Ruolo dell'Enantiomero (R)-9-HSA nel controllo della proliferazione in una linea di Adenocarcinoma del Colon umano

9-hydroxystearic acid (9-HSA) is an endogenous lipoperoxidation product and its administration to HT29, a colon adenocarcinoma cell line, induced a proliferative arrest in G0/G1 phase mediated by a direct activation of the p21WAF1 gene, bypassing p53. We have previously shown that 9-HSA controls cell growth and differentiation by inhibiting histone deacetylase 1 (HDAC1) activity, showing interesting features as a new anticancer drug. The interaction of 9-HSA with the catalytic site of the 3D model has been tested with a docking procedure: noticeably, when interacting with the site, the (R)-9-enantiomer is more stable than the (S) one. Thus, in this study, (R)- and (S)-9-HSA were synthesized and their biological activity tested in HT29 cells. At the concentration of 50 M (R)-9-HSA showed a stronger antiproliferative effect than the (S) isomer, as indicated by the growth arrest in G0/G1. The inhibitory effect of (S)-9-HSA on HDAC1, HDAC2 and HDAC3 activity was less effective than that of the (R)-9-HSA in vitro, and the inhibitory activity of both the (R)- and the (S)-9-HSA isomer, was higher on HDAC1 compared to HDAC2 and HDAC3, thus demonstrating the stereospecific and selective interaction of 9-HSA with HDAC1. In addition, histone hyperacetylation caused by 9-HSA treatment was examined by an innovative HPLC/ESI/MS method. Analysis on histones isolated from control and treated HT29 confirmed the higher potency of (R)-9-HSA compared to (S)-9-HSA, severely affecting H2A-2 and H4 acetylation. On the other side, it seemed of interest to determine whether the G0/G1 arrest of HT29 cell proliferation could be bypassed by the stimulation with the growth factor EGF. Our results showed that 9-HSA-treated cells were not only prevented from proliferating, but also showed a decreased [3H]thymidine incorporation after EGF stimulation. In this condition, HT29 cells expressed very low levels of cyclin D1, that didn’t colocalize with HDAC1. These results suggested that the cyclin D1/HDAC1 complex is required for proliferation. Furthermore, in the effort of understanding the possible mechanisms of this effect, we have analyzed the degree of internalization of the EGF/EGFR complex and its interactions with HDAC1. EGF/EGFR/HDAC1 complex quantitatively increases in 9-HSA-treated cells but not in serum starved cells after EGF stimulation. Our data suggested that 9-HSA interaction with the catalytic site of the HDAC1 disrupts the HDAC1/cyclin D1 complex and favors EGF/EGFR recruitment by HDAC1, thus enhancing 9-HSA antiproliferative effects. In conclusion 9-HSA is a promising HDAC inhibitor with high selectivity and specificity, capable of inducing cell cycle arrest and histone hyperacetylation, but also able to modulate HDAC1 protein interaction. All these aspects may contribute to the potency of this new antitumor agent.

Il craniofaringioma nel bambino e nell'adolescente. Luci ed ombre durante il follow-up

Introduction. Craniopharyngioma (CF) is a malformation of the hypothalamicpituitary region and it is the most common nonglial cerebral tumor in children with an high overall survival rate. In some case severe endocrinologic and metabolic sequelae may occur during follow up. 50% of patients (pts), in particular those with radical removal of suprasellar lesions, develop intractable hyperphagia and morbid obesity, with dyslypidemia and high cardiovascular risk. We studied the auxological and metabolic features of a series of 29 patients (18 males) treated at a mean age of 7,6 years, followed up in our Centre from 1973 to 2008 with a mean follow up of 8,3 years. Patients features at the onset. 62% of pts showed as first symptoms of disease visual impairment and neurological disturbancies (headache); 34% growth arrest; 24% signs of raised intracranial pressure and 7% diabetes insipidus. Diagnosis. Diagnosis of CF was reached finally by TC or MRI scans which showed endo-suprasellar lesion in 23 cases and endosellar tumour in 6 cases. Treatment and outcome. 25/29 pts underwent surgical removal of CF (19 by transcranial approach and 6 by endoscopic surgery); 4 pts underwent stereotactic surgery as first line therapy. 3 pts underwent local irradiation with yttrium-90, 5 pts post surgery radiotherapy. 45% of pts needed more than one treatment procedure. Results. After CF treatment all patients suffered from 3 or more pituitary hormone deficiencies and diabetes insipidus. They underwent promptly substitutive therapy with corticosteroids, l-thyroxine and desmopressin. In 28/29 pts we found growth hormone (GH) deficiency. 20/28 pts started GH substitutive therapy and 15 pts reached final height(FH) near target height(TH). 8 pts were not GH treated for good growth velocity, even without GH, or for tumour residual. They reached in 2 cases FH over TH showing the already known phenomenon of growth without GH. 38% of patients showed BMI SDS >2 SDS at last assessment, in particular pts not GH treated (BMI 2,5 SDS) are more obese than GH treated (BMI 1,2 SDS). Lipid panel of 16 examined pts showed significative differencies among GH treated (9 pts) and not treated (7 pts) with better profile in GH treated ones for Total Cholesterol/C-HDL and C-LDL/C-HDL. We examined intima media thickness of common carotid arteries in 11 pts. 3/4 not GH treated pts showed ultrasonographic abnormalities: calcifications in 2 and plaque in 1 case. Of them 1 pt was only 12,6 years old and already showed hypothalamic obesity with hyperphagia, high HOMA index and dyslipidemia. In the GH treated group (7) we found calcifications in 1 case and a plaque in another one. GH therapy was started in the young pt with carotid calcifications, with good improvement within 6 months of treatment. 5/29 pts showed hypothalamic obesity, related to hypothalamic damage (type of surgical treatment, endo-suprasellar primitive lesion, recurrences). 48% of patients recurred during follow up ( mean time from treatment: 3 years) and underwent, in some cases up to 4 transcranial surgical treatments. GH seems not to increase recurrence rate since 40% of GH treated recurred vs 66,6% of not GH treated pts. Discussion. Our data show the extereme difficulties that occur during follow up of craniopharyngioma treated patients. GH therapy should be offered to all patients even with good growth velocity after CF treatment, to avoid dislypidemia and reduce cardiovascular risk. The optimal therapy is not completely understood and whether gross tumor removal or partial surgery is the best option remains to be decided only on one patient tumour features and hypothalamic involvement. In conclusion the gold standard treatment of CF remains complete tumour removal, when feasible, or partial resection to preserve hypothalamic function in endosuprasellar large neoplasms.

