Identification of HIV integration sites in infected host genomic DNA.

The integration of the Human Immunodeficiency Virus (HIV) genetic information into the host genome is fundamental for its replication and long-term persistence in the host. Isolating and characterizing the integration sites can be useful for obtaining data such as identifying the specific genomic location of integration or understanding the forces dictating HIV integration site selection. The methods outlined in this article describe a highly efficient and precise technique for identifying HIV integration sites in the host genome on a small scale using molecular cloning techniques and standard sequencing or on a massive scale using 454 pyrosequencing.

DNA methylation profiles of human active and inactive X chromosomes.

X-chromosome inactivation (XCI) is a dosage compensation mechanism that silences the majority of genes on one X chromosome in each female cell. To characterize epigenetic changes that accompany this process, we measured DNA methylation levels in 45,X patients carrying a single active X chromosome (X(a)), and in normal females, who carry one X(a) and one inactive X (X(i)). Methylated DNA was immunoprecipitated and hybridized to high-density oligonucleotide arrays covering the X chromosome, generating epigenetic profiles of active and inactive X chromosomes. We observed that XCI is accompanied by changes in DNA methylation specifically at CpG islands (CGIs). While the majority of CGIs show increased methylation levels on the X(i), XCI actually results in significant reductions in methylation at 7% of CGIs. Both intra- and inter-genic CGIs undergo epigenetic modification, with the biggest increase in methylation occurring at the promoters of genes silenced by XCI. In contrast, genes escaping XCI generally have low levels of promoter methylation, while genes that show inter-individual variation in silencing show intermediate increases in methylation. Thus, promoter methylation and susceptibility to XCI are correlated. We also observed a global correlation between CGI methylation and the evolutionary age of X-chromosome strata, and that genes escaping XCI show increased methylation within gene bodies. We used our epigenetic map to predict 26 novel genes escaping XCI, and searched for parent-of-origin-specific methylation differences, but found no evidence to support imprinting on the human X chromosome. Our study provides a detailed analysis of the epigenetic profile of active and inactive X chromosomes.

Crescimento micelial e síntese de proteínas de choque térmico em três isolados de fungos ectomicorrízicos sob condições de temperaturas supra-ótimas

A síntese de proteínas de choque térmico é uma alteração fisiológica transiente na célula de organismos expostos a temperaturas supra-ótimas. A resposta fisiológica ao choque térmico é dependente, particularmente, do tipo de célula e da capacidade dos organismos em responder às alterações do meio. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o crescimento micelial e a síntese de proteínas de choque térmico de dois isolados de Pisolithus sp. (RV82 e RS24) e de um isolado de Paxillus involutus em temperaturas supra-ótimas. No trabalho, foram feitas análises de crescimento micelial em placa de Petri com meio apropriado para o crescimento sob condições de temperaturas subletais, letais e de choque térmico. As proteínas nos micélios dos isolados foram marcadas com aminoácido radioativo (³H-leucina), e a radioatividade, quantificada em solução de cintilação. A síntese das proteínas de choque térmico (HSPs) foi avaliada em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE e 2D-PAGE). Demonstrou-se, com ³H-leucina, que os fungos ectomicorrízicos apresentaram respostas diferenciadas em relação ao crescimento micelial quando expostos a temperaturas supra-ótimas. Os dois isolados de Pisolithus sp., RS24 e RV82, mostraram-se mais tolerantes a altas temperaturas, quando comparado ao isolado de P. involutus. Os isolados de Pisolithus sp. diferem quanto à síntese de proteínas de estresse, com a síntese de HSPs de alta e de baixa massa molecular. Em resposta ao choque térmico, o isolado RV82 sintetizou proteínas putativas dos grupos HSP70, HSP28 e HSP26 e as sHSPs (15-18 kDa), enquanto o isolado RS24 sintetizou as dos grupos HSP86, HSP60, HSP55 e HSP35 e as sHSPs (12-18 kDa). A baixa tolerância a temperaturas elevadas do isolado de P. involutus foi atribuída à ausência de síntese de proteínas putativas do grupo HSPs em condições de choque térmico. Os resultados sugerem que os isolados de fungos ectomicorrízicos diferem quanto ao mecanismo de indução de termotolerância.

