miRNAs as therapeutic agents in neurodegeneration, a pilot study

L’échec des différents essais cliniques souligne la nécessité de développer des nouvelles thérapies pour la maladie d’Alzheimer (MA), la cause la plus commune de démence. Les microARNs (miARNs) sont les ARNs non-codants les plus étudiés et ils jouent un rôle important dans la modulation de l’expression des gènes et de multiples voies de signalisation. Des études antérieures, dont celles de mon laboratoire d’accueil, ont permis de développer l’hypothèse que certains membres de la famille miR-15/107 (c.-à-d. miR-15ab, miR-16, miR-195, miR-424, and miR-497) pourraient être utilisés comme agents thérapeutiques dans MA. En effet, cette famille avait le potentiel de réguler de multiples gènes associés à MA, tels que la protéine précurseur de l’amyloïde (APP), la β-secrétase (BACE1), et la protéine Tau. Tel que démontré dans ce projet de thèse, j’ai choisi miR-16 comme cible thérapeutique potentielle pour MA parmi tous les membres de la famille. L’essai luciférase dans ce projet confirme que miR-16 peut réguler simultanément APP et BACE1, directement par une interaction avec la région non-codante en 3’ de l’ARNm). Notamment, nous observons aussi une réduction de la production des peptides amyloïdes et de la phosphorylation de Tau après une augmentation de miR-16 en cellule. J’ai ensuite validé mes résultats in vivo dans la souris en utilisant une méthode de livraison de miR-16 via une pompe osmotique implanté dans le cerveau. Dans ce cas, l’expression des protéines d’intérêts (APP, BACE1, Tau) a été mesurée par immunobuvardage et PCR à temps réel. Après validation, ces résultats ont été complémentés par une étude protéomique (iTRAQ) du tronc cérébral et de l’hippocampe, deux régions associées à la maladie. Ces données m’ont permis d’identifier d’autres protéines régulées par miR-16 in vivo, incluant α-Synucléine, Transferrine receptor1, et SRm300. Une autre observation intéressante : les voies régulées par miR-16 in vivo sont directement en lien avec le stress oxydatif et la neurodégénération. En résumé, ce travail démontre l’efficacité et la faisabilité d’utiliser un miARN comme outil thérapeutique pour la maladie d’Alzheimer. Ces résultats rentrent dans un cadre plus vaste de découvrir de nouvelles cibles pour MA, et en particulier la forme sporadique de la maladie qui représente plus de 95% de tous les cas. Évidemment, la découverte d’une molécule pouvant cibler simultanément les deux pathologies de la maladie (plaques amyloïdes et hyper phosphorylation de tau) est nouvelle et intéressante, et ce domaine de recherche ouvre la porte aux autres petits ARNs non-codants dans MA et les maladies neurodégénératives connexes.

Étude de l'expression des microARNs et des enzymes de synthèse des corticostéroïdes dans le développement pulmonaire

