氧电极，低温荧光等生理技术手段，对作物非叶器官的结构和主要生理特性进行了较全面和系统的研究。其中，比较分析了非叶器官叶绿体超微结构的差异，测量了非叶器官的放氧和低温荧光等生理指标，尝试从结构与功能相结合的角度，探讨非叶器官在提高作物产量中所起的重要作用。 首先以不同品种的小麦为实验材料，对其主要非叶器官－茎秆，从解剖结构、木质素含量、以及抗倒伏的力学特性等方面做了详细的比较研究。结果表明：高产小麦品种茎秆的秆壁厚度、茎截面积、机械组织厚度及细胞层数、维管束与其韧皮部的截面积等，均明显优于一般小麦品种。在茎秆薄壁组织细胞、机械组织细胞（厚壁组织细胞）和维管束的木质素含量上，高产品种也显著高于对照品种。另外，通过分析证明，小麦植株抗倒伏的能力与其茎秆高度、直径和髓腔直径等均有密切关系。因此，在超高产小麦品种的选育上，重视外源基因的引进，改进茎秆的结构特性及提高其木质素含量，可能是一个重要的选育方向。 气孔是植物器官吸收CO2 和放出O2 的主要通道，对光合作用的强弱有着决定性的作用。因此，对非叶器官表面气孔的研究显得尤为重要。通过对几种作物非叶器官气孔频度、气孔大小和气孔指数的研究，结果发现，非叶器官的气孔频度均较对应功能叶低;而气孔大小和气孔指数则变化较大。另外，本文还着重讨论了非叶器官气孔频度对作物光合作用的影响，并提出了在非叶器官中可能存在与此相适应的未知的光合类型 叶绿体是作物进行光合作用的场所，通过对小麦、水稻非叶器官及功能叶叶绿体超微结构的比较研究，发现非叶器官单个光合细胞中叶绿体的数量较少，体积也较小。其中小麦芒和颖片有发育较好的叶绿体结构，其基粒数可达普通叶的水平，但比旗叶少;外稃和穗轴都有完整的基粒跺叠，只是跺叠的数量较少;而内稃基粒少，基粒内囊体跺叠不整齐。随着小麦芒的衰老过程，其中叶绿体的数量也随之减少，并且这种减少的趋势在旗叶中先发生。非叶器官中叶绿体超微结构的这种变化和差异，暗示着非叶器官可能在作物的不同发育时期，对籽粒有重要作用。 通过对非叶器官和功能叶光合特性的比较研究，发现不同种作物非叶器官具有与功能叶不同的光合特性。在436nm 激发光下，非叶器官的F686／F734 明显高于旗叶;若以放氧为标准，比较功能叶和非叶器官的光合活性，发现以叶绿素为单位，非叶器官的放氧速率与旗叶相当，或甚至高于旗叶;以单穗为单位，最高可相当于旗叶的28％。另外，比较不同发育时期芒和旗叶的放氧速率，发现芒在作物的衰老后期，仍保持较高的光合活性。

青蒿素生物合成相关基因的克隆、大肠杆菌表达与分子分析

利用现代分子生物学和基因工程技术手段，克隆青蒿素生成途径的关键酶基因，研究关键酶基因对青蒿素生物合成的调控规律，是打破青蒿素生物合成的限速步骤，大幅度提高青蒿素含量，最终达到利用植物生物技术工业化生产青蒿素的目的必须解决的关键问题。本论文基于此目的，开展了青蒿素生物合成相关基因的分子克隆工作。 用RACE方法从青蒿高产株系001中克隆了一个新的1886bp的全长倍半萜合酶cDNA。克隆的倍半萜合酶氨基酸序列与烟草马兜铃烯合酶、莨菪岩兰螺旋二烯合酶、棉花杜松烯合酶的一致性分别为39%，38%和41%;与青蒿柏木脑合酶、紫穗槐二烯合酶和一个推测的倍半萜合酶克隆cASC125的一致性为50%，48%和59%。cDNA编码区序列被克隆进原核表达载体pET-30a，并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，但过量表达的蛋白主要是以不溶性蛋白形式存在。RT-PCR分析表明此基因在茎、叶和花中表达，在根中没有表达。 用RT/PCR方法从青蒿高产株系001中克隆了amorpha-4, 11-diene合酶cDNA。将该cDNA插入原核表达载体pET3d并在大肠杆菌BL21（DE3）中过量表达。Southern blot分析表明AMS基因在青蒿基因组中至少有3个拷贝。AMS基因组DNA有一个复杂的结构，包含有7个外显子和6个内含子。RT/PCR分析表明AMS基因在叶片、茎和花中表达，而在根中没有表达。 用RACE方法首次从青蒿中克隆了一个1539 bp全长鲨烯合酶cDNA。青蒿鲨烯合酶氨基酸序列与拟南芥、烟草、人类、酵母鲨烯合酶的一致性分别为70%、77%、44%、39%。青蒿鲨烯合酶基因组DNA有一个复杂的结构，包括14个外显子和13个内含子。全长的或C末端截短的鲨烯合酶cDNA被克隆进原核表达载体pET30a并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。但在含有全长的鲨烯合酶cDNA的大肠杆菌中并没有观察到预期大小的鲨烯合酶表达，而C末端截短30个疏水氨基酸的鲨烯合酶可在大肠杆菌中过量表达。