Interação de bactérias fluorescentes do gênero Pseudomonas e de Bacillus spp. com a rizosfera de diferentes plantas

Embora haja muitos trabalhos na literatura com rizobactérias promotoras do crescimento de plantas (RPCPs), existem poucos que expliquem seu mecanismo de ação. É possível que algumas rizosferas favoreçam a colonização radicular por RPCPs, facilitando o estabelecimento da interação planta-bactéria, como se houvesse certa especificidade entre ambas. O objetivo deste trabalho foi verificar se a rizosfera de alface, em comparação com a de outras espécies vegetais, favorece o estabelecimento de bactérias fluorescentes do gênero Pseudomonas, em comparação com as do gênero Bacillus. Coletaram-se amostras do sistema radicular de alface, rúcula, chicória, salsa e tiririca em oito propriedades de produtores comerciais de hortaliças, na região de Campinas, SP. Foi feita a contagem de Pseudomonas spp. fluorescentes e de Bacillus spp. por diluição em série e plaqueamento. De maneira geral, observou-se maior crescimento de Pseudomonas spp. fluorescentes na rizosfera de alface-crespa em relação à de outras plantas, mas isso não ocorreu com Bacillus spp.

DNA mismatch repair gene MSH6 implicated in determining age at natural menopause.

The length of female reproductive lifespan is associated with multiple adverse outcomes, including breast cancer, cardiovascular disease and infertility. The biological processes that govern the timing of the beginning and end of reproductive life are not well understood. Genetic variants are known to contribute to ∼50% of the variation in both age at menarche and menopause, but to date the known genes explain <15% of the genetic component. We have used genome-wide association in a bivariate meta-analysis of both traits to identify genes involved in determining reproductive lifespan. We observed significant genetic correlation between the two traits using genome-wide complex trait analysis. However, we found no robust statistical evidence for individual variants with an effect on both traits. A novel association with age at menopause was detected for a variant rs1800932 in the mismatch repair gene MSH6 (P = 1.9 × 10(-9)), which was also associated with altered expression levels of MSH6 mRNA in multiple tissues. This study contributes to the growing evidence that DNA repair processes play a key role in ovarian ageing and could be an important therapeutic target for infertility.

Novas bactérias diazotróficas endofíticas na cultura do trigo em interação com a adubação nitrogenada, no campo

Bactérias diazotróficas pertencentes a diferentes espécies podem estar associadas a gramíneas, como o trigo, promovendo incrementos no crescimento e na produtividade de grãos. Foi realizado um experimento, em condições de campo, com o objetivo de avaliar os benefícios e a viabilidade econômica da inoculação de novos isolados homólogos de bactérias diazotróficas endofíticas em genótipos de trigo sob diferentes doses de N. Foram empregados três isolados de bactérias diazotróficas endofíticas (IAC-AT-8-Azospirillum brasiliense, IAC-HT-11-Achromobacter insolitus e IAC-HT-12-Zoogloea ramigera), dois genótipos de trigo (ITD- 19-Triticum durum L. e IAC-370-Triticum aestivum hard L.) e três doses de N (0, 60 e 120 kg ha-1). Foram avaliados, no estádio de perfilhamento e de maturidade fisiológica, a matéria seca, o N acumulado e o índice de eficiência de utilização do N na parte aérea e na colheita; a produtividade de grãos, os componentes de rendimento e os índices de colheita para biomassa e N. No estádio de perfilhamento, somente houve aumento na produção de biomassa com a inoculação de Azospirillum brasiliense e Achromobacter insolitus no genótipo IAC-370, com a adição de N. Entretanto, não houve especificidade dos genótipos de trigo empregados e essas novas bactérias diazotróficas endofíticas para as demais caracaterísticas avaliadas. Houve aumento no acumulado de N na espiga com a inoculação de Azospirillum brasiliense. A inoculação de Achromobacter insolitus propiciou aumento da produtividade de grãos, na maior dose de N utilizada (120 kg ha-1). A inoculação, embora não tenha substituído a adubação nitrogenada, reverteu-se em lucro para o agricultor.

Respiratory chain dysfunction associated with multiple mitochondrial DNA deletions in antiretroviral therapy-related lipodystrophy.

Highly-active antiretroviral therapy (HAART) can induce a characteristic lipodystrophy syndrome characterized by peripheral fat wasting and central adiposity, usually associated with hyperlipidaemia and insulin resistance [1,2]. Indirect data have led some authors to propose that mitochondrial dysfunction could play a role in this syndrome [3,4].To date, as recently outlined by Kakuda et al. [5] in this journal, HIV-infected patients developing lipodystrophy have not been studied for mitochondrial changes or respiratory chain capacity...