Le syndrome de détresse respiratoire du nouveau-né (SDR) est l’une des pathologies les plus fréquentes dont souffrent les bébés prématurés. Le SDR est causé par un déficit dans la synthèse du surfactant pulmonaire en raison de l’immaturité du poumon lors d’une naissance prématurée. Plusieurs éléments régulent le développement pulmonaire notamment les stéroïdes sexuels et les corticostéroïdes. Le sexe est aussi un élément régulateur du développement pulmonaire. En effet, les garçons sont plus atteints que les filles par le SDR. Ce dimorphisme sexuel est attribué aux androgènes. Le traitement anténatal aux glucocorticoïdes est prescrit aux femmes qui sont à risque d’accoucher prématurément. En effet, les corticostéroïdes favorisent la maturation pulmonaire anténatale. Également, il a été démontré que les microARNs sont primordiaux pour le développement pulmonaire. Ceci nous a conduit à étudier l’impact des androgènes sur le profil d’expression des microARNs lors de la transition du stade canaliculaire au stade sacculaire (jour gestationnel (JG)17.0 au JG18.0), période qui coïncide avec la montée de la synthèse et de la sécrétion du surfactant chez la souris. Tout d’abord, nous avons étudié la stabilité des gènes de normalisation (snoRNAs) afin de quantifier les microARNs par qPCR. Cette analyse a été effectuée avec 3 logiciels différents et sur plusieurs stades du développement notamment de la période pseudoglandulaire jusqu’au stade alvéolaire chez les deux sexes. On a identifié les meilleures combinaisons de gènes de normalisation les plus stables pour chaque stade du développement étudié ainsi que pour la période couvrant tous les stades étudiés. Ensuite nous avons analysé à GD17.0 et GD18.0 le profil d’expression des microARNs chez des fœtus mâles dont les mères ont été traitées au flutamide (anti-androgènes pure). Les résultats ont montré que 43 microARNs matures sont modulés par les androgènes à GD17.0 et 35 microARNs à GD18.0. Pour certains microARNs, nous avons identifié des cibles potentielles qui sont inversement modulées par les androgènes par rapport aux microARNs. Ces cibles sont impliquées dans plusieurs processus biologiques tels que le métabolisme des lipides et la prolifération cellulaire ainsi que dans des fonctions moléculaires tels que la liaison des facteurs de transcription. Des expériences de validation ont été effectuées par qPCR. Nos résultats ont montré que les androgènes régulent des processus qui peuvent être impliqués dans la maturation pulmonaire via la régulation des microARNs. En plus de l’intérêt porté aux androgènes dans la maturation pulmonaire, nous avons analysé l’expression d’enzymes de synthèse des corticostéroïdes dans le poumon fœtal humain. L’expression de l’enzyme 21-hydroxylase a été étudiée par qPCR et par immunobuvardage. Également la localisation de l’ARNm de cette enzyme clé de la synthèse des glucocorticoïdes, a été effectuée par hybridation in situ. L’ARNm de CYP21A2 a été détecté par qPCR dans les 34 échantillons analysés et dont les âges variaient entre 17 et 40 semaines de grossesse. Aucune corrélation, avec l’âge gestationnel ou le sexe, n’a été observée. Des niveaux significatifs de la protéine 21-hydroxylase ont été détectés dans nos échantillons. Nous avons investigué l’expression d’autres enzymes impliquées dans la voie de synthèse des glucocorticoïdes notamment CYP11B1, CYP11B2 et CYP17A1. Les ARNm des gènes CYP11B1, CYP11B2 n’ont pas été détectés dans nos échantillons, contrairement à CYP17A1 dont l’ARNm a été détecté dans tous nos tissus fœtaux analysés. La protéine de la 17α-hydroxylase a été détectée à de faibles niveaux. Nos résultats d’hybridation in situ ont montré que l’expression de CYP21A2 est localisée presqu’exclusivement dans l’épithélium pulmonaire distal. Nos résultats suggèrent que les produits de la 21-hydroxylase agiront via une action intracrine sur l’épithélium distal en activant le récepteur des glucocorticoïdes (GR). L’activation du récepteur des minéralocorticoïdes (MR) ne semble pas dépendre de produits de la 21-hydroxylase en raison des quantités importantes d’aldostérone circulante.

Développement et applications d’un outil bio-informatique pour la détection de similarités de champs d’interaction moléculaire

Résumé : Les méthodes de détection de similarités de sites de liaison servent entre autres à la prédiction de fonction et à la prédiction de cibles croisées. Ces méthodes peuvent aider à prévenir les effets secondaires, suggérer le repositionnement de médicament existants, identifier des cibles polypharmacologiques et des remplacements bio-isostériques. La plupart des méthodes utilisent des représentations basées sur les atomes, même si les champs d’interaction moléculaire (MIFs) représentent plus directement ce qui cherche à être identifié. Nous avons développé une méthode bio-informatique, IsoMif, qui détecte les similarités de MIF entre différents sites de liaisons et qui ne nécessite aucun alignement de séquence ou de structure. Sa performance a été comparée à d’autres méthodes avec des bancs d’essais, ce qui n’a jamais été fait pour une méthode basée sur les MIFs. IsoMif performe mieux en moyenne et est plus robuste. Nous avons noté des limites intrinsèques à la méthodologie et d’autres qui proviennent de la nature. L’impact de choix de conception sur la performance est discuté. Nous avons développé une interface en ligne qui permet la détection de similarités entre une protéine et différents ensembles de MIFs précalculés ou à des MIFs choisis par l’utilisateur. Des sessions PyMOL peuvent être téléchargées afin de visualiser les similarités identifiées pour différentes interactions intermoléculaires. Nous avons appliqué IsoMif pour identifier des cibles croisées potentielles de drogues lors d’une analyse à large échelle (5,6 millions de comparaisons). Des simulations d’arrimage moléculaire ont également été effectuées pour les prédictions significatives. L’objectif est de générer des hypothèses de repositionnement et de mécanismes d’effets secondaires observés. Plusieurs exemples sont présentés à cet égard.

