Avaliação da ação antitumoral in vitro da pterocarpanoquinona LQB 118 e estudo de alguns mecanismos de ação

Tem sido descrito que o acúmulo de mutações em proto-oncogenes e genes supressores de tumor contribui para o direcionamento da célula à carcinogênese. Na maioria dos casos de câncer, as células apresentam proliferação descontrolada devido a alterações na expressão e/ou mutações de ciclinas, quinases dependentes de ciclinas e/ou inibidores do ciclo celular. Os tumores sólidos figuram entre o tipo de câncer mais incidente no mundo, sendo a quimioterapia e/ou hormônio-terapia, radioterapia e cirurgia os tratamentos mais indicados para estes tipos de tumores. Entretanto, o tratamento quimioterápico apresenta diversos efeitos colaterais e muitas vezes é ineficaz. Portanto, a busca por novas moléculas capazes de conter a proliferação destas células e com baixa toxicidade para o organismo se faz necessário. Este trabalho teve por objetivo avaliar a ação antitumoral in vitro de um novo composto sintético, a pterocarpanoquinona LQB118, sobre algumas linhagens tumorais humanas de alta prevalência e estudar alguns dos seus mecanismos de ação. As linhagens tumorais estudadas neste trabalho foram os adenocarcinomas de mama (MCF7) e próstata (PC-3), e carcinoma de pulmão (A549). A citotoxicidade foi avaliada pelo ensaio do MTT e a proliferação celular pela contagem de células vivas (exclusão do corante azul de tripan) e análise do ciclo celular (citometria de fluxo). A expressão gênica foi avaliada por RT-PCR e a apoptose foi avaliada por condensação da cromatina (microscopia de fluorescência-DAPI), fragmentação de DNA (eletroforese) e marcação com anexina V (citometria de fluxo). Das linhagens tumorais testadas, a de próstata (PC3) foi a que se mostrou mais sensível ao LQB 118, e em função deste resultado, os demais experimentos foram realizados com esta linhagem tumoral. O efeito citotóxico do LQB 118 se mostrou tempo e concentração dependente. Esta substância inibiu a proliferação celular e prejudicou a progressão do ciclo celular, acumulando células nas fases S e G2/M. Buscando esclarecer os mecanismos desta ação antitumoral, demonstrou-se que o LQB 118 inibe a expressão do mRNA do fator de transcrição c-Myc e das ciclinas D1 e B1, e induz a apoptose de tais células tumorais. Em suma, o LQB 118 é capaz de inibir a proliferação das células tumorais de próstata, alterando a expressão do mRNA de alguns genes reguladores do ciclo celular, resultando em interrupção do ciclo celular e indução de apoptose, indicando este composto como um potencial candidato a futuro medicamento no tratamento do câncer de próstata.

Efeito da restrição alimentar materna durante a lactação sobre a função ovariana da prole fêmea na puberdade e vida adulta

α.O objetivo deste estudo foi avaliar se a restrição alimentar materna durante a lactação altera a função ovariana da prole na puberdade e na vida adulta. No dia do nascimento da ninhada, as ratas foram separadas aleatoriamente nos seguintes grupos: (C) controle = dieta com 23% de proteína; (PER) restrição protéica calórica = dieta com 8% de proteína. Após o desmame, as proles tiveram livre acesso a dieta com 23% proteína e apenas os animais na fase diestro foram sacrificados com uma dose letal de pentobarbital aos 40 e 90 dias de idade. O sangue foi retirado por punção cardíaca e o soro armazendo para posterior dosagem dos níveis hormonais por radioimunoensaio. O ovário direito foi excisado, pesado e armazenado a 80C para subseqüente avaliação do receptor de androgênio (AR), das isoformas dos receptores de estrogênio (ERα, ERβ1 e ERβ2), do receptor do hormônio folículo estimulante (FSHR), do receptor do hormonio luteinizante (LHR), das isoformas dos receptores de leptina (Ob-R, Ob-Ra and Ob-Rb), e da enzima aromatase pela técnica de RT-PCR. O ovário esquerdo foi incluido em parafina, seccionado em cortes de 5 μm de espessura e processado por análise histológica de rotina, para classificação dos foliculos ovarianos. Na puberdade, o grupo PER apresentou um aumento significativo (p<0,05) no número dos folículos pré-antrais e antrais, enquanto o número de folículos primordiais, folículos de Graaf e corpo lúteo foram reduzidos significativamente (p<0,05). As concentrações sericas de estradiol (pg/ml) foram significativamente aumentadas (p<0,05). Houve aumento significativo na expressão do RNAm dos FSHR (p<0.05) e LHR (p<0.05), e diminuição significativa na expressão do RNAm dos AR (p<0.05), ERα (p<0.05), ERβ1 (p<0.05) e ERβ2 (p<0.05). Na vida adulta, a restrição alimentar causou uma diminuição no número total de folículos ovarianos, entretanto esta redução só foi significativa no número dos folículos primordiais, primários e de Graaf (p<0.05). Houve redução significativa da expressão da enzima aromatase (p<0.01), do FSHR (p<0.05), LHR (p<0.05), Ob-R (p<0.05) e Ob-Rb (p<0.05). Podemos concluir que a restrição alimentar materna durante a lactação causa uma programação metabólica no ovário da prole, alterando a foliculogênese, expressão das diferentes isoformas dos receptores de estrogênio, leptina, androgênio e gonadotropinas e da enzima aromatase. Essa programação, possivelmente decorrente dos baixos níveis de leptina nos primeiros dias de vida, pode contribuir para uma senescência precoce e redução da fertilidade já descrita na literatura.