Generierung und Transduktion wachstumsnegativer Signale durch den Contactinhibin-Rezeptor

Generierung und Transduktion wachstumsnegativer Signale durch den Contactinhibin-RezeptorDie kontaktabhängige Wachstumshemmung, Kontaktinhibition, basierend auf der Interaktion von Contactinhibin (Ci) und seinem Rezeptor (CiR), reguliert das Zellwachstum. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Signalweiterleitung über den CiR.Der transformierende Wachstumsfaktor TGF-beta führt in den meisten Zelltypen wie die Kontaktinhibition zum Zellzyklusstopp in der G1-Phase. Um mögliche Interaktionen der beiden Signalkaskaden zu untersuchen, wurden humane Keratinozyten (HaCaT) mit einem dominant-negativen TGF-beta-Rezeptor Typ II stabil transfiziert. Das Ausschalten des TGF-beta-Signalweges resultierte in einer erhöhten Sättigungsdichte und Aufhebung der Kontaktinhibition. Die durch Kontaktinhibition induzierte Zunahme der Expression der TGF-beta-mRNA bestätigte die mögliche Interaktion der beiden Signalwege.In einem weiteren Ansatz sollte die Proteinkinase C (PKC) als möglicher Second Messenger der Kontaktinhibition untersucht werden. Die Herunterregulierung der PKC-Isoformen alpha, delta, epsilon und mu nach Langzeit-Behandlung mit 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat führte in humanen Fibroblasten (FH109) zu einer Reduktion der Kontaktinhibition. Nur durch Inkubation mit dem spezifischen Inhibitor der delta-Isoform Rottlerin konnte die Kontaktinhibition vollständig aufgehoben werden. Eine Beteiligung der PKC-delta in die Kontaktinhibition wurde dadurch bestätigt, daß sowohl die Stärke ihrer Proteinexpression als auch ihre intrazelluläre Verteilung über Zell-Zellkontakte reguliert wurde. Außerdem führte die transiente Transfektion von Maus-Fibroblasten, NIH3T3, mit einer dominant-negativen Mutante der PKC-delta zu einem transformierten Phänotyp.

Myc-mediated control of gene transcription in cancer cells

The Myc oncoproteins belong to a family of transcription factors composed by Myc, N-Myc and L-Myc. The most studied components of this family are Myc and N-Myc because their expressions are frequently deregulated in a wide range of cancers. These oncoproteins can act both as activators or repressors of gene transcription. As activators, they heterodimerize with Max (Myc associated X-factor) and the heterodimer recognizes and binds a specific sequence elements (E-Box) onto gene promoters recruiting histone acetylase and inducing transcriptional activation. Myc-mediated transcriptional repression is a quite debated issue. One of the first mechanisms defined for the Myc-mediated transcriptional repression consisted in the interaction of Myc-Max complex Sp1 and/or Miz1 transcription factors already bound to gene promoters. This interaction may interfere with their activation functions by recruiting co-repressors such as Dnmt3 or HDACs. Moreover, in the absence of , Myc may interfere with the Sp1 activation function by direct interaction and subsequent recruitment of HDACs. More recently the Myc/Max complex was also shown to mediate transcriptional repression by direct binding to peculiar E-box. In this study we analyzed the role of Myc overexpression in Osteosarcoma and Neuroblastoma oncogenesis and the mechanisms underling to Myc function. Myc overexpression is known to correlate with chemoresistance in Osteosarcoma cells. We extended this study by demonstrating that c-Myc induces transcription of a panel of ABC drug transporter genes. ABCs are a large family trans-membrane transporter deeply involved in multi drug resistance. Furthermore expression levels of Myc, ABCC1, ABCC4 and ABCF1 were proved to be important prognostic tool to predict conventional therapy failure. N-Myc amplification/overexpression is the most important prognostic factor for Neuroblastoma. Cyclin G2 and Clusterin are two genes often down regulated in neuroblastoma cells. Cyclin G2 is an atypical member of Cyclin family and its expression is associated with terminal differentiation and apoptosis. Moreover it blocks cell cycle progression and induces cell growth arrest. Instead, CLU is a multifunctional protein involved in many physiological and pathological processes. Several lines of evidences support the view that CLU may act as a tumour suppressor in Neuroblastoma. In this thesis I showed that N-Myc represses CCNG2 and CLU transcription by different mechanisms. • N-Myc represses CCNG2 transcription by directly interacting with Sp1 bound in CCNG2 promoter and recruiting HDAC2. Importantly, reactivation of CCNG2 expression through epigenetic drugs partially reduces N-Myc and HDAC2 mediated cell proliferation. • N-Myc/Max complex represses CLU expression by direct binding to a peculiar E-box element on CLU promoter and by recruitment of HDACs and Polycomb Complexes, to the CLU promoter. Overall our findings strongly support the model in which Myc overexpression/amplification may contribute to some aspects of oncogenesis by a dual action: i) transcription activation of genes that confer a multidrug resistant phenotype to cancer cells; ii), transcription repression of genes involved in cell cycle inhibition and cellular differentiation.