拟南芥AST基因的精细作图

拟南芥ast (anthocyanin spotted testa) 突变体是由碳离子束诱导产生的与花青苷生物合成有关的突变体，受单隐性核基因控制。由于花青苷的异常积累，突变体未成熟种子的种皮呈现紫红色的斑点;野生型植株幼嫩的种皮没有花青苷的异常积累，呈淡绿色。初步作图分析表明，AST基因定位于拟南芥第I号染色体上，并且位于SSLP分子标记nga280和CAPS分子标记PAB5之间。 AST基因与SSLP分子标记nga280紧密连锁，遗传距离为3.2cM;与CAPS分子标记PAB5相距较远，遗传距离为21.1cM。 采用DDRT-PCR的策略，分析野生型与突变型植株未成熟角果中基因表达的差异。通过调整DDRT-PCR中总RNA、锚定引物、随机引物、cDNA和dNTP等关键试剂的用量，优化了适用于银染检测的DDRT-PCR方法。PCR扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离后，银染能检测到多而清晰的条带。泳道中的条带数最少为40个，最多达80个，平均为60个，条带大小分布在100bp-900bp范围，银染的灵敏度为5pg/mm2。此方法操作简便快速，灵敏度高，重复性好。采用这个改良的的方法，分析了拟南芥野生型和ast突变型植株未成熟角果中16,000个cDNA扩增产物条带，从中筛选出28个差异条带。二次PCR扩增后，进一步筛选出10个差异表达的cDNA条带，其中6个是野生型特异表达的，4个是突变型特异表达的。对这10个差异片段进行测序。BLASTN分析表明，这10个差异表达的cDNA片段与数据库中花青苷生物合成途径中的结构基因和调节基因序列没有同源性，表明用DDRT-PCR的方法克隆特定的AST基因有一定的局限性。 利用图位克隆（map-based cloning）的策略，对拟南芥AST 基因进行克隆。根据拟南芥数据库中的SNPs (simple nucleotide polymophisms) 序列和插入/缺失多态性（insertion/deletion polymorphisms）序列，设计了一系列分子标记。利用这些分子标记，对600个F2代有突变表型的植株进行重组子筛选，完成了对拟南芥AST基因的精细作图，成功地将AST 基因定位到BAC克隆T13M11上。初步确定该BAC克隆中的基因T13M11.8 可能是AST基因。该基因的DNA序列长1432bp，含有6个外显子和5个内含子，编码的蛋白与花青苷生物合成途径中的二氢黄酮醇4-还原酶有较高的同源性。功能互补实验正在进行当中。

牛耳草光合作用的脱水保护和复苏机理

本文以复苏植物牛耳草成熟植株的离体叶片为实验材料，以光合作用、蔗糖、抗氧化剂系统和离子渗漏等在脱水复苏过程中的变化为切入点，从生理生化水平上探讨其耐脱水复苏的机制;同时应用mRNA差异显示技术，从分子水平上探讨其耐脱水复苏的机制。 牛耳草叶片光系统II光化学活性参数和叶黄素循环色素在脱水复苏过程中的变化结果表明，极微弱光强（3μmol.m-2.s-1）下，脱水8天的牛耳草叶片诱导了叶黄素循环，叶黄素循环可能介导了牛耳草叶片脱水过程中的光保护作用。 利用不同浓度的磷酸盐溶液处理牛耳草叶片的结果表明，0.1mol/L以上的磷酸盐溶液对牛耳草叶片具有损伤作用，极大的影响了其光系统II的光化学活性，使得牛耳草叶片在脱水后不能很好的复苏。 牛耳草叶片在脱水复苏过程中，抗坏血酸（AsA）、还原型谷胱甘肽（GSH）和蔗糖含量在脱水时很快增加，复苏时又迅速恢复到原来水平，表明它们可能对脱水的牛耳草叶片具有保护作用，但对复苏的牛耳草叶片可能不重要;其离子渗漏情况表明质膜结构的完整性和稳定性在脱水复苏过程中能得到很好的保持，这可能是其耐脱水复苏的重要机制之一。 利用mRNA差异显示技术分离到牛耳草叶片脱水过程中一些脱水和磷酸盐特异诱导表达的cDNA。对其中5个脱水特异诱导表达和3个磷酸盐特异诱导表达的cDNA进行克隆测序、同源性探测和Northern 杂交检测表明，牛耳草脱水过程中诱导表达的基因可能涉及到脱水胁迫的信号转导、调节基因的级联和结构基因产物调节细胞结构在脱水胁迫中的稳定性等。

