The role of reciprocal regulation between TAL1 and miRNA expression in T-cell leukemia progression

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2015

A Leucemia Linfoblástica Aguda de Células T (LLA-T) e um cancro pediátrico agressivo que resulta da expansão clonal de células progenitoras de linfócitos T, cuja diferenciação se encontra bloqueada em diferentes estádios de desenvolvimento. Embora os regimes quimioterápicos actuais sejam bastante eficazes, culminando numa taxa de cura de cerca de 80% em crianças, existe ainda um numero significativo de doentes que recidivam. Para alem disso, os regimes intensivos de quimioterapia estão normalmente associados a efeitos secundários consideráveis a médio e longo prazo. Por esta razão, urge desenvolver terapias com maior especificidade para as células leucémicas, reduzindo toxicidade e consequentes efeitos secundários. Para tal e necessário melhorar o nosso conhecimento sobre as causas, fisiologia e regulação da LLA-T, em particular através da identificação de alvos moleculares e vias fundamentais para a progressão da doença. TAL1 e um factor de transcrição essencial para a função das células estaminais hematopoiéticas. No entanto, a expressão de TAL1 decresce rapidamente nos progenitores destinados a originar células T. Assim, quando expresso de forma aberrante nos precursores de células T, TAL1 desempenha claramente uma função oncogénica. De facto, a sobre expressão de TAL1 ocorre em mais de 60% dos casos de LLA-T. Os microRNAs (miRNAs) são espécies de RNAs não-codificantes de pequena dimensão que regulam negativamente a expressão genes codificantes de proteínas. A sua acção e mediada pela inibição da tradução ou aumento da degradação dos RNAs mensageiros, resultando num decréscimo da proteína alvo. O envolvimento dos miRNAs na regulação da carcinogénese e largamente reconhecido, nomeadamente devido a sua capacidade de inibição da expressão de oncogenes ou supressores tumorais, resultando na prevenção ou promoção, respectivamente, do desenvolvimento tumoral. Tal como para outros tipos de cancro, vários miRNAs foram identificados e a sua função descrita como importante em LLAT. O trabalho desenvolvido no âmbito desta tese tem como objectivo caracterizar a rede de interacções entre TAL1 e microRNAs. Desta forma, esperamos contribuir para a compreensão dos mecanismos pelos quais TAL1 promove o desenvolvimento de leucemia. Através da identificação de novos genes promotores dos efeitos de TAL1 ou envolvidos na regulação deste oncogene esperamos identificar potenciais alvos moleculares para intervenção terapêutica em LLA-T. Para alem disso, pretendemos contribuir para o conhecimento geral da biologia e fisiologia dessa doença. Na maioria dos casos de LLA-T os mecanismos subjacentes a expressão ectópica de TAL1 estão ainda por elucidar. Uma das questões colocadas nesta tese visa esclarecer se a sobre expressão de TAL1 em LLA-T pode resultar ou ser potenciada pela desregulação de determinados miRNAs. Esta hipótese implica por outro lado que a diminuição dos níveis de TAL1 durante o normal desenvolvimento de células T resulta de um decréscimo que e, em parte, dependente de microRNAs. De forma a verificar se assim e de facto, analisamos ratinhos com uma deleção condicional da enzima DICER, que consequentemente não expressam miRNAs em precursores T, e verificamos que timócitos de ratinhos deficitários para DICER expressam níveis aumentados do transcrito de Tal1 em relação a ratinhos controlo. De seguida, realizamos estudos bioinformáticos para prever os miRNAs que se podem ligar ao transcrito humano do gene TAL1 e compilamos uma lista de possíveis candidatos. Através de um sistema repórter baseado na expressão de luciferase, confirmamos as possíveis interacções miRNA/TAL1. Desta forma seleccionamos os miRNAs com relevância biológica que levaram a uma redução na expressão do repórter em pelo menos 25%: miR-101, miR-520d-5p, miR-140-5p, miR-448 e miR-485-5p. De seguida, validamos a interacção destes miRNAs com o transcrito de TAL1 através da mutação dos elementos reconhecidos por miRNAs e desta forma confirmamos que os miR-101 e miR-140-5p regulam TAL1 através dos locais previstos. De forma a avaliar a importância fisiológica da interacção miRNA/TAL1, sobre expressamos os miRNAs candidatos em linhas celulares de LLA-T. Verificamos que a sobre expressão de miR-520d, miR-101, miR-140, miR-485 e miR-448 em diferentes linhas celulares resultam na inibição da expressão de TAL1 a nível