Otimização da produção de frango de corte em condições de estresse por calor

Foram realizados dois experimentos (EXP) com a finalidade de apresentar alternativas para reduzir os efeitos do estresse por calor (EPC), aumentando a produtividade em épocas quentes. O primeiro EXP teve como objetivos verificar o efeito de dietas com mais gordura (2,4 vs 4,0%) e menos proteína bruta (19,5 vs 18,5%) na metabolizabilidade, desempenho, rendimento de carcaça, parâmetros morfológicos (baço, bursa, coração, intestino e fígado), bioquímicos (proteínas totais, glicose, fructosamina, albumina e globulinas) e hematológicos (heterófilos. linfócitos, eosinófilos, basófilos, monócitos e relação heterófilo:linfócito) das aves aos 42 dias submetidas a EPC cíclico (25-32C). O efeito direto do EPC no desempenho e na metabolizabilidade da dieta, na situação de consumo pareado (comparado ao ambiente termoneutro) Também foi estudada. O segundo EXP teve como objetivos verificar o efeito de dietas suplementadas com vitaminas C e E (100UI de vitamina E/kg de ração e 300 ppm de vitamina C/kg de ração) e minerais orgânicos Zn e Se (40 ppm Zn e 0,3 ppm Se/kg de ração) no desempenho de frangos de corte submetidos a EPC e nos parâmetros morfológicos, bioquímicos e hematológicos das aves aos 35 dias. Foi observado que a queda de desempenho verificada no calor está relacionada principalmente com a diminuição no consumo e à redução na metabolizabilidade da matéria seca. A dieta com 1,6% a mais de gordura e 1% a menos proteína proporcionou às aves em EPC melhora na conversão alimentar (CA), mas não interferiu no rendimento de carcaça e cortes. Esta dieta também proporcionou um melhor peso relativo de bursa, a diminuição no número de linfócitos, heterófilos, relação H/L e monócitos das aves em EPC, indicando que as alterações metabólicas ocasionadas pelo estresse foram atenuadas pela dieta. No segundo EXP, a suplementação vitamínica e/ou mineral melhorou o desempenho das aves em função de um menor consumo que resultou em melhor CA, independentemente do ambiente. O EPC reduziu o peso absoluto e relativo dos órgãos linfóides, os valores de hemoglobina, aumentou o número de heterófilos e a relação H/L . As suplementações vitamínico e/ou mineral não influenciaram os parâmetros bioquímicos séricos e hematológicos dos frangos em EPC. A relação H/L foi um bom indicador de estresse, aumentando sempre que as aves estiveram estressadas, independentemente do tipo de estresse. O peso dos órgãos linfóides também pode ser considerado um bom indicador de EPC desde que não estejam sofrendo outro tipo de estresse.

Os determinantes morfogenéticos da linguagem expressiva

O presente trabalho parte de uma reinterpretação dos determinantes e da organização da linguagem expressiva em indivíduos portadores de deficiência da audição. Neste sentido, submete a uma análise crítica as condições de estruturação e aquisição de um sistema de comunicação simbólica de natureza essencialmente verbal por parte de tais indivíduos. Avalia, em particular modo, a perspectiva de uma organização fonológica do discurso em portadores de surdez profunda “pré-linguagem~, como um processo que ultrapassa as possibilidades d e uma mera aprendizagem. A linguagem vista então como um processo semiótico de natureza percepto-expressiva, que se estabelece ao longo do desenvolvimento filogenético e ontogenético é assim interpretada, a luz de um novo modelo teórico sobre a Cognição Humana . Tal modelo, pautado em contribuições da Cibernética, da Lógica, da Linguística e da Epistemologia Genética, estabelece plataformas morfogenéticas, a partir das quais o psiquismo se organizaria. Desta maneira, 2 (dois) objetivos essenciais pretendem ser atingidos no presente e s tudo. 1º ) oferecer uma base teórica à dinâmica e processual cognitivo em que o surdo se vê envolvido ao longo da aprendizagem de um sistema verbal-simbólico - à luz de uma hipótese pré-formista, de base morfogenética. 2º) avaliar, a partir da linguagem expressiva escrita apresentada por deficientes auditivos com perda profunda ~pré-linguagem", a hipótese formulada por F. Lo P. Seminério (1980) "de uma memória morfogenética na espécie humana", a partir do que, toda a atividade cognitiva se organizaria, passando a operar segundo estruturas-código, pré-fixadas. A fim de confirmar as proposições estabelecidas, apresenta - se uma Verificação Empírica através de estudos exploratórios realizados com 6 (seis) sujeitos. Os resultados obtidos confirmam a existência de um marco seletivo e organizador de natureza audio-fonética, também entre indivíduos surdos. Constata-se que a informação veiculada é capaz de ser tratada, programada e recuperada linguisticamente, ainda que sem a possibilidade de um mecanismo de retroalimentação ao sistema que se desenvolve. O que equivale a dizer, que o indivíduo surdo apesar de não ouvir, programa à nível áudio-fonético, programação essa que vem a ser recuperada ou atualizada graças aos recursos e técnicas pedagógicas especializadas. Tais resultados sugerem uma reavaliação dos métodos psicopedagógicos usuais nesta área, podendo-se retomar sob nova orientação o debate de temas atuais, nas diretrizes das técnicas e do instrumental utilizado.

