Développement des marqueurs moléculaires spécifiques pour l'identification et la quantification de deux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires en utilisant la PCR en temps réel

Les champignons mycorhizien à arbuscules (CMA) sont des organismes pouvant établir des symbioses avec 80% des plantes terrestres. Les avantages d'une telle symbiose sont de plus en plus caractérisés et exploités en agriculture. Par contre, jusqu'à maintenant, il n'existe aucun outil permettant à la fois l'identification et la quantification de ces champignons dans le sol de façon fiable et rapide. Un tel outil permettrait, entre autres, de mieux comprendre les dynamiques des populations des endomycorhizes dans le sol. Pour les producteurs d'inoculum mycorhiziens, cela permettrait également d'établir un suivi de leurs produits en champs et d'avoir un contrôle de qualité de plus sur leurs inoculants. C'est ce que nous avons tenté de développer au sein du laboratoire du Dr. Hijri. Depuis environ une trentaine d'années, des outils d'identification et/ou de quantification ont été développés en utilisant les profiles d'acides gras, les isozymes, les anticorps et finalement l'ADN nucléaire. À ce jour, ces méthodes d’identification et de quantification sont soit coûteuses, soit imprécises. Qui plus est, aucune méthode ne permet à la fois la quantification et l’identification de souches particulières de CMA. L’ADN mitochondrial ne présente pas le même polymorphisme de séquence que celui qui rend l’ADN nucléaire impropre à la quantification. C'est pourquoi nous avons analysé les séquences d’ADN mitochondrial et sélectionné les régions caractéristiques de deux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA). C’est à partir de ces régions que nous avons développé des marqueurs moléculaires sous forme de sondes et d’amorces TaqMan permettant de quantifier le nombre de mitochondries de chacune de ces espèces dans un échantillon d’ADN. Nous avons ensuite tenté de déterminer une unité de quantification des CMA, soit un nombre de mitochondries par spore. C’est alors que nous avons réalisé que la méthode de préparation des échantillons de spores ainsi que la méthode d’extraction d’ADN avaient des effets significatifs sur l’unité de quantification de base. Nous avons donc optimisé ces protocoles, avant d’en e tester l’application sur des échantillons de sol et de racines ayant été inoculés avec chacune des deux espèces cibles. À ce stade, cet outil est toujours semi-quantificatif, mais il permet 9 l’identification précise de deux espèces de CMA compétentes dans des milieux saturés en phosphore inorganique. Ces résultats , en plus d’être prometteurs, ont permis d’augmenter les connaissances méthodologiques reliées à la quantification des CMA dans le sol, et suggèrent qu’à cause de leurs morphologies différentes, l’élaboration d’un protocole de quantification standardisé pour toutes les espèces de CMA demeure un objectif complexe, qui demande de nouvelles études in vivo.

Proteína c reactiva ultrasensible (PCR-h) en el dolor torácico de probabilidad intermedia para síndrome coronario agudo

