Functional expression of thermo-sensitive TRP channels in human odontoblasts

Introduction: Accumulating evidence supports a role for odontoblasts in initiating tooth pain, however direct ionic mechanisms underlying dentine nociceptive function remain unclear. The transient receptor potential (TRP) ion channels are directly related to cellular mechanisms of nociception and thermo-sensitive function but their expression by human odontoblasts remains to be determined. Objectives: To investigate the expression and functionality of the thermo-sensitive TRP channels TRPV1, TRPV4, TRPM8 and TRPA1 in human odontoblasts. Methods: Human odontoblasts were derived from dental pulp of immature permanent third molars by explant method. Cell lysates of odontoblasts were subject to SDS- polyacrylamide gel electrophoresis and proteins were blotted onto nitrocellulose membranes. Blots were probed with primary antibodies to TRPA1, TRPM8, TRPV4 and TRPV1. Detection of bound primary antibodies was achieved using appropriate anti-species antibody conjugates and chemiluminescent substrates. Functionality of the channels was determined with Ca2+ microfluorimetry, where cells grown in cover slips and incubated with Fura 2AM prior to stimulation with capsaicin (TRPV1 agonist), 4 alpha-phorbol 12,13-didecanoate (4áPDD) (TRPV4 agonist), icilin (TRPA1 agonist) and menthol (TRPM8 agonist). Emitted fluorescence was measured and the fluorescence ratio (R) was calculated as F340/F380 to determine the level of [Ca2+]i. Results: Western blotting confirmed the molecular localisation of thermo-sensitive TRP channels in human odontoblasts. Functionality assays revealed increase in [Ca2+]i in response to capsacin, icillin, methanol and 4áPDD indicating functional expression of TRPV1, TRPA1, TRPM8 and TRPV4 respectively. Conclusions: Functional expression of thermo-sensitive TRP channels in human odontoblasts may indicate a crucial role for odontoblasts in thermally induced dental pain. (Supported by a Research Grant from the Royal College of Surgeons of Edinburgh)

INFLUENCE OF NOX4 NADPH OXIDASE ON GENERATION AND ANGIOGENIC FUNCTION OF INDUCED PLURIPOTENT STEM CELL-DERIVED ENDOTHELIAL CELLS

Human induced pluripotent stem (iPS) cell-derived endothelial cells (ECs) hold clear potential for therapeutic angiogenesis as a novel strategy for ischaemic disease. Recently, we have developed a novel method for direct reprogramming of partial iPS (PiPS) cells, which unlike iPS cells, are generated before pluripotency so do not form tumours, and may be differentiated into ECs with characteristic morphology and pro-angiogenic actions. Our previous work showed that PiPS-derived ECs are capable of forming vascular-like tubes both in vitro and in vivo and promoting re-endothelialisation of ischemic tissue, with greater effectiveness versus mature ECs.

Interestingly, our preliminary data demonstrate that Nox NADPH oxidases, which are reported to influence stem cell function, are progressively induced during PiPs/PiPS-EC differentiation and in response to hypoxia, with Nox4 demonstrating highest expression. As this isoform is an established regulator of angiogenesis, we hypothesize that Nox4 plays a key role in modulating PiPS-EC generation and angiogenic function.

The aim of this project is therefore to investigate: (1) the specific role of Nox4 in direct reprogramming of PiPS cells and differentiation to PiPS-ECs; (2) whether genetic manipulation of Nox4 influences in vitro function of PiPs-ECs and their ability to promote in vivo angiogenesis. This will be achieved by employing established in vitro functional assays and an experimental model of hindlimb ischaemia with assessment of relevant end-points. Identification of a key role for Nox4 in regulating PiPS-EC generation/function may inform selective targeting of this isoform to enhance the efficiency of PiPS-EC differentiation and their capacity to treat ischemic disease.

