Detección de impactos con frutos electrónicos

Cada vez que los frutos y hortalizas se manipulan, se producen daños y, por tanto, pérdidas de calidad y pérdidas económicas. Los productos Electrónicos Simulados SEP miden y registran las fuerzas que intervienen en estos procesos. Por ello, se pueden utilizare para localizar los puntos que causan daños en las cosechadoras y en las líneas de manipulación. De esta manera, se pueden hacer las modificaciones oportunas para eliminar los daños por impactos en frutas y hortalizas. En este artículo se exponen las calibraciones de 4 SEPs y los ensayos realizados en distintas líneas de frutas y hortalizas.

Mecanización de las explotaciones hortofrutícolas en California

Con motivo de la celebración del 5o Simposio Internacional de Ingeniería de la Producción de Frutas y Hortalizas en la primera semana de septiembre de 1997 en Davis. California, se realizaron una serie de visitas técnicas a explotaciones hortofrutícolas del Valle Central de California, que es una de las zonas de mayor producción y riqueza agrícola del mundo. Creemos de interés para el sector hortofrutícola español presentar aquellos aspectos más relevantes de las explotaciones visitadas.

Daños por magulladura en frutos de pepita

La demanda de frutas y hortalizas es cada vez más exigente en términos de calidad. En frutos de pepita, los principales parámetros de calidad son el calibre, la firmeza, el color, la calidad gustativa y la ausencia de defectos; los daños mecánicos son los defectos que producen mayores pérdidas. En manzana, se ha comprobado que las magulladuras son el daño mecánico más frecuente, que influye decisivamente en el precio de venta y en la aceptación del consumidor. En los últimos cinco años, un equipo investigador del Departamento de Ingeniería Rural de la Universidad Politécnica de Madrid, dirigido por la Profesora M. Ruiz-Altisent, ha estudiado en profundidad los diversos factores que influyen en la aparición de daños por magulladura en frutos de pepita y la manera de evitarlos.

Control y reducción de daños mecánicos en la manipulación de frutos cítricos

Durante las operaciones de recolección, transporte y manipulación de frutas y hortalizas se producen inevitablemente lesiones que progresivamente se acumulan sobre cada uno de los frutos, resultando disminuida su calidad, y por tanto su valor comercial. Los mercados actuales, tanto nacionales como internacionales, demandan frutas de alta calidad. Uno de los aspectos que constituyen esa calidad es la apariencia externa del producto, y dentro de ésta la ausencia de daños mecánicos, heridas, defectos de coloración etc. Es por tanto necesario revisar todos aquellos factores y procesos que afectan al producto, desde el momento de la recolección hasta la llegada del producto a manos del consumidor, con el fin de reducir las cuantiosas pérdidas (alrededor del 20% de la cosecha), debidas a la aplicación de diferentes tipos de cargas mecánicas (impacto, compresión, fricción, etc) a lo largo de los procesos, y mejorar el aspecto externo del fruto. Son bien conocidas las consecuencias del estado actual de los procesos de recolección y post-recolección a nivel de fruto. Cuando un fruto es sometido reiteradamente a cargas mecánicas exteriores, éste induce una respuesta fisiológica de autodefensa y, como consecuencia, puede desencadenar en los tejidos cambios tales como envejecimiento acelerado, degeneración y degradación. Todas estas reacciones redundan indiscutiblemente en las pérdidas de calidad arriba mencionadas. Una vez definido el problema, es necesario conocer en detalle las causas, los procesos en si mismos, ser capaces de detectar los puntos potencialmente peligrosos en los que los frutos están expuestos a impactos, compresiones y otras situaciones de estrés mecánico, cuestión que hasta hace poco ha sido mal resuelta. Hasta ahora la detección y caracterización de los puntos críticos se venía realizando de un modo intuitivo, basado en la simple observación de la ejecución de las operaciones por parte del responsable de cada proceso. Actualmente, con la ayuda de los frutos electrónicos simulados, es posible realizar la evaluación de cualquier procedimiento de forma rápida, precisa y objetiva. El desarrollo de los frutos electrónicos viene a cubrir una demanda del sector, tanto de los productores como de los agentes de comercialización, que necesitaban un método objetivo para la evaluación de los procedimientos y líneas de manipulación. Agencias de extensión agraria y algunas cooperativas han mostrado interés por estos dispositivos, empleándolos para la detección de puntos críticos en sus instalaciones. Incluso algunos agentes de grandes cadenas de supermercados han empezado a solicitar "certificados de calidad" de las líneas que manipulan los productos que ellos comercializan como garantía de su calidad.

Daños por magulladura en frutos de pepita: Factores que influyen en su aparición y control de daños con frutos electrónicos

La demanda de frutas y hortalizas en Europa es cada vez más exigente en términos de calidad. En frutos de pepita, como la manzana y la pera, los principales parámetros de calidad son el calibre, la firmeza, el color, la calidad gustativa y la ausencia de defectos; los daños mecánicos son los defectos que producen mayores pérdidas. En manzana, se ha comprobado que las magulladuras son el daño mecánico más frecuente, que influye decisivamente en el precio de venta y en la aceptación del consumidor. En los últimos cinco años, un equipo investigador del Departamento de Ingeniería Rural de la Universidad Politécnica de Madrid, dirigido por la Profesora M. Ruiz-Altisent, ha estudiado en profundidad los diversos factores que influyen en la aparición de daños por magulladura en frutos de pepita y la manera de evitarlos