Caracterização do dna ribossômico do isolado de Scleroderma UFSMSc1 de Eucalyptus grandis W. Hill ex-maiden

O ácido desoxiribunocléico ribossomal (rDNA) é utilizado como uma ferramenta importante para caracterizar o polimorfismo entre os fungos. Existem muitas cópias de rDNA as quais são arranjadas por espaços não codificados. Essas cópias são altamente conservadas entre espécies de fungos. O objetivo deste trabalho foi estudar a região do Espaço Interno Transcrito (ITS) e analisar as diferenças no polimorfismo da seqüência dessa região no fungo Scleroderma UFSMSc1 com seqüências dos isolados de Scleroderma e Pisolithus do banco de dados GenBank. O DNA do isolado de Scleroderma UFSMSc1 foi extraído por meio da solução de extração à base de CTAB. A partir do DNA, foram feitas reações de PCR com os oligonucleotídeos iniciadores universais ITS1 e ITS4, cujo produto amplificado foi purificado e seqüenciado. A região do ITS do fungo mostrou uma banda simples de aproximadamente 650 pares de base. Na análise da seqüência dessa região em comparação com algumas depositadas no GenBank, observou-se a formação de agrupamento com espécies de Scleroderma. Os resultados mostraram que essa técnica favorece a identificação de espécies de Scleroderma, visto que tais fungos são difíceis de ser identificados apenas por seus caracteres morfológicos.

Plant DNA barcodes and the influence of gene flow.

Success of species assignment using DNA barcodes has been shown to vary among plant lineages because of a wide range of different factors. In this study, we confirm the theoretical prediction that gene flow influences species assignment with simulations and a literature survey. We show that the genome experiencing the highest gene flow is, in the majority of the cases, the best suited for species delimitation. Our results clearly suggest that, for most angiosperm groups, plastid markers will not be the most appropriate for use as DNA barcodes. We therefore advocate shifting the focus from plastid to nuclear markers to achieve an overall higher success using DNA barcodes.

Simulations of action of DNA topoisomerases to investigate boundaries and shapes of spaces of knots.

The configuration space available to randomly cyclized polymers is divided into subspaces accessible to individual knot types. A phantom chain utilized in numerical simulations of polymers can explore all subspaces, whereas a real closed chain forming a figure-of-eight knot, for example, is confined to a subspace corresponding to this knot type only. One can conceptually compare the assembly of configuration spaces of various knot types to a complex foam where individual cells delimit the configuration space available to a given knot type. Neighboring cells in the foam harbor knots that can be converted into each other by just one intersegmental passage. Such a segment-segment passage occurring at the level of knotted configurations corresponds to a passage through the interface between neighboring cells in the foamy knot space. Using a DNA topoisomerase-inspired simulation approach we characterize here the effective interface area between neighboring knot spaces as well as the surface-to-volume ratio of individual knot spaces. These results provide a reference system required for better understanding mechanisms of action of various DNA topoisomerases.

Efeito da interação do nicosulfuron e chlorpyrifos sobre o banco de sementes e os atributos microbianos do solo

Considerando o período de competição de plantas daninhas e a incidência da lagarta-do-cartucho na cultura do milho, há necessidade de aplicação, em curto intervalo de tempo, de herbicidas e de inseticidas, principalmente o nicosulfuron e o chlorpyrifos. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da aplicação sequencial do nicosulfuron e do chlorpyrifos sobre a emergência de plântulas do banco de sementes, a taxa de desprendimento de CO2 (respiração basal) e o C da biomassa microbiana (CBM) do solo. Foi realizada aplicação sequencial, em solo, do nicosulfuron (doses de 0 a 64 g ha-1) associado ou não ao chlorpyrifos (0 e 240 g ha-1). Aos 20, 40 e 60 dias após a aplicação (DAA) dos produtos, todas as plântulas emergidas do banco de sementes foram identificadas em nível de espécie, sendo estimadas a frequência, densidade e abundância, além do índice de valor de importância (IVI). Aos 60 DAA, determinou-se também a taxa de desprendimento de CO2, o CBM e o quociente metabólico (qCO2), por meio da relação entre o CO2 acumulado e o CBM total do solo. A aplicação alterou severamente a massa de plântulas secas e o número de espécies nas doses superiores a 20 g ha-1 do nicosulfuron. Na presença do herbicida, as espécies com maior IVI foram Boehavia diffusa e Commelina benghalensis. Quanto aos bioindicadores do solo, foi observado decréscimo na taxa da respiração basal do solo com o aumento da dose aplicada do nicosulfuron associado ao chlorpyrifos, sem efeito na ausência do inseticida. Houve decréscimo linear no CBM em todos os casos, independentemente da aplicação do chlorpyrifos; entretanto, observou-se uma taxa de decréscimo 4,5 vezes maior para o solo que recebeu esse inseticida em conjunto com o nicosulfuron. A avaliação do qCO2 confirmou o efeito negativo da aplicação do inseticida e do herbicida. Conclui-se que a aplicação de chlorpyrifos + nicosulfuron promove impacto negativo sobre o banco de sementes e sobre a atividade microbiana do solo.