Avaliação histológica da aplicação de um campo magnético em enxertos ósseos autógenos em ratos

Proposição: avaliar a qualidade do reparo de cavidades cirúrgicas com enxertos ósseos sob efeito de um campo magnético permanente, sepultado, in vivo. Materiais e Método: foi utilizada uma estrutura metálica constituída de duas arruelas de aço inoxidável, fixadas, isoladamente, à estrutura óssea por parafusos de titânio comercialmente puro. Neste estudo experimental, com grupos teste e controle, foram selecionados 30 Rattus norvergicus albinus, linhagem Wistar, divididos em seis grupos: três testes e três controles. Os animais foram submetidos à cirurgia acessando-se o fêmur direito para criação de uma cavidade cirúrgica e fixação de um par de dispositivos metálicos, tangenciando as margens dessa cavidade. Em seguida, o osso removido da cavidade cirúrgica foi reimplantado de modo a simular um enxerto ósseo autógeno. Nos grupos-teste, as arruelas encontravam-se imantadas, evento que diferiu nos grupos-controle. Os animais foram mortos aos 15, 45 e 60 dias pós-operatórios. As peças foram submetidas à avaliação histológica. Resultados: comparando os grupos-teste e controle durante os períodos experimentais de 15, 45 e 60 dias, houve favorecimento no processo de integração do enxerto ósseo. As formações ósseas, nas proximidades das regiões das arruelas e dos enxertos ósseos autógenos, nos grupos teste aos 45 e 60 dias pós-operatórios, demonstram a ação permanente do campo magnético. Conclusões: a liga de aço inoxidável imantada, sepultada, in vivo, foi capaz de favorecer o processo de integração do enxerto ósseo. Em todos os tempos experimentais, foi predominante o estímulo da neoformação óssea, no grupo teste quando comparado ao controle.

Parâmetros bioquímicos de alterações do citoesqueleto no modelo experimental da doença do Xarope do Bordo

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência na atividade do complexo desidrogenase dos cetoácidos de cadeia ramificada, levando ao acúmulo de concentrações milimolares dos seguintes α-cetoácidos de cadeia ramificada (CACR): ácidos α-cetoisocapróico (CIC), α-ceto-β-metilvalérico (CMV), α-cetoisovalérico (CIV) e dos seus aminoácidos precursores, leucina, isoleucina e valina em tecidos de pacientes afetados. Essa doença é caracterizada por severos sintomas neurológicos que incluem edema e atrofia cerebral, entretanto, os mecanismos envolvidos na neuropatologia da DXB ainda não são bem estabelecidos. Neste trabalho utilizamos um modelo experimental de DXB com o objetivo de verificar os efeitos dos CACR que se acumulam nessa desordem neurodegenerativa sobre o citoesqueleto de células neurais de ratos. Nesse modelo fatias de córtex cerebral de ratos de diferentes idades, ou culturas de células neurais foram incubados com concentrações variando de 0,1 a 10 mM de cada metabólito. Inicialmente demonstramos que o CIC, CMV e CIV inibiram a captação de glutamato em fatias de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. O CIC inibiu a captação de glutamato em ratos de 9, 21 e 60 dias de idade, enquanto o CMV e o CIV inibiram a captação de glutamato em animais de 21 e 60 dias. Observamos que o CIC alterou a fosforilação de proteínas do citoesqueleto de um modo dependente do desenvolvimento através de receptores glutamatérgicos ionotrópicos em fatias de córtex cerebral de ratos. O metabólito causou diminuição da fosforilação dos filamentos intermediários (FI) em ratos de 9 dias de idade e aumento dessa fosforilação em animais de 21 dias de vida. Também demonstramos que em animais de 9 dias de idade o efeito do CIC foi mediado pelas proteínas fosfatases PP2A e principalmente pela PP2B, uma proteína fosfatase dependente de cálcio, enquanto que em animais de 21 dias de idade o efeito deste metabólito foi mediado pela proteína quinase dependente de AMP cíclico (PKA) e pela proteína quinase dependente de cálcio e calmodulina (PKCaMII). Além disso, verificamos que o CIC promoveu um aumento nos níveis intracelulares dos segundos mensageiros AMPc e Ca2+. O aumento do Ca2+ intracelular provocado pelo CIC foi demonstrado pelo uso de bloqueadores específicos de canais de cálcio dependentes de voltagem tipo L, por exemplo, nifedipina, canais de cálcio dependentes de ligantes, por exemplo, NMDA e de quelantes de cálcio intracelular, por exemplo, BAPTA-AM. Por outro lado, o CMV aumentou a fosforilação de FI somente em ratos de 12 dias de idade, sendo esse efeito mediado por receptores GABAérgicos do tipo A e B, desencadeando a ativação das proteínas quinases PKA e PKCaMII. É importante salientar que o CIV não alterou a atividade do sistema fosforilante em nenhuma das idades estudadas. Além dos efeitos causados pelos CACR que se acumulam na DXB sobre a atividade do sistema fosforilante associado aos FI em fatias de córtex cerebral de ratos, demonstramos que esses metabólitos foram capazes de alterar a fosforilação da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) na linhagem de glioma C6. Essa alteração de fosforilação causou uma reorganização do citoesqueleto de GFAP e um aumento no imunoconteúdo da GFAP na fração citoesquelética. Também verificamos que o CIC, o CMV e o CIV, em concentrações encontradas em pacientes portadores de DXB, levaram a uma reorganização dos filamentos de GFAP e do citoesqueleto de actina de astrócitos em cultura, causando uma importante alteração na morfologia destas células. As alterações do citoesqueleto levaram a morte celular progressiva quando os astrócitos foram expostos por várias horas aos metabólitos. Demonstramos também que os efeitos dos CACR sobre a morfologia dos astrócitos foram desencadeados por mecanismos de membrana que diminuíram a atividade da Rho GTPase. Esse mecanismo foi evidenciado utilizando-se ácido lisofosfatídico (LPA), um ativador específico da RhoA, o qual preveniu os efeitos causados pelos CACR em culturas de astrócitos. É importante salientar que as alterações morfológicas e a morte celular induzida pelos CACR em culturas de astrócitos foram totalmente evitadas com a suplementação de creatina às culturas. Também verificamos que a atividade da creatina quinase foi inibida pelos metabólitos, indicando que a homeostase energética provavelmente estaria envolvida nos efeitos causados pelos CACR. XI Sabe-se que as alterações do citoesqueleto estão relacionadas com inúmeras doenças neurodegenerativas. Portanto, é provável que as alterações causadas pelos CACR nos mecanismos de membrana que regulam níveis de segundos mensageiros intracelulares e cascatas de sinalização celular, na perda do equilíbrio fisiológico do sistema fosforilante associado ao citoesqueleto e conseqüentemente na sua reorganização, possam ter importantes conseqüências para a função neural. Com base nos presentes resultados demonstramos que os CACR que se acumulam na DXB levam à desorganização do citoesqueleto em um modelo experimental podendo ser uma contribuição importante para o estudo da patogênese do sistema nervoso central característica dos pacientes portadores de DXB.

