Estudi d'un receptor quinasa atípic (Mark) i de les proteïnes que interaccionen amb el seu domini intracel·lular. Transducció del senyal i desenvolupament en blat de moro (Zea mays)

Aquesta tesi doctoral s'engloba dins d'un projecte general d'estudi de gens implicats en l'embriogènesi del blat de moro. L'embriogènesi del blat de moro, i en general la de totes les plantes superiors, es dóna en tres etapes: una primera etapa on es diferencien tots els diversos teixits que formaran l'embrió, una segona etapa on l'embrió acumula productes de reserva i un tercer període, la dormància, que finalitza quan les condicions ambientals són les idònies per a la germinació. En el laboratori estàvem interessats, concretament, en l'estudi de gens implicats en la primera etapa morfogenètica, on els diferents teixits i estructures embrionàries queden definides. Per tal d'estudiar gens que s'expressaven en aquest període, una de les estratègies que es va realitzar fou un crivellat diferencial entre teixit embrionari i teixit de planta adulta. D'entre els diferents clons obtinguts, un corresponia a un clon parcial que presentava similitud amb receptors quinasa i que fou objecte d'estudi. A partir d'aquest clon es va obtenir el clon complet i es va anomenar MARK (per Maize Atypical Receptor Kinase). MARK presenta una estructura típica d'un receptor quinasa amb un domini extracel.lular, que conté 6 còpies imperfectes de LRR (Leucine- Rich Repeats), un únic domini transmembrana i un domini quinasa intracel.lular. El domini quinasa de MARK presenta, però, algunes variacions en els residus aminoacídics que es consideren claus per a la funció catalítica dels dominis quinasa. En concret cinc dels aminoàcids considerats essencials per a la fosforilació es troben substituits en el domini quinasa de MARK (DK-MARK). Els experiments de fosforilació in vitro que es van realitzar al laboratori, van mostrar com MARK era incapaç de fosforilar in vitro. Aquesta característica no és, però, exclusiva de MARK. Una búsqueda en les bases de dades ens van permetre identificar altres seqüències que també presentaven els mateixos o altres canvis en aquestes posicions aminoacídiques. En les bases de dades de plantes es van identificar un conjunt de seqüències genòmiques o ESTs amb aquestes característiques i només una d'elles, la proteïna TMKL1 d'Arabidopsis, ha sigut descrita com un receptor quinasa incapaç de fosforilar in vitro. Respecte a la búsqueda de receptors similars a MARK en les bases de dades d'animals, es van identificar també un conjunt de proteïnes que, en alguns casos, s'ha descrit que no tenen activitat quinasa in vivo. Per exemple, un dels casos més ben estudiats és el del receptor erbB3 que forma part de la família de receptors del EGF (Epidermal Growth Factor). Aquesta família de receptors està formada per 4 receptors: erbB1, erbB2, erbB3 i erbB4, dels quals només l'erbB3 no presenta activitat catalítica. S'ha descrit que erbB3 és capaç, tot i no fosforilar in vivo, de participar activament en la transducció del senyal formant heterodímers amb els altres membres de la família. Així, erbB3 és fosforilat pel seu partner i pot iniciar la cascada de transducció del senyal. La participació d'erbB3 en la transducció del senyal és essencial ja que embrions de ratolí knock-out pel gen erbB3 són inviables. Així doncs, el fet que receptors quinasa catalíticament inactius participin en les cascades de transducció del senyal, suggereix l'existència de nous mecanismes d'acció per a la transducció del senyal. Per tant, l'objectiu d'aquest treball fou l'estudi del mecanisme d'acció de MARK mitjançant la caracterització les proteïnes capaces d'interaccionar amb el seu domini quinasa. Per tal d'assolir aquest objectiu, es va realitzar un crivellat de doble-híbrid amb una llibreria de cDNA d'embrions de blat de moro de 7 DAP. D'aquest crivellat es va obtenir un conjunt de possibles clons positius que foren seqüenciats i entre els quals es van escollir per un estudi més detallat aquells que s'havien obtingut més vegades com a clons independents. Aquests clons codificaven per: una SAMDC (S-Adenosil Descarboxilasa), una eIF5 (Eukaryotic translation initiation), una hypothetical protein, una unknown protein, una gamma-adaptina i una MAP4K. Amb aquests 6 clons es van fer estudis in vitro i in vivo per tal de confirmar al seva interacció amb DK-MARK. Els estudis in vivo es van realitzar amb la soca de llevat AH109, una soca més astringent que la utilitzada en el crivellat, ja que presenta tres gens marcadors: Histidina, Adenina i Lacz. Els resultats obtinguts van mostrar que els clons codificants per SAMDC i eIF5 no van créixer en un medi selectiu per His i Ade i, per tant o es tracta de falsos positius del sistema o la seva interacció amb DK-MARK és dèbil. D'altra banda, la resta dels clons analitzats (proteïna hipotètica, una proteïna de funció desconeguda, la gamma-adaptina i una MAP4K) van créixer en medis en absència de Histidina i Adenina. Els assatjos de b-galactosidasa van