INTRODUCCION: El dolor torácico es una de las principales causas de consulta en los servicios de urgencias y cardiología, se convierte en un reto clasificar a los pacientes empleando una herramienta diagnóstica lo suficientemente sensible y especifica para establecer riesgo y pronóstico, la estrecha relación existente entre enfermedad aterosclerótica e inflamación ha dirigido su atención al papel de marcadores plasmáticos de inflamación como predictores de riesgo de eventos cardiovasculares. La Proteína C reactiva (PCR) ha sido ampliamente estudiada en pacientes con factores de riesgo cardiovascular y Eventos coronarios Agudos, pero se desconoce el comportamiento en pacientes con dolor torácico de probabilidad intermedia. OBJETIVOS: Determinar la utilidad y comportamiento de la Proteína C reactiva en pacientes con dolor torácico de probabilidad Intermedia para síndrome coronario. MATERIALES Y METODOS: Este estudio fue realizado entre junio 2008 y febrero de 2009 en una institución de referencia en cardiológica ( Fundación Cardio Infantil, Bogotá-Colombia), Se Estudiaron pacientes con EKG normal o no diagnostico y marcadores de injuria miocardica negativos. Los pacientes continuaron su estudio según las recomendaciones y guías internacionales para dolor torácico. Nosotros realizamos dos tomas de PCR, Una PCR antes de 12 horas de iniciado el dolor torácico y otra PCR después de las 18 Hrs de iniciado el dolor torácico, se realizo la deferencia entre estas dos PCR (PCR 18 hrs vs PCR basal) Con estos 3 resultados se hizo el análisis estadístico para hallar sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo, comparándolo contra las pruebas de provocación de isquemia y cateterismo. RESULTADOS: Un total de 203 pacientes fueron analizaron. Con un promedio de edad fue de 60.8 ± 11 años, Los dos géneros tuvieron una distribución sin diferencia significativas. Los factores de riesgo asociados fueron: Hipertensión arterial 76%(n=155), Dislipidemia 68.1%(n=139), Diabetes Mellitus 20.6%(n=42), Obesidad 7.4%(n=15) y tabaquismo 9.3%(n=19). El total de cateterismos realizados fueron 66 pruebas: Normal el 27%(n=18), lesiones no significativas el 25.8%(n=17) y lesiones Obstructivas 47%(n=31). La PCR tuvo una utilidad diagnostica baja, la PCR a las 18 horas es la mejor prueba diagnóstica , con un mejor comportamiento del área de la curva ROC 0.74 (IC , 0.64-0.83), con sensibilidad del 16.13% (IC 95%, 1.57-30.69), especificidad del 98.26%( IC 955, 96.01-100), un valor predictivo negativo de 86.67%(IC 95%, 81.64-91.69). En el seguimiento a los 30 días no encontró nuevas hospitalizaciones de causa cardiovascular. CONCLUSIONES: Nuestro estudio muestra una utilidad diagnostico baja de la PCR en el dolor torácico de probabilidad intermedia para enfermedad coronaria, el mejor comportamiento diagnostico se encontró en la PCR a las 18 hrs con una alta especificidad y un alto Valor predictivo negativo para un valor de PCR > de 3mg/dl, siendo menor la utilidad de la PCR basal y diferencia de la PCR. diferencia de la PCR. Estos hallazgos no se correlacionaron con estudios previos. No se pudo establecer un punto de Corte de la PCR diferente a los ya existentes debido a la variabilidad de la PCR entre la población de estudio. Las limitaciones encontradas en nuestro estudio hacen necesaria la realización de un estudio multicéntrico.

Correlación entre niveles séricos de PCR ultrasensible y riesgo cardiovascular en una cohorte de mujeres adultas

La PCR es el marcador de inflamación vascular más estudiado y validado hasta la fecha. Los niveles de PCR ultrasensible pueden predecir el riesgo de enfermedad cardiovascular. En el programa “salud integral para la mujer” de la fundación cardio-infantil se realizan estratificaciones de riesgo cardiovascular a mujeres adultas. Se midieron los niveles de PCR en este grupo de pacientes entre Octubre del 2007 y Mayo del 2009 y se evaluó la correlación entre la estratificación del riesgo cardiovascular por escala de Framingham y niveles de PCR en esta población. Objetivo: establecer el grado de correlación entre los niveles de PCR ultrasensible y el grado de riesgo cardiovascular y otros factores de riesgo cardiovascular. Resultados: Edad promedio 48 años (18 a 98 años). 62 pacientes hipertensas (40,7%). 19 pacientes con cifras alteradas de glicemia en ayunas (12%). Hay un 83% de la población estudiada con dislipidemia (127 pacientes). 78 pacientes con sobrepeso u obesidad. El 87% de la población tiene al menos un factor de riesgo presente. Discusión y resultados: En la población estudiada existe una alta prevalencia de factores de riesgo cardiovasculares, dentro de los cuales predomina los trastornos del metabolismo de los lípidos. Sin embargo no hay correlación entre los niveles de PCR ultrasensible y el riesgo cardiovascular según la escala de Framingham. En la literatura médica publicada sobre PCR ultrasensible y su relación con el riesgo cardiovascular los resultados son muy divergentes con los encontrados en este estudio.