Avaliação do reparo ósseo em fêmures de ratos após implante de blocos de cimento de fosfato de cálcio e enxerto ósseo autógeno

Proposição: o trabalho busca descrever, por resultado histológico, o processo de reparo ósseo de cavidades cirurgicamente criadas avaliando a biocompatibilidade e osteocondutibilidade do cimento de α-fosfato tricálcico (CFtC) (SANTOS, 2002); e o comportamento da cicatrização óssea frente ao implante de CFtC comparada ao enxerto ósseo autógeno e à cavidade cirúrgica livre de enxerto. Metodologia: foram utilizados 30 ratos da raça Rattus novergicus albinus, Cepa Wistar, divididos em cinco grupos. O Grupo I correspondeu ao período de três; Grupo II, de sete; Grupo III, de 14; Grupo IV, de 21; Grupo V, de 60 dias pós-operatórios. Na diáfise óssea de cada fêmur direito, houve a confecção de três cavidades ósseas, sendo designadas: teste (T), na porção proximal do fêmur, que recebeu implantação do bloco de CFtC; controle positivo (C+), na porção distal, onde foi realizada a enxertia óssea autógena; e controle negativo (C-), na porção média, que permaneceu livre de enxerto. Resultados: aos três dias pós-operatórios, observou-se a presença de infiltrado inflamatório, hemácias e proliferação fibroblástica em T, C- e C+. Aos sete dias, a intensa neoformação óssea foi constatada nos grupos T e C+, o que não ocorreu no grupo C-. Nesse período, verificou-se início da reabsorção do CFtC pelas células do sistema fagocitário. Aos 14 dias, houve intensa atividade osteoblástica nos três grupos, assim como em 21 dias. Aos 60 dias pós-operatórios, nos grupos T, C- e C+, o osso neoformado assemelhou-se ao osso circundante, sendo que em C- e C+ verificou-se discreta solução de continuidade no osso cortical ostectomizado. Em T, não houve a oclusão do teto da cavidade. Conclusões: CFtC, formulado por Santos (2002), responde a biocompatibilidade e osteotransdutividade; o osso alveolar, em ratos, frente ao implante do CFtC e ao enxerto ósseo autógeno, realiza um processo de neoformação óssea, já no período de sete dias, assim, quando comparados, o grupo C- com os grupos T e C+, declara-se uma aceleração inicial do processo cicatricial nas cavidades preenchidas; e aos 60 dias, os grupos controles apresentaram cicatrização óssea quase total, sendo assim, sugere-se, experimentalmente, tempos de implantação superiores há 60 dias, para análise da reabsorção do cimento estudado (SANTOS, 2002).