Bio-conjugaison de la fibronectine sur surface de téflon pour applications dans le domaine vasculaire

Depuis trente ans, des efforts ont été menés dans le domaine de l’ingénierie des matériaux afin de concevoir des appareils médicaux pouvant être en contact avec les tissus humains. Néanmoins l’interaction entre la surface du matériau et l’environnement physiologique entraine la plupart du temps des complications. Le laboratoire d’ingénierie des surfaces est spécialisé dans l’élaboration de surfaces biomimétiques capables d’interagir de manière proactive avec leur environnement. Pour des applications cardiovasculaires, une des stratégies consiste à utiliser des protéines de la matrice extracellulaire, comme la fibronectine, connue pour la promotion de l’adhésion des cellules endothéliales. Dans ce contexte, parce que la bioactivité de la fibronectine est fortement liée à sa conformation, l’objectif est de comparer différentes stratégies d’immobilisation en caractérisant la quantité de fibronectine immobilisée ainsi que son activité biologique. Les précédentes études menées au laboratoire ont souligné le fait que la fibronectine immobilisée par les cystéines présente une meilleur bioactivité que lorsque celle-ci est immobilisée par les groupements lysines qu’elle contient. L’actuel projet porte sur l’étude de l’influence de l’utilisation d’un bras d’ancrage hydrophile ou hydrophobe entre la protéine et la surface sur la bioactivité de la protéine. Les résultats ont d’une part montré l’efficacité des bras d’ancrage dans l’immobilisation de la fibronectine et d’autre part les limites de leur utilisation pour une étude comparative portant sur la quantification et la bioactivité de la protéine.

Regulation of osteoclast activation and autophagy through altered protein kinase pathways in Paget's disease of bone

Résumé : La maladie osseuse de Paget (MP) est un désordre squelettique caractérisé par une augmentation focale et désorganisée du remodelage osseux. Les ostéoclastes (OCs) de MP sont plus larges, actifs et nombreux, en plus d’être résistants à l’apoptose. Même si la cause précise de la MP demeure inconnue, des mutations du gène SQSTM1, codant pour la protéine p62, ont été décrites dans une proportion importante de patients avec MP. Parmi ces mutations, la substitution P392L est la plus fréquente, et la surexpression de p62P392L dans les OCs génère un phénotype pagétique partiel. La protéine p62 est impliquée dans de multiples processus, allant du contrôle de la signalisation NF-κB à l’autophagie. Dans les OCs humains, un complexe multiprotéique composé de p62 et des kinases PKCζ et PDK1 est formé en réponse à une stimulation par Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B Ligand (RANKL), principale cytokine impliquée dans la formation et l'activation des OCs. Nous avons démontré que PKCζ est impliquée dans l’activation de NF-κB induite par RANKL dans les OCs, et dans son activation constitutive en présence de p62P392L. Nous avons également observé une augmentation de phosphorylation de Ser536 de p65 par PKCζ, qui est indépendante d’IκB et qui pourrait représenter une voie alternative d'activation de NF-κB en présence de la mutation de p62. Nous avons démontré que les niveaux de phosphorylation des régulateurs de survie ERK et Akt sont augmentés dans les OCs MP, et réduits suite à l'inhibition de PDK1. La phosphorylation des substrats de mTOR, 4EBP1 et la protéine régulatrice Raptor, a été évaluée, et une augmentation des deux a été observée dans les OCs pagétiques, et est régulée par l'inhibition de PDK1. Également, l'augmentation des niveaux de base de LC3II (associée aux structures autophagiques) observée dans les OCs pagétiques a été associée à un défaut de dégradation des autophagosomes, indépendante de la mutation p62P392L. Il existe aussi une réduction de sensibilité à l’induction de l'autophagie dépendante de PDK1. De plus, l’inhibition de PDK1 induit l’apoptose autant dans les OCs contrôles que pagétiques, et mène à une réduction significative de la résorption osseuse. La signalisation PDK1/Akt pourrait donc représenter un point de contrôle important dans l’activation des OCs pagétiques. Ces résultats démontrent l’importance de plusieurs kinases associées à p62 dans la sur-activation des OCs pagétiques, dont la signalisation converge vers une augmentation de leur survie et de leur fonction de résorption, et affecte également le processus autophagique.

APRIN(PDS5B) et PALB2, deux protéines impliquées dans la réparation de l’ADN par recombinaison homologue et l’apparition de cancers