Biodiesel fuel formulation

O consumo de energia a nível mundial aumenta a cada dia, de forma inversa aos recursos fósseis que decrescem de dia para dia. O sector dos transportes é o maior consumidor deste recurso. Face ao actual cenário urge encontrar uma solução renovável e sustentável que permita não só, diminuir a nossa dependência de combustíveis fósseis mas fundamentalmente promover a sua substituição por energias de fontes renováveis. O biodiesel apresenta-se na vanguarda das alternativas aos combustiveis derivados do petróleo, para o sector dos transportes, sendo considerado uma importante opção a curto prazo, uma vez que o seu preço pode ser competitivo com o diesel convencional, e para a sua utilização o motor de combustão não necessita de alterações. O biodiesel é uma mistura líquida, não tóxica, biodegradável de ésteres de ácidos gordos, sem teor de enxofre ou compostos aromáticos, apresenta boa lubricidade, alto número de cetano, e origina emissões gasosas mais limpas. O presente trabalho contribui para um melhor conhecimento da dependência das propriedades termofisicas do biodiesel com a sua composição. A publicação de novos dados permitirá o desenvolvimento de modelos mais fiáveis na previsão do comportamento do biodiesel. As propriedades densidade e viscosidade são o espelho da composição do biodiesel, uma vez que dependem directamente da matéria prima que lhe deu origem, mais do que do processo de produção. Neste trabalho os dados medidos de densidade e viscosidade de biodiesel foram testados com vários modelos e inclusivamente foram propostos novos modelos ajustados para esta família de compostos. Os dados medidos abrangem uma ampla gama de temperaturas e no caso da densidade também foram medidos dados a alta pressão de biodiesel e de alguns ésteres metilico puros. Neste trabalho também são apresentados dados experimentais para o equilíbrio de fases sólido-liquído de biodiesel e equlibrio de fases líquidolíquido de alguns sistemas importantes para a produção de biodiesel. Ambos os tipos de equilíbrio foram descritos por modelos desenvolvidos no nosso laboratório. Uma importância especial é dado aqui a propriedades que dependem do perfil de ácidos gordos da matéria-prima além de densidade e viscosidade; o índice de iodo e temperature limite de filtrabalidade são aqui avaliados com base nas considerações das normas. Os ácidos gordos livres são um sub-produto de refinação de óleo alimentar, que são removidos na desodoração, no processo de purificação do óleo. A catálise enzimática é aqui abordada como alternativa para a conversão destes ácidos gordos livres em biodiesel. Estudou-se a capacidade da lipase da Candida antartica (Novozym 435) para promover a esterificação de ácidos gordos livres com metanol ou etanol, utilizando metodologia de superfície de resposta com planeamento experimental. Avaliou-se a influência de diversas variáveis no rendimento da reacção.

Characterization of the toxic potential of nanomaterials using in vitro cell models