A common ancestor DNA motif for invertebrate and vertebrate hormone response elements.

The ecdysone-responsive DNA sequence of the Drosophila hsp27 gene promoter contains four direct and inverted repeats reminiscent of those that compose the vertebrate palindromic estrogen response element (ERE) and the thyroid hormone/retinoic acid response element (TRE/RRE). Interestingly, a 3 bp substitution in the wild-type Hsp27 ecdysone response element (EcdRE) increases both its similarity with the vertebrate ERE and TRE/RRE and its capacity to confer ecdysone responsiveness to a heterologous promoter. Remarkably, increasing the spacing between the inverted repeats of this strong EcdRE by two nucleotides converts it into an ERE. Inversely, decreasing the spacing between the two inverted repeats of the vertebrate consensus palindromic ERE, from three to one nucleotide, converts it into a functional EcdRE. Thus, the only difference between an invertebrate EcdRE and a vertebrate palindromic ERE or TRE/RRE is in the spacing between the conserved inverted repeated motifs forming these palindromic HREs. The finding that the sequence motif 5'-GGTCA-3' present in the vertebrate ERE and TRE/RRE is also a functionally important characteristic of an invertebrate HRE, suggests that a common ancestor regulatory DNA sequence gave rise to all HREs known so far. We discuss the possibility that this progenitor motif is the GGTCA sequence.

Mitochondrial DNA variation along an altitudinal gradient in the greater white-toothed shrew, Crocidura russula.

The distribution of mitochondrial control region-sequence polymorphism was investigated in 15 populations of Crocidura russula along an altitudinal gradient in western Switzerland. High-altitude populations are smaller, sparser and appear to undergo frequent bottlenecks. Accordingly, they showed a loss of rare haplotypes, but unexpectedly, were less differentiated than lowland populations. Furthermore, the major haplotypes segregated significantly with altitude. The results were inconsistent with a simple model of drift and dispersal. They suggested instead a role for historical patterns of colonization, or, alternatively, present-day selective forces acting on one of the mitochondrial genes involved in metabolic pathways.

The SOS screen in Arabidopsis: a search for functions involved in DNA metabolism.

The SOS screen, as originally described by Perkins et al. (1999) [7], was setup with the aim of identifying Arabidopsis functions that might potentially be involved in the DNA metabolism. Such functions, when expressed in bacteria, are prone to disturb replication and thus trigger the SOS response. Consistently, expression of AtRAD51 and AtDMC1 induced the SOS response in bacteria, even affecting E. coli viability. 100 SOS-inducing cDNAs were isolated from a cDNA library constructed from an Arabidopsis cell suspension that was found to highly express meiotic genes. A large proportion of these SOS(+) candidates are clearly related to the DNA metabolism, others could be involved in the RNA metabolism, while the remaining cDNAs encode either totally unknown proteins or proteins that were considered as irrelevant. Seven SOS(+) candidate genes are induced following gamma irradiation. The in planta function of several of the SOS-inducing clones was investigated using T-DNA insertional mutants or RNA interference. Only one SOS(+) candidate, among those examined, exhibited a defined phenotype: silenced plants for DUT1 were sensitive to 5-fluoro-uracil (5FU), as is the case of the leaky dut-1 mutant in E. coli that are affected in dUTPase activity. dUTPase is essential to prevent uracil incorporation in the course of DNA replication.