Schwerionenbestrahlung zwei- und dreidimensionaler Zellsysteme

Aufgaben der vorliegenden Untersuchungen waren die Etablierung von planaren Multilayern aus mensch­lichen Tumorzellen (WiDr und SiHa) und die Testung dieses Zellsystems als Bestrahlungsmodell solider Tumoren. Neben der konventionellen Röntgenbestrahlung (250 kV) wurde auch das Überle­ben nach Schwerionenbestrahlung (12C6+) und nach Behandlung mit dem Chemotherapeutikum Etoposid unter­sucht. Multilayer aus beiden Zelllinien zeigten ein geringeres Überleben nach Röntgen- und Schwerionenbestrah­lung als die entsprechenden Monolayer. Die hier beschriebene multizelluläre Sensitivierung steht aller­dings im Ge­gensatz zu der in der Literatur beschriebenen multizellulären Resistenz der Sphäroide, dem sog. Kontakteffekt. Nach durchflußzytometrischen Mes­sungen arretierten die bestrahlten SiHa-Zellen in der G2/M-Phase. Im Gegen­satz zum transienten Block der Monolayer verweilten die Multilayer in einem per­manenten Arrest. Im Vergleich zur Röntgenbe­strahlung verlän­gerte sich die Arrestzeit der Mono­layer nach Schwerionenbestrahlung im Bragg-Peak um 12-24 h. Auch waren mehr Zellen betroffen. Im Gegensatz dazu war kein Unterschied zwischen beiden Bestrahlungsmo­dalitäten bei den Multi­layern bis zum Ende des Beobachtungszeit­raumes zu verzeichnen. Nach Etoposid-Behandlung verhielten sich die Multilayer deutlich resistenter als die Monolayer. Somit zeigten Multilayer interessan­terweise nach Bestrahlung eine Sensitivierung und nach Etoposid-Behandlung eine Resistenz. Die Unterschiede im Überleben der beiden Kultivierungs­formen beruhen zum Großteil auf den Differenzen in der Zellzyk­lusverteilung. Besonders deutlich wurde dieser Zusam­men­hang zwischen Überleben und Zell­zyklusvertei­lung durch Wie­deraussaat- und Synchronisations-Experi­mente.

Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese

Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese Die Rezeptor-Tyrosinkinase ERBB2 ist in einer Vielzahl epithelialer Tumore, wie Mamma- und Ovarialkarzinomen, überexprimiert. Diese erhöhte Expression korreliert mit aggressivem Tumorwachstum, verstärkter Metastasierung und schlechter Prognose für den Patienten. Zur genaueren Untersuchung molekularer Mechanismen, die zur Tumorentstehung infolge der ERBB2-Überexpression führen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des Tet-Systems induzierbare MCF-7 Zelllinien generiert. Diese exprimieren bei Gabe von Doxyzyklin ERBB2 bzw. die zum humanen ERBB2 homologe und durch Punktmutation onkogen aktivierte Rattenvariante NeuT. Nachdem die stringente Regulierbarkeit durch Doxyzyklin für die untersuchten Zellklone gezeigt werden konnte, stellte sich bei der Charakterisierung der Zelllinien heraus, dass die Induktion von ERBB2 erstaunlicherweise nicht zur Proliferation der Zellen, sondern zum Wachstumsarrest führt. Bei der Untersuchung verschiedener Zellzyklusregulatoren konnte dieser Zellzyklusarrest dem CDK-Inhibitor P21 zugeordnet werden, dessen Expression durch ERBB2 induziert wird. In P21-Antisense-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass P21 eine Schlüsselrolle beim ERBB2-induzierten Zellzyklusarrest spielt. Neben der Induktion von P21 und der daraus resultierenden Wachstumsinhibition zeigten die Zellen starke morphologische Veränderungen und waren positiv beim Nachweis der Seneszenz-assoziierten -Galaktosidase. Erstmals konnte gezeigt werden, dass die Induktion des Onkogens ERBB2 nicht zur Proliferation, sondern zur Aktivierung eines verfrühten Seneszenz-Programms führt, welches der Zelle Schutz gegen die Onkogeneinwirkung bietet. Bei der Untersuchung verschiedener Signaltransduktionskaskaden mit Inhibitormolekülen konnte die Aktivierung dieses Seneszenz-Programms der Stress-aktivierten Proteinkinase P38 zugeordnet werden. Zur Identifizierung von Genen, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sind, wurde die differenzielle Genexpression eines NeuT-Klons nach 8- bzw. 48-stündiger Induktion mit Doxyzyklin in einem cDNA-Array untersucht. Dabei zeigte sich eine besonders starke Induktion von Integrin 5 und Integrin 1, die zusammen den Fibronektinrezeptor bilden. Der funktionale Nachweis des Rezeptors in einem Adhäsionsassay demonstrierte ein stark erhöhtes Adhäsionsverhalten ERBB2-überexprimierender Zellen an Fibronektin. Bei der Untersuchung von Mamma-, Ovarial- und Endometriumkarzinomen konnte die Expression von ERBB2 mit der von Integrin 5 korreliert werden. Diese Ergebnisse machen Integrin 5 zu einem potenziellen neuen Tumormarker und Therapieziel in ERBB2-überexprimierenden Tumoren. Ein weiteres interessantes Gen, das sich im Array durch ERBB2 überexprimiert zeigte, war die Matrix-Metalloproteinase MMP-9. In einem Zymografieassay konnte die erhöhte Gelatinaseaktivität von MMP-9 in Dox-induzierten Zellen nachgewiesen werden. Der Einsatz verschiedener Signaltransduktionsinhibitoren ergab, dass auch die ERBB2-induzierte Expression von MMP-9 über die Aktivierung von P38 läuft. Bei der Suche nach weiteren MMPs, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sein könnten, wurde MMP-13 untersucht. Erstmals konnte gezeigt werden, dass diese Matrix-Metalloproteinase von ERBB2 induziert wird. Dieser interessante Befund wurde auch in einem anderen Zellmodell in NIH3T3 Mausfibroblasten verifiziert. Durch ihre Matrix-degradierenden Eigenschaften sind MMPs potente „Werkzeuge“ für Tumorzellen und stellen ein wichtiges Ziel zur Unterbindung der Invasion und Metastasierung dieser Zellen dar. Neben den Zellkulturarbeiten wurden im Rahmen dieser Dissertation transgene Responder-Mäuse generiert, die NeuT unter Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors exprimieren. Von vier transgenen Gründerlinien zeigten zwei eine unerwünschte, basale NeuT-Expression, für die beiden anderen Linien konnte sowohl in MEF-Assays, als auch nach Kreuzung mit rtTA- bzw. tTA-Effektor-Mäusen eine Dox-abhängige Regulation des Transgens gezeigt werden. Die Tiere dieser Linien sollen in Zukunft mit Effektor-Mäusen gepaart werden, die den rtTA bzw. tTA spezifisch in für die ERBB2-Tumorgenese relevanten Geweben, wie Ovarial- oder Lungenepithelzellen, exprimieren. So können individuelle Tumormodelle für die verschiedenen epithelialen Tumore, bei denen die Überexpression von ERBB2 von Bedeutung ist, entwickelt und untersucht werden.