Asociación entre PCR y riesgo cardiovascular en una cohorte de mujeres que asisten al programa salud de la mujer en la Fundación Cardioinfantil

La proteína C reactiva ultrasensible es un biomarcador de inflamación vascular más estudiado y validado hasta la fecha. En el presente estudio se determino la correlación entre la PCR y el riesgo cardiovascular estratificado mediante la escala europea y el método de farmingham, en pacientes incluidas desde septiembre de 2007 hasta septiembre de 2011. Objetivo: establecer el grado de correlación entre los niveles de PCR ultrasensible y el grado de riesgo cardiovascular. Resultados: se incluyeron un total (N=299) mujeres mayores de 18 años, con promedio de edad de 48 años; según los niveles de PCR (89%) N= 269 tenían riesgo cardiovascular bajo. Con la estratificación de riesgo según la escala europea solo un (0.66%) N=2 se catalogaban como alto riesgo cardiovascular, implementando la escala de framingham un (74%) N=222 estaban en bajo riesgo. Predominando el riesgo cardiovascular bajo y datos de PCR en riesgo bajo. Encontramos muy débil correlación positiva entre los niveles de PCR y el riesgo cardiovascular calculado por el método de framingham para las pacientes (correlación de Pearson 0.323 con significancia estadística de 0,01) Finalmente encontramos una correlación inversa entre los niveles de PCR y HDL en la muestra estudiada estadísticamente significativa. Discusión: En la población estudiada existe una alta prevalencia de factores de riesgo cardiovasculares, destacamos la utilidad del método de framingham para discriminar riesgo cardiovascular en comparación con la escala europea. Además en el presente estudio, se destacan las correlaciones de la PCR con el perfil lipídico. Finalmente encontramos un correlación inversa entre los niveles de PCR y HDL en la muestra estudiada estadísticamente significativa, con lo cual podemos concluir posible utilidad tanto para el diagnostico y alternativa de estratificación en riesgo cardiovascular en nuestra población.

Anàlisi polifàsica de soques de "Pseudomonas fluorescens" potencials agents de biocontrol de malalties de fruiters