Dose terapêutica de radiação ionizante induz um fenótipo migratório em células de carcinoma de colon humano (caco-2): vias de sinalização envolvidas

O câncer colo-retal é a terceira neoplasia mais frequente em todo o mundo e a recorrência local e neoplasia refratária são desafios no tratamento do câncer colo-retal após a cirurgia convencional. Com o intuito de controlar a recorrência e aumentar a média de sobrevida dos pacientes, uma estratégia multidisciplinar que combina a radioterapia (RT) e a quimioterapia com o processo cirúrgico tem sido protocolo clínico de escolha. Embora esta combinação seja capaz de otimizar o tratamento, nem todos os pacientes são beneficiados com o protocolo quimio-rádio combinado, uma vez que existem os insucessos terapêuticos relacionados com a incidência de neoplasias secundárias tardias em pacientes que foram submetidos à RT para tratamento de neoplasias anteriores. Além da doença refratária, outro agravante da RT são os efeitos colaterais produzidos pela radiação ionizante (IR), em especial àqueles do trato gastrointestinal. Estes efeitos estão relacionados com alterações da homeostase do epitélio intestinal, através da desorganização dos complexos juncionais. Porém, os mecanismos que medeiam estes efeitos ainda não estão elucidados. Este estudo avaliou as vias de sinalização que medeiam os efeitos da IR em células Caco-2. Foi observado que a IR causa uma desorganização da junção aderente via Src, EGFR e MAPK, sendo estas alterações acompanhadas por desorganização do citoesqueleto de actina em todo o volume celular. Src, EGFR e MAPK participam de maneira diferenciada na modulação destes efeitos. Observamos também que a radiação aumenta a motilidade dessas células via Src e MAPK e não induz alteração na proliferação celular até 48 horas após o tratamento. Este é o primeiro trabalho que correlaciona vias de sobrevivência celular como Src, EGFR e MAPK com alterações nas proteínas de junção aderente, alterações do citoesqueleto e migração celular. Estes eventos são relacionados aos efeitos colaterais primários e tardios induzidos pela IR, e podem favorecer à aquisição de um fenótipo maligno herdável durante o fracionamento de doses na RT, favorecendo a progressão tumoral do câncer colo-retal. Logo, além da correlação das vias de sinalização envolvidas nos eventos induzidos pela IR mostrados neste estudo, os resultados também corroboram para um melhor entendimento da atividade farmacológica dos inibidores químicos utilizados, uma vez que muitos deles encontram-se em fase de ensaios pré-clínicos e clínicos.

小麦肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）基因的分离和功能分析

作为植物界广泛存在的一类酚类聚合物，木质素是陆生植物正常生长发育过程中非常重要的生物大分子，而且与人类的生活息息相关。利用分子生物学手段和基因工程方法，从小麦中分离木质素生物合成途径的关键酶-肉桂酰辅酶A还原酶基因（CCR），研究肉桂酰辅酶A还原酶基因在木质素代谢途径中的调控规律，从其催化的限速步骤入手，来调控木质素的合成，有效的改变木质素的组成、含量和结构，是改善木质素在植物生长发育中的作用乃至开发木质素资源的关键所在。本文就小麦肉桂酰辅酶A还原酶基因的分离、表达特征及其在木质素合成途径中的作用开展了研究工作。 首先用RACE方法从小麦中克隆了CCR的两个cDNA的部分序列，序列分析表明它们编码的蛋白具有CCR的典型特点，GC含量高于均60%，两者在核酸水平和蛋白水平的同源性为76%和 69%，证明在小麦中至少存在着两个CCR基因。通过 RT-PCR和Northern 杂交确定W-cr6和W-cr19在小麦的发育中具有不同的表达特征，W-cr6主要在茎中表达，而W-cr19的表达集中在根中。以W-cr6为探针，从cDNA文库中筛选到一个全长1317bp的cDNA，命名为TaCCR1。TaCCR1包括开放阅读框 (ORF) 1047bp、5′端侧翼 72bp和3′端侧翼198bp的非翻译序列。TaCCR1能够编码由349个氨基酸组成的蛋白质，预期的分子量为37.4kD。同源性比较显示TaCCR1基因在核酸水平和蛋白质水平与其他物种的CCR基因的同源性高于60%。 为了分析CCR在木质素合成中的作用，用TaCCR1构建了用于转化烟草的正义和反义表达载体pStCCR和pAtCCR、用于转化小麦的正义和反义表达载体pBSC1和pBAC1。通过农杆菌介导得到了30株反义转基因烟草和12株正义转基因烟草。由于外源基因的抑制作用，转基因烟草在形态、木质素组成和含量、木质部显微结构上都程度不同的发生了变化。正义和反义的转基因株系呈现出株型矮化、木质素含量下降、木质部导管细胞壁受到破坏等现象。同时利用花粉管通道法转化小麦种子5000多粒，部分处理经过初步的PCR和 Southern分子鉴定获得了1株转基因株系，需要对其遗传、生理和形态特征做进一步的研究。 本文还对木质素对小麦茎杆的机械强度的影响做了初步的探讨，得到的结果是小麦茎杆的木质素含量、维管束的数量、茎杆有效的横界面积与其最大弯曲应力存在着正相关，而维管束的结构、密度对茎杆的最大弯曲应力没有明显的影响，从而为通过CCR基因来改善小麦茎杆的抗倒特性建立了生理学基础。