Los medios mecánicos y las técnicas de la ingeniería

A pesar los graves condicionamientos socio-económicos y energéticos, se observa una demanda creciente de medios mecánicos y de sofisticación de los mismos, a nivel mundial. Los años 60 suponen un importante empuje en el desarrollo de medios mecánicos, siendo el momento de despegue de la U.C. Davis con el Dept. of Agricultural Engineering. En este momento se establece la llegada de Ingenieros y Científicos agrarios españoles a California. Los programas de colaboración desde aquel momento hasta hoy impulsan varios de los avances desde nuestro punto de vista más importantes en la mecanización de la agricultura española, recolección de frutos con vibradores; sistema mecanizado integrado de producción de lechugas, siembra y recolección mecánica del tomate para industria y producción y utilización de biogás a partir de residuos agrícolas. Otros temas más recientes tratan de dar respuesta a nuevos problemas como: sistemas más económicos y apropiados de laboreo del suelo, evaluación de la calidad de frutas y hortalizas, recolección y manejo no destructivos de frutos. Se incorpora cada vez más una visión sistemática e integrada de la mecanización agraria. La interacción entre los materiales biológicos, los medios mecánicos y el hombre es apreciada como un todo, el cual tiende a desarrollarse de forma unificada.

Impacto mecánico en frutos. Determinación de la resistencia a la magulladura y de la textura en variedades de pera y manzana.

Se presenta un completo sistema de detecci6n para el estudio de IDS impactos sobre frutas y hortalizas. Se han ensayado» durante un periodo de 10 a 12 semanas de almacenamiento en cámara frigorífica y de maduraci6n, tres variedades de peras: Blanquilla, Limonera y Decana de Comice y dos de manzanas: Golden Delicious y Starking. Los impactos se realizaron con un indentador de 50.6 g con cabeza de acero esférica de 19 mm de diámetro. Las alturas ensayadas fueron de 2 a 12 cm de dos en dos y uno complementario a 20 cm sobre cada fruto. La magulladura resultante se midió. y se observó cuidadosamente su estructura. Como método de análisis estadístico se utilizó el factorial de correspondencias-Los parámetros mecánicos y la magulladura resultado de un impacto se pueden clasificar en tres categorías, en función de su correlación con la energía (altura) del impacto o con la textura de los frutos. Se han establecido los principios técnicos para el diseño de un mecanismo no destructivo de detección de la madurez de estos frutos.

Sensitization profiles and cross-reactivity among plant allergens. Molecular mechanisms of food allergy development and the role of enhancers

La prevalencia de las alergias está aumentando desde mediados del siglo XX, y se estima que actualmente afectan a alrededor del 2-8 % de la población, pero las causas de este aumento aún no están claras. Encontrar el origen del mecanismo por el cual una proteína inofensiva se convierte en capaz de inducir una respuesta alérgica es de vital importancia para prevenir y tratar estas enfermedades. Aunque la caracterización de alérgenos relevantes ha ayudado a mejorar el manejo clínico y a aclarar los mecanismos básicos de las reacciones alérgicas, todavía queda un largo camino para establecer el origen de la alergenicidad y reactividad cruzada. El objetivo de esta tesis ha sido caracterizar las bases moleculares de la alergenicidad tomando como modelo dos familias de panalergenos (proteínas de transferencia de lípidos –LTPs- y taumatinas –TLPs-) y estudiando los mecanismos que median la sensibilización y la reactividad cruzada para mejorar tanto el diagnóstico como el tratamiento de la alergia. Para ello, se llevaron a cabo dos estrategias: estudiar la reactividad cruzada de miembros de familias de panalérgenos; y estudiar moléculas-co-adyuvantes que pudieran favorecer la capacidad alergénica de dichas proteínas. Para estudiar la reactividad cruzada entre miembros de la misma familia de proteínas, se seleccionaron LTPs y TLPs, descritas como alergenos, tomando como modelo la alergia a frutas. Por otra parte, se estudiaron los perfiles de sensibilización a alérgenos de trigo relacionados con el asma del panadero, la enfermedad ocupacional más relevante de origen alérgico. Estos estudios se llevaron a cabo estandarizando ensayos tipo microarrays con alérgenos y analizando los resultados por la teoría de grafos. En relación al estudiar moléculas-co-adyuvantes que pudieran favorecer la capacidad alergénica de dichas proteínas, se llevaron a cabo estudios sobre la interacción de los alérgenos alimentarios con células del sistema inmune humano y murino y el epitelio de las mucosas, analizando la importancia de moléculas co-transportadas con los alérgenos en el desarrollo de una respuesta Th2. Para ello, Pru p 3(LTP y alérgeno principal del melocotón) se selección como modelo para llevarlo a cabo. Por otra parte, se analizó el papel de moléculas activadoras del sistema inmune producidas por patógenos en la inducción de alergias alimentarias seleccionando el modelo kiwi-alternaria, y el papel de Alt a 1, alérgeno mayor de dicho hongo, en la sensibilización a Act d 2, alérgeno mayor de kiwi. En resumen, el presente trabajo presenta una investigación innovadora aportando resultados de gran utilidad tanto para la mejora del diagnóstico como para nuevas investigaciones sobre la alergia y el esclarecimiento final de los mecanismos que caracterizan esta enfermedad. ABSTRACT Allergies are increasing their prevalence from mid twentieth century, and they are currently estimated to affect around 2-8% of the population but the underlying causes of this increase remain still elusive. The understanding of the mechanism by which a harmless protein becomes capable of inducing an allergic response provides us the basis to prevent and treat these diseases. Although the characterization of relevant allergens has led to improved clinical management and has helped to clarify the basic mechanisms of allergic reactions, it seems justified in aspiring to molecularly dissecting these allergens to establish the structural basis of their allergenicity and cross-reactivity. The aim of this thesis was to characterize the molecular basis of the allergenicity of model proteins belonging to different families (Lipid Transfer Proteins –LTPs-, and Thaumatin-like Proteins –TLPs-) in order to identify mechanisms that mediate sensitization and cross reactivity for developing new strategies in the management of allergy, both diagnosis and treatment, in the near future. With this purpose, two strategies have been conducted: studies of cross-reactivity among panallergen families and molecular studies of the contribution of cofactors in the induction of the allergic response by these panallergens. Following the first strategy, we studied the cross-reactivity among members of two plant panallergens (LTPs , Lipid Transfer Proteins , and TLPs , Thaumatin-like Proteins) using the peach allergy as a model. Similarly, we characterized the sensitization profiles to wheat allergens in baker's asthma development, the most relevant occupational disease. These studies were performed using allergen microarrays and the graph theory for analyzing the results. Regarding the second approach, we analyzed the interaction of plant allergens with immune and epithelial cells. To perform these studies , we examined the importance of ligands and co-transported molecules of plant allergens in the development of Th2 responses. To this end, Pru p 3, nsLTP (non-specific Lipid Transfer Protein) and peach major allergen, was selected as a model to investigate its interaction with cells of the human and murine immune systems as well as with the intestinal epithelium and the contribution of its ligand in inducing an allergic response was studied. Moreover, we analyzed the role of pathogen associated molecules in the induction of food allergy. For that, we selected the kiwi- alternaria system as a model and the role of Alt a 1 , major allergen of the fungus, in the development of Act d 2-sensitization was studied. In summary, this work presents an innovative research providing useful results for improving diagnosis and leading to further research on allergy and the final clarification of the mechanisms that characterize this disease.

