Nanopatterning and functionalization of phospholipid-based Langmuir-Blodgett and Langmuir-Schaefer films

Durant les dernières décennies, la technique Langmuir-Blodgett (LB) s’est beaucoup développée dans l’approche « bottom-up » pour la création de couches ultra minces nanostructurées. Des patrons constitués de stries parallèles d’environ 100 à 200 nm de largeur ont été générés avec la technique de déposition LB de monocouches mixtes de 1,2-dilauroyl-sn-glycéro-3-phosphatidylcholine (DLPC) et de 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphatidylcholine (DPPC) sur des substrats de silicium et de mica. Afin d’amplifier la fonctionnalité de ces patrons, la 1-palmitoyl-2-(16-(S-methyldithio)hexadécanoyl)-sn-glycéro-3-phosphatidylcholine (DSDPPC) et la 1-lauroyl-2-(12-(S-methyldithio)dodédecanoyl)-sn-glycéro-3-phosphatidylcholine (DSDLPC) ont été employées pour la préparation de monocouches chimiquement hétérogènes. Ces analogues de phospholipide possèdent un groupement fonctionnel méthyldisulfide qui est attaché à la fin de l’une des chaînes alkyles. Une étude exhaustive sur la structure de la phase des monocouches Langmuir, Langmuir-Schaefer (LS) et LB de la DSDPPC et de la DSDLPC et leurs différents mélanges avec la DPPC ou la DLPC est présentée dans cette thèse. Tout d’abord, un contrôle limité de la périodicité et de la taille des motifs des stries parallèles de DPPC/DLPC a été obtenu en variant la composition lipidique, la pression de surface et la vitesse de déposition. Dans un mélange binaire de fraction molaire plus grande de lipide condensé que de lipide étendu, une vitesse de déposition plus lente et une plus basse pression de surface ont généré des stries plus continues et larges. L’addition d’un tensioactif, le cholestérol, au mélange binaire équimolaire de la DPPC/DLPC a permis la formation de stries parallèles à de plus hautes pressions de surface. La caractérisation des propriétés physiques des analogues de phospholipides a été nécessaire. La température de transition de phase de la DSDPPC de 44.5 ± 1.5 °C comparativement à 41.5 ± 0.3 °C pour la DPPC. L’isotherme de la DSDPPC est semblable à celui de la DPPC. La monocouche subit une transition de phase liquide-étendue-à-condensée (LE-C) à une pression de surface légèrement supérieure à celle de la DPPC (6 mN m-1 vs. 4 mN m-1) Tout comme la DLPC, la DSDLPC demeure dans la phase LE jusqu’à la rupture de la monocouche. Ces analogues de phospholipide existent dans un état plus étendu tout au long de la compression de la monocouche et montrent des pressions de surface de rupture plus basses que les phospholipides non-modifiés. La morphologie des domaines de monocouches Langmuir de la DPPC et de la DSDPPC à l’interface eau/air a été comparée par la microscopie à angle de Brewster (BAM). La DPPC forme une monocouche homogène à une pression de surface (π) > 10 mN/m, alors que des domaines en forme de fleurs sont formés dans la monocouche de DSDPPC jusqu’à une π ~ 30 mN m-1. La caractérisation de monocouches sur substrat solide a permis de démontrer que le patron de stries parallèles préalablement obtenu avec la DPPC/DLPC était reproduit en utilisant des mélanges de la DSDPPC/DLPC ou de la DPPC/DSDLPC donnant ainsi lieu à des patrons chimiquement hétérogènes. En général, pour obtenir le même état de phase que la DPPC, la monocouche de DSDPPC doit être comprimée à de plus hautes pressions de surface. Le groupement disulfide de ces analogues de phospholipide a été exploité, afin de (i) former des monocouches auto-assemblées sur l’or et de (ii) démontrer la métallisation sélective des terminaisons fonctionnalisées des stries. La spectrométrie de photoélectrons induits par rayons X (XPS) a confirmé que la monocouche modifiée réagit avec la vapeur d’or pour former des thiolates d’or. L’adsorption de l’Au, de l’Ag et du Cu thermiquement évaporé démontre une adsorption préférentielle de la vapeur de métal sur la phase fonctionnalisée de disulfide seulement à des recouvrements sub-monocouche.

Morphological and functional characterization of placenta during gestation in bovine clones derived by somatic nuclear transfer