Os nanomateriais são estruturas com uma ou mais dimensões inferiores a 100 nanómetros. Devido à sua pequena dimensão, as nanopartículas apresentam atributos únicos, tais como a sua elevada área superficial relativamente à sua massa, reactividade ou força tênsil. Estas características influenciam grandemente algumas das propriedades dos nanomateriais, como a sua hidrofobicidade, carga ou toxicidade. As propriedades das nanopartículas tornam-nas também muito úteis para o Homem, sendo aplicadas em medicina, farmácia, electrónica, cosmética, vestuário e biotecnologia, entre outras. O aumento de produção e utilização de nanomateriais tem vindo a aumentar também a possibilidade de exposição humana a este tipo de partículas, levando a preocupações relativas ao risco de toxicidade aguda ou crónica. A exposição humana pode ocorrer por diversas vias, sendo as mais relevantes a via inalatória, ingestão ou contacto com a pele. Dependendo do material e do órgão-alvo, a exposição a nanomateriais pode conduzir a diferentes consequências biológicas: a nível dos órgãos, os nanomateriais podem levar a inflamação ou a supressão do sistema imunitário e, a nível celular e molecular, a perturbações na estrutura e integridade do genoma, assim como a interacções com moléculas biológicas e inibição da actividade proteica, entre outras consequências. Um dos nanomateriais mais utilizados são os nanotubos de carbono. Estes são constituídos por grafite cilíndrica disposta numa única camada (designados nanotubos de carbono de parede simples) ou em várias (nanotubos de carbono de parede múltipla). Os nanotubos de carbono apresentam propriedades como resistência e condutividade que os tornam muito úteis em aplicações como aparelhos electrónicos, vestuário ou biomedicina; cada vez mais, portanto, se torna provável a exposição ocupacional ou ambiental a este material. A semelhança estrutural destas partículas com fibras de amianto conduziu a questões relativas à sua segurança, pelo que já foram elaborados diversos estudos relativos aos seus efeitos biológicos. Alguns trabalhos sugerem que os nanotubos de carbono têm a capacidade de produzir toxicidade associada a lesões físicas, à produção de danos oxidativos por interacção com mecanismos celulares, ou a morte celular. Outros trabalhos defendem que estas partículas não causam toxicidade relevante. O projecto de dimensão europeia “NANoREG” surgiu da necessidade de ser desenvolvida legislação e regulamentação apoiadas em conhecimento científico e adequadas à produção e ao uso actual de nanomateriais. Este trabalho teve como objectivos principais a determinação do potencial cito- e genotóxico de um conjunto de nanotubos de carbono de parede múltipla (designados NM-400 a NM-403), e a consequente tentativa de associar este potencial às características físico-químicas dos nanomateriais. Com este objectivo, a exposição por via inalatória foi analisada, pelo uso de duas linhas celulares in vitro provenientes de tecidos do tracto respiratório: epitélio pulmonar (células A549) e epitélio brônquico (células BEAS-2B). A citotoxicidade dos nanotubos de carbono foi analisada com base em três parâmetros. Em primeiro lugar, as células foram contadas após a exposição aos nanomateriais utilizando o corante azul de tripanao para excluir as células inviáveis; a contagem foi realizada 3 e 24 horas após a exposição das células aos nanotubos. Os resultados deste ensaio apontam para a ausência de citotoxicidade após a exposição mais curta, e dados inconsistentes após a mais longa. Em segundo lugar, foi realizado o ensaio clonogénico, que se baseia na capacidade das células de se dividirem após a exposição ao agente em estudo. Este ensaio só foi realizado nas células A549 pois as BEAS-2B não permitem a formação de colónias. Os resultados apontam para uma citotoxicidade após a exposição a todos os nanomateriais, cuja intensidade se relaciona directamente com o tamanho das partículas, assim como ao seu diâmetro e área de superfície. Em terceiro lugar, foram calculados dois índices de viabilidade no ensaio dos Micronúcleos, cujo objectivo é avaliar se as células se dividiram durante a exposição aos nanomateriais em comparação com o controlo, e cujos resultados apresentam incoerências em relação aos outros já referidos. Estes dados podem ser justificados pelas diferenças existentes entre os ensaios, como o tempo de exposição ou a densidade celular. Os efeitos genotóxicos dos nanomateriais foram avaliados com recurso aos ensaios do cometa e dos micronúcleos. O primeiro detecta lesões pequenas e reversíveis nas cadeias de DNA, ao passo que o segundo detecta efeitos irreversíveis ao nível cromossómico, tais como quebras ou perdas de cromossomas. Os resultados do ensaio do cometa sugerem que nenhum dos nanomateriais testados é genotóxico, uma vez que em ambas as linhas celulares e em ambos os tempos de exposição, os resultados são negativos. O ensaio dos micronúcleos, por outro lado, aponta para existência de genotoxicidade de dois dos nanomateriais (NM-401 e NM-402) nas células A549, mas não em células BEAS-2B. Uma possível explicação para estes dados aparentemente contraditórios pode residir na hipótese de estes nanotubos de carbono serem compostos com efeitos aneugénicos, mas não clastogénicos: o ensaio dos micronúcleos permite a detecção de ambos os mecanismos de acção, ao passo que o ensaio do cometa só revela a quebra de cadeias de DNA. Outra justificação para os resultados é a possível influência da perda de viabilidade das células analisadas. Com base nos dados do ensaio clonogénico, estas partículas apresentam elevada citotoxicidade, pelo que os resultados dos ensaios de genotoxicidade, em particular do Ensaio do Cometa, poderão ser afectados por estes efeitos. O meio de cultura usado para expor as células aos nanomateriais também é um parâmetro muito relevante na sua toxicidade. Neste trabalho, foram usados meios de cultura com proteínas, que podem ser adsorvidas pelas partículas e formar uma “corona” em seu redor; este processo pode alterar propriedades importantes dos nanomateriais, entre os quais o seu potencial efeito biológico. Também o método usado para conseguir uma dispersão homogénea de nanomateriais pode conduzir a diferenças nos resultados dos ensaios de toxicidade. Neste estudo, foram observados alguns problemas relativos à perda de homogeneidade das dispersões de nanotubos de carbono, o que pode ter conduzido a que as células fossem expostas a massas de partículas de grandes dimensões conjuntamente com partículas individualizadas. O período durante o qual as células são expostas ao nanomaterial é também um aspecto essencial na produção de efeitos tóxicos. Resumindo, este projecto forneceu informações relativas à toxicidade dos nanotubos de carbono que, complementadas pelas conclusões dos restantes parceiros do projecto europeu, poderão contribuir significativamente para a avaliação de risco e criação de legislação relativamente à utilização de nanomateriais. Na linha celular BEAS-2B, nenhum destes nanomateriais parece produzir efeitos tóxicos, quer a nível de célula, quer a nível de genoma, nas condições experimentais utilizadas. Nas células A549, por outro lado, os três nanomateriais testados parecem ser acentuadamente citotóxicos, e dois deles (NM-401 e NM-402) são também genotóxicos. Em relação a perspectivas futuras, pode-se concluir que nem todos os ensaios de toxicidade existentes actualmente são adequados à análise de nanopartículas, pelo que novas metodologias devem ser desenvolvidas e complementadas por ensaios in vivo. Todos os estudos envolvendo nanomateriais deverão também descrever as características físico-químicas dos materiais usados, de forma a se poderem comparar os resultados com os de outros trabalhos.

