El virus de l'hepatitis C i la ribonucleasa Phumana: aspectes biològics i terapèutics

El virus de l'hepatitis C (VHC) provoca una hepatitis crònica que afecta a més de 170 milions de persones d'arreu del món. És un virus petit que es classifica dins de la família Flaviviridae i és un virus d'RNA de cadena positiva amb un genoma d'aproximadament 9.600 nucleòtids. A l'extrem 5' del genoma viral s'hi troba una regió no codificant (5'NCR) que comprèn els primers 341 nucleòtids i la seva funció està relaciona amb la traducció. Immediatament després hi ha una pauta de lectura oberta ORF que acaba en un únic codó d'aturada i codifica una poliproteïna de 3.010 aminoàcids. A continuació l'extrem 3' no codificant (3'NCR), que malgrat es desconeixen les seves funcions exactes, s'ha demostrat que és essencial per a la replicació vírica. La única poliproteïna generada és processada co- i postraduccionalment mitjançant proteases de l'hoste i víriques, donant lloc a les proteïnes estructurals (Core, E1 i E2-p7) i no estructurals (NS2-NS5B). Igual que la majoria de virus RNA, el VHC es caracteritza per tenir una taxa de mutació elevada. De fet, el genoma del virus no es pot definir com una única seqüència sinó per una població de variants molt relacionades entre sí. A aquesta manera d'organitzar la informació genètica se l'anomena quasiespècie viral i una de les seves implicacions principals és la facilitat amb què sorgeixen resistents al tractament. Els tractaments disponibles són llargs, cars, provoquen efectes secundaris considerables i només es resolen completament el 40% dels casos. Per aquesta raó es busquen altres solucions terapèutiques per combatre el virus entre les quals s'hi inclouen diferents estratègies. Una de les més innovadores i prometedores és la utilització de ribozims dirigits directament contra el genoma del virus. Aquest treball es centra en l'estudi de les noves estratègies terapèutiques basades en ribozims, concretament la ribonucleasa P. La ribonucleasa P és un ribozim que està present en tots els organismes ja que és l'enzim responsable de la maduració dels precursors d'RNA de transferència. El més interessant a nivell terapèutic és que s'ha demostrat que es pot dirigir la seva activitat cap a qualsevol RNA utilitzant una seqüència guia d'RNA que quan hibrida amb l'RNA diana, l'híbrid imita l'estructura secundària del substrat natural. En el cas del VHC, s'han estudiat ribozims dependents de seqüència (ribozims derivats d'RNAs satèl·lits i de viroides de plantes), sempre dirigits contra la regió més conservada del virus per evitar una disminució de l'eficiència del ribozim deguda a la variació de la diana. La ribonucleasa P és una endonucleasa d'activitat molt específica i es diferencia dels altres ribozims naturals en el sistema de reconeixement del substrat, reconeix elements estructurals i no de seqüència. L'objectiu final del treball és tallar in vitro l'RNA del VHC aprofitant la propietat que presenta aquest ribozim de reconèixer elements estructurals i no de seqüència ja que per a un mateix nombre de seqüències, el nombre d'estructures viables que pot adoptar l'RNA genòmic és molt més petit i per tant la variabilitat de la diana disminueix. S'han estudiat dos models d'RNasa P, la RNasa P humana guiada per