Innovaciones tecnológias en el abonado del melón de La Mancha: influencia en el perfil sensorial.

La conservación de sabor, el aroma y la cantidad microbiana, después de la cosecha y a lo largo de la cadena de distribución es un gran desafío para la industria de fruta fresca. Factores pre y post-cosecha, transporte y almacenamiento influyen directamente en la calidad de las frutas y verduras. El objetivo principal de este trabajo fue investigar el efecto del abonado con compost de orujo en diferentes dosis en el perfil sensorial del melón de La Mancha. Para la realización de este estudio se han empleado tres dosis diferentes de compost de orujo de calidad certificada (1, 2 y 3Kg/m lineal) en melones de la variedad Trujillo cultivados en la región de Castilla-La Mancha. Los melones fueron recolectados en base a su madurez comercial (10-11ºBrix). El análisis descriptivo cuantitativo (QDA) de los melones fue realizado por un panel de 8 catadores entrenados utilizando los atributos que previamente habían sido seleccionados como los que mejor describían las características sensoriales del melón de la variedad Trujillo. Para cuantificar la intensidad de los atributos se utilizaron escalas no estructuradas de 10 cm. La evaluación del perfil sensorial de los melones puso de manifiesto que abonado con compost de orujo no modifica de manera significativa el perfil olfativo y el perfil de textura de los melones independientemente de la dosis empleada. Sin embargo, la dosis de abonado sí modificó ligeramente el perfil gustativo de los melones especialmente cuando la dosis aplicada fue de 3kg/m lineal apareciendo notas a dulce/sintético que no fueron detectadas en los melones control y con menores dosis de abonado.

Evaluación no destructiva de la calidad e implementación en la industria frutícola

Este documento se generó a partir de la IV Reunión de la Red Temática FRUTURA de CYTED realizada en la Facultad de Ciencias Agronómicas de la Universidad de Chile ubicada en Santiago de Chile. Esta reunión se celebró durante el mes de diciembre del 2010 y fue organizada por el Centro de Estudios Postcosecha (CEPOC) de esta Universidad. En esta reunión se realizaron dos seminarios relacionados con aspectos tecnológicos y situación comercial de la exportación frutícola en Iberoamérica. El primer seminario tuvo por título “Seminario Internacional sobre Evaluación no Destructiva de la Calidad e Implementación en la Industria Frutícola” y contó con la participación como expositores de los miembros de la red. Este evento mostró las tendencias actuales relacionadas con el transporte y trazabilidad, monitoreo y predicción de la calidad en la industria frutícola. Durante el segundo seminario titulado “Tendencias Actuales de las Agroexportaciones en Chile” se conocieron los desafíos del transporte de frutas desde el hemisferio sur al mundo, las barreras de protección y control fitosanitario y las herramientas de promoción en la apertura de nuevos mercados. En cada seminario asistieron más de 80 personas vinculadas con la investigación, transferencia y el sector privado (productores, exportadores y empresas de servicio). Esta actividad fue apoyada por las empresas de transporte TRANSFRESH Chile S.A. y GESEX exportadora, la asociación gremial FEDEFRUTA, las instituciones públicas PROCHILE y Servicio Agrícola Ganadero (SAG). Los trabajos aquí expuestos son el resultado de la adaptación de las presentaciones expuestas durante el primer seminario.

Resistance to malathion and lambda-cyhalothrin in Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae)