The role of reciprocal regulation between TAL1 and miRNA expression in T-cell leukemia progression

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2015

Cytotoxicity Induced by Extracts of Pisolithus tinctorius Spores on Human Cancer and Normal Cell Lines—Evaluation of the Anticancer Potential

Fungi have been considered a potential source of natural anticancer drugs. However, studies on these organisms have mainly focused on compounds present in the sporocarp and mycelium. The aim of this study was to assess the anticancer potential of fungal spores using a bioassay-guided fractionation with cancer and normal cell lines. Crude extracts from spores of the basidiomycetous fungus Pisolithus tinctorius were prepared using five solvents/solvent mixtures in order to select the most effective crude extraction procedure. A dichloromethane/methanol (DCM/MeOH) mixture was found to produce the highest extraction yield, and this extract was fractionated into 11 fractions. Crude extracts and fractions were assayed for cytotoxicity in the human osteocarcinoma cell line MG63, the human breast carcinoma cell line T47D, the human colon adenocarcinoma cell line RKO, and the normal human brain capillary endothelial cell line hCMEC/D3. Cytotoxicity was assessed by the 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) reduction assay. The results showed a reduction in cancer cell viability of approximately 95% with 4 of 11 fractions without a significant reduction in viability of hCMEC/D3 cells. Data demonstrated that spores of P. tinctorius might serve as an interesting source of compounds with potential anticancer properties.

Electrodialytic remediation of two types of air pollution control residues and their applicability in construction materials

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia do Ambiente Perfil de Engenharia de Sistemas Ambientais

A novel anti-CD19 monoclonal antibody (GBR 401) with high killing activity against B cell malignancies.