ser tots positius a excepció de la proteïna hipotètica suggerint que potser aquesta interacció sigui més feble. D'altra banda també es van realitzar estudis in vitro amb la tècnica del pull-down. Els resultats obtinguts amb aquesta tècnica van recolzar els obtinguts en cèl.lules de llevat, ja que tots els clons analitzats a excepció dels codificants per SAMDC i eIF5 van donar un resultat d'interacció amb KD-MARK in vitro positiu. Davant aquests resultats ens vam centrar en l'estudi de la proteïna similar a MAP4K, doncs algunes proteïnes de la seva família s'han relacionat amb receptors de membrana. Els clons que es va obtenir del crivellat codificaven per una proteïna similar amb el domini C-terminal a les proteïnes BnMAP4Ka1 i a2 de Brassica napus. Aquestes proteïnes presenten una forta similitud de seqüència amb proteïnes de la família GCK/SPS1 que formen part d'un grup particular de MAPK relacionades amb la proteïna Ste20 (sterile 20 protein) de llevat. Ste20p activa la MAP3K de llevat Ste11 directament per fosforilació, transduint d'aquesta manera el senyal del receptor de feromones de creuament de les cèl.lules de llevat i es pot, doncs, considerar com una proteïna del tipus MAP4K (mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase). En els darrers anys, s'han identificat un gran nombre de proteïnes similars a Ste20: fins a una trentena en mamífers, en Drosophila, en Caenorhabditis elegans i en altres organismes. Segons la seva estructura aminoacídica, la família Ste20 s'ha classificat en dues subfamílies: les proteïnes STE20/PAK (p21-activated kinases) i la subfamília GCK/SPS1 (germinal center kinases). Les dues subfamílies estan formades per proteïnes que contenen un domini quinasa i un domini regulador, però, mentre que les proteïnes PAK presenten el domini quinasa en la part C-terminal, les GCKs el presenten en la regió N terminal. Les proteïnes GCK presenten una elevada diversitat estructural en el domini regulador permetent la seva classificació en 6 subfamílies. Mitjançant la tècnica del RACE es va obtenir el clon de cDNA complet que es va anomenar MIK (MARK Interacting Kinase). Amb la tècnica del Southern blot es va poder determinar que el gen MIK és un gen de còpia única en el genoma de blat de moro. Per tal d'analitzar la possible interacció entre DK-MARK i MIK, es va estudiar tant el patró d'expressió d'ambdós gens com el seu patró d'acumulació d'ambdues proteïnes durant l'embriogènesi del blat de moro. El patró d'expressió, analitzat per Northen blot va mostrar uns patrons coincidents al llarg de l'embriogènesi des del seu inici fins als 20 DAP amb una acumulació màxima de mRNA en embrions de 15 DAP. D'altra banda per tal d'estudiar el patró d'acumulació de la proteïna MIK així com per comparar-lo amb el de MARK, es van realitzar estudis de Westerns blot. Els resultats també van mostrar una coincidència en el temps de l'acumulació de les proteïnes MARK i MIK durant l'embriogènesi de blat de moro amb una major acumulació en embrions de 15 i 20 DAP. Es van dur a terme també estudis d'immunolocalitzacions sobre embrions de blat de moro de 15 DAP per tal d'estudiar en quins teixits s'acumulaven ambdues proteïnes. Les immunolocalitzacions van mostrar una major acumulació tant de MARK com de MIK en les zones meristemàtiques i en el teixit vascular sobretot del coleòptil on s'aprecia una forta co-localització de MARK i MIK. Totes aquestes dades són compatibles, doncs, amb una possible interacció de les proteïnes MARK i MIK, tot i que no la demostren. Per tal de demostrar la interacció es van realitzar experiments d'immunoprecipitació in vivo a partir d'extractes d'embrions. Malauradament, els resultats no són clars i en aquests moments en el laboratori s'estan posant a punt aquests experiments. També es van realitzar estudis comparatius de seqüència amb diferents proteïnes de la família GCK, mostrant una major similitud amb les proteïnes de la subfamília GCK-III. La subfamília GCK-III ha estat molt poc estudiada i en formen part un conjunt de proteïnes amb funcions molt diverses des de l'apoptosi, la citoquinesi o l'anòxia cel.lular. Per tant, la similitud de seqüència possiblement fa referència a una conservació en el mecanisme d'acció més que no pas a una conservació funcional. La possible interacció de MARK amb el domini C-terminal de MIK (el domini regulador) podria activar aquesta última iniciant una cascada de transducció del senyal en un model en el que una proteïna del tipus GCK-III faria de lligam directa entre un receptor de membrana i una cascada de senyalització intracel.lular. Aquest tipus de lligam entre un recepctor de membrana i mòduls intracel.lulars de senyalització s'ha descrit per a altres proteïnes GCK, si bé no directament sinó a través de proteïnes adaptadores. D'altra banda, la interacció directa de MARK, un receptor quinasa atípic que no té activitat catalítica, amb MIK suggereix un mecanisme on receptors atípics podrien interaccionar en la transducció del senyal activant la via de les MAPK.