利用转基因植物生产生物可降解塑料(PHB)的研究

聚 3 一控基丁酸酯 (Poly – 3 - hydroxybutyrate,PHB) 及其它类型的聚 3-泾基链烷酸醋同属于聚酯类物质 , 是自然界中多种细菌的碳源及能源储备物。这种聚酯的物理化学特性与传统塑料相似 , 并具有生物可降解性 , 如能取代化学合成塑料将减少环境中的塑料废弃物 , 从源头治理 " 白色污染 " 问题。微生物发酵法生产的 PHB 价格过高 , 无法在市场上与化学合成塑料竞争。随着分子生物学的发展 , 人们逐渐将视线转向植物生物反应器。转基因植物能够利用二氧化碳为碳源、太阳能为能源合成目的产物 , 大大降低生产成本 , 为生产具有市场 竞争力的新型生物可降解塑料提供可行途径。在此领域虽然己取得一定进展 , 但远未达到商业化生产水平。大规模商业化生产要求转基因植物能够在确保环 境安全性的前提下高效、稳定地生产 PHB 。本文尝试改善植物中 PHB 的生产体系 ,为环保型塑料早日进入市场作出努力。 1. 由于表达框架中多次使用同一启动子会导致基因沉默 , 本文克隆了另一 种子特异性启动子 nap300, 以替换重复使用的7S启动子,减轻“共抑制”。将 nap300 与 GUS 基因相连进行功能鉴定。荧光检测和组织化学染色的结果都证明此仅 30Obp 的 DNA 序列足以调控基因进行种子特异性表达。尽管 B 盒作为 高度保守区在种子特异性表达中起重要作用 , 位于此处的两个碱基替代型突变 并未使 nap300 的活性明显降低 , 对启动子的时空表达模式也无明显影响。将 nap300 、 7S 分别与 phbA 基因 ( 编码 3-酮硫裂解酶) 相连 , 在相似表达环境中 对二者功能进行比较 , 发现两个启动子表达模式基本相同并在同一时期达到活 性高峰 , 因此 nap300 可用于改善 PHB 合成基因在植物体内的表达调控。通过 对种子特异性启动子的比较可加深对其表达模式的了解 , 为植物基因工程中的 精细调控提供依据。 2. 叶绿体基因工程是随着植物遗传转化技术发展刚刚兴起的生物技术 , 具 有超量表达外源基因 , 为原核基因提供适宜表达环境 , 消除 “位置效应”和基因沉默 , 环境安全性好等优点 , 较更适合用于植物生物反应器方面的研究。本研究在国内率先探讨将叶绿体转化技术引入植物生产生物可降解塑料这一领域 的可行性 ( 国外仅有日本一例 ), 构建了叶绿体转化及表达载体 pTRV-PHB, 通过基因枪法将 PHB 合成相关基因导入烟草叶绿体基因组。转基因烟草顺利达到同质化，其形态和生长发育均无异常。 Northern 点杂交检测表明与 PHB 合成相关的三个基因均能在转录水平表达 , 未出现核转化中经常发生的“基因沉默”现象。通过 RT-PCR 进一步检测表明叶绿体型转基因烟草中目的基因的表达水平明显比核转化植株中相应基因的表达水平高。气相色谱分析确证转基因植株具有合成 PHB 的能力。这些都表明叶绿体转化适合用于转基因植物生产 PHB的研究。虽然叶绿体型转基因烟草中产物含量偏低 , 并未达到预期结果 , 但经进一步改进与完善 , 终将会成功地用于生产高附加值产品的植物基因工程中。 3. 为初步探讨叶绿体转化中在同源重组反应介导下整合外源基因的机理 , 从油菜叶绿体基因组中分离两段序列作为同源片段 , 基因枪法转化烟草 , 结果显示即使供体所含同源片段与受体叶绿体基因组相应区域差异高达 10%, 转化效率也无降低。这一现象的发现有助于促进“通用载体”　的改进 , 扩展叶绿体转化受体范围乃至达到商业化应用水平。 4. 成功地通过二次转化获得整合并表达多基因的转基因烟草 , 缩短了研究周期 , 对相关转基因植物的研究有一定参考价值。本文还优化了油菜转化体系 , 使转基因油菜同时整合三个 PHB 合成相关基因的效率由 7.69% 增加至 16.0% 。 田间试验与产物分析正在进行中。