Au Canada, en 2015, il était estimé que 78 000 personnes allaient mourir d’un cancer, représentant 30 % de tous les décès et faisant de celui-ci la première cause de mortalité. De plus, 196 900 nouveaux cas de cancers seraient découverts au cours de cette même année (Canadian Cancer Society’s Advisory Committee on Cancer Statistics. Canadian Cancer Statistics 2015. Toronto, ON : Canadian Cancer Society; 2015). L’intégrité du génome est chaque jour menacée par des conditions environnementales qui endommagent l’ADN (ultraviolets, produits chimiques divers, etc.). Parmi les différents types de lésions, l’un des plus délétères et pouvant mener au cancer est la cassure double-brin (CDB). Celle-ci peut être réparée suivant deux mécanismes majeurs : la jonction des extrémités non homologues (Non-Homologous End-Joining ou NHEJ) ou la Recombinaison Homologue (RH). Cette dernière, prépondérante pendant les phases S/G2, consiste en la réparation d’une CDB grâce à l’utilisation d’une chromatide soeur comme modèle, permettant une réparation fidèle du dommage. La RH est sous la dépendance de diverses protéines, dont RAD51, PALB2 et BRCA2. Ces deux dernières sont connues pour être mutées dans les cancers du sein et des ovaires. Ainsi, la compréhension de l’implication de chaque acteur dans la RH est un objectif fondamental dans la lutte contre le cancer et constitue l’objectif général de cette thèse. En 2012, une étude a montré qu’une nouvelle protéine, APRIN (Androgen-induced PRoliferation INhibitor), appartenant au complexe cohésine, interagissait avec BRCA2 et jouait un rôle dans la RH. Les rôles précis d’APRIN dans ce mécanisme restaient toutefois à être définis. Le projet principal de cette thèse repose sur la caractérisation fonctionnelle d’APRIN dans la réparation par RH. Nous révélons qu’APRIN aurait un rôle spécifique et indépendant de celui de la cohésine dans la RH, et pourrait agir à diverses étapes cruciales de ce mécanisme. De plus, nos données montrent que le niveau d’expression d’APRIN pourrait être un marqueur de prédiction dans le cancer ovarien. Étant donné qu’APRIN interagit aussi avec PALB2, autre partenaire essentiel de BRCA2, nous avons également étudié et caractérisé les fonctions de divers mutants de PALB2. Nous faisons ainsi la découverte inattendue d’un nouveau phénotype induit par une troncation de cette protéine associée à certains cancers agressifs. Ainsi, cette thèse apporte des informations supplémentaires et indispensables à la compréhension de la réparation de l’ADN par RH et de la survenue de certains cancers.

Augmentation de l'immunogénicité de la nucléoprotéine de l'influenza par multimérisation in vitro

Les travaux effectués au cours de ce mémoire ont permis de développer une alternative aux vaccins présentement utilisés contre le virus de l’influenza. Nous avons utilisé la nucléoprotéine (NP) de l’influenza comme base vaccinale puisque cette protéine est conservée chez les souches d’influenza A et qu’elle possède un potentiel de protection croisée. Nous avons montré que la multimérisation de la NP grâce à un gabarit d’ARN permet d’augmenter son immunogenicité. Cette multimérisation en pseudo-nucléoparticule virale (NLP) a augmenté la réponse humorale et cellulaire spécifique à NP et l’ajout d’un adjuvant (PAL) a permis d’amplifier davantage la réponse humorale contre NP. Une dose du vaccin candidat NLP-PAL n’a pas réussi à protéger des souris contre une infection létale avec une souche homotypique d’influenza. Cependant, des résultats avec un régime de deux immunisations montrent des résultats encourageants qui permettent d’espérer une protection envers une infection virale.

Les plasmocytes et leur niche: Étude de la génération de plasmocytes humains in vitro

Chez l’humain, les lymphocytes B mémoires IgG+ et IgA+ sont des cellules clés de l’immunité humorale. Ces cellules mémoires sont maintenues à long-terme dans notre organisme. Elles représentent une défense rapide et efficace contre toutes les infections que nous avons déjà vaincues pendant notre vie. Ces cellules mémoires qui rencontrent à nouveau leur antigène se différencient rapidement en plasmocytes à courte vie, et permettent la sécrétion massive d’immunoglobuline (Ig). La contrepartie mémoire de ces cellules sont les plasmocytes à longue vie qui sont présents dans les niches de la moelle osseuse et y sécrètent en permanence des anticorps protecteurs qui circulent dans le sang. Ces cellules sécrétrices peuvent avoir une durée de vie allant de dizaines d’années à la vie entière de l’individu. Les patients qui reçoivent des traitements de chimiothérapie ou de radiothérapie sont privés de ces cellules mémoires détruites par ces traitements au même titre que les cellules cancéreuses. Ces patients deviennent vulnérables aux infections et leur survie dépend de la régénération rapide de leur système hématopoïétique. Notre équipe a déjà mis au point une méthode pour préparer de grandes quantités des cellules mémoires capables de sécréter des IgG et des IgA. Les présents travaux visent à générer des plasmocytes fonctionnels et capables de survivre à long terme in vitro. La stratégie expérimentale visait à établir des conditions permettant de se rapprocher de l’environnement de la moelle osseuse. Dans un premier temps, nous avons étudié les paramètres permettant la différenciation des lymphocytes B mémoires en plasmocytes. Étant donné l’importance du potentiel redox dans l’environnement de la moelle osseuse, nous avons d’abord tenté d’en contrôler l’impact avec un antioxydant, le N-acétyle cystéine (NAC). Nos résultats ont démontré que le NAC avait un effet significatif et diminuait la phosphorylation de la protéine STAT3 en raison d’une inhibition des kinases JAK2 et JAK3. Étonnamment, cet antioxydant retardait la différenciation de nos lymphocytes B qui étaient stimulés avec une forte interaction CD40-CD154. Par la suite, la comparaison des interactions CD40-CD154 et CD27-CD70 a permis de conclure qu’il était essentiel de réduire à son minimum l’interaction CD40-CD154 et qu’il fallait ajouter les cytokines IL-6 et IL-10. Les cellules CD31+CD38+CD138+ générées présentaient un phénotype similaire à celui des plasmocytes de la moelle osseuse. Malheureusement la fréquence de ces cellules était faible et leur viabilité insuffisante. Afin d’augmenter la survie de ces cellules le dernier volet de nos travaux visait à se rapprocher des niches de la moelle osseuse. Notre but a été atteint en ajoutant des cellules mésenchymateuses issues de la moelle osseuse en présence de 8% de dioxygène (O2). Les cellules CD31+CD38+CD138+ générées ont une excellente viabilité et représentent plus de 50% des cellules totales en culture. De plus, le modèle de culture est maintenant établi dans un milieu exempt de sérum et de protéines animales. Dans l’ensemble, nos résultats permettent de proposer la production ex vivo de plasmocytes autologues avec une perspective thérapeutique pour réduire les risques d’infections des patients devenues immunodéficients, suite à un traitement de radiothérapie ou de chimiothérapie.