seqüència guia externa (EGS) i l'RNA M1 de l'RNasa P d'E.coli unit a la seqüència guia per l'extrem 3' (ribozim M1GS). Abans però de dirigir el ribozim, s'han estudiat l'estructura i la variabilitat d'una regió del genoma del virus ja que s'ha descrit que són factors que poden limitar l'eficiència de qualsevol ribozim. Derivat d'aquests estudis s'aporten dades sobre accessibilitat i variabilitat d'una regió interna del genoma del virus de l'hepatitis C, la zona d'unió de la regió E2/NS2 (regió 2658-2869). L'estudi d'accessibilitat revela que la regió 2658-2869 del genoma del virus conté dominis oberts i tancats i que la transició entre uns i altres no és brusca si es compara amb altres regions d'estructura coneguda (regió 5' no codificant). Els resultats dels assajos in vitro amb els dos models de RNasa P mostren que s'ha aconseguit dirigir tant la ribonucleasa P humana com el ribozim M1GS cap a una zona, predeterminada segons l'estudi d'accessibilitat, com a poc estructurada i tallar l'RNA del virus. De l'anàlisi de mutacions, però, es dedueix que la regió estudiada és variable. Tot i dirigir el ribozim cap a la zona més accessible, la variació de la diana podria afectar la interacció amb la seqüència guia i per tant disminuir l'eficiència de tall. Si es proposés una estratègia terapèutica consistiria en un atac simultani de vàries dianes.D'altra banda i derivat d'un resultat inesperat on s'ha observat en els experiments control que l'extracte de RNasa P humana tallava l'RNA viral en absència de seqüències guia externes, s'ha caracteritzat una nova interacció entre l'RNA del VHC i la RNasa P humana. Per a la identificació de l'enzim responsable dels talls s'han aplicat diferents tècniques que es poden dividir en mètodes directes (RNA fingerprinting) i indirectes (immunoprecipitació i inhibicions competitives). Els resultats demostren que la ribonucleasa P humana, i no un altre enzim contaminant de l'extracte purificat, és la responsable dels dos talls específics observats i que es localitzen, un a l'entrada interna al ribosoma (IRES) i molt a prop del codó AUG d'inici de la traducció i l'altre entre la regió codificant estructural i no estructural. La ribonucleasa P és un dels enzims del metabolisme del tRNA que s'utilitza per identificar estructures similars al tRNA en substrats diferents del substrat natural. Així doncs, el fet que la ribonucleasa P reconegui i talli el genoma del VHC en dues posicions determinades suggereix que, a les zones de tall, el virus conté estructures semblants al substrat natural, és a dir estructures tipus tRNA. A més, tot i que el VHC és molt variable, els resultats indiquen que aquestes estructures poden ser importants per el virus, ja que es mantenen en totes les variants naturals analitzades. Creiem que la seva presència podria permetre al genoma interaccionar amb factors cel·lulars que intervenen en la biologia del tRNA,particularment en el cas de l'estructura tipus tRNA que es localitza a l'element IRES. Independentment però de la seva funció, es converteixen en unes noves dianes terapèutiques per a la RNasa P. S'ha de replantejar però l'estratègia inicial ja que la similitud amb el tRNA les fa susceptibles a l'atac de la ribonucleasa P, directament, en absència de seqüències guia externes.