La technique de clonage par transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) présente une page importante dans les annales scientifiques, mais son application pratique demeure incertaine dû à son faible taux de succès. Les anomalies placentaires et de développement fœtal se traduisent par des pertes importantes de gestation et des mortalités néonatales. Dans un premier temps, la présente étude a caractérisé les changements morphologiques des membranes fœtales durant la gestation clonée en les comparant à des gestations contrôles obtenues à partir de l’insémination artificielle. Les différentes anomalies morphologiques des placentomes telles que l’œdème chorioallantoique, la présence de zones hyperéchoiques et irrégulières dans la membrane amniotique et la présence de cellules inflammatoires dégénérées compromettent le développement fœtal normal de la gestation clonée. L’examen ultrasonographique représente une technique diagnostique importante pour faire le suivi d’une gestation et de caractériser les changements placentaires dans le cadre d’évaluation globale du bien-être fœtal. Le profil hormonal de trois stéroïdes (progestérone (P4), estrone sulfate (E1S), et œstradiol (E2)) et de la protéine B spécifique de gestation (PSPB) dans le sérum des vaches porteuses de clones SCNT a été déterminé et associé aux anomalies de gestations clonées. Une diminution de la P4 sérique au jour 80, une élévation du niveau de la concentration de la PSPB au jour 150, et une augmentation de la concentration d’E2 sérique durant le deuxième et troisième tiers de la gestation clonée coïncident avec les anomalies de gestation déjà reportées. Ces changements du profil hormonal associés aux anomalies phénotypiques du placenta compromettent le déroulement normal de la gestation clonée et gênent le développement et le bien-être fœtal. Sur la base des observations faites sur le placenta de gestation clonée, le mécanisme moléculaire pouvant expliquer la disparition de l’épithélium du placenta (l’interface entre le tissue maternel et le placenta) a été étudié. L’étude a identifié des changements dans l’expression de deux protéines d’adhérence (E-cadhérin et β-catenin) de cellules épithéliales pouvant être associées aux anomalies du placenta chez les gestations clonées. Le tissu de cotylédons provenant de gestations clonées et contrôles a été analysé par Western blot, RT-PCR quantitatif, et par immunohistochimie. Les résultats présentaient une diminution significative (p<0.05) de l’expression des dites protéines dans les cellules trophoblastiques chez les gestations clonées. Le RT-PCR quantitatif démontrait que les gènes CCND1, CLDN1 et MSX1 ciblés par la voie de signalisation de la Wnt/β-catenin étaient significativement sous exprimés. La diminution de l’expression des protéines E-cadherin et β-catenin avec une réduction de l’activation de la protéine β-catenin durant le période d’attachement de l’embryon peut potentiellement expliquer l’absence totale ou partielle de l’attachement des membranes fœtales au tissu maternel et éventuellement, l’insuffisance placentaire caractéristique des gestations clonées chez la vache. La caractérisation morphologique et fonctionnelle du placenta durant les gestations clonées à haut risque est essentielle pour évaluer le statut de la gestation. Les résultats de la présente étude permettront de prédire le développement et le bien-être fœtal de façon critique à travers un protocole standardisé et permettre des interventions médicales pour améliorer le taux de succès des gestations clonées chez les bovins.

Poly(ethylene-co-acrylic acid) random copolymers : amphiphilic properties and self-assembly in aqueous medium

Les travaux de recherche présentés ici avaient pour objectif principal la synthèse de copolymères statistiques à base d’éthylène et d’acide acrylique (AA). Pour cela, la déprotection des groupements esters d’un copolymère statistique précurseur, le poly(éthylène-co-(tert-butyl)acrylate), a été effectuée par hydrolyse à l’aide d’iodure de triméthylsilyle. La synthèse de ce précurseur est réalisée par polymérisation catalytique en présence d’un système à base de Palladium (Pd). Le deuxième objectif a été d’étudier et de caractériser des polymères synthétisés à l’état solide et en suspension colloïdale. Plusieurs copolymères précurseurs comprenant différents pourcentages molaires en tert-butyl acrylate (4 à 12% molaires) ont été synthétisés avec succès, puis déprotégés par hydrolyse pour obtenir des poly(éthylène-coacide acrylique) (pE-co-AA) avec différentes compositions. Seuls les copolymères comprenant 10% molaire ou plus de AA sont solubles dans le Tétrahydrofurane (THF) et uniquement dans ce solvant. De telles solutions peuvent être dialysées dans l’eau, ce qui conduit à un échange lent entre cette dernière et le THF, et l’autoassemblage du copolymère dans l’eau peut ensuite être étudié. C’est ainsi qu’ont pu être observées des nanoparticules stables dans le temps dont le comportement est sensible au pH et à la température. Les polymères synthétisés ont été caractérisés par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ainsi que par spectroscopie Infra-Rouge (IR), avant et après déprotection. Les pourcentages molaires d’AA ont été déterminés par combinaison des résultats de RMN et ii de titrages conductimètriques. A l’état solide, les échantillons ont été analysés par Calorimétrie différentielle à balayage (DSC) et par Diffraction des rayons X. Les solutions colloïdales des polymères pE-co-AA ont été caractérisées par Diffusion dynamique de la lumière et par la DSC-haute sensibilité. De la microscopie électronique à transmission (TEM) a permis de visualiser la forme et la taille des nanoparticules.

Étude du rôle des lymphocytes T chez les receveurs pédiatriques de greffe de sang de cordon ombilical

La transplantation de sang de cordon ombilical (TSCO) est utilisée pour traiter les enfants atteints de maladies hématologiques en l’absence de donneurs apparentés compatibles. Elle est associée avec des risques plus élevés d’échec de greffe et d’infections opportunistes dans les premiers mois qui suivent la transplantation en comparaison avec une greffe de moelle osseuse. Par contre, la TSCO comporte un risque plus faible de maladie du greffon contre l’hôte et une incidence comparable de rechute de leucémie. Ces quatre complications impliquent directement les lymphocytes T. Dans le but de mieux comprendre le schéma particulier des évènements qui suivent la TSCO et d’améliorer le pronostic des patients, nous avons étudié le potentiel fonctionnel, la persistance et la reconstitution antivirale des lymphocytes T au sein d’un groupe d’enfants transplantés de sang de cordon ombilical (SCO). Étant donné que le SCO contient une majorité de lymphocytes T naïfs, nous avons étudié les lymphocytes T spécifiques au HLA-A2:Melan-A26-35 A27L; seul répertoire naïf et abondant caractérisé chez l’homme. Nous avons observé que les lymphocytes T du SCO se différencient en populations effectrices, s’oligoclonalisent, produisent de l’IFN-γ et lysent spécifiquement leur cible suite à la stimulation. Néanmoins, ces cellules produisent moins d’IFN-γ et sont moins bifonctionnelles que leurs homologues issus du sang périphérique d’adultes. Chez les patients, les lymphocytes T du SCO s’épuisent après la TSCO : ils s’oligoclonalisent dramatiquement, sont principalement en différenciation terminale, et une importante fréquence exprime PD-1 (« programmed death-1 ») dans les 3 à 6 premiers mois post-greffe. Très peu de patients sont capables de développer des réponses antivirales durant cette période et la fréquence de lymphocytes T qui expriment PD-1 semble aussi avoir un impact sur le risque subséquent de faire une rechute de leucémie. La deuxième vague de lymphocytes T émergeant à 6 mois post-TSCO mène à une population fonctionnelle et diversifiée. En conclusion, la fonctionnalité des lymphocytes T présents dans les 3 à 6 premiers mois post-TSCO doit être rétablie pour améliorer les risques d’infections opportunistes et de rechute de leucémie.