BACKGROUND: CD19 is a B cell lineage specific surface receptor whose broad expression, from pro-B cells to early plasma cells, makes it an attractive target for the immunotherapy of B cell malignancies. In this study we present the generation of a novel humanized anti-CD19 monoclonal antibody (mAb), GBR 401, and investigate its therapeutic potential on human B cell malignancies. METHODS: GBR 401 was partially defucosylated in order to enhance its cytotoxic function. We analyzed the in vitro depleting effects of GBR 401 against B cell lines and primary malignant B cells from patients in the presence or in absence of purified NK cells isolated from healthy donors. In vivo, the antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) efficacy of GBR 401 was assessed in a B cell depletion model consisting of SCID mice injected with healthy human donor PBMC, and a malignant B cell depletion model where SCID mice are xenografted with both primary human B-CLL tumors and heterologous human NK cells. Furthermore, the anti-tumor activity of GBR 401 was also evaluated in a xenochimeric mouse model of human Burkitt lymphoma using mice xenografted intravenously with Raji cells. Pharmacological inhibition tests were used to characterize the mechanism of the cell death induced by GBR 401. RESULTS: GBR 401 exerts a potent in vitro and in vivo cytotoxic activity against primary samples from patients representing various B-cell malignancies. GBR 401 elicits a markedly higher level of ADCC on primary malignant B cells when compared to fucosylated similar mAb and to Rituximab, the current anti-CD20 mAb standard immunotherapeutic treatment for B cell malignancies, showing killing at 500 times lower concentrations. Of interest, GBR 401 also exhibits a potent direct killing effect in different malignant B cell lines that involves homotypic aggregation mediated by actin relocalization. CONCLUSION: These results contribute to consolidate clinical interest in developing GBR 401 for treatment of hematopoietic B cell malignancies, particularly for patients refractory to anti-CD20 mAb therapies.

Cold fission: splitting the pombe cell at room temperature.

The mechanisms responsible for cytokinesis and its coordination with other events of the cell cycle are poorly understood. Genetic studies of cytokinesis in fission yeast are one useful approach to this problem. A number of conditional mutants of fission yeast that show defects in the formation of the septum of cytokinesis have been identified. Cloning of the genes affected in these mutants has begun to shed light upon the elements required to direct the construction of the division septum and also upon how the initiation of septum formation may be coordinated with mitosis.

Direct Thy-1/alphaVbeta3 integrin interaction mediates neuron to astrocyte communication.

Thy-1 is an abundant neuronal glycoprotein of poorly defined function. We recently provided evidence indicating that Thy-1 clusters a beta3-containing integrin in astrocytes to induce tyrosine phosphorylation, RhoA activation and the formation of focal adhesions and stress fibers. To date, the alpha subunit partner of beta3 integrin in DI TNC1 astrocytes is unknown. Similarly, the ability of neuronal, membrane-bound Thy-1 to trigger astrocyte signaling via integrin engagement remains speculation. Here, evidence that alphav forms an alphavbeta3 heterodimer in DI TNC1 astrocytes was obtained. In neuron-astrocyte association assays, the presence of either anti-alphav or anti-beta3 integrin antibodies reduced cell-cell interaction demonstrating the requirement of both integrin subunits for this association. Moreover, anti-Thy-1 antibodies blocked stimulation of astrocytes by neurons but not the binding of these two cell types. Thus, neuron-astrocyte association involved binding between molecular components in addition to the Thy-1-integrin; however, the signaling events leading to focal adhesion formation in astrocytes depended exclusively on the latter interaction. Additionally, wild-type (RLD) but not mutated (RLE) Thy-1 was shown to directly interact with alphavbeta3 integrin by Surface Plasmon Resonance analysis. This interaction was promoted by divalent cations and was species-independent. Together, these results demonstrate that the alphavbeta3 integrin heterodimer interacts directly with Thy-1 present on neuronal cells to stimulate astrocytes.

Interactions between Siglec-7/9 receptors and ligands influence NK cell-dependent tumor immunosurveillance.