Molts bacteris del grup fluorescent del gènere Pseudomonas són capaços de controlar malalties de les plantes causades per fongs i bacteris fitopatògens (ACBs) o mostren activitat com a bacteris promotors del creixement de les plantes (BPCPs). S'han descrit diversos metabòlits que intervenen de manera important en la seva activitat com a ACBs i BPCPs entre els quals en destaquen el 2,4-diacetilfloroglucinol (Phl), àcid fenazin-1-carboxílic (PCA), Pirrolnitrina (Prn), àcid cianhídric (HCN), àcid 3-indolacètic (IAA), sideròfors i quitinases. L'objectiu principal del nostre treball ha estat la comparació de les característiques d'un grup de Pseudomonas del grup fluorescent utilitzant una aproximació polifàsica amb la finalitat d'establir possibles relacions entre algunes de les característiques i la capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Atesa la importància en el biocontrol de la producció de metabòlits com Phl, PCA i Prn, l'objectiu preliminar ha estat la recerca i obtenció de soques productores d'aquests metabòlits. Per assolir aquest objectiu s'ha emprat una aproximació molecular basada en la detecció dels gens biosintètics implicats en la seva producció en lloc de la detecció directa dels metabòlits per evitar els efectes que poden tenir les condicions de cultiu en la inducció o repressió de la seva síntesi. S'han realitzat diferents protocols basats (i) en la cerca assistida de productors mitjançant l'ús de marcadors fenotípics i posterior confirmació per PCR i, (ii) en l'ús de la PCR per a la detecció dels gens directament dels extractes bacterians, d'enriquiments d'aquests extractes i la realització de la hibridació en colònies per al posterior aïllament. La cerca assistida de productors de Phl mitjançant marcadors fenotípics i posteriorment la utilització de tècniques moleculars (amplificació per PCR del gen phlD), ha estat el millor mètode en el tipus de mostres processades en el nostre treball, on la proporció de productors és relativament baixa. En total s'han aïllat a partir de diversos ambients 4 soques portadores dels gens de la síntesi de PCA, 15 de Phl i 1 de Prn. S'ha constituït una col·lecció de 72 soques de Pseudomonas del grup fluorescent que inclou 18 aïllats propis portadors dels gens biosintètics necessaris per la producció de Phl PCA i Prn; 6 soques de referència procedents de col·leccions de cultius tipus, 14 soques productores dels diferents antibiòtics cedides per altres investigadors i una selecció de 34 soques procedents d'un treball previ realitzat en el nostre grup de recerca. A la col·lecció s'hi troben soques candidates a ACB i BPCP de diverses malalties i plantes. Les 72 soques s'han caracteritzat fenotípica i genotípicament. La caracterització fenotípica s'ha portat a terme mitjançant la identificació a nivell d'espècie amb galeries API 20NE i proves bioquímiques específiques; la producció de metabòlits com PCA, Phl, Prn, IAA, HCN, quitinases i sideròfors mitjançant l'ús de diferents tècniques; antagonisme in vitro en diversos medis enfront dos fongs (Stemphylium vesicarium i Penicillium expansum) i tres bacteris fitopatògens (Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv. syringae i Xanthomonas arboricola pv. juglandis); l'eficàcia de la inhibició de la infecció en bioassaigs in vivo sobre material vegetal enfront els fongs P. expansum en poma i S. vesicarium en fulles de perera i enfront el bacteri E. amylovora en fruits immadurs de perera i, finalment, en assaigs de promoció de creixement en dos portaempelts comercials de Prunus. Cal destacar que P. expansum causa la podridura blava en pomes i peres en postcollita, S. vesicarium la taca bruna de la perera i E. amylovora el foc bacterià de les rosàcies. El nombre de soques de Pseudomonas, sobre el total de les 72 estudiades, productores d'IAA (4) i quitinases (6) és baix, mentre que és elevat en el cas del HCN (32), que a més està associat a la producció de Phl. Els resultats obtinguts en l'antagonisme in vitro han mostrat en el cas dels bacteris que és dependent del patogen indicador i del medi de cultiu. La presència o absència de ferro no sembla ser un factor que potencií l'antagonisme. En el cas dels fongs no s'ha observat però, influència del medi de cultiu emprat. En el total de 72 soques s'ha observat un percentatge baix de soques que manifesten antagonisme en tots els medis assajats vers 3 o 4 dels patògens (7). Solament 2 d'aquestes 7 soques han mostrat ser també efectives en bioassaigs d'inhibició de les infeccions causades per 2 dels 3 patògens assajats. Algunes de les soques efectives en els bioassaigs no són antagonistes in vitro en cap dels medis assajats enfront el mateix patogen. En el cas de la promoció del creixement, s'han observat més soques promotores del creixement del portaempelts de prunera Marianna 2624 que no en l'híbrid de presseguer-ametller GF677 i les eficàcies assolides són també majors en el cas de Marianna 2624, detectant una elevada especificitat soca/portaempelts La caracterització genotípica s'ha realitzat mitjançant l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de restricció de DNA ribosomal (RFLP-rDNA) i l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de macrorestricció genòmica de DNA cromosòmic separats per electroforesi en camp polsant (MRFLP-PFGE). Ambdues anàlisis van mostrar una gran heterogeneïtat genètica entre les soques caracteritzades i no s'ha pogut relacionar les agrupacions obtingudes amb les característiques fenotípiques o capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Els patrons de macrorestricció genòmica (MRFLP-PFGE) del bacteri model P. fluorescens EPS288 són estables en el temps i independents de les condicions de cultiu assajades al laboratori o en mostres naturals, mostrant ser una tècnica eficaç en la identificació de reaïllats de mostres naturals inoculades prèviament amb el bacteri. Una selecció de soques que comparteixen el fet de produir floroglucinol s'han caracteritzat mitjançant RFLP i seqüenciació del gen phlD. S'ha establert una relació entre les agrupacions obtingudes en les anàlisis RFLP-rDNA, RFLP-phlD i les seqüències del gen. En l'anàlisi filogenètica de les seqüències del gen phlD s'ha observat un elevat grau de polimorfisme obtenint-se 3 agrupacions principals. Les agrupacions semblen relacionar-se amb els patrons de producció de metabòlits (Phl, HCN i Prn en una primera agrupació; Phl i HCN en la segona i solament Phl en la tercera), però aquestes no s'han pogut relacionar amb l'origen geogràfic de les soques o la seva activitat com a ACBs i/o BPCP. Amb les dades obtingudes de la caracterització fenotípica i genotípica s'ha realitzat una anàlisi multivariant (correspondències, correlacions d'Spearman i de freqüències amb variables categòriques). S'ha demostrat la importància de disposar d'una tècnica que permeti depurar una col·lecció de soques descartant les soques genèticament idèntiques, ja que influeixen en els resultats de les anàlisis. Pels tres patògens assajats com a indicadors i els dos portaempelts emprats, no s'ha observat cap correlació entre la inhibició de la infecció o la promoció del creixement amb les característiques fenotípiques i genotípiques de les soques que fos significatiu i consistent en les tres tècniques emprades.