Rôles et régulation des enzymes antioxydantes paraoxonases au niveau intestinal et implication dans les maladies inflammatoires de l'intestin

Le stress oxydant joue un rôle majeur dans le développement et l’évolution des maladies inflammatoires de l’intestin. Le corps humain est doté d’une panoplie d’enzymes antioxydantes ayant pour fonction de protéger l’intégrité cellulaire. De nouvelles enzymes au fort potentiel antioxydant, les paraoxonases (PON) 1, 2 et 3, ont récemment été identifiées tout au long du tube digestif, mais leurs rôles y restent inconnus. Les cellules intestinales Caco-2/15, qui ont la capacité de se différencier et d’acquérir les caractéristiques physiologiques de l'intestin grêle, ont été utilisées dans le présent travail pour étudier la régulation des PON. Les cellules ont été traitées avec différents effecteurs physiologiques (cytokines, LPS, stress oxydant) et pharmacologiques (fibrates, thiazolidinédiones) et l’expression des leurs gènes et protéines a été évaluée. Les résultats ont mis en lumière la modulation distincte de l’expression des PON par le stress oxydant et l’inflammation. Ceci suggère que chaque PON peut jouer un rôle différent au niveau intestinal et être impliquée dans le maintien de l’homéostasie. La régulation de l’expression des PON a également été largement explorée dans un article de revue. Pour définir le rôle de PON2, celle-ci étant potentiellement la plus importante pour l’homéostasie intestinale, les cellules Caco-2/15 ont été infectées à l’aide de lentivirus contenant des ARN d’interférence, ce qui a fortement réduit l’expression de PON2. En l’absence de PON2, les cellules Caco-2/15 étaient plus susceptibles face à un stress oxydant, la réponse inflammatoire était exacerbée et la perméabilité cellulaire paraissait altérée. Toutes ces composantes sont majeures dans le développement des maladies inflammatoires de l’intestin chez l’humain. De plus, des cellules Caco-2/15 de la PON2, ce qui a renforcé la force de la défense antioxydante cellulaire. Les résultats suggèrent que les PON jouent un rôle dans le maintien de l’homéostasie intestinale et pourraient être impliquées dans l’étiologie et la pathogenèse des maladies inflammatoires de l’intestin.

Développement de papier bioactif par couchage à grande échelle d’enzymes immobilisées par microencapsulation

L’objectif principal de cette recherche est de contribuer au développement de biocapteurs commerciaux utilisant des surfaces de papier comme matrices d’immobilisation, capables de produire un signal colorimétrique perceptible dans les limites sensorielles humaines. Ce type de biocapteur, appelé papier bioactif, pourrait servir par exemple à la détection de substances toxiques ou d’organismes pathogènes. Pour atteindre l’objectif énoncé, ce travail propose l’utilisation de systèmes enzymatiques microencapsulés couchés sur papier. Les enzymes sont des catalyseurs biologiques dotés d’une haute sélectivité, et capables d'accélérer la vitesse de certaines réactions chimiques spécifiques jusqu’à des millions des fois. Les enzymes sont toutefois des substances très sensibles qui perdent facilement leur fonctionnalité, raison pour laquelle il faut les protéger des conditions qui peuvent les endommager. La microencapsulation est une technique qui permet de protéger les enzymes sans les isoler totalement de leur environnement. Elle consiste à emprisonner les enzymes dans une sphère poreuse de taille micrométrique, faite de polymère, qui empêche l’enzyme de s’echapper, mais qui permet la diffusion de substrats à l'intérieur. La microencapsulation utilisée est réalisée à partir d’une émulsion contenant un polymère dissous dans une phase aqueuse avec l’enzyme désirée. Un agent réticulant est ensuite ajouté pour provoquer la formation d'un réseau polymérique à la paroi des gouttelettes d'eau dans l'émulsion. Le polymère ainsi réticulé se solidifie en enfermant l’enzyme à l'intérieur de la capsule. Par la suite, les capsules enzymatiques sont utilisées pour donner au papier les propriétés de biocapteur. Afin d'immobiliser les capsules et l'enzyme sur le papier, une méthode courante dans l’industrie du papier connu sous le nom de couchage à lame est utilisée. Pour ce faire, les microcapsules sont mélangées avec une sauce de couchage qui sera appliquée sur des feuilles de papier. Les paramètres de viscosité i de la sauce et ceux du couchage ont été optimisés afin d'obtenir un couchage uniforme répondant aux normes de l'industrie. Les papiers bioactifs obtenus seront d'abord étudiés pour évaluer si les enzymes sont toujours actives après les traitements appliqués; en effet, tel que mentionné ci-dessus, les enzymes sont des substances très sensibles. Une enzyme très étudiée et qui permet une évaluation facile de son activité, connue sous le nom de laccase, a été utilisée. L'activité enzymatique de la laccase a été évaluée à l’aide des techniques analytiques existantes ou en proposant de nouvelles techniques d’analyse développées dans le laboratoire du groupe Rochefort. Les résultats obtenus démontrent la possibilité d’inclure des systèmes enzymatiques microencapsulés sur papier par couchage à lame, et ce, en utilisant des paramètres à grande échelle, c’est à dire des surfaces de papier de 0.75 x 3 m2 modifiées à des vitesses qui vont jusqu’à 800 m/min. Les biocapteurs ont retenu leur activité malgré un séchage par évaporation de l’eau à l’aide d’une lampe IR de 36 kW. La microencapsulation s’avère une technique efficace pour accroître la stabilité d’entreposage du biocapteur et sa résistance à l’exposition au NaN3, qui est un inhibiteur connu de ce biocapteur. Ce projet de recherche fait partie d'un effort national visant à développer et à mettre sur le marché des papiers bioactifs; il est soutenu par Sentinel, un réseau de recherche du CRSNG.