三叶木通花发育相关基因的结构、功能和进化研究

花是被子植物最关键的创新（innovation）性状。在被子植物的不同类群中，其形态多种多样，尤其以基部真双子叶植物的花形态最为丰富。大量的系统发育分析表明，在核心真双子叶植物起源之前，几个与花发育相关的MADS-box基因亚家族均发生了大尺度的基因重复事件。因此，在被子植物的不同物种中，花发育相关基因的组成并不相同，并且它们经历了不同的进化历史，这意味着这些基因可能以不同的方式调控花的发育。基部真双子叶植物，作为基部被子植物和核心真双子叶植物之间的过渡类群，对于我们理解被子植物花的进化，揭示核心真双子叶植物花的起源以及基部真双子叶植物花多样性分化的分子机制非常重要。本文以基部真双子叶植物三叶木通为研究材料，着重进行了以下研究工作： 1. 花器官发生过程的观察。三叶木通的花为雌雄同序的单性花。而且，根据成熟花的形态，三叶木通的雌花和雄花都只有一轮花被器官，即三个花瓣状的萼片。扫描电镜的观察结果表明：1）在花器官的发生和发育过程中，在萼片和雄蕊原基之间，确实没有花瓣原基或另一轮萼片原基发生。2）雌花和雄花都是以两性花的方式发生发育的。3）单性花是由于在花发育的最后阶段，雌花中雄蕊或者雄花中心皮的退化而产生的。 2. 花发育相关基因的克隆。应用5’/3’ RACE的方法，我们从三叶木通不同发育阶段的混合花芽中共分离到九个与花发育相关的MADS-box基因： AktFL1、AktFL2、AktAP3_1、AktAP3_2、AktAP3_3、AktPI、AktAG1、AktAG2和AktSEP3。 3. A类MADS-box基因的进化。由于A类基因在进化过程中序列结构的改变，再加上取样的限制，使得A类基因间的进化历史一直不能被很好的理解。因此，本文对A类基因的研究从构建该基因亚家族的系统发育树开始。主要结果如下：1）通过扩大在基部真双子叶植物和被子植物其它重要类群的取样，我们的系统发育树基本上反映了现存被子植物的系统发育关系。2）核心真双子叶植物的A类基因由三个分支组成：euFUL、euAP1和AGL79，它们是通过发生在核心真双子叶植物起源之前的两次几乎同时的基因重复事件产生的。3）在基部真双子叶植物中，山龙眼目、毛茛目和黄杨科的A类基因各形成一支。而且，在这些类群内，发生了多次小尺度的独立的基因重复事件。4）来自单子叶植物的FUL-like基因明显地构成一个单系，并且包括三个分支：OsAMDS14、OsMADS15和OsMADS18。它们是由于两次不连续的基因重复事件产生的。5）不同类型的A类基因产物在C末端拥有不同的保守基元。6）从基因组结构上看，所有的A类基因都拥有八个外显子和七个内含子。7）通过对三叶木通中两个FUL-like型基因（AktFL1和AktFL2）表达式样的观察，我们发现它们在叶原基和发育早期的花原基以及发育着的花器官中都有表达。此外，A类基因表达式样的进化分析结果表明被子植物中该类基因的祖先可能具有广泛的功能，既在营养器官中表达又在生殖器官中表达 。 4. B类基因表达式样的保守性和多样性。通过对B类基因的系统发育和表达式样分析，得到以下结果：1）三叶木通中的三个paleoAP3基因是通过两次基因重复事件产生的。2）在木通科或木通属内，PI型基因并没有发生基因重复事件。3）RT-PCR结果表明，AktAP3_1在雌花中的表达量比雄花中高，而AktAP3_2则在雄花中的表达量比雌花中高。