Characterization of cancer/testis antigen MAGE-A11 for immunotherapy of prostate cancer

Les antigènes testiculaires du cancer sont des cibles idéales pour l’immunothérapie du cancer car ce sont des protéines immunogéniques dont l’expression est restreinte aux cellules germinales et au cancer. Le but de cette étude est d’évaluer le potentiel de MAGE-A11, un antigène testiculaire du cancer, comme cible pour développer un vaccin contre le cancer de la prostate. Pour ce faire, l’anticorps monoclonal 5C4 qui a la capacité de reconnaître la présence de MAGE-A11 dans les tissus fixés et inclus en paraffine a été produit. De plus, l’expression de MAGE-A11 a été analysée sur plusieurs lignées de cellules cancéreuses. Il a été démontré que MAGE-A11 est exprimé dans plusieurs types de cancers notamment dans le cancer du côlon et du cerveau. Finalement, nous avons identifié trois épitopes du CMH classe II HLA-DR1 dans la protéine MAGE-A11 confirmant ainsi l’immunogénicité de cet antigène et son potentiel comme cible pour l’immunothérapie du cancer.

Relations entre la composition du lait et les facteurs alimentaires dans les troupeaux laitiers québécois

L’objectif général des travaux présentes dans cette thèse de doctorat était d’établir la relation entre l’alimentation et la composition du lait des vaches laitières, en mettant l’emphase sur les teneurs en matières grasses (TMG), sur l’urée du lait et sur l’efficience d’utilisation de l’azote. Pour la TMG, c’est principalement la relation entre cette teneur et la différence alimentaire cations-anions (DACA) qui a été investiguée. Une base de données de 2 142 troupeaux québécois a été utilisée et la relation entre la composition de la ration, incluant la DACA, et la TMG du lait a été déterminée à l’aide de régressions multiples. Il a été possible de prédire entre 32 et 66 % de la variation de la TMG du lait en fonction du stade de lactation. Malgré plusieurs interactions trouvées, une augmentation de la DACA, une supplémentation avec de l’acide palmitique et une distribution des aliments en ration totale mélangée ont eu une relation positive avec la TMG du lait, tandis qu’une augmentation de la proportion de concentrés dans la ration a eu un effet négatif. Les modèles développés ont montré l’importance de la gestion de l’alimentation sur la TMG du lait. En plus, ils ont démontré l’intérêt de considérer la DACA dans la formulation de rations chez la vache laitière. Dans une deuxième étude, la même base des données a été utilisée pour identifier les facteurs nutritionnels qui peuvent faire varier la teneur en urée du lait. Contrairement à ce qui est mentionné dans la littérature, tant des corrélations positives et que négatives entre les teneurs en urée du lait et en protéines des rations à l’intérieur des troupeaux sur une période de 36 mois ont été obtenues. Pour mieux comprendre ces relations, les résultats de performances et d’alimentation de 100 troupeaux avec des corrélations positives (r > 0,69) et de 100 troupeaux avec des corrélations négatives (r < -0,44) entre la teneur en urée du lait et en protéine brute de la ration ont été comparés. Les résultats n’ont pas montré de différences entre les deux groupes ni pour la composition de la ration, ni pour l’urée du lait. Ces résultats ne permettent pas d’identifier le meilleur contexte pour l’utilisation de la teneur en urée du lait comme un outil de gestion de l’alimentation. Ces observations soulèvent des questions sur la validité de l’utilisation des statistiques d’alimentation provenant de la base de données utilisée pour des évaluations nutritionnelles plus spécifiques. Considérant les résultats du projet précédent, le dernier projet visait à mieux comprendre les caractéristiques des fermes avec différentes efficiences d’utilisation de l’azote en utilisant des données plus fiables. Ainsi, 100 fermes laitières au Québec ont été visitées pour recueillir les données de production, de consommation d’aliments et de gestion de leur troupeau. Ces fermes ont été divisées en quatre groupes par une analyse en grappes selon leur efficience d’utilisation de l’azote. La comparaison entre les groupes a montré que les fermes dans les groupes avec une plus haute efficience d’utilisation d’azote ont une production laitière moyenne par vache plus élevée. Pour les stratégies d’alimentation, les fermes plus efficientes donnent plus d’énergie, mais moins de protéines brutes que les fermes des groupes moins efficients. Les résultats ont également montré l’importance de la prise alimentaire des vaches sur l’efficience d’utilisation de l’azote