Étude fonctionnelle de l’opéron fimbriaire stg de Salmonella enterica sérovar Typhi

La bactérie Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) provoque la fièvre typhoïde chez les humains et constitue un problème de santé publique important. La majorité de nos connaissances sur la pathogenèse de cette bactérie provient du modèle de fièvre entérique chez la souris causée par le sérovar Typhimurium. Peu d’études se sont penchées sur les facteurs de virulence uniques au sérovar Typhi, ni sur la possibilité que les pseudogènes retrouvés dans son génome puissent être fonctionnels. Le fimbria stg, unique au sérovar Typhi, renferme un codon d’arrêt TAA prématuré dans le gène stgC qui code pour le placier responsable de l’assemblage des sous-unités fimbriaires à la surface de la bactérie. Ainsi, le fimbria stg a été classifié dans la liste des pseudogènes non-fonctionnels. Les objectifs de cette étude étaient d’évaluer l’implication du fimbria stg lors de l’interaction avec les cellules humaines, puis de vérifier l’importance du pseudogène stgC lors de la biogenèse fimbriaire. Dans une première partie, la transcription de stg a été évaluée à l’aide d’une fusion lacZ. Malgré des niveaux d’expression observés généralement faibles en milieu riche, la croissance en milieu minimal a favorisé la transcription de l’opéron. La délétion complète de l’opéron fimbriaire stgABCD du génome de S. Typhi a été réalisée par échange allélique, puis a été complémentée sur un plasmide. Il a été démontré que la présence de stg chez S. Typhi, S. Typhimurium et E. coli contribue à une adhérence accrue sur les cellules épithéliales humaines. De plus, ce fimbria semble agir comme une structure anti-phagocytaire lors de l’interaction avec des macrophages humains. Ainsi, l’opéron stg semble fonctionnel, malgré son codon d’arrêt prématuré, puisque des phénotypes ont été observés. La seconde partie de cette étude consistait à vérifier le rôle joué par le pseudogène stgC dans la biogenèse du fimbria. Différentes variantes de l’opéron ont été générées, clonées dans un vecteur inductible à l’arabinose, puis transformées dans la souche afimbriaire d’E. coli ORN172. La translocation de la sous-unité fimbriaire StgD à la surface de la bactérie a été évaluée chez ces différents mutants par immunobuvardage de type Western. Cette expérience a permis de démontrer que le pseudogène stgC est essentiel pour l’exportation de la sous-unité StgD à la surface. L’ajout d’une étiquette de 6-histidines en C-terminal de StgC a permis de confirmer la traduction complète du gène, malgré le codon d’arrêt TAA prématuré. Le séquençage peptidique a révélé l’insertion d’une tyrosine à ce codon. Une fusion traductionnelle avec la protéine verte fluorescente a révélé qu’environ 0.8% de l’ARNm peut être traduit et permet la production complète du placier. Ce projet a permis la caractérisation d’un facteur de virulence unique à S. Typhi et constitue une étape de plus vers la compréhension de ses mécanismes de pathogenèse. Il s’agit de la première démonstration chez les bactéries de la fonctionnalité d’un gène interrompu prématurément par un codon d’arrêt TAA.

Étude des mécanismes associés aux effets bénéfiques de la restriction calorique sur la fonction somatotrope du rat vieillissant.