Alteration of the surface glycosylation pattern on malignant cells potentially affects tumor immunity by directly influencing interactions with glycan-binding proteins (lectins) on the surface of immunomodulatory cells. The sialic acid-binding Ig-like lectins Siglec-7 and -9 are MHC class I-independent inhibitory receptors on human NK cells that recognize sialic acid-containing carbohydrates. Here, we found that the presence of Siglec-9 defined a subset of cytotoxic NK cells with a mature phenotype and enhanced chemotactic potential. Interestingly, this Siglec-9+ NK cell population was reduced in the peripheral blood of cancer patients. Broad analysis of primary tumor samples revealed that ligands of Siglec-7 and -9 were expressed on human cancer cells of different histological types. Expression of Siglec-7 and -9 ligands was associated with susceptibility of NK cell-sensitive tumor cells and, unexpectedly, of presumably NK cell-resistant tumor cells to NK cell-mediated cytotoxicity. Together, these observations have direct implications for NK cell-based therapies and highlight the requirement to consider both MHC class I haplotype and tumor-specific glycosylation.

Creatine deficiency syndomes : a new model of partial GAMT deficiency affecting brain cell development

Les syndromes de déficiences cérébrales en créatine (CCDS) sont dus à des mutations dans les gènes GATM et G AMT (codant pour les enzymes AGAT et G AMT de la voie de synthèse de créatine) ainsi que SLC6A8 (transporteur de créatine), et génèrent une absence ou une très forte baisse de créatine (Cr) dans le cerveau, mesurée par spectroscopic de résonance magnétique. Les patients CCDS développent des handicaps neurologiques sévères. Les patients AGAT et GAMT peuvent être traités avec des doses importantes de Cr, mais gardent dans la plupart des cas des séquelles neurologiques irréversibles. Aucun traitement efficace n'existe à ce jour pour la déficience en SLC6A8. Bien que de nombreux modèles aient été développés pour comprendre la Cr cérébrale en conditions physiologiques, les pathomécanismes des CCDS ne sont pas encore compris. Des souris transgéniques pour les gènes Gatm, Gamt et Slc6a8 ont été générées, mais elles ne miment que partiellement la pathologie humaine. Parmi les CCDS, la déficience en GAMT est la plus sévère, en raison de l'accumulation cérébrale de l'intermédiaire guanidinoacétate (GAA). Alors que la toxicité cérébrale du GAA a été étudiée par exposition directe au GAA d'animaux adultes sains, les mécanismes de la toxicité du GAA en condition de déficience en GAMT dans le cerveau en développement sont encore inconnus. Le but de ce projet était donc de développer un modèle de déficience en GAMT dans des cultures 3D primaires de cellules nerveuses de rat en agrégats par knock-down du gène GAMT, en utilisant un virus adéno-associé (AAV) induisant le mécanisme d'interférence à l'ARN (RNAi). Le virus scAAV2, à la multiplicité d'infection de 1000, s'est révélé le plus efficace pour transduire tous les types de cellules nerveuses des cultures (neurones, astrocytes, oligodendrocytes), et générer un knock-down maximal de la protéine GAMT de 85% (jour in vitro 18). Cette déficience partielle en GAMT s'est révélée insuffisante pour générer une déficience en Cr, mais a causé l'accumulation attendue de GAA, à des doses comparables aux niveaux observés dans le LCR des patients GAMT. Le GAA a induit une croissance axonale anarchique accompagnée d'une baisse de l'apoptose naturelle, suivis par une induction tardive de mort cellulaire non-apoptotique. Le co-traitement par la Cr a prévenu tous les effets toxiques du GAA. Ce travail montre que l'accumulation de GAA en absence de déficience en Cr est suffisante pour affecter le développement du tissu nerveux, et suggère que des formes de déficiences en GAMT supplémentaires, ne présentant pas de déficiences en Cr, pourraient être découvertes par mesure du GAA, en particulier à travers les programmes récemment proposés de dépistage néonatal de la déficience en GAMT. -- Cerebral creatine deficiency syndromes (CCDS) are caused by mutations in the genes GATM and GAMT (respectively coding for the two enzymes of the creatine synthetic pathway, AGAT and GAMT) as well as SLC6A8 (creatine transporter), and lead to the absence or very strong decrease of creatine (Cr) in the brain when measured by magnetic resonance spectroscopy. Affected patients show severe neurological impairments. While AGAT and GAMT deficient patients can be treated with high dosages of Cr, most remain with irreversible brain sequelae. No treatment has been successful so far for SLC6A8 deficiency. While many models have helped understanding the cerebral Cr pathways in physiological conditions, the pathomechanisms underlying CCDS are yet to be elucidated. Transgenic mice carrying mutations in the Gatm, Gamt and Slc6a8 genes have been developed, but only partially mimic the human pathology. Among CCDS, GAMT deficiency is the most severe, due to the CNS accumulation of the guanidinoacetate (GAA) intermediate. While brain toxicity of GAA has been explored through direct GAA exposure of adult healthy animals, the mechanisms underlying GAA toxicity in GAMT deficiency conditions on the developing CNS are yet unknown. The aim of this project was thus to develop and characterize a GAMT deficiency model in developing brain cells by gene knockdown, by adeno-associated virus (AAV)-driven RNA interference (RNAi) in rat 3D organotypic primary brain cell cultures in aggregates. scAAV2 with a multiplicity of infection of 1000 was shown as the most efficient serotype, was able to transduce all brain cell types (neurons, astrocytes, oligodendrocytes) and to induce a maximal GAMT protein knockdown of 85% (day in vitro 18). Metabolite analysis showed that partial GAMT knockdown was insufficient to induce Cr deficiency but generated the awaited GAA accumulation at concentrations comparable to the levels observed in cerebrospinal fluid of GAMT-deficient patients. Accumulated GAA induced axonal hypersprouting paralleled with inhibition of natural apoptosis, followed by a later induction in non-apoptotic cell death. Cr supplementation led to the prevention of all GAA-induced toxic effects. This work shows that GAA accumulation without Cr deficiency is sufficient to affect CNS development, and suggests that additional partial GAMT deficiencies, which may not show the classical brain Cr deficiency, may be discovered through GAA measurement including by recently proposed neonatal screening programs for GAMT deficiency.