puisque les fermes des groupes avec la plus grande efficience étaient également celles avec la plus faible prise alimentaire. Aussi, les résultats n’ont pas permis d’établir clairement la relation entre la teneur en urée du lait et l’efficience de l’utilisation de l’azote. En effet, des valeurs différentes pour l’urée du lait étaient obtenues entre le groupe plus efficient et le moins efficient, mais la faible ampleur de variation de l’efficience d’utilisation de l’azote des groupes intermédiaires n’a pas permis d’observer de différences pour l’urée du lait. Finalement, outre une réduction des risques de pollution, les fermes des groupes plus efficaces pour l’utilisation de l’azote étaient également celles avec la marge sur les coûts d’alimentation par les vaches plus élevées. Par conséquent, il y a aussi un intérêt économique à améliorer l’efficience de l’utilisation de l’azote sur les fermes.

Altération de la régénération musculaire dans la maladie pulmonaire obstructive chronique

Altération de la régénération musculaire dans la maladie pulmonaire obstructive chronique. La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est caractérisée par une obstruction bronchique irréversible et progressive. L’atrophie musculaire périphérique y est fréquente et a un impact négatif sur la capacité fonctionnelle et la survie des sujets atteints. Toutefois, on ignore si une altération du processus de régénération musculaire est un processus ayant cours dans l’atrophie musculaire périphérique. Le but de la présente thèse était donc d’étudier les cellules satellites, principales cellules responsables de la régénération musculaire dans les muscles périphériques de patients ayant une MPOC. Dans un premier temps, nous avons évalué l’historique de réplication du tissu musculaire et la sénescence des cellules satellites. Les changements morphologiques ayant lieu dans le muscle au cours de la progression de la maladie rendent le muscle plus susceptible aux dommages, induisant un raccourcissement prématuré des télomères. Un raccourcissement des télomères chez les sujets ayant une MPOC avec atrophie est concomitant avec une augmentation du nombre de cellules satellites sénescentes et de l’épuisement du potentiel de régénération compromettant le maintien de la masse musculaire chez ces sujets. Dans un deuxième et troisième temps, nous avons étudié les étapes amenant une cellule satellite vers une cellule musculaire dans les muscles périphériques et respiratoires de patients ayant une MPOC comparativement à des sujets contrôles. Les cellules satellites sont impliquées dans la réparation du tissu musculaire. Dans les cellules satellites provenant des sujets ayant une MPOC, une altération de la prolifération et de la différentiation a été observée. Ces résultats sont compatibles avec une altération de la régénération musculaire pouvant conduire à l’atrophie musculaire dans la MPOC. Le quatrième volet de ce projet s’intéressait à l’impact d’un entraînement en résistance sur l’activité des cellules satellites et le rôle joué par la myostatine dans ce contexte. La littérature montre que l’exercice en résistance est bien toléré et aide les patients ayant une MPOC à retrouver une meilleure qualité de vie. Cependant, il semble qu’ils n’y répondent pas tous aussi bien que les sujets contrôles. La capacité de réponse des cellules satellites à un entraînement en résistance semble inadéquate, suggérant ainsi un défaut de leur activation. Dans la dernière étude de cette thèse, nous avons voulu évaluer l’impact de l’inflammation systémique en étudiant SAA1, une protéine de phase aiguë et p21, une protéine du cycle cellulaire dans la dégradation des protéines des cellules musculaires. Les liens de causalité entre l’affection primaire et les différentes comorbidités demeurent nébuleux dans la MPOC. SAA1 et p21 sont augmentés dans les muscles squelettiques des patients ayant une MPOC et par ailleurs, SAA1 est capable d’induire la dégradation des protéines musculaires. Cette thèse expose les premiers éléments impliquant l’altération de la régénération musculaire avec la dysfonction musculaire observée chez les patients ayant une MPOC. Ces résultats vont certainement contribuer au développement de nouvelles thérapies et stratégies d’intervention dans le but d’améliorer la qualité de vie des personnes atteintes d’une MPOC. En somme, les travaux effectués dans le cadre de la présente thèse montrent que plusieurs mécanismes agissent de concert avec l’inactivité physique afin d’induire le phénotype dysfonctionnel dans les muscles des patients ayant une MPOC.