Eosinófilos e proteína catiônica eosinofílica em bronquiolite viral aguda

Introdução: Bronquiolite viral aguda (BVA) é a doença respiratória mais grave de lactentes previamente hígidos. Ocorre em epidemias anuais durante os meses de inverno, sendo uma causa freqüente de hospitalizações nesta faixa etária. O agente etiológico mais freqüente é o vírus respiratório sincicial (VRS). É uma doença benigna na maioria dos casos, mas pode apresentar-se de forma grave em alguns pacientes e freqüentemente produz seqüelas após o episódio agudo. Nos últimos anos vários estudos têm procurado elucidar a patogênese da BVA e suas seqüelas, e mecanismos imunológicos e de resposta inflamatória têm sido pesquisados. O papel dos eosinófilos e suas proteínas citotóxicas, como a Proteína Catiônica Eosinofílica (PCE), têm sido investigado na BVA, com resultados inconclusivos. O objetivo do presente estudo é determinar a contagem de eosinófilos no sangue periférico e a concentração sérica de PCE em pacientes internados com BVA e comparar com diferentes graus de gravidade. Pacientes e Métodos: Foi realizado um estudo com lactentes menores de 1 ano que internaram no Hospital da Criança Santo Antônio (HCSA) no período de junho a agosto de 1999 com quadro clínico de BVA com os seguintes critérios de inclusão: freqüência respiratória maior ou igual a 60 movimentos por minuto, ou saturação da hemoglobina (satHb) menor do que 95%. Foram excluídos pacientes com história prévia de doença respiratória inferior e pacientes com uso prévio de cortiscoteróides. Os pacientes elegíveis para o estudo foram avaliados nas primeiras 12 horas de internação. Foi colhida amostra de secreção nasofaríngea para pesquisa de vírus respiratpórios. Foi colhida amostra de sangue para hemograma e reservada uma amostra para determinação da PCE. Foram realizadas comparações do número de eosinófilos e concentração de PCE entre grupos de pacientes conforme a gravidade, sexo e faixa etária. Foram utilizados como critérios de gravidade a satHb em ar ambiente e a prevalência de ventilação mecânica. A análise estatística foi realizada através dos testes de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis, e teste de correlação de Spearman para as associações. Foi considerado  (alfa) crítico de 5% para significância estatística. Resultados: Foram estudados 58 pacientes, 32 (55%) eram do sexo masculino. A idade variou de 0 a 10 meses, com média de 2 meses. Dezenove pacientes foram classificados como graves de acordo com a satHb, inferior a 90%. Sete pacientes necessitaram ventilação mecânica, resultando numa prevalência de 12%. A prevalência do VRS foi de 62% entre os pacientes nos quais foi realizada pesquisa virológica (48 pacientes). A contagem de eosinófilos sangüíneos variou de 0 a 1104, com mediana de 100. O número de eosinófilos foi maior nos lactentes menores de 3 meses em relação aos maiores de 3 meses (p=0.052). Verificou-se que o número de eosinófilos foi menor nos pacientes com saturação mais baixa (p<0.05). Os pacientes que necessitaram ventilação mecânica também apresentaram menor número de eosinófilos, porém sem significância estatística. A concentração sérica de PCE na amostra estudada variou de 2 a 114 g/litro, com mediana em 6 g/l. Não houve correlação com satHb nem com ventilação mecânica e PCE. Conclusões: Houve associação entre baixo número de eosinófilos e gravidade da BVA medida pela satHb. Não houve associação entre PCE e gravidade. Estudos adicionais são necessários para elucidar melhor o papel de eosinófilos e seus derivados na determinação da gravidade da bronquiolite.

Associação entre a ingestão de macronutrientes e a obesidade abdominal com a doença arterial coronária

Introdução: A incidência da doença arterial coronária é uma das principais causas de morbidade e motalidade em diversos países e o estudo dos fatores de risco têm grande importância na prevenção e no tratamento dessa enfermidade. Entre outros fatores, a obesidade e a obesidade abdominal têm sido associadas com a maior incidência de DAC. A ingestão diária de nutrientes também pode estar relacionada com essa doença, porém, uma vez que a alimentação é complexa e contém diversos nutrientes, ainda não foi possível elucidar o impacto da alimentação no risco de desenvolver a doença arterial coronária. Objetivo: Avaliar a relação entre o consumo alimentar diário, a presença de obesidade abdominal e achados angiográficos de obstrução arterial em pacientes portadores de cardiopatia isquêmica, submetidos a cateterismo cardíaco. Métodos: Foi realizado um estudo transversal, com 284 pacientes submetidos a cateterismo cardíaco, da unidade de hemodinâmica de um hospital universitário. Foi avaliada a RCQ, o IMC, a ingestão alimentar diária através de um inquérito nutricional, a análise bioquímica do sangue e a avaliação do laudo do cateterismo cardíaco. Resultados: Dos pacientes avaliados, 172 indivíduos (60,6%) apresentavam alterações em uma ou mais artérias coronárias. A ingestão média diária de calorias foi de 2450,56 Kcal/dia. O consumo de proteínas foi em média 1,66 g/Kg/dia, de carboidratos foi de 3,83 g/Kg/dia e de lipídeos foi de 1,21 g/Kg/dia. A idade, o sexo masculino, os níveis séricos de triglicerídeos, o consumo de álcool e a glicemia em jejum foram estatisticamente significativos na análise multivariada. Conclusão: Nos pacientes avaliados, o consumo diário de calorias encontra-se adequado, porém a ingestão de proteínas, carboidratos e lipídeos estão inadequados. Em relação aos fatores de risco para DAC, as mulheres apresentaram maior associação para desenvolver a síndrome metabólica do que os homens.

Utilidade da ultra-sonografia e cintilografia da paratireóide no diagnóstico do hiperparatireoidismo secundário em pacientes com insuficiência renal crônica em hemodiálise

