Les plasmocytes et leur niche: Étude de la génération de plasmocytes humains in vitro

Chez l’humain, les lymphocytes B mémoires IgG+ et IgA+ sont des cellules clés de l’immunité humorale. Ces cellules mémoires sont maintenues à long-terme dans notre organisme. Elles représentent une défense rapide et efficace contre toutes les infections que nous avons déjà vaincues pendant notre vie. Ces cellules mémoires qui rencontrent à nouveau leur antigène se différencient rapidement en plasmocytes à courte vie, et permettent la sécrétion massive d’immunoglobuline (Ig). La contrepartie mémoire de ces cellules sont les plasmocytes à longue vie qui sont présents dans les niches de la moelle osseuse et y sécrètent en permanence des anticorps protecteurs qui circulent dans le sang. Ces cellules sécrétrices peuvent avoir une durée de vie allant de dizaines d’années à la vie entière de l’individu. Les patients qui reçoivent des traitements de chimiothérapie ou de radiothérapie sont privés de ces cellules mémoires détruites par ces traitements au même titre que les cellules cancéreuses. Ces patients deviennent vulnérables aux infections et leur survie dépend de la régénération rapide de leur système hématopoïétique. Notre équipe a déjà mis au point une méthode pour préparer de grandes quantités des cellules mémoires capables de sécréter des IgG et des IgA. Les présents travaux visent à générer des plasmocytes fonctionnels et capables de survivre à long terme in vitro. La stratégie expérimentale visait à établir des conditions permettant de se rapprocher de l’environnement de la moelle osseuse. Dans un premier temps, nous avons étudié les paramètres permettant la différenciation des lymphocytes B mémoires en plasmocytes. Étant donné l’importance du potentiel redox dans l’environnement de la moelle osseuse, nous avons d’abord tenté d’en contrôler l’impact avec un antioxydant, le N-acétyle cystéine (NAC). Nos résultats ont démontré que le NAC avait un effet significatif et diminuait la phosphorylation de la protéine STAT3 en raison d’une inhibition des kinases JAK2 et JAK3. Étonnamment, cet antioxydant retardait la différenciation de nos lymphocytes B qui étaient stimulés avec une forte interaction CD40-CD154. Par la suite, la comparaison des interactions CD40-CD154 et CD27-CD70 a permis de conclure qu’il était essentiel de réduire à son minimum l’interaction CD40-CD154 et qu’il fallait ajouter les cytokines IL-6 et IL-10. Les cellules CD31+CD38+CD138+ générées présentaient un phénotype similaire à celui des plasmocytes de la moelle osseuse. Malheureusement la fréquence de ces cellules était faible et leur viabilité insuffisante. Afin d’augmenter la survie de ces cellules le dernier volet de nos travaux visait à se rapprocher des niches de la moelle osseuse. Notre but a été atteint en ajoutant des cellules mésenchymateuses issues de la moelle osseuse en présence de 8% de dioxygène (O2). Les cellules CD31+CD38+CD138+ générées ont une excellente viabilité et représentent plus de 50% des cellules totales en culture. De plus, le modèle de culture est maintenant établi dans un milieu exempt de sérum et de protéines animales. Dans l’ensemble, nos résultats permettent de proposer la production ex vivo de plasmocytes autologues avec une perspective thérapeutique pour réduire les risques d’infections des patients devenues immunodéficients, suite à un traitement de radiothérapie ou de chimiothérapie.

In Humans, IgG+- and IgA+ memory B lymphocytes are key cells for the maintenance of humoral immunity. Memory B lymphocytes are long-lived cells maintained as a memory repertoire throughout our lives. Memory B lymphocytes can establish an efficient and rapid defense against previously encountered infections. These cells rapidly differentiate into short-lived plasma cells secreting high levels of antibodies. Their counterpart, the long-lived plasma cells are the memory populations present in the bone marrow microenvironment. The long-lived plasma cells release protective antibodies into the peripheral blood, maintaining a permanent immune protection. Plasma cells can remain active for years or even for the entire life of an individual. Conversely, patients treated for cancer receive massive doses of chemotherapy or radiotherapy, which are detrimental for immune memory cells as well as cancerous cells. Those patients become highly vulnerable to infectious diseases and their survival depends on the regeneration of their hematopoietic system. Our research group has established an in vitro model enabling to prepare large quantities of IgG and IgA-secreting memory B lymphocytes. The present study aims to further investigate in vitro conditions to generate plasma cells with high survival capacity and able to secrete antibodies. Our experimental strategy intends to establish culture conditions similar to the bone marrow environment. The first step was to study parameters involved into differentiation of memory B lymphocytes into plasma cells. The importance of the redox balance in the bone marrow environment led us to measure the impact of Nacetyl cysteine (NAC), an antioxidant. Our results showed that NAC decreased STAT3 activation by inhibiting the phosphorylation of two kinases namely JAK2 and JAK3. Surprisingly, the addition of NAC had a negative effect on the differentiation of memory B lymphocytes in our culture conditions using a high level of CD40 stimulation. By comparing the levels of CD40-CD154 and CD27-CD70 interactions, we then confirmed that a low level of CD40-CD154 interaction was essential. We also established that addition of IL-6 and IL-10 was better to favor plasma cell generation. The cells obtained in this model were CD31+CD38+CD138+, showing a phenotype close to that of plasma cells found in the bone marrow. Unfortunately, those cells were produced in low frequency and were characterized by a low viability. To increase the survival of these in vitro generated plasma cells, we tried to generate culture conditions that resemble the bone marrow environment. We have achieved this by adding mesenchymal stem cells from bone marrow and maintained the cells at a low O2 level (8%). Cells CD31+CD38+CD138+ obtained at the end of the culture periods showed a high viability, and corresponded to more than 50% of total cultured cells. As expected, those cells were non-proliferating and able to secrete IgG. Furthermore, this in vitro culture model was established with a serum free media. In conclusion, our findings pave the way for the ex vivo production of autologous plasma cell for therapeutic purposes in order to reduce the risks of infection of immune-deficient patients.

Prix: Tableau d’honneur de la FÉSP