On the cellular stress response to Staphylococcus aureus alpha-toxin

Staphylococcus aureus alpha-hemolysin was the first bacterial toxin recognized to form pores in the plasma membrane of eukaryotic cells. It is secreted as a water-soluble monomer that upon contact with target membranes forms an amphiphatic heptameric beta-barrel which perforates the bilayer. As a consequence, red cells undergo colloidosmotic lyses, while some nucleated cells may succumb to necrosis or programmed cell death. However, most cells are capable of repairing a limited number of membrane lesions, and then respond with productive transcriptional activation of NF-kB. In the present study, by using microarray and semiquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), data from a previously performed serial analysis of gene expression (SAGE) were extended and verified, revealing that immediate early genes (IEGs) such as c-fos, c-jun and egr-1 are strongly induced at 2-8 h after transient toxin treatment. Activating protein 1 (AP-1: c-Fos, c-Jun) binding activity was increased accordingly. As IEGs are activated by growth factors, these findings led to the discovery that -toxin promotes cell cycle progression of perforated cells in an EGFR-dependent fashion. Although the amount of c-fos mRNA rose rapidly after toxin treatment, c-Fos protein expression was observed only after a lag of about 3 h. Since translation consumes much ATP, which transiently drops after transient membrane perforation, the suspicion arised that membrane-perforation caused global, but temporary downregulation of translation. In fact, eIF2α became heavily phosphorylated minutes after cells had been confronted with the toxin, resulting in shutdown of protein synthesis before cellular ATP levels reached the nadir. GCN2 emerged as a candidate eIF2α kinase, since its expression rapidly increased in toxin-treated cells. Two hours after toxin treatment, GADD34 transcripts, encoding a protein that targets the catalytic subunit of protein phosphatase 1 (PP1) to the endoplasmic reticulum, were overexpressed. This was followed by dephosphorylation of eIF2α and resumption of protein synthesis. Addition of tautomycetin, a specific inhibitor of PP1, led to marked hyperphosphorylation of eIF2α and significantly reduced the drop of ATP-levels in toxin-treated cells. A novel link between two major stress-induced signalling pathways emerged when it was found that both translational arrest and restart were under the control of stress-activated protein kinase (SAPK) p38. The data provide an explanation for the indispensible role of p38 for defence against the archetypal threat of membrane perforation by agents that produce small transmembrane-pores.