Caractérisation d'IGFBP-2 comme biomarqueur intégrateur de la santé cardiométabolique

La protéine de liaison aux facteurs de croissance analogues à l’insuline (IGFBP)-2 est une protéine circulante fortement associée à la résistance à l’insuline qui module les effets métaboliques d’IGF-I et IGF-II en s’y associant directement, et qui exerce aussi des actions IGF-indépendantes via sa liaison à la matrice extracellulaire et aux intégrines. Chez l’homme, de faibles niveaux d’IGFBP-2 sont associés à un profil lipidique délétère, ainsi qu’à une augmentation de la masse grasse et de la résistance à l’insuline. Les travaux décrits dans cette thèse montrent chez l’humain et la souris que les niveaux d’IGFBP-2 sont associés de manière indépendante aux composantes du risque cardiométabolique. Chez l’homme, de faibles niveaux d’IGFBP-2 sont associés à la dyslipidémie athérogène. Une valeur seuil d’IGFBP-2 de 221.5 ng/mL a permis de discriminer entre les sujets métaboliquement sains et ceux répondant aux critères du syndrome métabolique. En plus de son association avec la résistance à l’insuline et les composantes du profil lipidique, de faibles niveaux d’IGFBP-2 sont associés à une fonction cardiaque diminuée chez les patients atteints de sténose aortique, tel qu’évaluée par le volume d’éjection indexé, un indice de fonction global du ventricule gauche qui intègre la fonction pompe et le remodelage du tissu. Chez l’homme, des niveaux d’IGFBP-2 élevés sont associés à un tissu adipeux brun plus volumineux ainsi qu’à une activité métabolique plus importante de ce dernier. Ces observations, telles qu’évaluées par PET/CT, sont aussi validées chez les souris surexprimant la forme humaine d’IGFBP-2. Nos travaux démontrent que les niveaux d’IGFBP-2 sont fortement associés au métabolisme des lipoprotéines et des lipides, à la fonction cardiaque ainsi qu’à l’activité du tissu adipeux brun. L’influence des niveaux d’IGFBP-2 par différentes altérations métaboliques menant à l’augmentation du risque cardiométabolique pourrait faire de ce dernier un biomarqueur précoce et intégrateur. Les travaux exposés dans la présente thèse soulignent aussi un rôle mécanistique potentiel pour IGFBP-2 dans la protection contre certaines altérations du métabolisme.

Regulation of mitotic BubR1 phosphorylation by the BubR1 pseudokinase domain

BubR1 est une protéine importante dans le point de contrôle de la mitose pour la stabilisation des interactions entre kinétochores et microtubules (KT-MT). Ces fonctions protègent de la ségrégation anormale des chromosomes et de l’instabilité du génome. BubR1 possède des sites de phosphorylation mitotique hautement conservés dans le domaine régulant l’attachement des kinétochores (KARD), où S676 et S670 sont phosphorylées respectivement par la kinase polo-like 1 (Plk1) et par la kinase cycline-dépendante 1 (Cdk1). Ces sites de phosphorylation sont essentiels pour le recrutement de la phosphatase PP2A-B56, qui stabilise les interactions KT-MT. Nos résultats montrent que la délétion entière ou des mutations qui déstabilisent le domaine pseudokinase de BubR1, causent la perte de phosphorylation des résidus S676 et S670 en mitose. Notre hypothèse est que le domaine pseudokinase de BubR1 peut jouer un rôle essentiel dans la régulation de la phosphorylation du KARD et donc dans la stabilisation des interactions KT-MT.