Dans les cellules somatotropes, la liaison du facteur de libération de l’hormone de croissance (GHRH) à son récepteur (GHRH-R) stimule la synthèse et la sécrétion de l’hormone de croissance (GH) ainsi que la prolifération cellulaire. Chez les mammifères, le vieillissement est caractérisé par une diminution de la sécrétion de GH, liée à une perte de sensibilité des somatotropes au GHRH. Chez le rat âgé, des modifications de niveaux d'ARNm du GHRH-R et une diminution d'affinité et de capacité de liaison du GHRH sont rapportés. Au cours du vieillissement, une augmentation des niveaux de glucose et d’acides gras libres sérique suggère qu’une gluco- ou lipotoxicité puisse contribuer au dysfonctionnement de la fonction somatotrope. À ce jour, la restriction calorique modérée de longue durée (RCMLD) constitue l’intervention la plus efficace pour prévenir ou retarder les détériorations liées à l’âge. Des études ont montré des effets bénéfiques de la RCMLD sur l’axe somatotrope au cours du vieillissement via un maintien des paramètres de liaison du GHRH-R. Compte tenu de l’importance de cet axe, la compréhension des mécanismes menant à la somatopause ainsi que ceux associés aux effets bénéfiques de la RCMLD s’avère importante. Les objectifs principaux de la présente thèse étaient : 1) de déterminer les effets de la RCMLD chez le rat, sur le GHRH-R hypophysaire et la sensibilité des somatotropes au GHRH, 2) d’identifier les mécanismes associés à la somatopause et aux effets bénéfiques de la RCMLD, et 3) de préciser les effets d’une gluco-ou lipotoxicité sur l’axe somatotrope de rats et leur implication dans la somatopause. Des rats de 8 mois ont été soumis à une restriction calorique de 40% jusqu’à l’âge de 18-20 mois et ont été comparés à des rats jeunes et âgés nourris ad libitum. Cette étude a permis de mettre en évidence des effets bénéfiques de la RCMLD sur la régulation et la fonctionnalité du GHRH-R et de proposer que le glucose et les acides gras libres (AGL) circulants soient impliqués dans le vieillissement de la somatotrope. Une étude de micro-puce à ADN à permis d’identifier des gènes associés à des mécanismes de protection et de réparation des dommages cellulaires mis en place dans l’hypophyse antérieure au cours du vieillissement et par la RCMLD. Finalement, les effets d’un stress gluco- ou lipotoxique sur la fonction somatotrope ont été étudiés chez des rats de 2 et 6 mois, infusés 72 h avec une solution de glucose ou d’Intralipides, mimant les niveaux circulants de glucose et d’AGL retrouvés chez le rat âgé. Les résultats obtenus montrent que la glucotoxicité affecte la régulation de certains gènes de la somatotrope, dont le GHRH-R, et suggèrent que la capacité de réponse à ce type de stress est altérée. Les mécanismes par lesquels la glucotoxicité exerce ces effets pourraient inclure la génération de stress oxydant. L’ensemble de ces résultats proposent de nouvelles pistes mécanistiques qui pourraient contribuer au retardement de la somatopause et, ultimement, à l’élaboration de nouvelles stratégies d’intervention nutritionnelles ou pharmacologiques ciblant les mêmes voies que la RCMLD, avec une efficacité similaire ou supérieure.

Conséquences fonctionnelles de mutations affectant le récepteur de la vasopressine de type 2 et implications thérapeutiques

Le récepteur de la vasopressine de type 2 (V2R) joue un rôle crucial dans l’homéostasie hydrique. Exprimé principalement au niveau du rein, son activation par l’hormone antidiurétique arginine-vasopressine (AVP) favorise la réabsorption d’eau, participant ainsi à diminuer la diurèse. Plus de 200 mutations dans le gène du V2R ont été associées au diabète néphrogénique insipide congénital (DINc), une maladie causée par une perte de fonction du récepteur. À l’opposé, trois mutations découvertes récemment induisent un gain de fonction du V2R, et sont la cause du syndrome néphrogénique de l’anti-diurèse inappropriée (NSIAD). Les travaux de cette thèse visent à mieux comprendre les bases moléculaires responsables de la perte ou du gain de fonction des récepteurs mutants associés à ces deux maladies. Dans plus de 50% des cas, les mutations faux-sens affectent négativement l’adoption d’une conformation native par le V2R, provoquant la reconnaissance et la rétention intracellulaire des mutants par le système de contrôle de qualité du réticulum endoplasmique. Nos résultats ont démontré que l’interaction entre les récepteurs mutants et le chaperon moléculaire calnexine est dépendante de N-glycosylation et que sa durée varie en fonction de la mutation. De plus, l’importance de cette modification co-traductionnelle et des interactions lectines-sucres dans le processus de maturation d’un mutant donné s’est avérée une caractéristique intrinsèque, puisque l’absence de N-glycosylation n’a pas affecté le mutant Y128S (phénotype léger) tandis que la maturation du mutant W164S (phénotype sévère) a été totalement abolie. Nos résultats suggèrent aussi que l’action des chaperons pharmacologiques (CP), molécules favorisant la maturation des mutants du V2R, peut survenir à différentes étapes au cours du processus de maturation, selon le mutant réchappé. Ces différences entre muta nts suggèrent des processus biosynthétiques ‘personnalisés’ dictés par la nature de la mutation impliquée et pourraient expliquer la différence de sévérité des manifestations cliniques chez les patients porteurs de ces mutations. Bien qu’une récupération de fonction ait été obtenue pour les mutants Y128S et W164S par un traitement au CP, il n’en est pas de même pour toutes les mutations occasionnant un défaut conformationnel. C’est ce que nous avons démontré pour le mutant V88M, affligé de deux défauts, soit une faible efficacité de maturation combinée à une basse affinité pour l’AVP. Dans ce cas, et malgré une augmentation du nombre de récepteurs mutants la surface cellulaire, la diminution de l’affinité apparente du récepteur mutant pour l’AVP a été exacerbée par la présence résiduelle de CP à son site de liaison, rendant impossible l’activation du récepteur aux concentrations physiologiques d’AVP. Les mutants R137C et R137L ont une activité constitutive élevée et mènent au NSIAD tandis que la substitution de cette même arginine par une histidine (R137H) mène au DINc. Ces trois mutants se sont avéré partager plusieurs caractéristiques, dont une efficacité de maturation réduite et une désensibilisation spontanée élevée. La seule différence iden tifiée entre ces mutants est leur niveau d’activité constitutive. Le CP utilisé dans nos études possède aussi la propriété d’agoniste inverse, mais n’a pourtant pas diminué l’activité constitutive des mutants R137C/L, suggérant une conformation active ‘figée’. Seul l’effet chaperon a été observé, entraînant la hausse de récepteurs à la surface cellulaire, qui se traduit par une augmentation de la production de second messager. Nous avons par contre suggéré l’utilisation d’AVP puisqu’il favorise l’endocytose des récepteurs R137/L sans promouvoir leur activation, diminuant ainsi le nombre de récepteurs actifs à la surface cellulaire. Nous avons identifié la première mutation occasionnant un gain de fonction du V2R qui n’implique pas l’arginine 137. Le mutant F229V a une activité constitutive élevée et, contrairement aux R137C et R137L, il n’est pas sujet à une désensibilisation spontanée accrue. L’observation que des agonistes inverses sont aptes à inhiber l’activité constitutive de ce nouveau mutant est une découverte importante puisque l’insuccès obtenu avec les mutations précédentes suggérait que ces molécules n’étaient pas utiles pour le traitement du NSIAD. Considérés globalement, ces travaux illustrent le caractère particulier des formes mutantes du V2R et l’importance de bien cerner les conséquences fonctionnelles des mutations afin d’apporter aux patients atteints de DINc ou NSIAD une thérapie personnalisée, et de développer de nouveaux agents thérapeutiques adaptés aux besoins.