do transcrito e proteína. Por outro lado, também observamos que a inibição dos miR-520d-5p e miR-101 endógenos e responsável pelo incremento da proteína TAL1. Através da comparação da expressão dos miRNAs miR-101, miR-140-5p, miR-448 e miR-485-5p entre células de pacientes com LLA-T e células de medula óssea normal, verificamos que a expressão dos microRNAs se encontra diminuída em relação aos controlos. Estes resultados vão ao encontro da nossa hipótese de que um decréscimo de expressão de miRNAs que regulam TAL1 pode ser, pelo menos parcialmente, responsável pela expressão aberrante de TAL1 em LLA-T. O nosso trabalho demonstra também que TAL1 e regulado de forma postranscricional por miRNAs. Apesar de se conhecer há muito a relevância de TAL1 na biologia da LLA-T, pouco se sabe sobre os genes alvo da sua função como regulador transcricional e do contributo destes genes para o desenvolvimento leucémico. Uma outra questão que procuramos resolver no âmbito deste trabalho foi perceber se TAL1 regula a expressão de genes de miRNAs potencialmente relevantes para o desenvolvimento leucémico. Para tal, analisamos o perfil de expressão de miRNAs dependente de TAL1 e identificamos os miRNAs cuja expressão variou de forma significativa apos sobre expressão de TAL1 numa linha celular LLA-T. Os resultados obtidos foram validados através da sobre expressão ou silenciamento de TAL1 em linhas celulares de LLA-T, confirmando que a expressão dos miR-135a, miR-223 e miR-330-3p e activada por TAL1, enquanto a expressão de miR-146b-5p e miR-545 e inibida. Para alem disso verificamos que a o TAL1 se liga a uma região no genoma 3.5000 nucleótidos a jusante do local de inicio de transcrição do miR-223, indicando que existe uma regulação directa da transcrição deste miRNA por TAL1. O facto de TAL1 activar a expressão de miR-223, que outros demonstraram inibir o supressor tumoral FBXW7, sugere que o TAL1 se encontra no centro de uma rede transcricional que envolve a estabilização de proteínas com importantes funções oncogénicas em LLA-T. Curiosamente, a anotação funcional dos alvos já validados dos miRNAs regulados por TAL1 revelou a prevalência de processos biológicos relacionados com inflamação e cancro. Em conclusão, identificamos um conjunto de genes não codificantes regulados por TAL1, implicando pela primeira vez genes de miRNAs na rede transcricional a jusante de TAL1 cujo papel pode ser relevante no contexto da hematopoiese normal e do desenvolvimento de LLA-T. Finalmente direccionamos a nossa investigação para os efeitos moleculares e funcionais da desregulação do miR-146b-5p por TAL1 em LLA-T. Os nossos resultados sugerem que TAL1 inibe transcricionalmente o miR-146b-5p de forma directa. Para alem disso, apesar de não termos encontrado diferenças na viabilidade e proliferação das células, demonstramos que a inibição do miR-146b-5p tem como consequência uma melhoria das capacidades de migração e invasão das células de LLA-T. Estes resultados sugerem que o miR-146b-5p poderá ter uma função supressora tumoral. Em concordância com esta possibilidade, as células leucémicas de pacientes com LLA-T expressam significativamente menos miR-146b-5p do que as células de dadores saudáveis, indicando que a diminuição da expressão deste miRNA poderá ser benéfica para as células tumorais. Para alem disso, observamos que a sobre expressão de miR-146b-5p em células humanas de LLA-T aumentou a sobrevivência de ratinhos num modelo de xenotransplante de leucemia humana. Desta forma, os nossos resultados sugerem que o miR-146b-5p e um alvo transcricional de TAL1 com relevância funcional. A redução dos níveis de expressão deste miRNA poderá contribuir para a LLA-T através da regulação da mobilidade das células leucémicas e da agressividade da doença. Em conclusão, o trabalho apresentado nesta tese estabelece a existência de uma relação reciproca entre TAL1 e microRNAs que envolve a regulação epigenética de TAL1 por miRNAs a jusante e a regulação transcricional de miRNAs por TAL1 a montante. Por outras palavras, os nossos estudos contribuem para o esclarecimento dos mecanismos conducentes a expressão anómala de TAL1 em LLA-T bem como dos mecanismos tumorigenicos a jusante de TAL1, nomeadamente no que respeita a identificação de genes de miRNAs alvo de regulação transcricional por TAL1. A pertinência destes estudos para intervenção terapêutica para beneficio dos pacientes de LLA-T e um desafio para o futuro, para qual o nosso trabalho serve como ponto de partida.