AktAP3_3和AktPI在雌花和雄花中的表达水平相似。4）原位杂交分析显示这些基因在发育着的雄蕊和心皮中表达。此外，AktAP3_3和AktPI还在萼片中表达，可能参与花瓣状萼片的发育。 5. 三叶木通C/D和E类基因的序列结构和表达分析。通过序列结构分析，我们发现，与其它被子植物AG同源基因编码的MADS-domain蛋白一样，AktAG1和AktAG2在MADS结构域的N末端都拥有一段氨基酸序列的延伸，AktAG1为20个氨基酸;AktAG2为7个氨基酸。原位杂交分析表明AktAG1和AktAG2主要在发育着的雄蕊和心皮中表达，说明它们具有决定生殖器官发育这一保守的功能。 AktSEP3属于AGL9型的E类基因。该基因在所有花器官中都有表达，说明和其它被子植物的E类基因一样，AktSEP3在三叶木通中对于所有花器官的发育都是必需的。 6. 各类MADS-domain蛋白间的相互作用。在前面工作的基础上，我们首次对三叶木通中上述MADS-domain蛋白间的作用方式进行了研究。酵母双杂交结果表明：1）AktSEP3的C末端具有转录激活功能。2）三个AktAP3蛋白与AktPI蛋白都能够形成异源二聚体，但是它们之间的作用能力并不相同。3）AktSEP3蛋白可以与AktFL1、AktPI、AktAG1和AktAG2形成异源二聚体，充分体现了E类基因产物作用式样的保守性。4）AktFL1与AktPI、AktSEP3和AktAG2也能形成异源二聚体，这与核心真双子叶植物的euFUL型蛋白在作用式样上是非常相似的。 综合以上结果，我们探讨了三叶木通花发育的分子机制。在三叶木通的三轮花器官中，与拟南芥等模式植物相似的是：E类（AktSEP3）基因在每一轮花器官中都起作用;此外，A类（AktFL1）和B类（AktAP3_3和AktPI）基因在花瓣状的萼片中有不同程度的表达，类似于拟南芥的第二轮;B类（AktAP3_1、AktAP3_2、AktAP3_3和AktPI）和C/D类（AktAG1和AktAG2）基因在雄蕊的发育过程中起作用;C/D类（AktAG1和AktAG2）基因对心皮的发育起作用。与拟 南芥等模式植物不同的是：1）虽然原位杂交分析表明，AktFL1、AktAP3_3、AktPI和AktSEP3都在花瓣状的萼片中有 不同程度的表达，但是它们的蛋白质产物AktFL1与AktSEP3和AktAP3_3与AktPI都只能形成较弱的异源二聚体。而 且，根据我们的研究结果，在三叶木通中没有找到euAP1型的A类基因，只有两个FUL-like型的A类基因。它们的功能 与核心真双子叶植物中的euFUL型基因相似。因此，AktFL1很可能与其它调控因子共同作用负责花分生组织的形成;AktFL1/AktAG2则可能在花发育的后期起作用。那么，三叶木通花瓣状萼片的发育是否需要AktFL1/AktSEP3和 AktAP3_3/AktPI的参与，还是另有其它转录因子的参与，仍然需要更深入的研究。2）虽然在三叶木通中，雄蕊的发 育同样需要B、C/D和E类基因的参与，但是由于小尺度的基因重复事件，在该物种中只拥有三个paleoAP3型基因，而没有euAP3型基因。而且，由于复制拷贝间的亚功能化，AktAP3_1/AktPI主要参与雌花的发育过程;而AktAP3_2/AktPI主要参与雄花的发育过程。