Génération efficace de graphes d’appels dynamiques complets

Analyser le code permet de vérifier ses fonctionnalités, détecter des bogues ou améliorer sa performance. L’analyse du code peut être statique ou dynamique. Des approches combinants les deux analyses sont plus appropriées pour les applications de taille industrielle où l’utilisation individuelle de chaque approche ne peut fournir les résultats souhaités. Les approches combinées appliquent l’analyse dynamique pour déterminer les portions à problèmes dans le code et effectuent par la suite une analyse statique concentrée sur les parties identifiées. Toutefois les outils d’analyse dynamique existants génèrent des données imprécises ou incomplètes, ou aboutissent en un ralentissement inacceptable du temps d’exécution. Lors de ce travail, nous nous intéressons à la génération de graphes d’appels dynamiques complets ainsi que d’autres informations nécessaires à la détection des portions à problèmes dans le code. Pour ceci, nous faisons usage de la technique d’instrumentation dynamique du bytecode Java pour extraire l’information sur les sites d’appels, les sites de création d’objets et construire le graphe d’appel dynamique du programme. Nous démontrons qu’il est possible de profiler dynamiquement une exécution complète d’une application à temps d’exécution non triviale, et d’extraire la totalité de l’information à un coup raisonnable. Des mesures de performance de notre profileur sur trois séries de benchmarks à charges de travail diverses nous ont permis de constater que la moyenne du coût de profilage se situe entre 2.01 et 6.42. Notre outil de génération de graphes dynamiques complets, nommé dyko, constitue également une plateforme extensible pour l’ajout de nouvelles approches d’instrumentation. Nous avons testé une nouvelle technique d’instrumentation des sites de création d’objets qui consiste à adapter les modifications apportées par l’instrumentation au bytecode de chaque méthode. Nous avons aussi testé l’impact de la résolution des sites d’appels sur la performance générale du profileur.

Développement et caractérisation d’une méthode photonique pour créer des distributions spatiales de protéines

Les cellules sont capables de détecter les distributions spatiales de protéines et ainsi de migrer ou s’étendre dans la direction appropriée. Une compréhension de la réponse cellulaire aux modifications de ces distributions spatiales de protéines est essentielle pour l’avancement des connaissances dans plusieurs domaines de recherches tels que le développement, l’immunologie ou l’oncologie. Un exemple particulièrement complexe est le guidage d’axones se déroulant pendant le développement du système nerveux. Ce dernier nécessite la présence de plusieurs distributions de molécules de guidages étant attractives ou répulsives pour connecter correctement ce réseau complexe qu’est le système nerveux. Puisque plusieurs indices de guidage collaborent, il est particulièrement difficile d’identifier la contribution individuelle ou la voie de signalisation qui est déclenchée in vivo, il est donc nécessaire d’utiliser des méthodes pour reproduire ces distributions de protéines in vitro. Plusieurs méthodes existent pour produire des gradients de protéines solubles ou liées aux substrats. Quelques méthodes pour produire des gradients solubles sont déjà couramment utilisées dans plusieurs laboratoires, mais elles limitent l’étude aux distributions de protéines qui sont normalement sécrétées in vivo. Les méthodes permettant de produire des distributions liées au substrat sont particulièrement complexes, ce qui restreint leur utilisation à quelques laboratoires. Premièrement, nous présentons une méthode simple qui exploite le photoblanchiment de molécules fluorescentes pour créer des motifs de protéines liées au substrat : Laser-assisted protein adsorption by photobleaching (LAPAP). Cette méthode permet de produire des motifs de protéines complexes d’une résolution micrométrique et d’une grande portée dynamique. Une caractérisation de la technique a été faite et en tant que preuve de fonctionnalité, des axones de neurones du ganglion spinal ont été guidés sur des gradients d’un peptide provenant de la laminine. Deuxièmement, LAPAP a été amélioré de manière à pouvoir fabriquer des motifs avec plusieurs composantes grâce à l’utilisation de lasers à différentes longueurs d’onde et d’anticorps conjugués à des fluorophores correspondants à ces longueurs d’onde. De plus, pour accélérer et simplifier le processus de fabrication, nous avons développé LAPAP à illumination à champ large qui utilise un modulateur spatial de lumière, une diode électroluminescente et un microscope standard pour imprimer directement un motif de protéines. Cette méthode est particulièrement simple comparativement à la version originale de LAPAP puisqu’elle n’implique pas le contrôle de la puissance laser et de platines motorisées, mais seulement d’envoyer l’image du motif désiré au modulateur spatial. Finalement, nous avons utilisé LAPAP pour démontrer que notre technique peut être utilisée dans des analyses de haut contenu pour quantifier les changements morphologiques résultant de la croissance neuronale sur des gradients de protéines de guidage. Nous avons produit des milliers de gradients de laminin-1 ayant différentes pentes et analysé les variations au niveau du guidage de neurites provenant d’une lignée cellulaire neuronale (RGC-5). Un algorithme pour analyser les images des cellules sur les gradients a été développé pour détecter chaque cellule et quantifier la position du centroïde du soma ainsi que les angles d’initiation, final et de braquage de chaque neurite. Ces données ont démontré que les gradients de laminine influencent l’angle d’initiation des neurites des RGC-5, mais n’influencent pas leur braquage. Nous croyons que les résultats présentés dans cette thèse faciliteront l’utilisation de motifs de protéines liées au substrat dans les laboratoires des sciences de la vie, puisque LAPAP peut être effectué à l’aide d’un microscope confocal ou d’un microscope standard légèrement modifié. Cela pourrait contribuer à l’augmentation du nombre de laboratoires travaillant sur le guidage avec des gradients liés au substrat afin d’atteindre la masse critique nécessaire à des percées majeures en neuroscience.