Untersuchung zum Einfluss der ACD-CPR mit während der Dekompressionsphase blockiertem Gasfluss (ITD) im Vergleich zur Standard-Reanimationstechnik auf die Kurzzeit-Überlebensrate von Patienten mit präklinisch aufgetretenem Herzkreislaufstillstand

Untersuchung zum Einfluss der ACD-CPR (Aktive Kompressions- Dekompressions-Reanimation) mit während der Dekompressionsphase blockiertem Gasfluss (Impedance-Threshold-Device) im Vergleich zur Standardreanimationsrechnik auf die Kurzzeit-Überlebensrate von Patienten mit präklinisch aufgetretenem Herzkreislaufstillstand. Die Studie vergleicht die ACD-ITD-CPR gegen die Standard-CPR bei Patienten mit präklinischem Herkreislaufstillstand. Primär untersuchter Parameter war die Ein-Stunden-Überlebensrate nach Krankenhausaufnahme. Sekundär wurden die Tastbarkeit eines Pulses unter CPR, die Wiederkehr des Spontankreislaufs (ROSC), die Rate an Krankenhausaufnahmen, 24-Stunden-Überleben und Krankenhausentlassungen untersucht. Außerdem wurde das neurologische Outcome evaluiert. Die Studie fand in Mainz statt; Mainz bietet sich für die Durchführung notfallmedizinischer Studien in besonderem Maße an. Der Rettungsdienst der Stadt arbeitet nach dem in Deutschland üblichen zweigliedrigen System mit RA/RS auf RTWs und NA auf NAW/NEF. Die Studie wurde nach einer fünfmonatigen Pilotphase und extensivem Training beider Verfahren durchgeführt. Zusätzlich bestanden bei einigen der Beteiligten schon Erfahrungen mit ACD-CPR. Es ergaben sich signifikante Vorteile der ACD-ITD-CPR gegenüber der Standard-CPR hinsichtlich des primär untersuchten Parameters (51% vs. 32% p=0,006), außerdem statistisch auffällige Vorteile hinsichtlich der Pulstastbarkeit unter CPR (85% vs. 69%, p=0,008), der Wiederkehr des Spontankreislaufs (55% vs. 37%, p=0,016), der Rate der Krankenhausaufnahmen (52% vs. 36%, p=0.023) und des 24-Stunden-Überlebens (37% vs. 22%, p=0,033). Es ergaben sich keine statistisch auffälligen Unterschiede hinsichtlich der Rate an Krankenhausentlassungen und im neurologischen Outcome. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die ACD-ITD die Kurzzeitüberlebensrate der Patienten mit außerklinischem Herzkreislaufstillstand verbessern kann. Eine Voraussetzung hierfür ist eine ausreichende und andauernde Ausbildung der beteiligten Helfer und/oder die Verfügbarkeit technisch verbesserter Lösungen. Weitere Untersuchungen zum Einfluss auf die Langzeitüberlebensraten und das neurologische Outcome scheinen angezeigt.

Immunoconiugati contenenti tossine vegetali o siRNA per la deplezione selettiva di cellule leucemiche. Preparazione, citotossicità e studi di mutagenesi sito-specifica.

CD33 is a myeloid cell surface marker absent on normal hematopoietic stem cells and normal tissues but present on leukemic blasts in 90% of adult and paediatric acute myeloid leukaemia (AML) cases. By virtue of its expression pattern and its ability to be rapidly internalized after antibody binding, CD33 has become an attractive target for new immunotherapeutic approaches to treat AML. In this study two immunoconjugates were constructed to contain a humanised single-chain fragment variable antibody (scFv) against CD33 in order to create new antibody-derived therapeutics for AML. The first immunoconjugate was developed to provide targeted delivery of siRNAs as death effectors into leukemic cells. To this purpose, a CD33-specific scFv, modified to include a Cys residue at its C-terminal end (scFvCD33-Cys), was coupled through a disulphide bridge to a nona-d-arginine (9R) peptide carrying a free Cys to the N-terminal. The scFvCD33-9R was able to completely bind siRNAs at a protein to nucleic acid ratio of about 10:1, as confirmed by electrophoretic gel mobility-shift assay. The conjugate was unable to efficiently transduce cytotoxic siRNA (siTox) into the human myeloid cell line U937. We observed slight reductions in cell viability, with a reduction of 25% in comparison to the control group only at high concentration of siTox (300 nM). The second immunoconjugate was constructed by coupling the scFvCD33-Cys to the type 1 ribosome inactivating protein Dianthin 30 (DIA30) through a chemical linking The resulting immunotoxin scFvCD33-DIA30 caused the rapid arrest of protein synthesis, inducing apoptosis and leading ultimately to cell death. In vitro dose-dependent cytotoxicity assays demonstrated that scFvCD33-DIA30 was specifically toxic to CD33-positive cell U937. The concentration needed to reach 50 % of maximum killing efficiency (EC50) was approximately 0.3 nM. The pronounced antigen-restricted cytotoxicity of this novel agent makes it a candidate for further evaluation of its therapeutic potential.

Modulation of hypoxia-inducible factors as a therapeutic target for multiple myeloma

Hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1α) plays a critical role in survival and is associated with poor prognosis in solid tumors. The role of HIF-1α in multiple myeloma is not completely known. In the present study, we explored the effect of EZN2968, an locked nucleic acid antisense oligonucleotide against HIF-1α, as a molecular target in MM. A panel of MM cell lines and primary samples from MM patients were cultured in vitro in the presence of EZN2968 . Under normoxia culture condition, HIF-1α mRNA and protein expression was detectable in all MM cell lines and in CD138+ cells from newly diagnosed MM patients samples. Significant up-regulation of HIF-1α protein expression was observed after incubation with IL6 or IGF-I, confirming that HIF-1α can be further induced by biological stimuli. EZN2968 efficiently induces a selective and stable down-modulation of HIF-1α and decreased the secretion of VEGF released by MM cell. Treatment with EZN2968 gave rise to a progressive accumulation of cells in the S and subG0 phase. The analysis of p21, a cyclin-dependent kinase inhibitors controlling cell cycle check point, shows upregulation of protein levels. These results suggest that HIF-1α inhibition is sufficient for cell cycle arrest in normoxia, and for inducing an apoptotic pathways.. In the presence of bone marrow microenvironment, HIF-1α inhibition blocks MAPK kinase pathway and secretion of pro-surviaval cytokines ( IL6,VEGF,IL8) In this study we provide evidence that HIF-1α, even in the absence of hypoxia signal, is expressed in MM plasma cells and further inducible by bone marrow milieu stimuli; moreover its inhibition is sufficient to induce a permanent cell cycle arrest. Our data support the hypothesis that HIF-1α inhibition may suppress tumor growth by preventing proliferation of plasma cells through p21 activation and blocking pro-survival stimuli from bone marrow microenvironment.