Estudi d'una metal·lotioneïna d'alzina surera (QsMT)

En aquest treball es caracteriza per primera vegada la capacitat de coordinació metàl·lica d'una metal·lotineïna (MT) de planta i es proposa un model de plegament per a les MTs de planta en general. Els resultat mostren que aquestes proteïnes poden tenir un paper molt important en la regulació de l'estat redox de les cèl·lules, probablement a través de la coordinació a Cu. Les MTs de planta són proteïnes molt desconegudes. Es postula que participen en l'homeòstasi del Cu i en la protecció contra l'estrès oxidatiu, però es desconeix la capacitat de coordinació metàl·lica i el plegament. En aquest treball s'han estudiat una metal·lotioneïna d'alzina surera, QsMT, aïllada d'una llibreria de cDNA de fel·lema. Els objectius concrets han estat: (1) estudiar l'expressió de QsMT i la resposta a l'estrès oxidatiu; (2) determinar la capacitat de coordinació metàl·lica i la funcionalitat in vivo; (3) fer una aproximació al plegament de les MTs de planta. L'expressió del gen s'ha estudiat mitjançant hibridació in situ en plàntules i en embrions d'alzina surera. QsMT s'expressa majoritàriament en cèl·lules amb fort estrès oxidatiu, associat a la síntesi de polifenols (suberització i lignificació) i a la senescència. També s'expressa en cèl·lules meristemàtiques, cèl·lules en divisió molt activa on la funció de les MTs podria estar relacionada amb el manteniment de l'estat redox. L'aplicació d'estrès oxidatiu exogen (H2O2 i paraquat) incrementa fortament l'expressió de QsMT en teixits amb expressió constitutiva, confirmant la regulació de l'expressió del gen per estrès oxidatiu. Per l'estudi de les propietats de coordinació metàl·lica es va expressar QsMT en cèl·lules d'E. coli en medi de cultiu suplementat amb Cu, Zn o Cd. Es van aïllar els agregats metàl·lics corresponents i es van analitzar mitjançant tècniques espectroscòpiques i espectromètriques (ICP-OES, ESI-MS i CD). Els resultats mostren que QsMT coordina de forma estable Cu (8 ions metàl·lics/molècula), Zn (4 ions de Zn/molècula) i Cd (6 ions de Cd/molècula), i adopta una estructura especialment quiral en coordinació a Cu. L'elevada capacitat quelant de la proteïna i la quiralitat de l'estructura indiquen que QsMT possiblement té preferència metàl·lica pel Cu i per tant una funció relacionada amb aquest metall in vivo. Estudis de complementació en llevat demostren que QsMT coordina Cu de forma funcional in vivo. En coordinació a Cd QsMT presenta una peculiaritat no observada fins ara en altres MTs: la participació d'ions sulfur en la formació de l'agregat metàl·lic incrementant la capacitat de coordinació metàl·lica (6 ions metàl·lics divalents de Cd enlloc de 4 ions de Zn). A més QsMT coordina Cd de forma funcional en llevat, i per tant la seva funció també podria estar relacionada amb la destoxicació de Cd en la planta. QsMT s'ha utilitzat com a model per fer una aproximació al plegament de les MTs de planta. Amb aquest objectiu vam dissenyar tres pèptids mutants derivats de QsMT: N25 corresponent a la zona rica en cisteïna en posició amino-terminal, C18 corresponent a la zona rica en cisteïna en posició carboxil-terminal, i N25-C18 corresponent a les dues zones riques en cisteïna enllaçades per 4 glicines substituint la zona central de 39 aminoàcids. Es van expressar i estudiar aquests pèptids per les mateixes tècniques utilitzades en l'estudi de QsMT. Els resultats indiquen que QsMT es plega formant un sol agregat metàl·lic per la interacció de les dues zones riques en cisteïna. En aquest model la zona central d'enllaç, típica de les MTs de planta, no participa en la coordinació metàl·lica però és imprescindible per a la funció de la proteïna. El paper de la zona central podria variar en funció del metall que coordina, participant en el plegament i estructura de la proteïna quan coordina Zn i Cd i en la seva regulació i estabilització quan coordina Cu.

Les sHsps en surera: capacitat protectora enfront l'estrés i variabilitat genètica