A osteodistrofia renal é uma complicação comum da insuficiência renal crônica. A biópsia óssea continua sendo o melhor método para o diagnóstico das doenças ósseas metabólicas. O objetivo deste estudo foi avaliar a utilidade da ultra-sonografia e da cintilografia com Tc-99m-sestamibi da paratireóide, como métodos diagnósticos não invasivos em pacientes com osteodistrofia renal em hemodiálise. Foram investigados 30 pacientes com insuficiência renal crônica, em tratamento com hemodiálise por no mínimo 6 meses, com sintomas e/ou com alterações bioquímicas sugestivas de doença óssea renal, sendo 19 mulheres e 11 homens, com média de idade de 43,9  9,17 anos. Quinze pacientes (50%) apresentaram diagnóstico de hiperparatireoidismo secundário, 5 (16,7%) de doença óssea mista, 3 (10%) de osteomalácia e 3 (10%) de doença óssea adinâmica. Glândulas aumentadas da paratireóide foram observadas em 12 (40%) pacientes na ultra-sonografia e em 15 (50%) na cintilografia com Tc-99m-sestamibi. O grupo de pacientes com glândulas aumentadas da paratireóide na ultra-sonografia, comparado com o grupo com glândulas não detectadas, apresentaram níveis séricos de PTHi aumentados (1536,6  881,8 x 811,7  705,5 pg/ml, p<0,05) e níveis séricos de albumina menores (3,690,24 x 4,030,44 g/dl, p<0,05). Todos os pacientes com níveis séricos de PTHi inferiores a 280 pg/ml apresentaram ecografias da paratireóide com resultados normais. Nove de 12 pacientes (83,3%), com ultra-sonografia com glândulas aumentadas da paratireóide, apresentavam níveis de PTHi superiores a 720 pg/ml. Ultra-sonografia mostrando glândulas aumentadas da paratireóide apresentou uma sensibilidade de 50%, uma especificidade de 66% e um valor preditivo positivo de 83% para o diagnóstico de doenças de alto remanejamento ósseo. Em relação aos resultados das cintilografias de paratireóide com Tc-99m-sestamibi, não houve diferenças nas médias dos níveis de PTHi entre os pacientes com ou sem glândulas aumentadas da paratireóide, assim como para os outros exames bioquímicos. Quando comparado aos níveis de PTHi, 2 pacientes apresentaram resultados positivos na cintilografia com PTHi inferior a 280 pg/ml e 8 (53,4%) acima de 720 pg/ml. Semelhante aos resultados das ultra-sonografias, a sensibilidade, a especificidade e o valor preditivo positivo da cintilografia para o diagnóstico das doenças de alto remodelamento ósseo foram baixos, 50%, 33% e 71%, respectivamente. Podemos concluir que a ultra-sonografia e a cintilografia com Tc-99m-sestamibi da paratireóide não foram bons métodos para o diagnóstico de doenças ósseas com alto remodelamento, no entanto, a ultra-sonografia da paratireóide foi superior a cintilografia com Tc-99m-sestamibi na detecção de glândulas aumentadas, sugerindo ser um marcador mais útil de gravidade em pacientes sintomáticos com hiperparatireoidismo secundário severo.

Ratos tratados com dieta cetogênica apresentam aumento de tecido adiposo mediado pela elevação da atividade da fosfoenolpiruvato carboxicinase

A Dieta Cetogênica é caracterizada pelo alto teor de gordura e baixo teor de carboidratos e proteínas, e tem sido proposta como benéfica em crianças com desordens epiléticas que não respondem ao tratamento convencional de drogas anti-epiléticas. O retardo de crescimento é um importante inconveniente desta dieta e as causas metabólicas ainda não estão bem caracterizadas. O objetivo desse estudo é examinar a variação de peso corporal e de tecido adiposo de ratos Wistar tratados com a dieta cetogênica durante 6 semanas, e a atividade da fração citosólica da enzima fosfoenolpiruvato carboxicinase (PEPCK) no tecido adiposo. Os ratos alimentados com a dieta cetogênica apresentaram uma diminuição do peso corporal, mas um significante aumento de tecido adiposo. A razão tecido adiposo/peso corporal apresentou diferenças entre os ratos cetogênicos e os controles já na primeira semana de tratamento, cerca de 2 vezes maior nos ratos cetogênicos. A lipogênese visceral foi mantida por um aumento na atividade da PEPCK, objetivando o fornecimento de glicerol-3- fosfato para a síntese de triacilglicerol e este acúmulo de gordura foi acompanhado por intolerância à glicose. Não foram observadas mudanças na glicemia e lipidemia basais. Estes dados contribuem para o entendimento dos efeitos metabólicos da dieta cetogênica e sugere alguns riscos potenciais desta dieta.

Efeitos dos ácidos propiônico e metilmalônico sobre o imunoconteúdo da subunidade de alto peso molecular dos neurofilamentos em fatias de córtex cerebral de ratos