La mosca mediterránea de la fruta, Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) (Diptera: Tephritidae), es una de las plagas de mayor incidencia económica en cítricos y otros frutales a nivel mundial. En España las medidas de control de esta plaga en cítricos, desde mediados de los 90 hasta 2009, se basaron principalmente en el monitoreo de las poblaciones y en la aplicación de tratamientos aéreos y terrestres con malatión cebo. Sin embargo, desde la retirada en la Unión Europea en 2009 de los productos fitosanitarios que contienen malatión, los insecticidas más utilizados para el control de esta plaga han sido lambda-cihalotrina y spinosad. En 2004-2005 se detectaron poblaciones españolas de C. capitata resistentes a malatión. Esta resistencia se ha asociado a una mutación (G328A) en la acetilcolinesterasa (AChE), a una duplicación del gen de la AChE (Ccace2) (una de las copias lleva la mutación G328A) y a resistencia metabólica mediada por esterasas (posiblemente aliesterasas). Sin embargo, cuando se secuenció la aliesterasa CcE7 en individuos de una línea resistente a malatión, no se encontró ninguna de las mutaciones (G137D y/o W251L/S/G) asociadas a resistencia en otras especies, si bien se encontraron otras mutaciones al compararlos con individuos de una línea susceptible. Asimismo, mediante la selección en laboratorio de una línea resistente a malatión (W-4Km) con lambda-cihalotrina, se ha podido obtener una línea resistente a lambda-cihalotrina (W-1K). Finalmente, se ha demostrado la capacidad de esta especie para desarrollar resistencia a spinosad mediante selección en laboratorio. Los múltiples mecanismos de resistencia identificados evidencian el potencial de esta especie para desarrollar resistencia a insecticidas con diferentes modos de acción. Los objetivos de esta tesis doctoral son: 1) evaluar la susceptibilidad de poblaciones españolas de campo de C. capitata a lambda-cihalotrina y dilucidar los mecanismos de resistencia en la línea W-1Kλ; 2) comparar la herencia, el coste biológico y la estabilidad de la resistencia a malatión mediada por la mutación G328A y la duplicación del gen Ccace2 (una de las copias lleva la mutación G328A); y 3) investigar el papel de las mutaciones identificadas en la aliesterasa CcαE7 en la resistencia a malatión. Estos estudios son de utilidad para el desarrollo de estrategias de manejo de la resistencia que puedan prevenir o retrasar la aparición de resistencia y aumentar la sostenibilidad de los insecticidas disponibles para el control de esta plaga. Nuestros resultados indican que las poblaciones españolas de C. capitata analizadas han desarrollado resistencia a lambda-cihalotrina. Los valores de CL50 estimados para las poblaciones recogidas en la Comunidad Valenciana, Cataluña y Andalucía oscilaron entre 129 ppm y 287 ppm, igualando o sobrepasando la concentración recomendada para los tratamientos de campo (125 ppm). Estos resultados contrastan con los obtenidos con tres poblaciones de campo recogidas en Túnez, cuya susceptibilidad fue similar a la de la línea control (C). La línea resistente a lambda-cihalotrina W-1K se continuó seleccionando en el laboratorio alcanzándose unos niveles de resistencia de 205 veces con respecto a la línea C, siendo su CL50 (4224 ppm) más de 30 veces superior a la concentración recomendada para los tratamientos de campo. Esta línea resistente mostró altos niveles de resistencia cruzada a deltametrina (150 veces) y a etofenprox (240 veces), lo que sugiere que el desarrollo de resistencia a lambda-cihalotrina podría comprometer la eficacia de otros piretroides para el control de esta plaga. Hemos demostrado que la resistencia de la línea W-1K a lambda-cihalotrina fue casi completamente suprimida por el sinergista PBO, lo que indica que las enzimas P450 desempeñan un papel muy importante en la resistencia a este insecticida. Sin embargo, tanto las moscas de la línea susceptible C como las de la línea resistente W-1K perdieron inmediatamente la capacidad de caminar (efecto “knock-down”) al ser tratadas tópicamente con lambda-cihalotrina, lo que sugiere que la resistencia no está mediada por alteraciones en la molécula diana (resistencia tipo “kdr”). La resistencia metabólica mediada por P450 fue analizada comparando la expresión de 53 genes CYP (codifican enzimas P450) de las familias CYP4, CYP6, CYP9 y CYP12 en adultos de la línea resistente W-1K y de la línea susceptible C. Nuestros resultados muestran que el gen CYP6A51 (número de acceso GenBank XM_004534804) fue sobreexpresado (13-18 veces) en la línea W-1K. Por otra parte, la expresión del gen CYP6A51 fue inducida tanto en adultos de la línea W-1K como de la línea C al ser tratados con lambda-cihalotrina. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias significativas entre la línea susceptible C y la línea resistente W-1K al comparar la cantidad de P450 y la actividad NADPH-citocromo c reductasa presente en fracciones microsomales obtenidas a partir de abdómenes. Asimismo, no hemos podido correlacionar el metabolismo de deltametrina, estimado in vitro mediante la incubación de este insecticida con fracciones microsomales, con el nivel de resistencia a este piretroide observado en los bioensayos con la línea W-1K. Por otro lado, no se encontró ninguna alteración en la región promotora 5'UTR del gen CYP6A51 (-500 pb desde el inicio de la traducción) que pudiera explicar su sobreexpresión en la línea W-1K. Los datos obtenidos sugieren que la resistencia a lambda-cihalotrina en la línea W-1K está mediada por P450 y que la sobreexpresión de CYP6A51 puede desempeñar un papel importante, aunque se necesitan más evidencias para establecer una asociación directa de la resistencia con este gen. Hemos estudiado la herencia, el coste biológico y la estabilidad de la resistencia a malatión mediada por la mutación G328A y la duplicación del gen Ccace2 (una de las copias lleva la mutación G328A). La línea susceptible C, donde no se encuentra la mutación G328A (genotipo S/S), se cruzó con dos isolíneas establecidas para representar genotipos únicos correspondientes a los dos mecanismos de resistencia asociados a la molécula diana: 1) la isolínea 267Y (genotipo R/R) establecida a partir de una pareja que portaba la mutación G328A en homocigosis; 2) la isolínea 306TY (genotipo RS/RS) establecida a partir de una pareja que portaba en homocigosis la duplicación del gen Ccace2. No se realizaron cruces recíprocos, ya que mediante experimentos de hibridación in situ en cromosomas politénicos se pudo comprobar que el locus de la AChE y la duplicación (probablemente en tándem) se