Role of Notch signalling in human hepatocellular carcinoma

The Notch signalling is a cellular pathway that results conserved from Drosophila to Homo sapiens controlling a wide range of cellular processes in development and in differentiated organs. It induces cell proliferation or differentiation, increased survival or apoptosis, and it is involved in stemness maintainance. These functions are conserved, but exerted with a high tissue and cellular context specificity. Signalling activation determs nuclear translocation of the receptor’s cytoplasmic domain and activation of target genes transcription. As many developmental pathway, Notch deregulation is involved in cancer, leading to oncogenic or tumour suppressive role depending on the functions exerted in normal tissue. Notch1 and Notch3 resulted aberrantly expressed in human hepatocellular carcinoma (HCC) that is the more frequent tumour of the liver and the sixth most common tumour worldwide. This thesis has the aim to investigate the role of the signalling in HCC, with particular attention to dissect common and uncommon regulatory pathways between Notch1 and Notch3 and to define the role of the signalling in HCC. Nocth1 and Notch3 were analysed on their regulation on Hes1 target and involvement in cell cycle control. They showed to regulate CDKN1C/p57kip2 expression through Hes1 target. CDKN1C/p57kip2 induces not only cell cycle arrest, but also senescence in HCC cell lines. Moreover, the involvement of Notch1 in cancer progression and epithelial to mesenchymal transition was investigated. Notch1 showed to induce invasion of HCC, regulating EMT and E- Cadherin expression. Moreover, Notch3 showed specific regulation on p53 at post translational levels. In vitro and ex vivo analysis on HCC samples suggests a complex role of both receptors in regulate HCC, with an oncogenic role but also showing tumour suppressive effects, suggesting a complex and deep involvement of this signalling in HCC.

Der Einfluss der Zellalterung auf die pathobiochemischen Prozesse von Morbus Alzheimer und weiteren neurodegenerativen Erkrankungen

Die am häufigsten auftretende altersassoziierte neurodegenerative Krankheit ist die Alzheimer Demenz. Ein mit entscheidender Schritt bei der Entstehung der Alzheimer Erkrankung ist wahrscheinlich die Produktion des Aβ-Peptids durch proteolytische Spaltung das Amyloid-Vorläuferproteins APP. In der vorliegenden Arbeit wurde die altersabhängige Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) in Fibroblasten von Hautbiopsien von Familiärer Alzheimer-, Trisomie21 und Niemann-Pick Typ C-Krankheit untersucht. Die in dieser Arbeit verwendeten Fibroblasten wurden bis zum Erreichen des zellulären Wachstumsstopps (replikative Seneszenz) seriell passagiert und die Untersuchungen erfolgten an Zellen aufsteigender PDL. Dabei zeigte sich, dass, unabhängig von dem durch die Krankheit vorliegenden genetischen biochemischen Hintergrund, die APP-Prozessierung im Laufe der Zellalterung progressiv verringert wird. Die altersabhängig ansteigenden Cholesterinspiegel führten zu einer Reduktion der APP-Reifung und infolge dessen nahmen sowohl die intrazellulären APP-Spaltfragmente (C99, C83 und AICD) als auch die extrazellulären APP-Fragmente (sAPPα, sAPP) ab. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die γ-Sekretase-Aktivität abnimmt. Dies war verbunden mit einem Rückgang der Proteinspiegel von Nicastrin und Presenilin, beides Komponenten des γ-Sekretase-Komplexes. Obwohl die Proteinexpression der α-Sekretase ADAM10 altersassoziiert konstant blieb, nahm die α-Sekretase-Aktivität mit steigendem Lebensalter ab. Erste Untersuchungen zeigten, dass die NAD+-abhängige Histon-Deacetylase SIRT1 eine wichtige Rolle im Bezug auf die α-Sekretase-Aktivität spielen könnte. Im Gegensatz zu den Abnahmen der α- und γ-Sekretase-Aktivitäten konnte eine erhöhte Aktivität der β-Sekretase in seneszenten Zellen beobachtet werden. Die mRNA-Menge und Proteinspiegel der ß-Sekretase BACE1 blieben dabei unverändert. Des Weiteren zeigte sich eine Zunahme der β-Sekretase-Aktivität bei Behandlung von jungen Zellen mit konditioniertem Medium seneszenter Zellen. Da sensezente Zellen einem Proliferationsstopp in der G1-Phase unterliegen, wurde der Einfluss des Zellzyklus-Inhibitors Aphidicolin auf die β-Sekretase untersucht. Hier wurde sowohl in IMR90 Fibroblasten als auch in Neuroblastoma-Zellen N2a eine Zunahme der β-Sekretase-Aktivität nach Zugabe der Inhibitoren beobachtet. Auch kommt es im Zuge der Alterung zu einer verstärkten Expression inflammatorischer Zytokine, die mit der Entstehung von Aβ-Peptiden in Verbindung gebracht werden. Deshalb wurde der Einfluss von Zytokinen auf die β-Sekretase-Aktivität untersucht. Die Zugabe von Interferon-γ und Interleukin 6 führte bei jungen IMR90-Zellen zu einem Anstieg der β-Sekretase-Aktivität, während bei alten Zellen keine Änderung zu verzeichnen war.