云杉属的分子系统学与生物地理学研究

云杉属植物是非常重要的森林树种，广泛分布于北半球的寒温带、温带高山和亚高山地带。该属为松科中仅次于松属和冷杉属的第三大属，约有 28-56 种。自云杉属建立以来，其属于松科没有任何疑议。然而，由于云杉属物种间频繁杂交、形态趋同和取样困难，尽管已经有基于形态学、细胞学、化学成份、叶绿体 DNA RFLP 等方面的研究，该属的属下分类仍然存在诸多争议。本文利用父系遗传的叶绿体基因和母系遗传的线粒体基因序列重建了云杉属的系统发育关系，探讨了云杉属生物地理格局的形成过程。在此基础上，我们研究了低拷贝核 CAD 基因在云杉属的进化式样。另外，我们还对裸子植物线粒体基因 rps3 的内含子分布和进化进行了初步研究。 1． 云杉属的系统发育和生物地理学研究 我们选择了 Farjon (1990) 确定的 34 个种中的 33 种 (另一个种在 Flora of China 未得到承认)，共 103 个个体，对这些个体的叶绿体 DNA 片段 trnC-trnD 和 trnT-trnF 以及线粒体基因 nad5 的第一个内含子进行了序列测定。在两个叶绿体基因片段联合分析构建的系统发育树上，北美西部的 P. breweriana 和 P. sitchensis 位于最基部。其余的物种分为三支：第一支由北美的两个物种组成;第二支包括分布于喜马拉雅-横断山区及其周围地区的八个种、台湾的 P. morrisonicola、西亚的 P. orientalis、日本的两个种及北美的 P. chihuahuana;第三支中，北美的 P. pungens 位于基部，亚洲东北部的种 (除 P. maximowiczii 和 P. torano 外)、P. retroflexa 和欧洲的 P. abies 构成一个单系群，并与北美的 P. mariana 和 P. rubens 及来自巴尔干半岛的 P. omorika 形成姐妹支。所有样品的 nad5 第一个内含子序列可分为 A、B、C、D 和 E 5 种单倍型，北美的物种拥有前 4 种，而且 A、B 和 C 单倍型为北美所特有;欧亚的物种仅含 D 和 E 两种单倍型。 上述结果结合 MacClade 和 DIVA 分析及化石证据，我们推断云杉属起源于北美，至少两次经白令陆桥扩散至亚洲，然后从亚洲扩散至欧洲。亚洲东北部的绝大多数物种和欧洲云杉 P. abies 的种间遗传变异非常低，而且线粒体单倍型均为 D，可能来源于一次近期的辐射分化。云杉属的现代分布中心之一喜马拉雅-横断山区的物种可能不是一次起源，日本的物种同样如此，这可能与第三纪气候变冷和第四纪冰川导致的物种迁移有关。此外，我们发现目前用于云杉属分类的一些形态性状（如叶扁平、菱形等）在系统发育树上位于不同的位置，说明这些性状可能不是一次起源或是祖征在不同支系中的保留，用于云杉属的系统划分须慎重。 2． 云杉属 CAD 基因的进化研究 裸子植物的多倍体特别少，且以基因组庞大而著称。被子植物中的很多单拷贝基因在裸子植物中以低拷贝或多拷贝基因家族的方式存在。CAD 基因在木质素单体合成的最后一步起作用，在松属中只发现了一种 CAD 基因拷贝，在欧洲云杉中却发现了三种拷贝，而且 Southern 杂交和子代分离鉴定结果表明这三种拷贝至少位于两个位点上。然而，对云杉属三个物种 (包括欧洲云杉) 构建的遗传图谱却都只发现了一个 CAD 基因位点。由于云杉属 CAD 基因的数目和分布存在很大争议，我们根据构建的叶绿体基因树，选择了不同支上的 20 个物种、29 个样品研究该基因的进化式样。结果表明：云杉属不同物种中 CAD 基因的拷贝数为 1-4 种，多数为 2-3 种。系统发育分析发现有些物种的所有 CAD 基因拷贝聚成一支，另有一些物种的 CAD 基因拷贝位于不同位置。此外，我们对 GenBank 中云杉属三个物种 CAD 基因的 EST 序列分析后发现：EST 序列的差异主要发生在 3’-UTR 区，表现为序列长短的不同，这有可能是进行体外反转录时引物结合于不同的位置所致。因此，结合前人研究（包括遗传图谱分析），我们推测 CAD 基因在云杉属内发生了多次重复，重复拷贝很可能呈串联排列。 3. 裸子植物线粒体基因 rps3 的进化研究 线粒体基因内含子的获得/丢失已经被广泛应用于系统发育研究。rps3 为分布最广的线粒体核糖体蛋白基因，一般含一个内含子，前人研究显示其在裸子植物中多了一个第二类内含子 rps3i2，并将这个内含子作为区分裸子植物和其它植物类群的标志之一。然而，该研究只选择了苏铁和银杏作为裸子植物的代表，取样代表性不足。在本研究中，我们对裸子植物每个科至少选择一个物种作为代表，通过 DNA 序列和部分物种的 RT-PCR 分析，探讨 rps3 基因在裸子植物中的进化。结果表明 rps3 基因内含子的分布与裸子植物系统发育关系相吻合：Conifer II、松科的落叶松属和黄杉属及百岁兰科不仅不含 rps3i2，而且丢失了第一个内含子;金钱松属缺失第二个内含子。我们推断在 Conifer II 的祖先和百岁兰科中分别一次性丢失了两个内含子;在松科中则发生了两次单独的丢失事件，一次是在落叶松属和黄杉属的祖先中丢失了两个内含子，一次是在金钱松属中丢失了第二个内含子。另外，在 Ephedra 中没有扩增出 rps3 基因，Gnetum 中具有第二个内含子，倪藤科的 rps3i2 似乎支持松科与倪藤纲的关系更近。对 rps3i2 的进一步分析发现，其序列结构与松科的系统发育关系非常吻合。根据上述结果和 mRNA 编辑位点分析，我们认为 Conifer II等类群中的两个rps3内含子丢失可能是反转录酶介导的 cDNA 反转录造成的。Psuedolarix 的内含子丢失也可能为相同机制，但因缺乏材料而未能进一步研究。