localizan en el cromosoma autosómico 2L. La susceptibilidad al malatión de los parentales resistentes (R/R o RS/RS) y susceptibles (S/S), los cruces F1 (S/R, S/RS y R/RS) y los retrocruzamientos indican que la resistencia a malatión es semi-dominante en ambos casos. Sin embargo, nuestros resultados no fueron concluyentes con respecto a la naturaleza monogénica de la resistencia a malatión en estas isolíneas. Por lo tanto, no podemos descartar que otros genes que contribuyan a la resistencia, además de la mutación G328A (isolínea 267Y) y de la duplicación del gen Ccace2 (isolínea 306TY), puedan haber sido seleccionados durante el proceso de selección de 267Y y 306TY. Varios parámetros biológicos fueron evaluados para determinar si estos dos mecanismos de resistencia a malatión suponen un coste biológico para los genotipos resistentes. Individuos con genotipo R/R mostraron un retraso en el tiempo de desarrollo de huevo a pupa, un peso de pupa reducido y una menor longevidad de los adultos, en comparación con los individuos con genotipo S/S. Sin embargo, el peso de pupa de los individuos con genotipo RS/RS fue similar al de los individuos S/S, y su desarrollo de huevo a pupa intermedio entre S/S y R/R. Estas diferencias en el coste biológico pueden estar relacionadas con la reducción de la eficiencia catalítica de la AChE mutada en los individuos R/R, y al efecto compensatorio que la copia no mutada del gen tiene en los individuos RS/RS que portan la duplicación. La estabilidad de la resistencia a malatión mediada por la mutación G328A y la duplicación se analizó mediante el seguimiento de los caracteres de resistencia en la progenie de retrocruzamientos S/R x R/R y S/RS x RS/RS a lo largo de varias generaciones en ausencia de presión de selección con insecticidas. Nuestros resultados muestran que la frecuencia del alelo que porta la mutación G328A disminuyó desde 67,5% en la primera generación del retrocruzamiento S/R x R/R (75% esperado, asumiendo segregación mendeliana y que sólo hay dos alelos: uno mutado y otro no mutado) a 12% después de 10 generaciones. Por el contrario, la frecuencia de la duplicación sólo disminuyó desde 75% en en la primera generación del retrocruzamiento S/RS x RS/RS (75% esperado, asumiendo segregación Mendeliana y que la duplicación segrega como un único alelo) a 50% en el mismo período, lo que indica que la duplicación es más estable que la mutación. Asimismo, se analizó la presencia de la mutación y de la duplicación en poblaciones de campo recogidas en seis localidades en 2004-2007, cuando todavía se usaba el malatión, y se comparó con poblaciones recogidas en los mismos campos en 2010, un año después de la prohibición del malatión en la Unión Europea. La frecuencia media del genotipo susceptible (S/S) aumentó del 55,9% en el período 2004-2007 a 70,8% en 2010, mientras que la frecuencia de los genotipos portadores de la mutación en homocigosis o heterocigosis (R/R y S/R) disminuyó del 30,4 al 9,2%, los que llevan la duplicación en homocigosis o heterocigosis (RS/RS y S/RS) aumentaron levemente desde 12,8 hasta 13,3%, y los que llevan a la vez la mutación y la duplicación (R/RS) también aumentaron del 1 al 6,7%. Estos resultados son consistentes con que la duplicación del gen Ccace2 (con una copia con la mutación G328A y la otra copia no mutada) es más ventajosa que la mutación G328A por si sola, ya que la duplicación mantiene los niveles de resistencia a la vez que limita el coste biológico. Para investigar la asociación entre la resistencia a malatión y las mutaciones encontradas previamente en CcE7, hemos generado isolíneas con mutaciones específicas seleccionadas por su ubicación próxima a la entrada al centro activo de la enzima. La isolínea Sm2 (procedente de una hembra heterocigota para la mutación V96L y un macho homocigoto para el alelo no mutado) mantuvo altos niveles de resistencia a malatión, incluso después de 30 generaciones sin presión de selección. Por el contrario, la isolínea 267Y (compuesta por individuos homocigotos para la mutación L267Y) y la línea 306TY (compuesta por individuos homocigotos para la doble mutación R306T-N307Y) mostraron una reducción significativa en los niveles de resistencia. También hemos encontrado que la resistencia a malatión de la línea Sm2 fue parcialmente revertida por DEF y TPP, y que Sm2 mostró una reducción significativa en la actividad MTB, como se ha descrito en otras especies que muestran resistencia específica a malatión mediada por aliesterases. Además, fue posible asociar la presencia de la mutación V96L en individuos de la línea Sm2 con supervivencia a una concentración discriminante de malatión (5,000 ppm) y con una baja actividad MTB. Estos resultados sugieren una posible relación entre la mutación V96L en la aliesterasa CcE7 y la resistencia a malatión, aunque todavía no se puede concluir que la resistencia es causada por esta mutación, siendo necesarios más estudios para comprobar su contribución a la resistencia. En conclusión, se ha encontrado por primera vez resistencia a lambda-cihalotrina en poblaciones de campo de C. capitata, y nuestros resultados indican que las P450 son el principal mecanismo de resistencia en la línea W-1K. Esta situación se suma al caso previamente descrito de resistencia en campo a malatión asociada a la mutación G328A, a la duplicación del gen Ccace2 (una de las copias lleva la mutación G328A) y a resistencia metabólica mediada por esterasas. Nuestros resultados también indican que la alteración de la molécula diana AChE parece ser responsable de un cierto nivel de resistencia a malatión en C. capitata, que puede ser estimada como aproximadamente 25-40 veces para la mutación G328A y 40-60 veces para la duplicación; mientras que la resistencia mediada por esterasas y que ha sido asociada en este estudio con la mutación V96L en CcE7 puede conferir un efecto multiplicativo (por un factor de 5 a 10) aumentando la resistencia a malatión a 200-400 veces. Por otra parte, hemos demostrado que los insectos resistentes que llevan la duplicación tienen un coste biológico menor y muestran una estabilidad mayor que aquellos con la mutación G328A en ausencia de presión de selección con insecticidas. Esto representa un escenario en el que los genotipos con la duplicación permanecerán en el campo en frecuencias bajas a moderadas, pero podrían ser seleccionados rápidamente si se utilizan malatión u otros insecticidas que muestren resistencia cruzada. Estos resultados tienen importantes implicaciones para los programas de manejo de la resistencia, ya que el repertorio de insecticidas eficaces para