Identification de nouveaux substrats des kinases Erk1/2 par une approche bio-informatique, pharmacologique et phosphoprotéomique

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle omniprésente des protéines Cette modification est ajoutée et enlevée par l’activité enzymatique respective des protéines kinases et phosphatases. Les kinases Erk1/2 sont au cœur d’une voie de signalisation importante qui régule l’activité de protéines impliquées dans la traduction, le cycle cellulaire, le réarrangement du cytosquelette et la transcription. Ces kinases sont aussi impliquées dans le développement de l’organisme, le métabolisme du glucose, la réponse immunitaire et la mémoire. Différentes pathologies humaines comme le diabète, les maladies cardiovasculaires et principalement le cancer, sont associées à une perturbation de la phosphorylation sur les différents acteurs de cette voie. Considérant l’importance biologique et clinique de ces deux kinases, connaître l’étendue de leur activité enzymatique pourrait mener au développement de nouvelles thérapies pharmacologiques. Dans ce contexte, l’objectif principal de cette thèse était de mesurer l’influence de cette voie sur le phosphoprotéome et de découvrir de nouveaux substrats des kinases Erk1/2. Une étude phosphoprotéomique de cinétique d’inhibition pharmacologique de la voie de signalisation Erk1/2 a alors été entreprise. Le succès de cette étude était basé sur trois technologies clés, soit l’enrichissement des phosphopeptides avec le dioxyde de titane, la spectrométrie de masse haut débit et haute résolution, et le développement d’une plateforme bio-informatique nommée ProteoConnections. Cette plateforme permet d’organiser les données de protéomique, évaluer leur qualité, indiquer les changements d’abondance et accélérer l’interprétation des données. Une fonctionnalité distinctive de ProteoConnections est l’annotation des sites phosphorylés identifiés (kinases, domaines, structures, conservation, interactions protéiques phospho-dépendantes). Ces informations ont été essentielles à l’analyse des 9615 sites phosphorylés sur les 2108 protéines identifiées dans cette étude, soit le plus large ensemble rapporté chez le rat jusqu’à ce jour. L’analyse des domaines protéiques a révélé que les domaines impliqués dans les interactions avec les protéines, les acides nucléiques et les autres molécules sont les plus fréquemment phosphorylés et que les sites sont stratégiquement localisés pour affecter les interactions. Un algorithme a été implémenté pour trouver les substrats potentiels des kinases Erk1/2 à partir des sites identifiés selon leur motif de phosphorylation, leur cinétique de stimulation au sérum et l’inhibition pharmacologique de Mek1/2. Une liste de 157 substrats potentiels des kinases Erk1/2 a ainsi été obtenue. Parmi les substrats identifiés, douze ont déjà été rapportés et plusieurs autres ont des fonctions associées aux substrats déjà connus. Six substrats (Ddx47, Hmg20a, Junb, Map2k2, Numa1, Rras2) ont été confirmés par un essai kinase in vitro avec Erk1. Nos expériences d’immunofluorescence ont démontré que la phosphorylation de Hmg20a sur la sérine 105 par Erk1/2 affecte la localisation nucléocytoplasmique de cette protéine. Finalement, les phosphopeptides isomériques positionnels, soit des peptides avec la même séquence d’acides aminés mais phosphorylés à différentes positions, ont été étudiés avec deux nouveaux algorithmes. Cette étude a permis de déterminer leur fréquence dans un extrait enrichi en phosphopeptides et d’évaluer leur séparation par chromatographie liquide en phase inverse. Une stratégie analytique employant un des algorithmes a été développée pour réaliser une analyse de spectrométrie de masse ciblée afin de découvrir les isomères ayant été manqués par la méthode d’analyse conventionnelle.