大叶石上莲（苦苣苔科，马铃苣苔属）花对称性基因的表达模式和进化研究

模式植物金鱼草的花对称性分子发育及遗传学研究揭示了花对称性的相关调控基因在花发育过程种的表达模式和功能以及它们的相互作用机制。然而，被子植物的花对称性丰富多样，远非模式植物的模式所能概括。根据目前的研究我们选择苦苣苔科马铃苣苔属作为研究对象，选取其中具有代表性的种大叶石上莲开展控制花对称性的几个关键基因的进化发育生物学研究，初步探讨这些基因的表达模式和功能以及它们与花对称性进化的联系。 RT-PCR实验结果显示，在大叶石上莲中花对称性基因ObCYC, ObRAD, ObDIV与它们的同源基因CYC, RAD, DIV在金鱼草中的表达模式有着明显的差异，这也意味着这些基因的功能及相互作用也有所不同。首先，大叶石上莲的ObCYC1C基因的表达与金鱼草的CYC基因相似，结合花形态比较认为ObCYC1C基因在花器官近轴区域的表达抑制了背部花器官的发育，在构建大叶石上莲微弱的两侧对称花过程中起到了主导的作用; 其它的几个ObCYC基因有着完全不同于CYC的表达模式，ObCYC1D的表达延伸到了花腹部区域而ObCYC2A在花发育中期和晚期没有表达，这意味着它们可能具有除控制花对称性之外的功能; 另一个特殊的现象是ObCYC2B因为在可读框架中一个终止子的提前出现而失去了功能。其次，ObRAD, ObDIV的表达与RAD, DIV的表达差异也极为明显，通过系统树和氨基酸序列比对分析发现ObRAD, ObDIV与RAD, DIV的保守功能区序列存在明显的不同，而ObRAD, ObDIV与BlRAD, BlDIV的保守区很相似，这与它们的花对称性以及基因的表达模式相对映，同时也说明了保守功能区具有极重要的作用。本研究显示了大叶石上莲中的花对称性基因的表达模式和功能与模式植物金鱼草存在显著的差异，在此基础上开展更深入的进化发育生物学研究将有助于揭示花对称性基因的分子进化及其与花对称性表型进化的关系。

玄参科毛泡桐花对称性基因的分离和表达研究

花两侧对称性的获得是由多次独立的进化事件而完成。在被子植物进化过程中，花两侧对称性在植物的适应辐射过程中有重要意义。在模式植物金鱼草中，CYCLOIDEA（CYC）是控制花对称性的关键基因。近年来，CYC 基因的同源基因已经在多个类群中被分离出来，并开展了CYC 类基因的分子进化及其与花对称性表型进化相关关系的研究。 泡桐属是模式植物金鱼草的一个近缘类群，我们从泡桐属的毛泡桐中分离出了CYC基因的两个同源基因，分别命名为PtCYC1 和PtCYC2 。组织特异性RT-PCR显示他们的表达模式发生了明显的分化。 毛泡桐中PtCYC1 基因的表达模式与 CYC 基因在金鱼草中和 McCYC 基因在M. confertiflora 中的表达模式存在明显的差异但是和RgCYC 在地黄（Rehmannia）中的表达模式十分相似。PtCYC1 基因在近轴区域的强烈表达可能与毛泡桐近轴雄蕊的缺失有关。 尽管PtCYC1和M. confertiflora 中的McCYC 基因均从近轴雄蕊延伸到了两侧雄蕊，但PtCYC1 基因的后期表达较弱。因此，毛泡桐中的两侧雄蕊的发育并没有像M. confertiflora 中的两侧雄蕊受到强烈的抑制而成为退化雄蕊，仅仅使得两侧雄蕊短于两个远轴雄蕊从而在毛泡桐中形成二强雄蕊。地黄属和泡桐属两侧对称花的显著特征是缺乏近轴雄蕊。PtCYC1 和RgCYC基因的表达模式的高度一致显示出近轴雄蕊的缺失可能和CYC类基因的强烈表达有关。十分有趣的是毛泡桐中PtCYC2 基因在各个区域均没有表达。对于PtCYC2 基因是否还有其他方面的功能还有待于进一步探讨。