el control de C. capitata es cada vez más limitado. Además, la coexistencia de múltiples mecanismos de resistencia en poblaciones de campo ofrece el potencial para desarrollar resistencia frente a otros insecticidas disponibles para el control de esta plaga. Estrategias para de manejo de la resistencia basadas en la alternancia de insecticidas con diferentes modos de acción, y su combinación con otros métodos de control, deben ser implementadas para evitar el desarrollo de resistencia en campo. ABSTRACT The Mediterranean fruit fly (Medfly), Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) (Diptera: Tephritidae), is one of the most economically damaging pests of citrus and other fruit crops worldwide. Control measures in citrus crops in Spain from the mid 90's to 2009 were mainly based on field monitoring of population levels and aerial and ground treatments with malathion bait sprays. However, since the withdrawal of phytosanitary products containing malathion in the European Union in 2009, lambda-cyhalothrin and spinosad have become the most widely used insecticides for the control of this pest. Resistance to malathion was found in Spanish field populations of C. capitata in 2004-2005. This resistance has been associated with a mutation G328A in the acetylcholinesterase (AChE), a duplication of the AChE gene (Ccace2) (one of the copies bearing the mutation G328A), and metabolic resistance mediated by esterases (probably aliesterases). However, when the gene of the aliesterase CcE7 was sequenced in individuals from a malathion resistant strain of C. capitata, none of the known G137D and/or W251L/S/G mutations associated to resistance in other species were found, though other mutations were detected when compared with individuals from a susceptible strain. Noteworthy, a lambda-cyhalothrin resistant strain (W-1K) was obtained by selecting a field-derived malathion resistant strain (W-4Km) with lambda-cyhalothrin. Moreover, it has also been demonstrated the capacity of this species to develop resistance to spinosad by laboratory selection. The multiple resistance mechanisms identified highlight the potential of this species to develop resistance to insecticides with different modes of action. The objectives of this PhD Thesis are: 1) to assess the susceptibility of Spanish field populations of C. capitata to lambda-cyhalothrin and to elucidate the resistance mechanisms in the W-1Kλ strain; 2) to compare the inheritance, fitness cost and stability of the malathion resistance mediated by the G328A mutation and the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A); and 3) to investigate the role of the aliesterase CcαE7 mutations in malathion resistance. All these studies will be of use for devising proactive resistance management strategies that could prevent or delay resistance development and would increase the sustainability of the insecticides available for Medfly control. Our results indicate that Spanish field populations of C. capitata have developed resistance to lambda-cyhalothrin. The LC50 values estimated for populations collected at Comunidad Valenciana, Cataluña and Andalucía ranged from 129 ppm to 287 ppm, equaling or overpassing the recommended concentration for field treatments (125 ppm). These results contrast with those obtained with three different Tunisian field populations, whose susceptibility was similar to that of the control (C) strain. The lambda-cyhalothrin resistant W-1K strain has been further selected to achieve a 205-fold resistance compared to the C strain, being its LC50 (4,224 ppm) more than 30 times higher than the recommended concentration for field applications. This resistant strain showed high levels of cross-resistance to deltamethrin (150-fold) and etofenprox (240-fold), suggesting that the development of resistance to lambda-cyhalothrin may compromise the effectiveness of other pyrethroids for the control of this species. We have shown that the resistance of the W-1K strain to lambda-cyhalothrin was almost completely suppressed by the synergist PBO, indicating that P450 enzymes play a very important role in resistance to this insecticide. However, both susceptible C and resistant W-1K flies were knocked down after topical treatment with lambda-cyhalothrin, suggesting that kdr resistance mediated by alterations of the target site is not playing a major role. Metabolic resistance mediated by P450 was further analyzed by comparing the expression of 53 genes of the families CYP4, CYP6, CYP9 and CYP12 in adults flies from the resistant W-1K and the susceptible C strains. We found that the gene CYP6A51 (GenBank accession number XM_004534804) was overexpressed (13-18-fold) in the W-1K strain. Moreover, the expression of the CYP6A51 gene was induced when adults of the W-1K and C strains were treated with lambda-cyhalothrin. However, no significant differences were obtained between susceptible C and resistant W-1K strains for the quantity of P450 and for the activity of NADPH- cytochrome c reductase measured in microsomal fractions obtained from abdomens. Moreover, we failed to correlate the metabolism of deltamethrin, analyzed in vitro by incubating this insecticide with microsomal fractions, with the resistance level against this pyrethroid observed in bioassays with W-1K. The sequencing of the 5´UTR region of the CYP6A51 gene failed in finding an alteration in the promoter region (-500 bp from translation start site) that could explain overexpression in the W-1K strain. All data obtained suggest that resistance to lambda-cyhalothrin in the W- 1K strain is mediated by P450 and that overexpression of CYP6A51 may play a major role, although further evidences are needed to establish a direct association of resistance with this gene. We have studied the inheritance, fitness cost and stability of the malathion resistance mediated by the G328A mutation and the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A). The malathion-susceptible C strain where the G328A mutation is not found (S/S genotype) was crossed with two isolines established to represent unique genotypes corresponding to the two target-site resistance mechanisms: 1) the 267Y isoline (genotype R/R) was established from a couple bearing the mutation G328A in homozygosis; and 2) the 306TY isoline (genotype RS/RS) was established from a couple being homozygous for the duplication of the Ccace2 gene. Reciprocal crosses have not been performed, since in situ hybridization on polythene chromosomes showed that the AChE locus and the duplication (most probably in tandem) are placed at the autosomal chromosome 