As acidemias orgânicas são desordens metabólicas caracterizadas, bioquimicamente, pelo acúmulo de um ou mais ácidos orgânicos e, clinicamente, por disfunções neurológicas graves. Os ácidos propiônico (PA) e metilmalônico (MMA) são metabólitos presentes, em altas concentrações, nos tecidos e fluídos biológicos de pacientes afetados pelas acidemias propiônica e metilmalônica, respectivamente. Os neurofilamentos (NFs) são proteínas do citoesqueleto neuronal formados pela polimerização de três subunidades, denominadas: NF de alto peso molecular (NFH), NF de médio peso molecular (NF-M) e NF de baixo peso molecular (NF-L), com pesos moleculares aparentes de 200, 150 e 68 kDa, respectivamente. Essas proteínas são amplamente fosforiladas, sendo que seu nível de fosforilação está relacionado com a polimerização dos NFs e com a regulação das interações entre os constituintes do citoesqueleto. Neste trabalho fizemos um estudo ontogenético dos efeitos in vitro do PA e do MMA 2,5 mM sobre a imunorreatividade da subunidade NF-H em fatias de córtex cerebral de ratos de 9, 12, 17, 21 e 60 dias de idade. Para tanto utilizamos uma abordagem metodológica baseada na imunodetecção da NF-H com dois anticorpos diferentes: o anticorpo monoclonal anti NF-200 clone NE14 que se liga somente a epítopos fosforilados da NF-H e, portanto, reconhece a NF-H fosforilada; e o anticorpo monoclonal anti NF-200 clone N52 que reconhece a NF-H total, independentemente do nível de fosforilação. Nossos resultados mostraram que os metabólitos induzem alterações na imunorreatividade da NF-H presente na fração citoesquelética de maneira dependente do estágio de desenvolvimento do animal Considerando o conjunto de dados obtidos com os anticorpos NE14 e N52 na fração citoesquelética, podemos dizer que o tratamento das fatias de córtex cerebral de ratos de 9 dias aumentou o nível de fosforilação sem alterar o imunoconteúdo total; em ratos de 12 e 17 dias de vida levou a um acúmulo da subunidade NF-H na fração citoesquelética e que esta proteína está na forma fosforilada; e finalmente, em ratos de 21 e 60 dias de vida os metabólitos não alteraram os parâmetros estudados. Mostramos, também, que o acúmulo da NF-H provocado pelos metabólitos em ratos de 12 e 17 dias de vida não decorreu de um aumento na síntese da proteína, mas, provalvelmente devido a um desequilíbrio na relação NF-H solúvel/NF-H polimerizada, que favoreceu a forma polimerizada. Finalmente, mostramos um possível envolvimento de mecanismos de neurotransmissão GABAérgica e glutamatérgica para os efeitos observados em ratos de 12 e 17 dias de idade, respectivamente. Considerando que a fosforilação é um mecanismo importante para a regulação da dinâmica de polimerização dos NFs e das interações com outros componentes do citoesqueleto, sugerimos que uma desorganização na sua homeostase possa causar uma neurodegeneração, que é característica dos pacientes portadores das acidemias propiônica e metilmalônica.

Desenvolvimento de ferramentas moleculares para indução de tolerância imunológica em transplante

As vacinas de DNA têm sido utilizadas para a indução de imunidade contra antígenos virais e bacterianos. A aplicação de modelos experimentais tem sido explorada visando a indução de tolerância imunológica através da expressão de genes cujos produtos podem modular o sistema imune para um estado de não responsividade. A terapia gênica oferece a possibilidade de manipulação do sistema imune do receptor, através de um sistema de administração de genes específicos sob condições pré-definidas. Sua eficácia depende dos níveis de expressão e da natureza do antígeno, da via de administração assim como de sua distribuição nos tecidos (a qual às vezes depende do promotor utilizado). Porém, sua aplicação clínica é limitada em parte devido aos baixos níveis de expressão obtidos in vivo. A VP22 é uma proteína do tegumento do vírus Herpes simples tipo 1, que tem a propriedade de fazer tráfego intercelular. Estudos recentes têm demonstrado a alta eficiência desta molécula no transporte de proteínas heterólogas como VP22-p53, VP22-β galactosidase e VP22-proteína verde fluorescente. Para a indução de tolerância imunológica, tem sido demonstrado que a persistência do antígeno, pelo menos por algum período, é muito importante. Moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) têm sido utilizadas para induzir tolerância a nível central ou periférico, em diferentes protocolos. Dentre estas, as moléculas da classe I do camundongo, Kb, têm sido utilizadas com sucesso. O objetivo desse trabalho foi de construir duas vacinas recombinantes: pVP22::Kb e pCIneo::Kb. A primeira contém dois genes clonados na mesma pauta de leitura: a cadeia pesada de classe I Kb e VP22. O cDNA que codifica para o Kb foi obtido pela extração de RNA total de baço de um camundongo C57BL/6 (haplótipo H-2b) seguido de transcrição reversa. Este produto foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase. Esta molécula também foi obtida pela amplificação direta do gene Kb previamente clonado no sítio EcoR I do plasmídeo pBluescriptIISK (Stratagene®). Ambos os produtos de PCR foram subclonados com extremidades cegas no plasmídeo pCRBluntII (Invitrogen®). Foram obtidos dezenove plasmídeos recombinantes, denominados pCRBluntII::Kb, e um deles foi escolhido e digerido com as enzimas de restrição Spe I e Xba I e defosforilado com a enzima fosfatase alcalina (CIAP). O fragmento digerido foi clonado nos plasmídeos pVP22-myc/His (Invitrogen®) e pCIneo (Promega®) previamente digeridos com a enzima Xba I. Os novos plasmídeos pVP22::Kb e pCIneo::Kb foram utilizados para transfectar a linhagem celular eucariótica CHO. A expressão do mRNA para o Kb foi confirmada pela transcrição reversa e PCR e a expressão da proteína por imunofluorescência e citometria de fluxo.

Indução de síntese de homoglobina em células K562 por doxorrubicina e aclarrubicina : em busca de um mecanismo comum