Els organismes responen a la temperatura i a molts altres estressos sintetitzant un grup de proteïnes anomenat proteïnes de xoc de calor (HSPs). En plantes les sHsps, d'entre 15 i 30 kDa formen el grup més abundant i divers, classificat en funció de la seva localització subcel.lular i homologia en: mitocondrials, cloroplàstiques, de reticle endoplasmàtic i citoplàsmiques de classe I i II. Les sHsps-CI s'ha descrit que s'indueixen per estrès tèrmic, hídric i oxidatiu (peròxid d'hidrògen, llum UV, ozó) i en resposta a algunes hormones. També s'expressen durant el desenvolupament, per exemple durant l'embriogènesi, on es creu que podrien tenir un paper protector de l'embrió enfront la dessecació. Tot i que hi ha abundants treballs que correlacionen la resistència a l'estrès i l'acumulació de sHsps-CI, els mecanismes moleculars d'aquesta activitat són poc conguts. Tot i això, per diverses sHsps-CI ha estat descrita una activitat xaperona in vitro i, més recentment, que la seva sobreexpressió augmenta la viabilitat de cèl.lules d'E.coli en condicions d'estrès tèrmic. L'estudi de l'acumulació de sHsps-CI en surera (Quercus suber) mitjançant immunodetecció en electroforesi bidimensional mostra uns patrons d'acumulació complexos i formats per dos grups d'espècies proteiques principals, a l'entorn dels 10 i 17 kDa respectivament, que mostren una inducció diferencial en funció del teixit i l'estrès. Mentre que les espècies proteiques de 17 kDa s'indueixen per temperatura però no per estrès oxidatiu, les de ca. 10 kDa ho fan per estrès oxidatiu i no per temperatura. Ambdós grups d'espècies proteiques s'acumulen conjuntament en fel.lema. Assajos de PCR i RT-PCR han permès clonar parcialment tres noves sHsps-CI en surera: Qshsp10-CI, QshspC-CI i QshspD-CI. Aquest fet confirma la multigeneïcitat de les sHsps-CI en surera que apuntava el patró bidimensional. Dels nous clons obtinguts destaca especialment Qshsp10-CI, un gen que presenta un codó stop enmig del domini -cristal.lí que fa que a la proteïna que se'n dedueix li manqui un 55% del domini -cristal.lí i tota l'extensió C-terminal. Es tractaria de la sHsp més petita i més truncada descrita fins al moment. L'anàlisi de l'expressió de Qshsp10-CI mitjançant RT-PCR mostra expressió en plantes tractades amb H2O2 però no en les que han estat sotmeses a un xoc de calor. Aprofitant l'oportunitat que oferia aquesta sHsp-CI de ser utilitzada com a model per l'estudi de la importància del domini -cristal.lí i l'extensió C-terminal en l'activitat protectora enfront l'estrès, es va voler determinar la capacitat que tenia d'augmentar la viabilitat de cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i oxidatiu. Els resultats mostren que la proteïna recombinant QsHsp10-CI, tot i la important truncació que té, és capaç de protegir cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i, remarcablement, en condicions d'estrès oxidatiu. Tots aquests resultats indiquen que les espècies proteiques de ca. 10 kDa podrien correspondre a Qshsp10-CI i tenir un paper en les cèl.lules del fel.lema en la protecció enfront l'estrès oxidatiu. L'estrès oxidatiu provoca lesions al DNA que poden produir errors en la replicació, transcripció o traducció i generar proteïnes aberrants. Donades les condicions d'estrès oxidatiu a les quals es troben sotmeses les cèl.lules del fel.lema, s'ha volgut estudiar la variabilitat dels seus àcids nucleics. La determinació de la taxa de mutació de la regió codificant del gen Qshsp17.4-CI en mRNA i DNA de fel.lema i àpex radicular, un teixit jove i en creixement actiu va mostrar unes taxes sorprenentment elevades en l'mRNA (1/1784 pb) i el DNA genòmic (1/1520 pb) del fel.lema. Aquestes taxes són les més altes descrites en un genoma nuclear eucariota i són similars a les dels virus d'RNA d'evolució ràpida com el virus de l'Hepatitis C. Amb aquestes taxes de mutació, un terç dels mRNAs del fel.lema de la surera contindrien missatges aberrants i la supervivència de les cel.lules es veuria compromesa. Això implica que el fel.lema hauria de ser considerat com un mosaic de cèl.lules genèticament heterogènies i, per tant, una sola seqüència no defineix en tota la seva amplitud un gen en aquest teixit. No es va detectar cap mutació en àpex de rel. Amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement de les mutacions que es donen en aquests dos teixits i per tal de poder fer una anàlisi qualitativa més completa que permetés especular sobre el seu origen, es va aplicar un mètode de selecció de seqüències mutants en base a la utilització d'enzims de restricció. Les mutacions detectades en fel.lema es corresponen amb les relacionades, en altres sistemes no nuclears (plasmidis, fags i DNA bacterià), amb l'estrès oxidatiu. En conseqüència, l'estrès oxidatiu al qual estan sotmeses les cèl.lules del fel.lema podria ser el causant de l'elevada taxa de mutació detectada. D'acord amb això, el tipus majoritari de productes d'oxidació de les bases del DNA que s'acumulen en brots de plàntules de surera en resposta al peròxid d'hidrògen produeixen el mateix tipus de mutacions detectades en l'mRNA del fel.lema de la surera. La major sensibilitat d'aquest nou mètode ha permès, a més, detectar mutacions en molècules d'mRNA de rel, un teixit en el qual no s'havia trobat cap mutació utilitzant el mètode de clonatge i seqüenciació directa. Tot i això, el tipus de mutacions predominants no estan relacionades amb l'estrès oxidatiu sinó amb erros en la reparació dels àcids nucleics.

Les sHsps en surera: Estudis de funcionalitat

Aquesta tesi es centra en la caracterització funcional d'una proteïna de xoc de calor de baix pes molecular (Small Heat Shock Protein - sHSP) de classe I de surera pel que fa a la seva capacitat per protegir les cèl·lules de l'estrès i per estabilitzar les membranes. Les sHsps són proteïnes que s'expressen en condicions d'estrès cel·lular. Encara que certs aspectes funcionals de les sHsps són ben coneguts, el nostre treball aporta informacions noves sobre el paper de les diferents regions de la proteïna, especialment de la regió N-terminal. L'objectiu concret d'aquest treball és determinar la funció termoprotectora de QsHsp17.4-CI, una sHsp de classe I oobtinguda a partir de les cèl·lules de fel·lema d'alzina surera, en un model bacterià i analitzar la importància de les diferents regions de la proteïna en aquesta funció. Amb aquesta finalitat s'han dissenyat dues proteïnes parcials derivades de QsHsp17.4-CI: una a la que li falta la regió N-terminal (C105) i una altra amb pràcticament tot el domini -cristal·lí deleccionat (N61), i una tercera, derivada de QsHs10-CI, a la que li falta la meitat del domini -cristal·lí (Hsp10). També s'estudia la possible capacitat estabilitzadora de membranes i la capacitat de modificar l'expressió d'altres Hsps quan s'expressa de forma heteròloga. Els nostres resultats demostren que l'expressió de QsHsp17.4-CI protegeix a les cèl·lules d'E.coli de l'estrès tèrmic alhora que la regió N-terminal i la regió consens II del domini -cristal·lí són imprescindibles per aquesta funció de protecció. En relació a un possible paper en les membranes, els estudis de localització subcel·lular mostren que QsHsp17.4-CI colocalitza amb la fracció membranes i que la regió N-terminal de la proteïna és responsable d'aquesta colocalització. No s'ha pogut demostrar, però, que la localització amb la membrana estigui associada a un efecte protector d'aquesta: en cap cas la sobrexpressió de les proteïnes modifica la composició d'àcids grassos i només N61, que no té acció termoprotectora, altera l'estat fisico-químic de la membrana. En estudis d'expressió de novo en E.coli s'ha observat que, a diferència de les altres proteïnes heteròlogues, N61 activa l'expressió de la majoria de Hsps d'E.coli fent pensar en una possible relació entre l'estat físic de la membrana i l'activació de la resposta a l'estrès. En resum, en aquest treball hem provat la capacitat protectora de QsHsp17.4 i aportem noves dades sobre la importància de la regió N-terminal i la regió consens II del domini -cristal·lí en aquesta funció. Per altra banda, es suggereix que QsHsp17.4 podria interaccionar amb la membrana d'E.coli i que la regió N-terminal seria imprescindible per aquesta interacció. Finalment hem determinat que les proteïnes que provoquen variacions en l'estat de fluïdesa de la membrana poden activar la resposta al xoc de calor per part de la cèl·lula bacteriana.