Molekulare Mechanismen der Kontaktinhibition: Identifizierung neuer Tumorsuppressorgene

Die Zellen eines Organismus unterliegen ständig den Einflüssen wachstumsfördernder und –hemmender Signale. Die korrekte Verarbeitung dieser Signale ist essentiell für die Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase. Wachstumsfördernde Signale sind z. B. Wachstumsfaktoren und –hormone. Diese Substanzen sowie ihre Rezeptoren und Signalwege sind relativ gut erforscht. Dagegen ist über die wachstumshemmenden Signalwege vergleichsweise wenig bekannt. Wichtige wachstumshemmende Signale werden einerseits über lösliche Faktoren, wie z. B. TGF-β, und andererseits über Zell-Zell-Kontakte vermittelt. Den Zell-Zell-Kontakt vermittelten Wachstumsstopp bezeichnet man auch als Kontaktinhibition. Die Kontaktinhibition ist ein wichtiges Merkmal nicht-transformierter Zellen. Im Gegensatz dazu zeichnen sich transformierte Zellen durch den Verlust der Kontaktinhibition aus, der einhergeht mit unkontrolliertem Wachstum der Zellen und Tumorbildung. Genauere Kenntnisse der molekularen Ursachen der Kontaktinhibition bzw. ihres Verlustes während der Tumorentstehung werden neue Ansatzpunkte für die Krebstherapie liefern. Diese können bei der Entwicklung neuer, nebenwirkungsärmerer Krebsmedikamente und einer verbesserten Diagnostik helfen. In der vorliegenden Arbeit sollten daher die molekularen Mechanismen der Kontaktinhibition in Fibroblasten aus der Maus näher untersucht werden. Dazu wurden differentielle Genexpressionsanalysen mittels genomweiter Microarrays durchgeführt. Weiterhin wurde der Einfluss der Kontaktinhibition auf die Regulation der Signalkaskaden der MAP-Kinasen ERK und p38 untersucht. Durch die Genexpressionsanalyse konnte gezeigt werden, dass viele Schlüsselgene des Zellzyklus und der DNA-Synthese in der Kontaktinhibition eine Rolle spielen, so zum Beispiel Skp2, Foxm1 und einige Komponenten des MCM-Komplexes. Weiterhin haben wir gezeigt, dass durch Kontaktinhibition selektiv die EGF-induzierte Signalkaskade über die MAP-Kinasen gehemmt wird.

Bedeutung von Rho-GTPasen bei der Regulation zellulärer Antworten auf genotoxischen Stress

SAPK/JNK regulieren nach genotoxischem Stress eine Vielzahl von Zielsubstraten, die bedeutsam für Reparatur und Überleben der Zelle sind, somit nehmen sie Einfluss auf das zelluläre Schicksal der Zelle. Ob DNA-Schäden eine Phosphorylierung von Stress-Kinasen nach sich ziehen ist bisher noch wenig untersucht. Mit reparaturdefizienten Zellen wurde der Einfluss von DNA-Schäden, durch Cisplatin/Transplatin/UV-C, auf die SAPK/JNK Aktivierung untersucht. Die Aktivierung der Stress-Kinasen erfolgte agenzspezifisch und abhängig von verschieden Reparaturfaktoren. Die Aktivierung korrelierte in reparaturdefizienten Zellen teilweise mit dem späten Auftreten von DNA-Strangbrüchen, war jedoch unabhängig von erhöhten initialen DNA-Schäden. Diese Befunde zeigten, dass die späte Aktivierung der SAPK/JNK DNA-schadensabhängig verläuft und das Cisplatin und Transplatin bei Verwendung von äquitoxischen Dosen zu einer vergleichbaren Aktivierung von SAPK/JNK führten. Die Hemmung der Rho-GTPasen sowohl durch Statine als auch mittels Clostridium difficile Toxin B zeigte weiterhin, dass Rho-GTPasen möglicherweise die späte DNA-schadensabhängige Aktivierung der Stress-Kinasen vermitteln. Die Hemmung von Rho-GTPasen durch physiologisch relevante Konzentrationen von Statinen führte in primären humanen Endothelzellen (HUVECs) zu einer Protektion vor IR-Strahlung und Doxorubicin. In beiden Fällen konnte eine Hemmung des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors p53 sowie der Chk1, welche einen Zellzyklusarrest reguliert, mit der Statin-Behandlung erreicht werden. Effektor-Caspasen wurden dabei durch den HMG-CoA-Reduktase Hemmer nicht beeinflusst. Ausschließlich bei dem Statin-vermittelten Schutz vor Doxorubicin kam es zu einer Reduktion von initialen DNA-Schäden, in Form von DNA-Strangbrüchen. Die IR-induzierten Strangbrüche in der DNA blieben von der Statin-Inkubation hingegen unbeeinflusst. Aufgrund ihrer protektiven Eigenschaften gegenüber IR- und Doxorubicin-induzierter Zytotoxizität in Endothelzellen und ihrer pro-apoptotischen Wirkung auf Tumorzellen könnten Statine möglicherweise die unerwünschten Nebenwirkungen von Zytostatika und einer Strahlentherapie günstig beeinflussen