五数苣苔(Bournea leiophylla)次生辐射对称花形成的分子机制和进化发育生物学研究

被子植物中，花对称性进化的一个重要方面就是从两侧对称向次生辐射对称的演化。唇形目是被子植物中以两侧对称花为主的类群，次生辐射对称花频繁发生。然而在分子发育水平上，除了模式植物金鱼草(Antirrhinum majus)和少数其他种外，从两侧对称花向次生辐射对称花演化的机制仍然是一个巨大的未被探索的领域。 在金鱼草和柳川鱼(Linaria vulgaris)中，腹部化反常整齐花的形成各自是由于CYC和LCYC的沉默所引起，这些基因沉默分别是由于转座子插入和DNA广泛甲基化所导致。在豆科(legumes)中，辐射对称花的形成是由于legCYC基因在所有五个花瓣均有表达，这相似于金鱼草中CYC基因同源异位表达所形成的背部化辐射对称花。然而，自然界中起源于不同的两侧对称花支系的许多次生辐射对称花好像并不是因为简单的花对称性基因功能丢失或者获得。因此，以模式植物突变体表型特征的分子机制作为研究出发点，通过对自然发生的次生辐射对称花进行详细研究探讨，有可能揭示两侧对称花向次生辐射对称花转变的新的演化途径，包括花对称性发育过程中不同基因的参与以及他们的表达在时间上的变化等。 苦苣苔科(Gesneriaceae)是唇形目(Lamiales sensu lato)其他类群的姊妹群, 以较弱的两侧对称花为特征，并拥有相当数量的次生辐射对称花种类;该科所拥有的辐射对称花属在唇形目所有科中占的比例最大。在苦苣苔科中，五数苣苔(Bournea leiophylla)是次生辐射对称花类群中具有两侧对称痕迹的代表类群，其花的发育过程显示出五数苣苔花经历了由花器官发育早期的两侧对称向成熟时期辐射对称的形态转变。这种发育模式暗示着五数苣苔的花可能起源于一个两侧对称花祖先;五数苣苔中控制花背腹非对称性的CYC类基因应该是有功能的，至少在花发育的早期是这样的。由于苦苣苔科和婆婆纳科(Veronicaceae)(金鱼草属于婆婆纳科)亲缘关系较近，而且CYC类基因的基本功能之一是导致背部雄蕊退化;因此五数苣苔中辐射对称花的形成很可能既不是由于CYC类基因失去，也不是因为CYC-类基因功能获得延伸或加强所致。在五数苣苔花发育过程中，从早期的两侧对称到成熟花的辐射对称的发育转变可能牵涉到TCP和MYB基因家族成员相互调节作用在时间和空间上的改变。因此，五数苣苔是探讨被子植物中次生辐射对称花新的进化途径的一个理想的候选材料。针对解决这一问题，我们对五数苣苔花进行了以下实验研究： 1 花器官发生过程的观察 成熟的五数苣苔花是辐射对称花，但是对花发育过程中花原基电镜扫描结果表明：在花器官起始和发育的早期，五数苣苔花是显著的两侧对称;但是随着进一步发育，这种两侧对称性逐步减弱，最后形成具有微弱两侧对称性痕迹的辐射对称花。 2 花对称性基因的克隆 我们应用RACE技术克隆得到了五数苣苔花对称性同源基因：BlDIV1、BlDIV2和BlRAD的翻译区全序列及其上下游非翻译区，得到了BlCYC1的3‘端翻译区和非翻译区序列。为了确定这些基因内含子的有无和位置，我们也从DNA中得到了相应同源基因的DNA序列，并且补全了BlCYC1的5‘端序列。同时也克隆到了一个没有在mRNA中得到的CYC同源基因BlCYC2。在该实验中我们第一次在金鱼草以外的类群中克隆得到了DIV和RAD的同源基因。 3 序列比较和分子系统发育分析 运用不同的比较软件和分子系统发育分析工具对五数苣苔的花对称性基因进行了比较和分析。结果表明：五数苣苔各种类型的花对称性基因和金鱼草的花对称基因在序列上是高度同源的，在分子系统发育上是非常近缘的。暗示着五数苣苔花对称性基因和金鱼草花对称性基因功能上的同源性。 4 花对称称性基因表达模式的分析 我们第一次运用组织原位杂交和RT-PCR技术对在金鱼草以外类群中所有已知类型花对称性同源基因的表达模式进行了实验研究。结果表明：五数苣苔花对称性基因的表达模式在花发育的早期类似于金鱼草;但是早期以后，BlCYC1和BlRAD被负调节，BlDIV的表达特异地在每个花瓣侧部边缘表达;这种表达结果和花的形态发生过程有很好的吻合。 上述研究表明：和金鱼草花对称基因的表达模式相比，五数苣苔三种类型花对称性基因在花发育过程中的时间和空间表达模式发生了改变;并且这种表达模式变化和五数苣苔花对称性由发育起始时期的两侧对称向成熟时期的辐射对称的转变是相互关联的。五数苣苔具有两侧对称性痕迹的辐射对称花和其他类群辐射对称花的比较显示：在五数苣苔中发育早期的两侧对称性应该是两侧对称性的遗迹;这是由于BlCYC1和BlRAD基因早期表达的保守性造成的。我们的结果揭示了一个新的花对称性演化路径：在花发育过程中，被CYC-like基因推动的RAD和DIV同源基因之间相互调节作用在时间和空间上的变化是花对称性从两侧对称向辐射对称转变或演化的基础;我们的发现还预示着：在一个调节网络的动态变化过程中，一个预先存在的两侧对称发育程序的修饰调节可能在被子植物次生辐射对称花多样性的形成中扮演重要角色。