O potencial da PCR em tempo real no diagnóstico da infecção por helicobacter pylori

H. pylori é um microrganismo responsável por gastrites e implicado, em associação com outros factores, na úlcera gastroduodenal e no cancro gástrico. O diagnóstico da infecção por microrganismo pode realizar-se recorrendo a métodos invasivos através da obtenção de uma biópsia gástrica obtida por endoscopia digestiva alta e a métodos não invasivos. Nenhum dos métodos, desenvolvido até hoje, constitui o método ideal. Todos eles possuem as suas vantagens e desvantagens consoante a situação em que são aplicados. A reacção de polimerização em cadeia (PCR) conduziu a uma modificação fundamental no campo da biologia molecular, abrindo novos horizontes nas ciências médicas e biológicas. Apesar da cultura de H. pylori a partir de biópsia gástrica continuar a ser o método de referência para o diagnóstico da infecção por esta bactéria, ela apresenta inconvenientes que podem ser ultrapassados pela utilização da PCR, como sejam o longo período para a obtenção de resultados e o respeito de condições estritas de transporte da biópsia gástrica. Recentemente foi desenvolvido um protocolo baseado no principio da PCR em tempo real, utilizando o aparelho LightCycler Roche Diagnostics. Este protocolo permite a obtenção de um resultado de detecção da presença de H. pylori na biópsia gástrica assim como do seu perfil de susceptibilidade aos macrólidos. A PCR em tempo real é dotada de uma grande sensibilidade e especificidade, rapidez de obtenção de resultados o que aliado à sua capacidade de detecção de mutações responsáveis pela resistência dos microrganismos aos antibióticos faz com que esta técnica seja a metodologia do futuro no diagnóstico das doenças infecciosas.

Evaluation of PCR to detect Theileria parva in field-collected tick and bovine samples in Tanzania

The ability of PCR to detect infections of Theileria parva, the cause of East Coast Fever, in field-collected tick and bovine samples from Tanzania was evaluated. PCR-detected infection prevalence was high (15/20, 75%) in unfed adult Rhipicephalus appendiculatus ticks that fed as nymphs on an acutely-infected calf, but low (22/836, 2.6%) in unfed adult R. appendiculatus collected from field sites in Tanzania. Tick infection prevalence was comparable to that in previous studies that used salivary gland staining to detect T parva infection in field-collected host-seeking ticks. Of 282 naturally-exposed zebu calves, seven had PCR-positive buffy coat samples prior to detection of Theileria spp. parasites in stained huffy coat cells or lymph node biopsies. Evidence of Theileria spp. infections was detected in stained smears of lymph node biopsies from 109 calves (38.6%) and huffy coat samples from 81 (28.7%), while huffy coat samples from 66 (23.4%) were PCR-positive for T parva. Implications of these findings for the sensitivity and specificity of the PCR are discussed. (C) 2003 Elsevier Science B.V. All rights reserved.