Cell-selective modulation of the Drosophila neuromuscular system by a neuropeptide

Neuropeptides can modulate physiological properties of neurons in a cell-specific manner. The present work examines whether a neuropeptide can also modulate muscle tissue in a cell-specific manner, using identified muscle cells in third instar larvae of fruit flies. DPKQDFMRFa, a modulatory peptide in the fruit fly Drosophila melanogaster, has been shown to enhance transmitter release from motor neurons and to elicit contractions by a direct effect on muscle cells. We report that DPKQDFMRFa causes a nifedipine-sensitive drop in input resistance in some muscle cells (6 and 7) but not others (12 and 13). The peptide also increased the amplitude of nerve-evoked contractions and compound excitatory junctional potentials (EJPs) to a greater degree in muscle cells 6 and 7 than 12 and 13. Knocking down FMRFa receptor (FR) expression separately in nerve and muscle indicate that both presynaptic and postsynaptic FR expression contributed to the enhanced contractions, but EJP enhancement was due mainly to presynaptic expression. Muscle-ablation showed that DPKQDFMRFa induced contractions and enhanced nerve-evoked contractions more strongly in muscle cells 6 and 7 than cells 12 and 13. In situ hybridization indicated that FR expression was significantly greater in muscle cells 6 and 7 than 12 and 13. Taken together, these results indicate that DPKQDFMRFa can elicit cell-selective effects on muscle fibres. The ability of neuropeptides to work in a cell-selective manner on neurons and muscle cells may help explain why so many peptides are encoded in invertebrate and vertebrate genomes.