基于TCP和MYB基因的表达模式，试探四数苣苔（Bournea sinensis）(苦苣苔科)中次生辐射对称花形成的进化发育途径

花对称性，作为花器官的一个基本而又非常重要的特征，它的进化发育过程，越来越吸引着科学家们的注意力。次生辐射对称花的形成也越来越受到关注。然而在分子发育水平上，除了模式植物金鱼草（Antirrhinum majus）和少数其他种外，次生辐射对称花演化的机制仍然是一个巨大的未被探索的领域。 在金鱼草和柳穿鱼（Linaria vulgaris）中，腹部化反常整齐花的形成各自是由CYC和LCYC基因沉默所致，二者基因沉默分别是由于转座子的插入和DNA广泛甲基化所导致;而在豆科（legumes）中，辐射对称花的形成是由于legCYC基因在五个花瓣上都有表达，这种情况和金鱼草中CYC基因同源异位表达所形成的背部化辐射对称花相似。然而，自然起源的两侧对称花支系中的次生辐射对称花的形成似乎并不是简单的花对称性基因功能丢失或获得。自然形成的次生辐射对称花究竟可能经历了怎样的进化途径？对此，我们选择了广义唇形目（Lamiales sensu lato）中苦苣苔科（Gesneriaceae）植物——四数苣苔（Bouenea sinensis）作为研究对象，通过和模式植物金鱼草的突变体中花对称性基因表达特征比较，结合其近缘种——五数苣苔（Bournea leiophylla）中DIVARICATA在时间和空间上的表达特征，试图揭示苦苣苔科中可能的两侧对称向次生辐射对称花转变的新的演化途径，以及在这种进化过程中所产生的可能的器官丢失或融合现象。 四数苣苔和五数苣苔同属于苦苣苔亚科（Cyrtandroideae）苦苣苔族（Trib.Ramondeae Eritsch）中的四数苣苔属（Bournea Oliv）。该属仅仅有两个种——四数苣苔和五数苣苔，它们都是次生辐射对称花类群中的典型代表，而且两者花发育过程都显示出了由腹部向背部顺序发生和生长的特征。然而和五数苣苔相比，四数苣苔花瓣和雄蕊数目分别少了一枚，拥有四枚花瓣（背部花瓣两枚、两侧花瓣两枚）和四枚雄蕊（背部雄蕊一枚、两侧雄蕊两枚、腹部雄蕊一枚）。从形态特征比较来看，很有可能是四数苣苔在次生辐射对称花形成的过程中，发生了腹部花瓣的丢失和两枚腹部雄蕊愈合成了一枚较大的腹部雄蕊。那么，我们推测在四数苣苔次生辐射对称花形成过程中，花对称性基因即CYC类和DIV类基因在分子水平上发生了变化，这种变化和四数苣苔中次生辐射对称花的形成有关。 基于上述考虑，我们开展了对四数苣苔中花对称性基因——BsCYCLOIDEA、BsDIVARICATA、BsRADALIS以及BsCYCLIND3四个基因共9个拷贝进行了在花组织中表达模式研究。我们在四数苣苔中共分离到了五个拷贝的CYC类基因，分别命名为BsCYC1C-1、BsCYC1C-2、BsCYC1D、BsCYC2A、BsCYC2B。这五个拷贝在保守的TCP区和R区保持了高度的同源性。BsDIV的两个拷贝BsDIV1、BsDIV2也是如此，在保守的两个区domain I、domain II，尤其是在那些螺旋和环结构处，保守性相当高。组织原位杂交结果显示，BsDIV在四数苣苔中的表达非常特别，在金鱼草和五数苣苔中该类基因的表达分两个不同时期，即早期表达和晚期特异性表达，BsDIV在四数苣苔中似乎没有早期表达模式或者在很早期就已经进入到了晚期的表达模式。它在四个花瓣的两侧边缘和四个雄蕊上均等表达，而且这种表达持续时间相对比较长。组织原位杂交结果也得到了RT-PCR结果的支持。有趣的是BsRAD的RT-PCR结果显示，BsRAD在晚期花瓣上只在背部表达，但是在雄蕊上的表达却和金鱼草中AmRAD在背部区域表达不同，它的表达从背部延伸到了两侧和腹部。BsRAD在花器官的第二轮和第三轮的表达显然发生了分化。这种现象可能暗示着BsRAD功能发生了分化。BsRAD和BsDIV在腹部雄蕊上精细的时间空间调控关系可能正是导致腹部雄蕊愈合的原因。RT-PCR结果并没有检测到BsCYC2在晚期花上的表达。原位杂交结果显示BsCYC2在第8期以后表达就基本消失了，从而验证了RT-PCR结果。BsCYC2在早期花原基和早期花器官上都是均匀表达，但在表达消失之前，它在花瓣裂片和花冠筒的分界处则有表达信号，BsCYC2可能和调控花冠筒高度有关。根据Almeida 和 Galego（2002）所说，花冠筒高度的改变依赖于CYC 、DIV基因和其它非主动生长决定因子之间的相互作用。BsCYC1C晚期的RT-PCR结果显示它在背部花瓣、背部雄蕊和两侧雄蕊上均有表达信号，但在腹部花瓣和雄蕊上则没有表达信号，这似乎和四数苣苔由腹部向背部顺序发育的形态特征相符合，说明BsCYC1C可能起到了抑制背部花瓣和背部雄蕊生长的作用。