L´onconasa com a model per l´estudi de les bases moleculars de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques. Aplicacions a la construcció de ribonucleases amb activitat antimicrobiana

La primera part d'aquest treball s´ha centrat en la caracterització i optimització del procés d'activació de l´onconasa recombinant per tal d'obtenir l´enzim igual a la forma nativa. Per això, les reaccions d'eliminació de la Met-1 i la ciclació de la Glu1, necessàries per generar el piroglutamic han estat seguides per MALDI-TOF MS. La segona part d´aquest treball s´ha centrat en l´estudi de la contribució del pont disulfur 30-75 de l´onconasa a les seves propietats biològiques. Els resultats suggereixen que el potencial redox del citosol cel·lular podria reduir el pont disulfur 30-75 de l´onconasa salvatge afectant la unió onconasa -inhibidor proteic de ribonucleases. La tercera part ha consistit en la construcció de variants de l´HP-RNasa i onconasa amb activitat bactericida. Per això, s´ha introduït el determinant bactericida (YRWR) descrit per la proteïna catiònica d'eosinòfils en els dos enzims. Els resultats obtinguts han evidenciat que les dues ribonucleases amb el determinant bactericida presenten activitat citotòxica contra bacteris gram-negatius preferentment.

Paper del nucli hidrofòbic principal de la RNasa A en el plegament i desplegament induïts per pressió i temperatura

Utilitzant temperatura i pressió com a agents desnaturalitzants s'ha explorat la contribució a l'estabilitat de diferents residus del principal nucli hidrofòbic de la RNasa A. Aquests resutats suggereixen que el principal nucli hidrofòbic d'aquest enzim, està fortament empaquetat i ha revelat l'existència de reordenacions en l'interior de la proteïna. El mètode dels valors , han permès estudiar el paper de les interaccions hidrofòbiques establertes pels residus del principal nucli hidrofòbic de la RNasa A en el seu estat de transició induït per pressió. En conjunt, aquests resultats suggereixen que l'estat de transició de la RNasa A, s'assemblaria a un glòbul col·lapsat amb una cadena estructurada però amb un debilitat nucli hidrofòbic. S'ha explorat també, el paisatge energètic del plegament/desplegament proteic de la variant Y115W de la RNasa A. L'estat de transició sembla interaccionar fortament amb la capa d'hidratació d'aquest estat, tal i com indiquen els resultats en presència de glicerol.

Producció i caracterització de variants de la ribonucleasa pancreàtica humana dissenyades per a adquirir propietats citotòxiques

Amb la finalitat d'aprofundir en les bases moleculars de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, es van construir variants derivades de l'HP-RNasa seguint dues estratègies. En la primera, es van generar variants de l'enzim resistents a l'acció de l'inhibidor proteic de les ribonucleases (hRI), substituint residus implicats en la interfície de contacte entre la ribonucleasa i l'hRI. En la segona, es va addicionar el motiu RGD en regions de superfície de la proteïna implicades en la formació del complex amb l'hRI, a fi de promoure la seva interacció amb la membrana plasmàtica de les cèl·lules i a la vegada disminuir l'afinitat de les variants per l'hRI. Es va comprovar que només les variants portadores de substitucions múltiples adquirien la capacitat de resistència a l'hRI. L'estudi del percentatge d'inhibició de la síntesi proteica en cèl·lules incubades amb cadascuna de les variants va mostrar que només dues de les variants construïdes havien adquirit propietats citotòxiques. La citotoxicitat més elevada la va presentar una variant que no era resistent a l'hRI, amb valors que eren només entre 5 i 15 vegades inferiors als de l'onconasa. Aquest resultat demostrà que la sensibilitat a l'hRI no és necessàriament un paràmetre limitant per a la citotoxicitat de les ribonucleases. Cap de les variants que incorporava un motiu RGD presentà citotoxicitat, evidenciant que aquest motiu no és efectiu a fi de dotar les ribonucleases pancreàtiques de propietats citotòxiques. Es van estudiar les bases moleculars de la citotoxicitat de la variant més citotòxica. En primer lloc, l'anàlisi de la internalització per marcatge radioactiu d'aquesta variant en relació amb l'onconasa i amb altres variants de l'HP-RNasa no citotòxiques, va posar en evidència que només l'onconasa era internalitzada eficientment. Es descartava així la possibilitat que l'acció citotòxica de l'enzim estudiat fos conseqüència d'una major eficiència d'endocitosi. També es va comprovar que l'addició del motiu RGD no era capaç de promoure la internalització de les proteïnes amb més eficàcia. Per microscòpia confocal de fluorescència, les variants humanes només es van començar a detectar a l'interior de la cèl·lula a partir de les 24 h d'incubació. Totes les variants generades van presentar una eficiència catalítica superior al 50 % de l'activitat de la seva proteïna parental, PM5, indicant que probablement l'estructura del centre actiu no havia estat afectada de manera dràstica per les substitucions introduïdes. No obstant, en tots els casos es va produir una disminució en la termoestabilitat respecte a PM5. Aquest resultat indicà que la correlació descrita a la bibliografia entre l'increment de termoestabilitat i l'increment de citotoxicitat per les ribonucleases no sempre es compleix. Per microscòpia confocal es va comprovar que tant la proteïna més citotòxica, com una variant no citotòxica resistent a l'hRI, així com la proteïna parental, seguien la via de degradació lisosomal. Aquesta ruta de trànsit no va ser afectada per l'addició de drogues que alteren les vies de trànsit retrògrad (monensina i brefeldina A), però sí per l'addició de la bafilomicina A1, una droga que neutralitza el pH endosomal i que va actuar alentint el trànsit de les proteïnes als lisosomes. D'acord amb aquests resultats, els valors de citotoxicitat de les variants es van incrementar de manera significativa només en presència de bafilomicina A1, suggerint que les ribonucleases transloquen al citoplasma a partir d'algun punt de la via de trànsit endosomal. Es va comprovar que l'acció de la variant més citotòxica era deguda a que l'addició d'un segon motiu de tres Arg en PE5 dota a aquesta proteïna amb un senyal de transport nuclear. La fracció d'enzim que aconsegueix translocar al citoplasma a partir d'algun punt de la via endosomal previ als lisosomes, és conduït ràpidament al nucli de la cèl·lula per mitjà del mecanisme clàssic de transport actiu. Per la seva afinitat amb l'rRNA, l'enzim es concentra en el nuclèol, on probablement duu a terme la seva activitat catalítica. La interacció d'aquesta variant amb els receptors nucleocitoplasmàtics, les importines, impediria per altra banda el bloqueig de l'enzim per part de l'hRI. Els resultats obtinguts presenten una nova estratègia de disseny de ribonucleases citotòxiques, basada en l'addició de segments NLS a fi de promoure el transport nuclear dels enzims. Aquesta estratègia podria permetre superar limitacions que fins al moment han estat descrites com a limitants de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, com la sensibilitat a l'hRI o la baixa eficiència d'internalització.