T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is an aggressive childhood malignancy in which the transformed clone is arrested during T-cell development. Despite significant improvements in treatment outcome that led to rates of cure close to 80% in children, survivors tend to face long term complications and develop serious secondary health problems. Therefore, the current challenge is to develop more efficient therapeutic strategies that target the leukemia cells in a more specific way, diminishing the toxic effects of the treatment. To achieve this, it is essential to improve our knowledge regarding the causes, pathophysiology and regulation of T-ALL, in particular by identifying the molecules and pathways fundamental for leukemia progression. TAL1 is an important transcription factor for the maintenance of hematopoietic stem cells and regulation of early hematopoiesis, being rapidly down-regulated upon T-cell lineage commitment. Aberrant expression of TAL1 in committed T-cell precursors is associated with leukemia and TAL1 is a well-established T-ALL oncogene, being over-expressed in more than 60% of T-ALL patients. MicroRNAs (miRNAs) are small, non-coding RNAs that primarily function as endogenous translational repressors of protein-coding genes. They decrease the expression of numerous genes by preventing translation or promoting mRNA degradation. The involvement of miRNAs in the regulation of cancer progression is well-established, namely by down-regulating the expression of key oncogenes or tumor suppressors and thereby preventing or promoting tumorigenesis, respectively. Similar to other cancers, several miRNA genes have been identified and revealed in the context of T-ALL. In this thesis, we aimed to characterize the network of interactions between TAL1 and microRNA genes. In doing so, we sought to contribute to the understanding of the mechanisms by which TAL1 promotes T-cell leukemia. By identifying novel genes acting as effectors of TAL1 or involved in the regulation of this major T-cell oncogene, we wish to contribute to the overall knowledge of T-ALL biology and pathophysiology and to identify potential molecular targets for therapeutic intervention in this malignancy. The mechanisms leading to aberrant activation of TAL1 in the majority of T-ALL patients who lack chromosomal rearrangements remain essentially unknown. Whether dysregulation of enhancer/promoter interactions, epigenetic alterations or deregulated trans-acting mechanisms lead to a disease-causing regulatory variant is still unsolved. We hypothesized that TAL1 levels decrease during normal T-cell development at least in part due to miRNA-dependent down-regulation, in which case TAL1 over-expression in some T-ALL cases should be the consequence of deregulated miRNA expression. To address this question, we analyzed conditional Dicer knockout mice and found that thymocytes lacking the expression of miRNAs expressed significantly more Tal1 transcript than controls, suggesting that TAL1 could be regulated post-transcriptionally by miRNAs during normal thymic development. By performing computational prediction of miRNAs that bind to the human TAL1 mRNA we then compiled a list of miRNAs that are candidates to regulate TAL1 transcript. Using a luciferase reporter system we confirmed the candidate miRNA/TAL1 mRNA interactions and selected miRNAs that significantly lowered the reporter expression in at least 25%: miR-101, miR-520d-5p, miR-140-5p, miR-448 and miR-485-5p. We further validated the interaction of the selected miRNAs with TAL1 by mutating the miRNA recognizing element (MRE) in the 3’UTR and confirmed that miR-101 and miR-140-5p target TAL1 mRNA in the predicted sites. Next, we evaluated the physiological importance of the miRNA/TAL1 mRNA pairs. Over-expression of miR-520d, miR-101, miR-140, miR-485 and miR- 448 in different T-ALL cell lines consistently resulted in the down-regulation of TAL1 transcript and protein. In accordance, inhibition of miR-101 and miR-520d-5p promoted TAL1 protein expression. Importantly, we