A proteome-wide strategy reveals a novel mechanism of control of cell cycle progression through modulation of cyclin mRNA stability

La quantité de données générée dans le cadre d'étude à grande échelle du réseau d'interaction protéine-protéine dépasse notre capacité à les analyser et à comprendre leur sens; d'une part, par leur complexité et leur volume, et d'un autre part, par la qualité du jeu de donnée produit qui semble bondé de faux positifs et de faux négatifs. Cette dissertation décrit une nouvelle méthode de criblage des interactions physique entre protéines à haut débit chez Saccharomyces cerevisiae, la complémentation de fragments protéiques (PCA). Cette approche est accomplie dans des cellules intactes dans les conditions natives des protéines; sous leur promoteur endogène et dans le respect des contextes de modifications post-traductionnelles et de localisations subcellulaires. Une application biologique de cette méthode a permis de démontrer la capacité de ce système rapporteur à répondre aux questions d'adaptation cellulaire à des stress, comme la famine en nutriments et un traitement à une drogue. Dans le premier chapitre de cette dissertation, nous avons présenté un criblage des paires d'interactions entre les protéines résultant des quelques 6000 cadres de lecture de Saccharomyces cerevisiae. Nous avons identifié 2770 interactions entre 1124 protéines. Nous avons estimé la qualité de notre criblage en le comparant à d'autres banques d'interaction. Nous avons réalisé que la majorité de nos interactions sont nouvelles, alors que le chevauchement avec les données des autres méthodes est large. Nous avons pris cette opportunité pour caractériser les facteurs déterminants dans la détection d'une interaction par PCA. Nous avons remarqué que notre approche est sous une contrainte stérique provenant de la nécessité des fragments rapporteurs à pouvoir se rejoindre dans l'espace cellulaire afin de récupérer l'activité observable de la sonde d'interaction. L'intégration de nos résultats aux connaissances des dynamiques de régulations génétiques et des modifications protéiques nous dirigera vers une meilleure compréhension des processus cellulaires complexes orchestrés aux niveaux moléculaires et structuraux dans les cellules vivantes. Nous avons appliqué notre méthode aux réarrangements dynamiques opérant durant l'adaptation de la cellule à des stress, comme la famine en nutriments et le traitement à une drogue. Cette investigation fait le détail de notre second chapitre. Nous avons déterminé de cette manière que l'équilibre entre les formes phosphorylées et déphosphorylées de l'arginine méthyltransférase de Saccharomyces cerevisiae, Hmt1, régulait du même coup sont assemblage en hexamère et son activité enzymatique. L'activité d'Hmt1 a directement un impact dans la progression du cycle cellulaire durant un stress, stabilisant les transcrits de CLB2 et permettant la synthèse de Cln3p. Nous avons utilisé notre criblage afin de déterminer les régulateurs de la phosphorylation d'Hmt1 dans un contexte de traitement à la rapamycin, un inhibiteur de la kinase cible de la rapamycin (TOR). Nous avons identifié la sous-unité catalytique de la phosphatase PP2a, Pph22, activé par l'inhibition de la kinase TOR et la kinase Dbf2, activé durant l'entrée en mitose de la cellule, comme la phosphatase et la kinase responsable de la modification d'Hmt1 et de ses fonctions de régulations dans le cycle cellulaire. Cette approche peut être généralisée afin d'identifier et de lier mécanistiquement les gènes, incluant ceux n'ayant aucune fonction connue, à tout processus cellulaire, comme les mécanismes régulant l'ARNm.

Hypothalamic GABA receptor functional regulation and liver cell proliferation

GABAergic alterations in hypothalamus during compensatory hyperplasia after partial hepatectomy (PH), lead nitrate (LN) induced direct hyperplasia and N-nitrosodiethylamine (NDEA) induced neoplasia in liver were investigated. Serum GABA levels were increased in all 3 experimental groups compared with the control. GABA content decreased in hypothalamus of PH and NDEA treated rats, while it increased in LN treated rats. GABAA receptor number and affinity in hypothalamic membrane preparations of rats showed a significant decrease in PH and NDEA treated rats, while in LN treated rats the affinity increased without any change in the receptor number. The GABAB receptor number increased in PH and NDEA treated rats, while it decreased in LN treated rats. The affinity of the receptor also increased in NDEA treated rats. Plasma NE levels showed significant increase in PH and NDEA rats compared with the control while it decreased in LN treated rats. The results of the present study suggests that liver cell proliferation is influencing the hypothalamic GABAergic neurotransmission and these changes regulate the hepatic proliferation through the sympathetic stimulation.