As leucemias são neoplasias que afetam o sistema hematopoiético e compreendem 2,53% dos casos de câncer relatados. Entre as leucemias, 27,95% correspondem a casos de leucemia mielóide crônica (LMC), que apresenta como marcador genético o cromossomo Philadelphia (Ph). Presente em mais de 80% dos casos, o cromossomo Ph é derivado da translocação t(9;22) (q34;q11), que origina um gene híbrido entre a região 5´ do gene bcr e 3´do gene abl. O produto deste gene é uma proteína Bcr-Abl na qual a atividade reguladora e nuclear do domínio tirosina quinase, originado da proteína Abl, torna-se constitutiva e citoplasmática. Estas mudanças na atividade tirosina quinase afetam diferentes vias de sinalização, com consequências em vários processos celulares como adesão, proliferação e apoptose. Em nível fisiológico, foi mostrado tanto in vitro quanto in vivo que as células hematopoiéticas precursoras Ph+ se diferenciam principalmente em células eritróides. Entretanto, quase 70% dos pacientes com LMC sofrem anemia, mostrando que, as células Ph+ diferenciadas em células eritróides não conseguem amadurecer até hemácias funcionais. Isto faz da LMC um bom modelo para o estudo da diferenciação de células eritróides e suas características, como os fatores que afetam a sintese de hemoglobina (Hb). A linhagem K562 é uma linhagem celular eritroleucêmica Ph+, amplamente utilizada como modelo para estudar drogas com capacidade anti-proliferativa e/ou indutoras da síntese de hemoglobina fetal. Entre estas drogas encontram-se a aclarrubicina (ACLA) e doxorrubicina (DOX) que, embora sejam análogos químicos pertencentes à família das antraciclinas, possuem mecanismos de ação diferentes e ainda não completamente esclarecidos. Neste trabalho, foram investigados vários aspectos da biologia das células K562 durante o tratamento com estas drogas. Foi observado que o tratamento com DOX produz um aumento de tamanho nas células e bloqueio do ciclo celular na fase G2/M, afetando também grandemente a viabilidade celular, com 70% de células mortas no sétimo dia de tratamento. Já durante o tratamento com ACLA a viabilidade, tamanho e ciclo celular foram menos afetados, com aproximadamente 15% de células mortas no sétimo dia de tratamento e um bloqueio transitório do ciclo na fase G1. No entanto, as duas drogas causaram um aumento significativo da síntese de hemoglobina, principalmente DOX que induziu um aumento quase duas vezes maior que o induzido por ACLA. A análise da expressão gênica realizada através da técnica de differential display mostrou várias bandas diferencialmente representadas e com diversas cinéticas de expressão, apresentando semelhanças e diferenças quando são comparados os dois tratamentos ou células tratadas e controle. Destas bandas, 26 estão sequenciadas mostrando genes envolvidos em vários processos celulares como dano do DNA, resistência a drogas, processamento do RNA e codificação de proteinas relacionadas com ferro. Das bandas sequenciadas, 7 foram validadas por RT-PCR (ndrg1, erk2, nf2l2, atp6ap1, rfc1, phf20 e zkscan) sendo observado um aumento na sua expressão durante o tratamento, com exceção de ndrg1 para o qual a expressão foi induzida em vez de aumentada e nf2l2 onde a diferença com o controle foi pequena e não permitiu validar este gene como diferencialmente expresso. Com o objetivo de procurar por mecanismos comuns entre os vários indutores da síntese de hemoglobina em células K562, estes genes foram também analisados durante o tratamento destas células com os indutores hidroxiuréia e dGTP. Além de induzirem a expressão de hemoglobina, os dois tratamentos provocaram um aumento no tamanho das células tratadas e um bloqueio no ciclo celular na fase S. Visando futuros trabalhos envolvendo os genes diferencialmente expressos, foi ainda otimizado um sistema de transferência gênica por eletroporação. Para isto foram testados varios parâmetros como campo elétrico, resistência, capacitância, meios de eletroporação, manipulação das células e uso de inibidores de DNAses. Como resultado, foi alcançado com o eletroporador padrão uma eficiência de transfecção de 81%, similar àquela alcançada pelo nucleoporator (eletroporador de última geração). As condições estabelecidas foram 750 V/cm, resistência infinita, 500 μF, meio RPMI1640, centrifugação e sulfato de zinco pós-pulso. A relação das antraciclinas e a hidroxiuréia, assim como de outros indutores da síntese de hemoglobina, com o ferro intracelular, juntamente com a diferença na expressão, durante o tratamento, de genes afetados direta ou potencialmente pela não disponibilidade de ferro intracelular, nos permitiu gerar uma hipótese para a via de sinalização que leva à síntese de hemoglobina. Nesta, sinais de falta ou não disponibilidade de ferro nas células ativariam a maquinaria celular para a captação e internalização do ferro extra-celular, simultaneamente com síntese de proteínas que utilizam o ferro para realizar as suas funções biológicas, entre elas a hemoglobina. Do mesmo modo, propomos a via de sinalização do ferro como um alvo potencialmente afetado por drogas indutoras da síntese de hemoglobina, como as antraciclinas, cujos alvos são ainda pouco conhecidos. Contudo, mais genes desta via de sinalização, bem como outros indutores, deveram ser estudados para saber se a síntese de hemoglobina pode ser induzida por drogas mais específicas e com menos efeitos colaterais que aquelas usadas atualmente para o tratamento de câncer e outras doenças.