Quantification of ruminal Clostridium proteoclasticum by real-time PCR using a molecular beacon approach

Aims: All members of the ruminal Butyrivibrio group convert linoleic acid (cis-9,cis-12-18 : 2) via conjugated 18 : 2 metabolites (mainly cis-9,trans-11-18 : 2, conjugated linoleic acid) to vaccenic acid (trans-11-18 : 1), but only members of a small branch, which includes Clostridium proteoclasticum, of this heterogeneous group further reduce vaccenic acid to stearic acid (18 : 0, SA). The aims of this study were to develop a real-time polymerase chain reaction (PCR) assay that would detect and quantify these key SA producers and to use this method to detect diet-associated changes in their populations in ruminal digesta of lactating cows. Materials and Results: The use of primers targeting the 16S rRNA gene of Cl. proteoclasticum was not sufficiently specific when only binding dyes were used for detection in real-time PCR. Their sequences were too similar to some nonproducing strains. A molecular beacon probe was designed specifically to detect and quantify the 16S rRNA genes of the Cl. proteoclasticum subgroup. The probe was characterized by its melting curve and validated using five SA-producing and ten nonproducing Butyrivibrio-like strains and 13 other common ruminal bacteria. Analysis of ruminal digesta collected from dairy cows fed different proportions of starch and fibre indicated a Cl. proteoclasticum population of 2-9% of the eubacterial community. The influence of diet on numbers of these bacteria was less than variations between individual cows. Conclusion: A molecular beacon approach in qPCR enables the detection of Cl. proteoclasticum in ruminal digesta. Their numbers are highly variable between individual animals. Signifance and Impact of the Study: SA producers are fundamental to the flow of polyunsaturated fatty acid and vaccenic acid from the rumen. The method described here enabled preliminary information to be obtained about the size of this population. Further application of the method to digesta samples from cows fed diets of more variable composition should enable us to understand how to control these bacteria in order to enhance the nutritional characteristics of ruminant-derived foods, including milk and beef.

Application of real-time and multiplex PCR assays to study leaf blotch epidemics in barley

Leaf blotch, caused by Rhynchosporium secalis, was studied in a range of winter barley cultivars using a combination of traditional plant pathological techniques and newly developed multiplex and real-time polymerase chain reaction (PCR) assays. Using PCR, symptomless leaf blotch colonization was shown to occur throughout the growing season in the resistant winter barley cv. Leonie. The dynamics of colonization throughout the growing season were similar in both Leonie and Vertige, a susceptible cultivar. However, pathogen DNA levels were approximately 10-fold higher in the susceptible cultivar, which expressed symptoms throughout the growing season. Visual assessments and PCR also were used to determine levels of R. secalis colonization and infection in samples from a field experiment used to test a range of winter barley cultivars with different levels of leaf blotch resistance. The correlation between the PCR and visual assessment data was better at higher infection levels (R(2) = 0.81 for leaf samples with >0.3% disease). Although resistance ratings did not correlate well with levels of disease for all cultivars tested, low levels of infection were observed in the cultivar with the highest resistance rating and high levels of infection in the cultivar with the lowest resistance rating.

Characterization and PCR multiplexing of polymorphic microsatellite loci in cashew (Anacardium occidentale L.) and their cross-species utilization

Cashew (Anacardium occidentale L.) is the most economically important tropical nut crop in the world, and yet there are no sequence tagged site (STS) markers available for its study. Here we use an automated, high-throughput system to isolate cashew microsatellites from a non-enriched genomic library blotted onto membranes at high density for screening. Sixty-five sequences contained a microsatellite array, of which 21 proved polymorphic among a closely related seed garden population of 49 genotypes. Twelve markers were suitable for multiplex analysis. Of these, 10 amplified in all three related tropical tree species tested: Anacardium microcarpum, Anacardium pumilum and Anacardium nanum.