2L. Mortality responses to malathion of resistant isolines (R/R or RS/RS) and susceptible (S/S) genotypes, F1 crosses (S/R, S/RS, and R/RS), and the back-crosses indicated that resistance to malathion is inherited as a semi-dominant trait in both cases. However, our results were not conclusive about the monogenic nature of the resistance to malathion in these isolines. Thus, we can not discard that other genes contributing to resistance, in addition to the mutation G328A (isoline 267Y) and the duplication of the Ccace2 gene (isoline 306TY), may have been selected during the selection process of 267Y and 306TY. Several biological parameters were evaluated to determine if these two malathion resistance mechanisms impose a fitness cost for resistant genotypes. Individuals with genotype R/R have a reduced fitness in terms of developmental time from egg to pupa, pupal weight and adult longevity, when compared to susceptible individuals (genotype S/S). Interestingly, the fitness cost was substantially diminished in individuals with genotype RS/RS. These differences in fitness may be related to the reduction of the catalytic efficiency of mutated AChE in individuals R/R, and the compensatory effect that the non-mutated copy of the gene has on individuals RS/RS bearing the duplication. The stability of malathion reistance associated with the mutation G328A or the duplication was analyzed by following these resistant traits in the progeny of the back-crosses S/RS x RS/RS and S/R x R/R over consecutive generations in the absence of insecticide selection pressure. Our results show that the frequency of the allele bearing the mutation G328A decreased from 67.5% at the first generation of the back-cross S/R x R/R (75% expected, assuming Mendelian segregation and that there are only two alleles: one mutated and the other non-mutated) to 12% after 10 generations. By contrast, the frequency of the duplication only declined from 75% at the first generation of the back-cross S/RS x RS/RS (75% expected, assuming Mendelian segregation and that the duplication segregates as an unique allele) to 50% in the same period, indicating that the duplication is more stable than the mutation. The presence of the mutation and the duplication was analyzed in field populations collected in six localities in 2004-2007, when malathion was still used, and compared to populations collected in the same fields in 2010, one year after the prohibition of malathion in the European Union. The average frequency of the susceptible genotype (S/S) increased from 55.9% in the period 2004-2007 to 70.8% in 2010, whereas the frequency of those genotypes carrying the mutation in homozygosis or heterozygosis (R/R and S/R) declined from 30.4 to 9.2%, those carrying the duplication in homozygosis or heterozygosis (RS/RS and S/RS) increased slightly from 12.8 to 13.3%, and those carrying both the mutation and the duplication (R/RS) also increased from 1 to 6.7%. These results are consistent with the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A and the other copy non-mutated) being more advantageous than the G328A mutation alone by maintaining resistance while restoring part of the fitness. In order to investigate the association of malathion resistance with mutations previously found in the aliesterase CcE7, we have generated isolines bearing specific mutations selected by their putative location near the upper part of the active site gorge of the enzyme. The isoline Sm2 (originating from a female heterozygous for the mutation V96L and a male homozygous for the non-mutated allele) kept high levels of resistance to malathion, even after 30 generations without selection pressure. On the contrary, the isoline 267Y (composed by individuals homozygous for the mutation L267Y) and the strain 306TY (composed by homozygous for the double mutation R306T-N307Y) showed a significant reduction in the levels of resistance. We have found also that resistance to malathion in the Sm2 isoline was partially reverted by DEF and TPP, and that Sm2 showed a significant reduction in MTB activity, as reported for other species showing malathion-specific resistance mediated by aliesterases. Besides, it was possible to associate the presence of the mutation V96L in individuals from the Sm2 isoline with both survival to a discriminating concentration of malathion (5,000 ppm) and low MTB activity. Our results point out to a possible connection betwen the mutation V96L in the aliesterase CcE7 and resistance to malathion, though we can not yet conclude that the resistance is caused by the mutation, being needed further work to understand its contribution to resistance. In conclusion, resistance to lambda-cyhalothrin has been found for the first time in field populations of C. capitata, and metabolic resistance mediated by P450 appears to be the main resistance mechanism in the resistant strain W-1K. These findings add to the previously reported case of field resistance to malathion, associated to the G328A mutation and the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A) and to metabolic resistance mediated by esterases. Our results also indicate that altered target site AChE appears to be responsible for a certain level of resistance to malathion in C. capitata, that can be estimated as about 25-40-fold for the mutation G328A and 40-60-fold for the duplication; whereas metabolic resistance mediated by esterases and associated in this study with the mutation V96L in CcE7 may confer a multiplicative effect (by a factor of 5 to10) increasing malathion resistance to 200-400-fold. Moreover, we have shown that resistant insects carrying the duplication have better fitness and exhibit a higher stability than those with the mutation G328A in the absence of insecticide pressure. This represents a scenario where genotypes with the duplication will remain in the field at low to moderate frequencies, but could be rapidly selected if malathion or other insecticides showing cross-resistance are used. These findings have important implications for resistance management programs, as the repertoire of effective insecticides for C. capitata control is becoming very limited. Besides, multiple resistance mechanisms coexisting in field populations provide the potential to develop resistance to other available insecticides for the control of this pest. Appropriate resistance management strategies based on the alternation of insecticides with different modes of action, and their combination with other control methods, must then be implemented to avoid the evolution of resistance in the field.