Scar formation in the inner ear followig acoustical injury: sequence of changes from early signs of damage to healed lesion

This paper is a review of a study to investigate the effects of excessive noise exposure to the organ of Corti using chinchillas.

Twelve sequence stories for use as part of reading curriculum for deaf children

This paper discusses the use of sight vocabulary drills, experience and sequence stories, pre-primers, basal readers and text books as part of a reading curriculum for hearing-impaired children.

A comparison between maximum length sequence and conventional auditory brainstem responses as a screening tool for auditory sensitivity

This paper compares conventional auditory brainstem response tests (ABRs) and Maximum Length Sequence auditory brainstem response tests (MLS ABRs). The results found that the faster MLS ABRs could prove an accurate screening tool for auditory sensitivity.

Cusp observations during a sequence of fast IMF B-Z reversals

In recent years, a large number of papers have reported the response of the cusp to solar wind variations under conditions of northward or southward Interplanetary Magnetic Field (IMF) Z-component (BZ). These studies have shown the importance of both temporal and spatial factors in determining the extent and morphology of the cusp and the changes in its location, connected to variations in the reconnection geometry. Here we present a comparative study of the cusp, focusing on an interval characterised by a series of rapid reversals in the BZ-dominated IMF, based on observations from space-borne and ground-based instrumentation. During this interval, from 08:00 to 12:00 UT on 12 February 2003, the IMF BZ component underwent four reversals, remaining for around 30 min in each orientation. The Cluster spacecraft were, at the time, on an outbound trajectory through the Northern Hemisphere magnetosphere, whilst the mainland VHF and Svalbard (ESR) radars of the EISCAT facility were operating in support of the Cluster mission. Both Cluster and the EISCAT were, on occasion during the interval, observing the cusp region. The series of IMF reversal resulted in a sequence of poleward and equatorward motions of the cusp; consequently Cluster crossed the high altitude cusp twice before finally exiting the dayside magnetopause, both times under conditions of northward IMF BZ. The first magnetospheric cusp encounter, by all four Cluster spacecraft, showed reverse ion dispersion typical of lobe reconnection; subsequently, Cluster spacecraft 1 and 3 (only) crossed the cusp for a second time. We suggest that, during this second cusp crossing, these two spacecraft were likely to have been on newly closed field lines, which were first reconnected (opened) at low latitudes and later reconnected again (re-closed) poleward of the northern cusp.

Sequence-selective assembly of tweezer-molecules on linear templates enables frameshift-reading of sequence information

Monomer-sequence information in synthetic copolyimides can be recognised by tweezer-type molecules binding to adjacent triplet-sequences on the polymer chains. In the present paper different tweezer-molecules are found to have different sequence-selectivities, as demonstrated in solution by 1H NMR spectroscopy and in the solid state by single crystal X-ray analyses of tweezer-complexes with linear and macrocyclic oligo-imides. This work provides clear-cut confirmation of polyimide chain-folding and adjacent-tweezer-binding. It also reveals a new and entirely unexpected mechanism for sequence-recognition which, by analogy with a related process in biomolecular information processing, may be termed "frameshift-reading". The ability of one particular tweezer-molecule to detect, with exceptionally high sensitivity, long-range sequence-information in chain-folding aromatic copolyimides, is readily explained by this novel process.

Sequence analysis of the cupin gene family in Synechocystis PCC6803

The recently described cupin superfamily of proteins includes the germin and germinlike proteins, of which the cereal oxalate oxidase is the best characterized. This superfamily also includes seed storage proteins, in addition to several microbial enzymes and proteins with unknown function. All these proteins are characterized by the conservation of two central motifs, usually containing two or three histidine residues presumed to be involved with metal binding in the catalytic active site. The present study on the coding regions of Synechocystis PCC6803 identifies a previously unknown group of 12 related cupins, each containing the characteristic two-motif signature. This group comprises 11 single-domain proteins, ranging in length from 104 to 289 residues, and includes two phosphomannose isomerases and two epimerases involved in cell wall synthesis, a member of the pirin group of nuclear proteins, a possible transcriptional regulator, and a close relative-of a cytochrome c551 from Rhodococcus. Additionally, there is a duplicated, two-domain protein that has close similarity to an oxalate decarboxylase from the fungus Collybia velutipes and that is a putative progenitor of the storage proteins of land plants.

Modeling based on the structure of vicilins predicts a histidine cluster in the active site of oxalate oxidase

It is known that germin, which is a marker of the onset of growth in germinating wheat, is an oxalate oxidase, and also that germins possess sequence similarity with legumin and vicilin seed storage proteins. These two pieces of information have been combined in order to generate a 3D model of germin based on the structure of vicilin and to examine the model with regard to a potential oxalate oxidase active site. A cluster of three histidine residues has been located within the conserved beta-barrel structure. While there is a relatively low level of overall sequence similarity between the model and the vicilin structures, the conservation of amino acids important in maintaining the scaffold of the beta-barrel lends confidence to the juxtaposition of the histidine residues. The cluster is similar structurally to those found in copper amine oxidase and other proteins, leading to the suggestion that it defines a metal-binding location within the oxalate oxidase active site. It is also proposed that the structural elements involved in intermolecular interactions in vicilins may play a role in oligomer formation in germin/oxalate oxidase.