Les partenaires d'interactions de Cirhin, la protéine portant la mutation responsable de la Cirrhose Amérindienne Infantile (NAIC)

La Cirrhose Amérindienne Infantile (CAI, NAIC) est une forme de cholestase non-syndromique héréditaire à transmission autosomique récessive, décrite uniquement chez les enfants autochtones du Nord-Ouest québécois et issue d’un effet fondateur. La maladie se présente d’abord sous la forme d’une jaunisse néonatale chez un enfant autrement en bonne santé, qui progresse en cirrhose de type biliaire dans l’enfance et dans l’adolescence. Le taux de survie à l’âge adulte est inférieur à 50% et la seule thérapie efficace à ce jour pour les patients avancés dans la maladie demeure la transplantation hépatique. Les recherches antérieures menées par le groupe ont permis d’identifier le locus ainsi que le gène responsable de NAIC, qui encode la protéine nucléolaire Cirhin. Cirhin est exprimée uniquement dans le foie et tous les patients sont homozygotes pour la mutation R565W. La fonction de Cirhin est inconnue, mais les motifs WD40 retrouvés dans sa séquence indiquent qu’elle participerait à des interactions protéine-protéine et serait impliquée dans un mécanisme moléculaire de base. Cirhin interagit avec la protéine nucléaire Cirip, qui a un effet positif important sur la transcription de l’élément activateur HIV-1 LTR et qui a un rôle dans la prolifération cellulaire. L’interaction de Cirhin et Cirip est affectée par la mutation R565W. À l’aide de la technique du double hybride chez la levure, la protéine nucléolaire Nol11 a été identifiée comme étant un partenaire d’interaction de Cirhin. Par son interaction avec MARK3 et c-Myc, Nol11 serait impliquée dans des processus cellulaires tels que le contrôle du cycle cellulaire, la polarité, la croissance cellulaire et possiblement la biogenèse des ribosomes. La portion C-terminale de Nol11 interagirait avec Cirhin, et la mutation R565W abolit cette interaction. Le résidu R565 serait donc important pour la fonctionnalité de Cirhin.

Étude de la biogenèse de l'autotransporteur AIDA-I d'Escherichia coli

Les autotransporteurs monomériques, appartenant au système de sécrétion de type V, correspondent à une famille importante de facteurs de virulence bactériens. Plusieurs fonctions, souvent essentielles pour le développement d’une infection ou pour le maintien et la survie des bactéries dans l’organisme hôte, ont été décrites pour cette famille de protéines. Malgré l’importance de ces protéines, notre connaissance de leur biogenèse et de leur mécanisme d’action demeure relativement limitée. L’autotransporteur AIDA-I, retrouvé chez diverses souches d’Escherichia coli, est un autotransporter multifonctionnel typique impliqué dans l’adhésion et l’invasion cellulaire ainsi que dans la formation de biofilm et d’agrégats bactériens. Les domaines extracellulaires d’autotransporteurs monomériques sont responsables de la fonctionnalité et possèdent pratiquement tous une structure caractéristique d’hélice β. Nous avons mené une étude de mutagenèse aléatoire avec AIDA-I afin de comprendre la base de la multifonctionnalité de cette protéine. Par cette approche, nous avons démontré que les domaines passagers de certains autotransporteurs possèdent une organisation modulaire, ce qui signifie qu’ils sont construits sous la forme de modules fonctionnels. Les domaines passagers d’autotransporteurs peuvent être clivés et relâchés dans le milieu extracellulaire. Toutefois, malgré la diversité des mécanismes de clivage existants, plusieurs protéines, telles qu’AIDA-I, sont clivées par un mécanisme qui demeure inconnu. En effectuant une renaturation in vitro d’AIDA-I, couplée avec une approche de mutagenèse dirigée, nous avons démontré que cette protéine se clive par un mécanisme autocatalytique qui implique deux acides aminés possédant un groupement carboxyle. Ces résultats ont permis la description d’un nouveau mécanisme de clivage pour la famille des autotransporteurs monomériques. Une des particularités d’AIDA-I est sa glycosylation par une heptosyltransférase spécifique nommée Aah. La glycosylation est un concept plutôt récent chez les bactéries et pour l’instant, très peu de protéines ont été décrites comme glycosylées chez E. coli. Nous avons démontré que Aah est le prototype pour une nouvelle famille de glycosyltransférases bactériennes retrouvées chez diverses espèces de protéobactéries. La glycosylation d’AIDA-I est une modification cytoplasmique et post-traductionnelle. De plus, Aah ne reconnaît pas une séquence primaire, mais plutôt un motif structural. Ces observations sont uniques chez les bactéries et permettent d’élargir nos connaissances sur la glycosylation chez les procaryotes. La glycosylation par Aah est essentielle pour la conformation d’AIDA-I et par conséquent pour sa capacité de permettre l’adhésion. Puisque plusieurs homologues d’Aah sont retrouvés à proximité d’autotransporteurs monomériques putatifs, cette famille de glycosyltranférases pourrait être importante, sinon essentielle, pour la biogenèse et/ou la fonction de nombreux autotransporteurs. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse apportent de nouvelles informations et permettent une meilleure compréhension de la biogenèse d’une des plus importantes familles de protéines sécrétées chez les bactéries Gram négatif.

Rivalité et marchés : une éthique adversative pour les agents économiques

Thèse réalisée en cotutelle avec l'Institut supérieur de philosophie, Université catholique de Louvain.