Développement, validation et nouvelles applications d’un modèle d’analyse des modes normaux basé sur la séquence et la structure de protéines

Les protéines existent sous différents états fonctionnels régulés de façon précise par leur environnement afin de maintenir l‘homéostasie de la cellule et de l‘organisme vivant. La prévalence de ces états protéiques est dictée par leur énergie libre de Gibbs alors que la vitesse de transition entre ces états biologiquement pertinents est déterminée par le paysage d‘énergie libre. Ces paramètres sont particulièrement intéressants dans un contexte thérapeutique et biotechnologique, où leur perturbation par la modulation de la séquence protéique par des mutations affecte leur fonction. Bien que des nouvelles approches expérimentales permettent d‘étudier l‘effet de mutations en haut débit pour une protéine, ces méthodes sont laborieuses et ne couvrent qu‘une fraction de l‘ensemble des structures primaires d‘intérêt. L‘utilisation de modèles bio-informatiques permet de tester et générer in silico différentes hypothèses afin d‘orienter les approches expérimentales. Cependant, ces méthodes basées sur la structure se concentrent principalement sur la prédiction de l‘enthalpie d‘un état, alors que plusieurs évidences expérimentales ont démontré l‘importance de la contribution de l‘entropie. De plus, ces approches ignorent l‘importance de l‘espace conformationnel protéique dicté par le paysage énergétique cruciale à son fonctionnement. Une analyse des modes normaux peut être effectuée afin d‘explorer cet espace par l‘approximation que la protéine est dans une conformation d‘équilibre où chaque acide aminé est représenté par une masse régie par un potentiel harmonique. Les approches actuelles ignorent l‘identité des résidus et ne peuvent prédire l‘effet de mutations sur les propriétés dynamiques. Nous avons développé un nouveau modèle appelé ENCoM qui pallie à cette lacune en intégrant de l‘information physique et spécifique sur les contacts entre les atomes des chaînes latérales. Cet ajout permet une meilleure description de changements conformationnels d‘enzymes, la prédiction de l‘effet d‘une mutation allostérique dans la protéine DHFR et également la prédiction de l‘effet de mutations sur la stabilité protéique par une valeur entropique. Comparativement à des approches spécifiquement développées pour cette application, ENCoM est plus constant et prédit mieux l‘effet de mutations stabilisantes. Notre approche a également été en mesure de capturer la pression évolutive qui confère aux protéines d‘organismes thermophiles une thermorésistance accrue.

Hepsine et matriptase activent l’hémagglutinine des virus influenza A et B et leur inhibition représente une nouvelle stratégie thérapeutique n’entraînant pas le développement de résistance

Résumé: Chaque année, les épidémies saisonnières d’influenza causent de 3 à 5 millions de cas sévères de maladie, entraînant entre 250 000 et 500 000 décès mondialement. Seulement deux classes d’antiviraux sont actuellement commercialisées pour traiter cette infection respiratoire : les inhibiteurs de la neuraminidase, tels que l’oseltamivir (Tamiflu) et les inhibiteurs du canal ionique M2 (adamantanes). Toutefois, leur utilisation est limitée par l’apparition rapide de résistance virale. Il est donc d’un grand intérêt de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’influenza. Le virus influenza dépend de l’activation de sa protéine de surface hémagglutinine (HA) pour être infectieux. L’activation a lieu par clivage protéolytique au sein d’une séquence d’acides aminés conservée. Ce clivage doit être effectué par une enzyme de l’hôte, étant donné que le génome du virus ne code pour aucune protéase. Pour les virus infectant l’humain, plusieurs études ont montré le potentiel de protéases à sérine transmembranaires de type II (TTSP) à promouvoir la réplication virale : TMPRSS2, TMPRSS4, HAT, MSPL, Desc1 et matriptase, identifiée récemment par notre équipe (Beaulieu, Gravel et al., 2013), activent l’HA des virus influenza A (principalement H1N1 et H3N2). Toutefois, il existe peu d’information sur le clivage de l’HA des virus influenza B, et seulement TMPRSS2 et HAT ont été identifiées comme étant capables d’activer ce type de virus. Les travaux de ce projet de maîtrise visaient à identifier d’autres TTSP pouvant activer l’HA de l’influenza B. L’efficacité de clivage par la matriptase, hepsine, HAT et Desc1 a été étudiée et comparée entre ces TTSP. Ces quatre protéases s’avèrent capables de cliver l’HA de l’influenza B in vitro. Cependant, seul le clivage par matriptase, hepsine et HAT promeut la réplication virale. De plus, ces TTSP peuvent aussi supporter la réplication de virus influenza A. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de TTSP, développé en collaboration avec notre laboratoire, permet de bloquer significativement la réplication virale dans les cellules épithéliales bronchiques humaines Calu-3. Cet inhibiteur se lie de façon covalente et lentement réversible au site actif de la TTSP par un mécanisme slow tight-binding. Puisque cet inhibiteur cible une composante de la cellule hôte, et non une protéine virale, il n’entraîne pas le développement de résistance après 15 passages des virus en présence de l’inhibiteur dans les cellules Calu-3. L’inhibition des TTSP activatrices d’HA dans le système respiratoire humain représente donc une nouvelle stratégie thérapeutique pouvant mener au développement d’antiviraux efficaces contre l’influenza.