Anàlisi de la capacitat de regeneració en estadis inicials del desenvolupament en diverses espècies mediterrànies del gènere Quercus

Aquest treball es centra en l'estudi de la regeneració vegetativa en els estadis inicials del desenvolupament de Quercus coccifera, Q. humilis, Q. ilex i Q. suber, analitzant la capacitat de rebrotada després de l'eliminació de la biomassa aèria. S'ha realitzat una descripció, a nivell histològic, de l'ontogènesi del nus cotiledonar des de l'embrió fins a la plàntula de mig any d'edat de Q. coccifera, Q. humilis i Q. ilex. Així mateix, s'ha analitzat el contingut de midó i de nitrogen a la primavera, l'estiu i l'hivern en diferents parts de les plàntules de les quatre espècies, avaluant, alhora, l'efecte de la tala. D'altra banda, també s'ha estudiat la biometria de les glans, la capacitat de germinació i el creixement de les plàntules de les quatre espècies de Quercus. A partir dels resultats s'ha comprovat que les glans de Q. suber, en general, són més grans, tant en diàmetre com en longitud, i tenen un pes superior, mentre que les de Q. ilex són més petites i pesen menys. En les quatre espècies estudiades, el pes de la llavor està determinat per la longitud i el diàmetre, si bé, també hi ha un cert efecte de l'espècie. Amb les dades obtingudes de les tres variables de la gla s'ha calculat una funció discriminant a partir de la qual es pot determinar, amb un alt grau d'encert, a quina espècie pertany una determinada gla coneixent la mida i el pes. En relació a la capacitat de germinació, en Q. coccifera i Q. ilex la germinació depèn del pes de la gla, mentre que en Q. humilis i Q. suber és independent. Així mateix, també s'ha comprovat que el pes de la llavor afecta positivament en el creixement de les plàntules de tres i sis mesos d'edat. Possiblement un major pes de la gla implica un contingut de substàncies de reserva més elevat, i per tant representa un major subministrament de nutrients cap a la planta, repercutint així en el seu creixement inicial. En plàntules de nou mesos d'edat ja no s'ha trobat relació entre el pes de la gla i el creixement de la planta, la qual cosa es podria explicar pel fet que les substàncies de reserva de la llavor s'han esgotat. Pel que fa al creixement de la plàntula, les plàntules de Q. ilex han tingut la major taxa de creixement per quasi totes les variables estudiades. En aquesta espècie, al principi de l'experiment la grandària de les plàntules ha estat baixa, però al final han crescut més que les de les altres espècies. Les plàntules de Q. coccifera han presentat la menor taxa. En les plàntules de les quatre espècies s'ha constatat, també, que la biomassa del sistema radicular és superior a la de l'aeri. Les plàntules de Q. coccifera i Q. humilis han tingut una relació BA/BR (biomassa aèria/biomassa radicular) més baixa que les de Q. ilex i Q. suber. En espècies mediterrànies s'ha relacionat sovint una baixa relació BA/BR com una adaptació a la sequera. No obstant això, Q. humilis és una espècie que viu en zones més humides que la resta d'espècies estudiades. En referència a la regeneració vegetativa, amb aquest estudi es demostra que les plàntules de les quatre espècies tenen una elevada capacitat d'emissió de rebrots, quan s'elimina la biomassa aèria per sobre la zona d'inserció dels cotilèdons. Tanmateix, el grau de supervivència difereix segons l'espècie i la intervenció. Així, per exemple, les plàntules de Q. ilex han presentat una major mortalitat tant en la primera com en la segona tala, mentre que en Q. humilis i Q. suber la supervivència de les plàntules ha disminuït després de talar dues vegades. En el cas de Q. coccifera el grau de supervivència és bastant similar tant en la primera com en la segona intervenció. La tala successiva afecta negativament al vigor dels rebrots en Q. coccifera, Q. humilis i Q. ilex. Ara bé, en el cas de Q. suber s'ha trobat que els rebrots emesos després de talar dues vegades han estat més grans que els obtinguts després d'una sola tala. Després de tallar la biomassa aèria per sobre la zona d'inserció dels cotilèdons, els rebrots s'originen a partir de les gemmes del nus cotiledonar. L'estudi de l'ontogènesi del nus cotiledonar ens ha permès de constatar que el patró de desenvolupament d'aquest en Q. coccifera, Q. humilis i Q. ilex és similar, però difereix del descrit per a Q. suber. En les tres primeres espècies el nus cotiledonar pràcticament no s'allarga i només es desenvolupen gemmes cotiledonars just en l'axil·la del pecíol cotiledonar. En aquest sentit, cal ressaltar que en el cas de Q. coccifera i Q. ilex les gemmes es formen després de germinar la gla, mentre que en Q. humilis i Q. suber són ja presents en l'embrió. Tal i com també s'ha descrit en Q. suber, en l'estadi de plàntula, en Q. coccifera, Q. humilis i Q. ilex a l'axil·la de la gemma cotiledonar proliferen noves gemmes, de tal manera que es formen plaques de gemmes. Les anàlisis del contingut de midó han permès de determinar que el sistema radicular de les plàntules de Q. coccifera, Q. humilis, Q. ilex i Q. suber conté aproximadament un 90% del midó de tota la planta. Concretament de les diferents fraccions del sistema radicular (nus cotiledonar, 11 pimers centímetres de l'arrel i resta de l'arrel) la major concentració de midó es troba ens els 11 primers cm de l'arrel, que en el cas de Q. suber correspon al nus cotiledonar. Quant a les estacions, a l'estiu la concentració de midó de la part aèria i radicular disminueix en Q. coccifera, Q. humilis i Q. ilex, si bé es recuperen a l'hivern. En canvi en el cas de Q. suber els nivells més baixos de midó s'han obtingut a l'hivern. La tala provoca una disminució dels nivells de midó, ja que una part d'aquest és mobilitzat per a la síntesi dels nous brots. En les quatre espècies la major proporció de midó mobilitzat és en els primers 11 cm de l'arrel, és a dir, el nus cotiledonar en el cas de Q. suber. Per tant, amb aquest estudi es reafirma que el nus cotiledonar de Q. suber és un lignotúber. Tanmateix, Q. coccifera, Q. humilis i Q. ilex no presenten cap lignotúber o estructura especialitzada en la rebrotada, si bé el fet de tenir gemmes i substàncies de reserva els confereix igualment una elevada capacitat per rebrotar. En relació al nitrogen, en les quatre espècies el sistema radicular presenta aproximadament el 70% del nitrogen total de la planta. A l'estiu, la concentració de nitrogen del sistema radicular de Q. humilis i Q. suber és més baixa que a l'hivern, mentre que en Q. coccifera i Q. ilex els valors són bastant similars en ambdues estacions. La tala no provoca una davallada dels nivells de midó, això possiblement es degui a que les plàntules van rebre continuament un aport de nitrogen a través de l'aigua de reg.