Untersuchungen zum Mechanismus der Zytotoxizität von alkylierenden Agenzien in malignen Melanomzellen

Maligne Melanome sind gegenüber Chemotherapeutika relativ resistent. Das methylierende Alkylanz Temozolomid sowie das chlorethylierende und DNA-Interstrand Crosslink (ICL) bildende Alkylanz Fotemustin kommen bei der Behandlung des malignen Melanoms als Mittel erster Wahl zum Einsatz. In der vorliegenden Arbeit konnte das erste Mal nachgewiesen werden, dass die zytotoxische Wirkung von Temozolomid und Fotemustin in Melanomzellen durch Apoptose vermittelt wird. Unter Verwendung klinisch relevanter Dosen der beiden Alkylantien konnte die Induktion von Apoptose durch vier unabhängige Methoden (Bestimmung der SubG1-Fraktion und der Apoptose- / Nekrose-Frequenz, Aktivierung der Effektorcaspasen-3 und -7 sowie Spaltung von PARP-1) nachgewiesen werden. Die Alkylierungen an der O6-Position des Guanins, welche durch beide Agenzien induziert werden, sind auch in Melanomzellen die wichtigsten Zytotoxizität-bewirkenden Läsionen in der DNA, und die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) ist folglich ein herausragender Resistenzmarker. Eine der verwendeten Zelllinien (D05) exprimierte p53-Wildtypprotein. Diese Zelllinie war resistenter als alle anderen Zelllinien gegenüber Temozolomid und Fotemustin. Dies weist darauf hin, dass p53 nicht die Apoptoseinduktion in Melanomzellen verstärkt. Die Prozessierung des O6MeG erfolgt über die Mismatch-Reparatur (MMR) unter Generierung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs). Die Untersuchung der durch Temozolomid induzierten DSBs, nachgewiesen durch gammaH2AX-Induktion, korrelierte direkt mit der apoptotischen Antwort von Melanomzelllinien und DSBs können somit als eine entscheidende apoptoseauslösende Größe angesehen werden. Eine Resistenz gegenüber dem methylierenden Temozolomid in der Zelllinie MZ7 konnte auf einen Defekt in der MMR-Schadenserkennung auf der Ebene des MutSalpha-Komplexes zurückgeführt werden. Dieser Defekt hatte keinen Einfluss auf die Fotemustin-vermittelte Apoptoseinduktion. Neben MGMT konnte somit die MMR als Resistenzfaktor gegenüber methylierenden Agenzien in Melanomen identifiziert werden. Die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde in Melanomzelllinien im Detail untersucht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass Fotemustin-bedingte ICLs in Zellen einen G2/M-Arrest im Behandlungszyklus induzieren. Wie anhand G1-arretierter Zellen nachgewiesen werden konnte, war das Durchlaufen der DNA-Replikation vor Erreichen des Arrests für die Induktion der Apoptose notwendig. Die Prozessierung von ICLs ist im Vergleich zu Methylierungen der DNA deutlich komplexer. Dies könnte erklären, warum in Melanomzellen die durch gammaH2AX-Induktion repräsentierten DSBs nicht mit der Sensitivität der einzelnen Zelllinien korreliert. Die Untersuchung unterschiedlich sensitiver Zelllinien zeigte ein vergleichbares Schadensniveau an ICLs und eine ebenso vergleichbare initiale Prozessierung derselben unter Generierung von DSBs. Die Prozessierung dieser sekundären Läsionen, welche anhand der Abnahme von gammaH2AX-Foci untersucht wurde, war hingegen in der sensitiveren Melanomzelllinie deutlich weniger effektiv. Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass eine uneffektive Prozessierung der sekundären Läsionen einhergeht mit einer verstärkten und länger anhaltenden Aktivierung der in der DSB-Detektion beteiligten Kinase ATM und der Checkpoint Kinase 1. Es wäre daher denkbar, dass eine verstärkte Aktivität dieser Kinasen proapoptotische Signale vermittelt. Unterschiede in der Prozessierung der sekundären Läsionen könnten somit ein wichtiger Marker der ICL-induzierten Apoptose darstellen. Des weitern konnte nachgewiesen werden, dass nach Fotemustingabe die mitochondrial-vermittelte Apoptose einen effektiven Exekutionsweg in Melanomen darstellt. Während Cytochrom C-Freigabe, Bcl-2-Abnahme an den Mitochondrien, Bax-Rekrutierung und Caspase-9 Aktivität nachgewiesen werden konnten, wurden keine Hinweise auf eine Fas-Rezeptor-vermittelte Apoptose gefunden. Die Unfähigkeit, Rezeptor-vermittelte Apoptose zu unterlaufen, könnte die Bedeutungslosigkeit des p53-Gens in Melanomen begründen, da gerade dieser Weg in der Alkylantien-induzierten Apoptose in anderen Zellsystemen eine große Relevanz besitzt. Bei der Suche nach einem alternativen proapoptotischen Signalweg konnten Hinweise für die Beteiligung des Rb/E2F-1-Wegs, welcher über p73 agiert, in einer p53-mutierten Melanomzelllinie gefunden werden. Einen Einfluss der Proteine Survivin und XIAP als Resistenzfaktoren auf die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde hingegen nicht nachgewiesen.