found that the expression of miR-101, miR-140-5p, miR-448 and miR-485-5p was decreased in T-ALL patient specimens as compared to normal bone marrow samples. These findings favor our hypothesis that aberrant down-modulation of miRNAs that target TAL1 during early T-cell development could be, at least in part, responsible for ectopic expression of TAL1 in some T-ALL cases. TAL1 appears to be on the top of a transcriptional network that, in transformed thymocytes, drives the expression of genes involved in abnormal proliferation, differentiation and survival. Yet, the pathways downstream of TAL1 that contribute to leukemia development are still poorly characterized. Having that in mind, miRNA genes are attractive candidates to fulfill the role of TAL1 targets with important consequences for leukemogenesis. Through characterization of a TAL1-dependent microRNA gene expression profile, we identified miRNAs whose expression changed significantly upon TAL1 overexpression in a T-ALL cell line. The microRNA screen profile results were then validated upon enforced expression or silencing of TAL1 in additional T-ALL cell lines, confirming that miR-135a, miR-223 and miR-330-3p were up-regulated by TAL1, whereas miR-146b-5p and miR-545 were down-regulated. Furthermore, we verified that TAL1 binds to a genomic area 3.5kbs upstream of the miR-223 transcription start site, which indicates that miR-223 is a direct target of TAL1 in T-ALL. The fact that TAL1 positively regulates miR-223, which others have shown to down-regulate the tumor suppressor FBXW7, indicates that TAL1 is at the core of a transcriptional network involving (de)stabilization of important proteins with oncogenic impact in T-ALL. Interestingly, functional annotation of validated target genes of the TAL1-regulated miRNAs that we identified revealed that these should regulate biological processes related to inflammation and cancer. Overall, we identified for the first time a set of non-protein coding TAL1 target genes, implicating microRNA genes as part of the transcriptional network downstream of TAL1 whose role may be important in the context of hematopoiesis and T-cell leukemogenesis. Finally, we focused on miR-146b-5p and evaluated the functional and molecular effects of its deregulation by TAL1 in the context of T-ALL. Our results point to a direct downregulation of miR-146b-5p by TAL1. Moreover, although no clear differences were found concerning cell viability or proliferation, miR-146-5p reduced expression improved the migration and invasion capacities of T-ALL cells. Therefore, miR-146-5p appears to have a tumor suppressor function in vitro. In line with these results, we verified that leukemia cells from T-ALL patients express significantly lower levels of miR-146b-5p than normal control samples. This further suggests that reduced expression of miR-146b-5p might be beneficial for T-ALL cells. In agreement, we showed that over-expression of miR-146b in human T-ALL cells significantly increased the survival of recipient mice in a xenotransplant model of human leukemia. In summary, our results suggest that miR-146b-5p is a functionally relevant TAL1 microRNA target gene, whose down-regulation may contribute to T-ALL by modulating leukemia cell motility and disease aggressiveness. Overall, the work presented in this thesis establishes the existence of a dual-way talk between TAL1 and microRNA genes in a manner that involves the upstream epigenetic regulation of TAL1 by specific miRNAs and the downstream transcriptional regulation of miRNA genes by TAL1. In other words, our studies contribute to the understanding of the mechanisms involved in TAL1 over-expression in T-ALL and to the clarification of the tumorigenic network downstream from TAL1, namely concerning the identification of miRNA genes transcriptionally regulated by TAL1. Whether the interactions identified here may be explored therapeutically for the benefit of T-ALL patients remains a challenge for the future.

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