Managanese and dicopper complexes for bioinspired oxidation reactions: catalytic and mechanistic studies on C-H and C=C oxidations

Enzymes are high-weight molecules which catalyze most of the metabolic processes in living organisms. Very often, these proteins contain one or more 1st row transition metal ions in their active center (Fe, Cu, Co, Mn, Zn, etc.), and are known as metalloenzymes or metalloproteins. Among these, metalloenzymes that activate molecular oxygen and use it as terminal oxidant stand out because of the wide range of catalyzed reactions and their exquisite selectivity. In this PhD dissertation we develop low-weight synthetic bioinspired complexes that can mimic structural and/or functional features of the active center of oxigenases. In the first part, we describe the use of unsymmetric dinuclear Cu complexes which are capable of performing the oxidation of phenols and phenolates in a analogous manner of the tyrosinase protein. In the second part, we describe the use of mononuclear manganese complexes in the oxidation of alcanes and alquenes.

O2 activation at bioinspired complexes: dinuclear copper systems and mononuclear non-heme iron compounds. Mechanisms and catalytic applications in oxidative transformations

L'activació d'oxigen que té lloc en els éssers vius constitueix una font d'inspiració pel desenvolupament d'alternatives als oxidants tradicionals, considerats altament tòxics i nocius. En aquesta treball s'utilitzen compostos sintètics com a models del centre actiu de proteïnes dinuclears de coure i mononuclears de ferro de tipus no-hemo que participen en l'activació d'oxigen en els éssers vius. Els sistemes dinuclears de coure mostren un centre de tipus coure(III) bis(oxo) que és capaç de dur a terme l'ortho-hidroxilació de fenols de manera similar a la reacció que catalitza la proteïna tirosinasa. Per altra banda, els sistemes de ferro desenvolupats en aquest treball actuen com a models de les dioxigenases de Rieske i poden dur a terme l'hidroxilació estereoespecífica d'alcans i l'epoxidació i cis-dihidroxilació d'olefines utilitzant peròxid d'hidrogen com a agent oxidant. Tot plegat demostra que el desenvolupament de sistemes model constitueix una bona estratègia per l'estudi dels sistemes naturals.