Genomic analysis of recombinant Sabin clinical isolates

Recombination in Poliovirus vaccine strains is a very frequent phenomenon. In this report 23 polio/Sabin strains isolated from healthy vaccinees or from VAPP patients after OPV administration, were investigated in order to identify recombination sites from 2C to 3D regions of the poliovirus genome. RT-PCR, followed by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) screening analysis were applied in four distant genomic regions (5' UTR, VP1, 2C and 3C-3D) in order to detect any putative recombinant. The detected recombinants were sequenced from 2C to the end of the genome (3' UTR) and the exact recombination sites were determined with computational analysis. Five of the 23 isolated strains were recombinant in one genomic region, two of them in 2C, isolates EP16:S3/S2, EP23:S3/S1, two in 3D isolates EP6:S2/S1, EP12:S2/S1 and one in 3A isolate EP9:S2/Sl. Point mutations were found in strains EP3, EP6, EP9 and EP12. Recombination specific types and sites re-occurrence along with point mutations are discussed concerning the polioviruses evolution.

Detection and enumeration of sulphate-reducing bacteria in estuarine sediments by competitive PCR

The distribution of sulphate-reducing bacteria (SRB) in the sediments of the Colne River estuary, Essex, UK covering different saline concentrations of sediment porewater was investigated by the use of quantitative competitive PCR. Here, we show that a new PCR primer set and a new quantitative method using PCR are useful tools for the detection and the enumeration of SRB in natural environments. A PCR primer set selective for the dissimilatory sulphite reductase gene (dsr) of SRB was designed. PCR amplification using the single set of dsr-specific primers resulted in PCR products of the expected size from all 27 SRB strains tested, including Gram-negative and positive species. Sixty clones derived from sediment DNA using the primers were sequenced and all were closely related with the predicted dsr of SRB. These results indicate that PCR using the newly designed primer set are useful for the selective detection of SRB from a natural sample. This primer set was used to estimate cell numbers by dsr selective competitive PCR using a competitor, which was about 20% shorter than the targeted region of dsr. This procedure was applied to sediment samples from the River Colne estuary, Essex, UK together with simultaneous measurement of in situ rates of sulphate reduction. High densities of SRB ranging from 0.2 - 5.7 × 108 cells ml-1 wet sediment were estimated by the competitive PCR assuming that all SRB have a single copy of dsr. Using these estimates cell specific sulphate reduction rates of 10-17 to 10-15 mol of SO42- cell-1 day-1 were calculated, which is within the range of, or lower than, those previously reported for pure cultures of SRB. Our results show that the newly developed competitive PCR technique targeted to dsr is a powerful tool for rapid and reproducible estimation of SRB numbers in situ and is superior to the use of culture-dependent techniques.

Development of a PCR-based assay for rapid and reliable identification of pathogenic Fusaria

Identification of Fusarium species has always been difficult due to confusing phenotypic classification systems. We have developed a fluorescent-based polymerase chain reaction assay that allows for rapid and reliable identification of five toxigenic and pathogenic Fusarium species. The species includes Fusarium avenaceum, F. culmorum, F. equiseti, F. oxysporum and F. sambucinum. The method is based on the PCR amplification of species-specific DNA fragments using fluorescent oligonucleotide primers, which were designed based on sequence divergence within the internal transcribed spacer region of nuclear ribosomal DNA. Besides providing an accurate, reliable, and quick diagnosis of these Fusaria, another advantage with this method is that it reduces the potential for exposure to carcinogenic chemicals as it substitutes the use of fluorescent dyes in place of ethidium, bromide. Apart from its multidisciplinary importance and usefulness, it also obviates the need for gel electrophoresis. (C) 2002 Published by Elsevier Science B.V. on behalf of the Federation of European Microbiological Societies.