Comportamento de células pulpares humanas expostas ao TGFβ1 a ao aFGF em cultura

O propósito do presente estudo foi avaliar o comportamento de células pulpares humanas expostas ao TGFβ1 e ao aFGF, em cultura, nas seguintes concentrações: TGFβ1 a 1ng/mL, TGFβ1 a 5ng/mL, TGFβ1 a 1ng/mL + aFGF a 5ng/mL, TGFβ1 a 5ng/mL + aFGF a 5ng/mL e aFGF a 5ng/mL. Foi avaliada a morfologia celular, a atividade da fosfatase alcalina, através de ensaio com pNPP como substrato e a expressão das proteínas osteocalcina, sialoproteína óssea e sialofosfoproteína de dentina, através de RT-PCR. Após quatro dias, verificou-se que a média do número de nucléolos no grupo tratado com TGFβ1 a 1ng/mL foi significativamente maior que no grupo tratado com aFGF a 5ng/mL. A média da atividade da fosfatase alcalina no grupo tratado com TGFβ1 a 1ng/mL foi significativamente maior que no grupo tratado com TGFβ1 a 5ng/mL + aFGF a 5ng/mL. Foi observada a expressão de osteocalcina em todas as células pulpares humanas que proliferaram em cultura. Entretanto, no grupo em que foi utilizado o aFGF a 5ng/mL houve diminuição da expressão da osteocalcina. A exposição dos fatores não induziu a expressão de componentes da matriz de dentina tais como BSP e DSPP. Sugere-se que as células expostas ao TGFβ1 1ng/mL foram estimuladas, apresentando uma maior atividade celular e as células expostas ao aFGF 5ng/mL foram inibidas, apresentando uma menor atividade celular.

Avaliação da ingestão de cálcio em pacientes com urolitíase

A litíase renal é uma doença comum, com prevalência estimada em 5 a 10% da população. Sua etiopatogenia é multifatorial, com a participação de fatores genéticos, nutricionais, sócio-econômicos, ambientais, metabólicos, anatômicos e infecciosos. A dieta tem papel relevante na formação e crescimento de cálculos renais. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil alimentar, principalmente a ingestão de cálcio, dos pacientes com litíase em atendimento ambulatorial. Foram avaliados 37 pacientes litiásicos (17M/20F, 46 ± 11 anos) e 45 controles (20M/25F, 44 ± 13 anos). Os litiásicos apresentaram média de Índice de massa corporal (IMC) maior que os controles (26 ± 4 vs 24 ± 3 kg/m2, P= 0,01). Foi utilizado o método de registro alimentar de quatro dias, incluindo três dias da semana e um domingo. Observou-se uma ingestão significativamente maior entre os controles quanto a calorias totais, kcal/kg de peso atual/dia, proteínas/kg de peso atual/dia, lipídios totais, percentual do valor calórico total em lipídios e cálcio (582±229 vs 949±480mg/dia). Desmembrando o registro alimentar de quatro dias, observou-se diferença significativa quanto a ingestão de cálcio tanto nos dias referentes à semana (608±289 vs 951±465mg/dia, P<0,001) quanto no domingo (556±276 vs 947±553mg/dia, P<0,001), entre casos e controles, respectivamente. Através da análise da regressão linear múltipla, corrigindo para IMC, renda, idade e sexo, observou-se maior ingestão de cálcio no grupo controle, nos registros alimentares estudados (P< 0,02). Em conclusão, os resultados do presente estudo mostram que, na amostra estudada, os pacientes litiásicos ingerem uma menor quantidade de cálcio que os indivíduos normais, tanto no registro alimentar de quatro dias, três dias e no domingo, podendo contribuir como mais um fator de risco para o desenvolvimento da urolitíase.

Obtenção e avaliação da proteína BYC (Boophilus Yolk pro-Cathepsin) recombinante em uma vacina contra o carrapato Boophilus microplus

O carrapato Boophilus microplus é um ectoparasita hematófago que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, causando grande prejuízo à pecuária. O principal método de controle deste parasita baseia-se no uso de acaricidas, entretanto, o uso de vacinas tem sido estudado como um método de controle promissor. A Boophilus Yolk pro-Cathepsin (BYC) é uma aspártico proteinase presente no ovo do carrapato e envolvida na embriogênese que foi anteriormente testada como imunógeno vacinal. Neste estudo, o cDNA da BYC foi amplificado por PCR e clonado em dois vetores de expressão para produção de duas formas da proteína recombinante com cauda de histidina, rBYC e rBYC-Trx (fusionada com tioredoxina). As duas formas foram expressas em Escherichia coli na forma de corpúsculos de inclusão (CI) e comparadas quanto ao nível de expressão, solubilidade e rendimento na purificacão. Três agentes desnaturantes (N-lauroil sarcosina, hidrocloreto de guanidina e uréia) foram testados para solubilização dos CIs. Sarcosina foi o agente mais eficiente, solubilizando mais de 90 % de rBYC-Trx e rBYC. As duas proteínas recombinantes foram purificadas em cromatografia de afinidade por metal (Ni2+), sob condições desnaturantes. O rendimento na purificação da proteína solúvel foi de 84 % para r-BYC-Trx e 6 % para rBYC. As duas formas foram reconhecidas por soro de coelhos, camundongos e bovinos previamente imunizados com BYC nativa, demonstrando a existência de epítopos comuns entre a BYC nativa e as formas recombinantes expressas em E. coli. Para verificar o potencial vacinal da proteína recombinante, um grupo de bovinos Hereford foi imunizado com rBYC e desafiado com 20.000 larvas de B. microplus por animal. Os soros dos bovinos imunizados reconheceram a BYC nativa em ELISA e “Western blot”, com títulos entre 500 e 4.000. Os resultados do desafio mostraram uma proteção parcial contra a infestação, com 25 % de proteção global. O perfil de expressão de citocinas (IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ) foi verificado por RT-PCR, porém os resultados não permitiram identificar a polarização da resposta imune em Th1 ou Th2. Os resultados de imunoproteção obtidos com a BYC recombinante foram similares aos obtidos na imunização de bovinos com BYC nativa, indicando a possibilidade de uso da forma recombinante como imunógeno vacinal.