A case of intestinal lymphangictasia with lipogranulomatous lymphangitis in a female rottweiler dog

Uma cadela, fêmea, de raça Rottweiller de três anos de idade apresentou-se com sinais clínicos de diarreira crónica, perda de peso grave e vómito esporádico. A histopatologia revelou uma linfangiectasia intestinal com linfangite lipogranulomatosa. A linfangiectasia intestinal consiste numa dilatação patológica dos vasos linfáticos intestinais, sendo a causa mais frequente de enteropatia com perda de proteína no cão. Este trabalho consiste na apresentação do caso clínico e numa breve revisão da literatura.

Benefícios de uma intervenção com uma dieta do tipo mediterrânico e um programa de exercício físico em variáveis de composição corporal e factores de risco de doença cardiovascular

Introdução: Uma dieta do tipo mediterrânico associada a exercício físico pode ser uma estratégia eficaz na prevenção da obesidade e de co-morbilidades associadas. Objectivo: Este estudo pretendeu determinar a associação entre um programa de intervenção, constituído por uma dieta do tipo mediterrânico e exercício físico, com alterações em variáveis de composição corporal e metabólicas. Método: 12 mulheres e homens sedentários (32,5±8,74 anos, 1,69±0,11 cm), com excesso de peso (81,9±18,1 kg, 28,5±5,45 kg/m2, 36,1±8,56 % massa gorda) participaram num programa de intervenção de 12 semanas. Foi realizada avaliação da composição corporal, do dispêndio energético, da ingestão energética e de níveis séricos de lípidos em jejum. As sessões de nutrição foram realizadas semanalmente e a dieta apresentou uma distribuição de macronutrientes correspondente a 40-45% de hidratos de carbono, 15-20% de proteína e 30-35% de lípidos. As sessões de exercício foram realizadas 3 vezes por semana, com prescrição para as componentes cardiovascular e de força. Resultados: Os participantes tiveram alterações significativas nas variáveis de peso, perímetro da cintura, massa gorda, dispêndio energético e níveis séricos de colesterol e triglicéridos (p<0,05). A distribuição de macronutrientes da dieta não se alterou com a intervenção alimentar, contudo, o aumento significativo do consumo de PUFA’s revelou-se associado a menores valores de massa gorda e a maiores diferenças nos níveis de triglicéridos (p<0,05). Conclusão: O dispêndio calórico e o consumo de PUFA’s revelaram estar associados a melhorias da composição corporal (massa gorda). Este estudo também conduziu à melhoria das concentrações de colesterol e triglicéridos. No entanto, as melhorias nas concentrações de triglicéridos associaram-se apenas à dieta.

Estudo da presença de Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis numa exploração leiteira no Litoral Centro de Portugal Continental

A Paratuberculose, conhecida também como Doença de Johne, é uma afeção infecciosa que provoca uma enterite granulomatosa crónica causada pelo agente Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (Map). É uma doença de carácter contagioso, de distribuição mundial, atingindo os mamíferos, particularmente os pequenos e grandes ruminantes, equinos, suínos, búfalos, coelhos, etc. Tem um grande impacto económico, nomeadamente na redução da produção leiteira, na redução dos teores de proteína no leite, na susceptibilidade a outras doenças, no refugo de animais e no aumento dos custos na sanidade. Pensa-se que também terá impacto a nível de Saúde Pública uma vez que o Map pode estar associado á doença de Crohn em humanos em que o leite cru, leite em pó ou leite pasteurizado podem ser os veículos de transmissão, porém não existem estudos suficientes para sustentar este acontecimento. A técnica de diagnóstico “Gold Standard” é a cultura microbiológica de fezes, no entanto é um procedimento muito demorado podendo levar até 4 meses para se observarem as colónias bacterianas, uma vez que o seu crescimento é muito lento. Deste modo, existem outros testes, tais como o PCR e ELISA, com elevada especificidade para o agente que fornecem resultados mais rápidos e que permitem minimizar os falsos-positivos, apesar da sua reduzida sensibilidade (por volta dos 50%). Este estudo é baseado na observação das instalações da exploração e consequente comparação com parâmetros analisados e documentados em literatura. Para além disso, são utilizadas informações fornecidas pelo Software da exploração com o intuito de estudar a incidência da Paratuberculose, ao longo dos anos, de modo a comprovar se as medidas de maneio e de higiene adotadas pela exploração afetada contribuem ou não de alguma maneira para o controlo/erradicaçãoda doença de Johne.

Apical leaf necrosis and leaf nitrogen dynamics in diseased leaves: a model study

Apical leaf necrosis is a physiological process related to nitrogen (N) dynamics in the leaf. Pathogens use leaf nutrients and can thus accelerate this physiological apical necrosis. This process differs from necrosis occurring around pathogen lesions (lesion-induced necrosis), which is a direct result of the interaction between pathogen hyphae and leaf cells. This paper primarily concentrates on apical necrosis, only incorporating lesion-induced necrosis by necessity. The relationship between pathogen dynamics and physiological apical leaf necrosis is modelled through leaf nitrogen dynamics. The specific case of Puccinia triticina infections on Triticum aestivum flag leaves is studied. In the model, conversion of indirectly available N in the form of, for example, leaf cell proteins (N-2(t)) into directly available N (N-1(t), i.e. the form of N that can directly be used by either pathogen or plant sinks) results in apical necrosis. The model reproduces observed trends of disease severity, apical necrosis and green leaf area (GLA) and leaf N dynamics of uninfected and infected leaves. Decreasing the initial amount of directly available N results in earlier necrosis onset and longer necrosis duration. Decreasing the initial amount of indirectly available N, has no effect on necrosis onset and shortens necrosis duration. The model could be used to develop hypotheses on how the disease-GLA relation affects yield loss, which can be tested experimentally. Upon incorporation into crop simulation models, the model might provide a tool to more accurately estimate crop yield and effects of disease management strategies in crops sensitive to fungal pathogens.