Análisis de la problemática de los impactos fruto-fruto en las líneas de manipulación.

Se han realizado diferentes ensayos con el objetivo de analizar la problemática de los impactos manzana-manzana en las líneas de manipulación de fruta. Para ello se ha utilizado una línea experimental de manipulación de frutas en la que se han evaluado las características de estos impactos en función de diferentes factores: características del producto, flujo de producto en línea y características de los puntos de transferencia entre elementos de la línea. Una vez conocida la problemática de los impactos fruto-fruto, se ha desarrollado un elemento decelerador accionado para minimizar dichos impactos en una transferencia en 90° entre dos cintas transportadoras. El elemento decelerador ha sido evaluado comparando su eficacia con otros sistemas. En los diferentes ensayos se han utilizado frutos electrónicos IS 100 y manzanas "Golden".

Calibración de una nariz electrónica tipo QCM y relación con las especificaciones para la calidad de la pera.

Las microbalanzas de cristal de cuarzo (QCM), son mecanismos piezoeléctricos, para transformarlos en sensores químicos es necesario recubrirlos con una capa de material capaz de capturar las moléculas del ambiente. Cuando una masa es adsorbida sobre la superficie del cristal, la frecuencia de oscilación cambia en proporción a la cantidad de masa (Di Natale et al. 1997). La respuesta de los sensores depende de numerosos factores que pueden ser difíciles de controlar, tales como la temperatura y la humedad del gas portador. Todos estos factores producen cambios en la selectividad de los sensores que afectan a la reproducibilidad de las medidas. A pesar de la existencia de numerosos estudios no existe ningún procedimiento establecido para la calibración de las QCM en relación con la sensibilidad necesaria en los sensores para el aseguramiento de la calidad en pera o en otras frutas.

Clasificación de frutos por su calidad interna mediante espectroscopia láser de reflectancia con resolución temporal (TDRS).

La determinación no destructiva de la calidad interna de la fruta ha sido un objetivo prioritario en las investigaciones recientes (Abbott, 1999). La espectroscopia en el infrarrojo (NIR) es aplicable a la cuantificación de compuestos químicos en alimentos; por otro lado se ha comprobado que el uso de láseres es interesante para la estimación no destructiva de la firmeza de los frutos. Sin embargo estas técnicas ópticas más tradicionales tienen el inconveniente de que miden la intensidad de luz transmitida sin poder diferenciar el efecto de la absorción óptica del efecto de la dispersión espacial que sufre la luz en el interior de los tejidos, lo cual dificulta la estimación independiente de aspectos físicos y químicos. La espectroscopia con resolución temporal es una técnica óptica desarrollada para el diagnóstico en medicina, que permite diferenciar ambos fenómenos (absorción y dispersión), proporcionando una caracterización óptica completa de los tejidos. El objetivo del presente trabajo ha sido la aplicación de esta técnica a frutas y hortalizas, y el desarrollo de modelos matemáticos de estimación no destructiva de su calidad interna para su uso en procesos de clasificación.

Usando Kinect como sensor para una pulverización inteligente.

Este trabajo esta orientado a resolver el problema de la caracterización de la copa de arboles frutales para la aplicacion localizada de fitosanitarios. Esta propuesta utiliza un mapa de profundidad (Depth image) y una imagen RGB combinadas (RGB-D), proporcionados por el sensor Kinect de Microsoft, para aplicar pesticidas de forma localizada. A través del mapa de profundidad se puede estimar la densidad de la copa y a partir de esta información determinar qué boquillas se deben abrir en cada momento. Se desarrollaron algoritmos implementados en Matlab que permiten además de la adquisición de las imágenes RGB-D, aplicar plaguicidas sólo a hojas y/o frutos según se desee. Estos algoritmos fueron implementados en un software que se comunica con el entorno de desarrollo "Kinect Windows SDK", encargado de extraer las imágenes desde el sensor Kinect. Por otra parte, para identificar hojas, se implementaron algoritmos de clasificación e identificación. Los algoritmos de clasificación utilizados fueron "Fuzzy C-Means con Gustafson Kessel" (FCM-GK) y "K-Means". Los centroides o prototipos de cada clase generados por FCM-GK fueron usados como semilla para K-Means, para acelerar la convergencia del algoritmo y mantener la coherencia temporal en los grupos generados por K-Means. Los algoritmos de clasificación fueron aplicados sobre las imágenes transformadas al espacio de color L*a*b*; específicamente se emplearon los canales a*, b* (canales cromáticos) con el fin de reducir el efecto de la luz sobre los colores. Los algoritmos de clasificación fueron configurados para buscar cuatro grupos: hojas, porosidad, frutas y tronco. Una vez que el clasificador genera los prototipos de los grupos, un clasificador denominado Máquina de Soporte Vectorial, que utiliza como núcleo una función Gaussiana base radial, identifica la clase de interés (hojas). La combinación de estos algoritmos ha mostrado bajos errores de clasificación, rendimiento del 4% de error en la identificación de hojas. Además, estos algoritmos de procesamiento de hasta 8.4 imágenes por segundo, lo que permite su aplicación en tiempo real. Los resultados demuestran la viabilidad de utilizar el sensor "Kinect" para determinar dónde y cuándo aplicar pesticidas. Por otra parte, también muestran que existen limitaciones en su uso, impuesta por las condiciones de luz. En otras palabras, es posible usar "Kinect" en exteriores, pero durante días nublados, temprano en la mañana o en la noche con iluminación artificial, o añadiendo un parasol en condiciones de luz intensa.