On the effect of molecular structure and composition on the photofragmentation of biomolecules

The research on the interaction between radiation and biomolecules pro-vides valuable information for both radiobiology and molecular physics. While radiobiology is interested in the damage inflicted on the molecule upon irradiation, molecular physics exploits these studies to obtain infor-mation about the physical properties of the molecule and the quantum me-chanical processes involved in the interaction. This thesis work investigated how a small change in the structure or composition of a biomolecule changes the response of the molecule to ioniz-ing radiation. Altogether eight different biomolecules were studied: nucleo-sides uridine, 5-methyluridine and thymidine; amino acids alanine, cysteine and serine; and halogenated acetic acids chloro- and bromoacetic acids. The effect of ionizing radiation on these molecules was studied on molecular level, investigating the samples in gas phase. Synchrotron radiation of VUV or soft x-ray range was used to ionize sample molecules, and the subsequent fragmentation processes were investigated with ion mass spectroscopy and ion-ion-electron coincidence spectroscopy. The comparison between the three nucleosides revealed that adding or removing a single functional group can affect not only the bonds from which the molecule ruptures upon ionization but also the charge localiza-tion in the formed fragments. Studies on amino acids and halogenated acetic acids indicated that one simple substitution in the molecule can dramatical-ly change the extent of fragmentation. This thesis work also demonstrates that in order to steer the radiation-induced fragmentation of the molecules, it is not always necessary to alter the amount of energy deposited on the molecules but selecting a suitable substitution may suffice.

Metabolic, biochemical and molecular profiling of Catharanthus roseus flower cultivars and transformed hairy roots for monoterpenoid indole alkaloid accumulation /

Catharanthlls rosellS (L.) G Don is a commercially significant flower species and in addition is the only source of the monoterpenoid indole alkaloids (MIA) vinblastine and vincristine, which are key pharmaceutical compounds that are used to combat a number of different cancers. Therefore, procurement of the antineoplastic agents is difficult but essential procedure. Alternatively, CatharanthllS tissue cultures have been investigated as a source of these agents; however they do not produce vindoline, which is an obligate precursor to vinblastine and vincristine. The interest in developing high MIA cultivars of Catharantlws rosellS has prompted metabolic profiling studies to determine the variability of MIA accumulation of existing flowering cultivars, with particular focus on the vindoline component ofthe pathway. Metabolic profiling studies that used high performance liquid chromatography of MIAs from seedlings and young leaf extracts from 50 different flowering cultivars showed that, except for a single low vindoline cultivar (Vinca Mediterranean DP Orchid), they all accumulate similar levels of MIAs. Further enzymatic studies with extracts from young leaves and from developing seedlings showed that the low vindoline cultivar has a IO-fold lower tabersonine-16-hydroxylase activity than those of CatharanthllS rosellS cv Little Delicata. Additionally, studies aimed at metabolic engineering ofvindoline bios}l1thesis in Catharanthus rosellS hairy root cultures have been performed by expressing the last step in vindoline biosynthesis [Dcacetylvindoline-4-0- acetyltransferase (DAT)]. Enzymatic profiling studies with transformed hairy roots have confirmed that over-expressing DAT leads to lines with high levels of O-acetyltransferase activity when compared to non-expressing hairy roots. One particular DA T over111 expressing hairy root culture (line 7) contained 200 times the OAT activity than leaves of control lines. Additional MIA analyses revealed that DAT over-expressing hairy roots have an altered alkaloid profile with significant variation in the accumulation of h6rhammericine. Further analysis of transformed hairy root line 7 suggests a correlation between the expression of OAT activity and h6rhammericine accumulation with root maturation. These studies show that metabolic and selective enzymatic profiling can enhance our ability to search for relevant MIA pathway mutants and that genetic engineering with appropriate pathway genes shows promise as a tool to modify the MIA profile of Catharanthus roseus.

Investigation into the relationships between molecular chaperones, mitochondrial antioxidant enzymes, and endothermic vertebrate longevity

The maximum lifespan (MLSP) of endothermic vertebrates can range from as little as a year to over two centuries, yet the underlying phenotype of aging is very similar amongst this group of organisms. One organelle that may be important in the phenotype of aging is the mitochondrion. When damaged, this organelle is thought to contribute to many of the neurodegenerative diseases of aging. For this thesis, mitochondria from brain tissues of 7 mammalian and 2 avian species were isolated to assess whether the antioxidant glutathione system and major molecular chaperone, HSP60, is correlated to species MLSP. Furthermore, HSP60, and the major endoplasmic reticulum chaperone, GRP78, were measured under basal conditions, and following the introduction of an oxidative stress (hydrogen peroxide) in cultured mammalian myoblasts from 10 different species. My results indicate that the enzymes involved in the glutathione defense system are not correlated to species MLSP in brain mitochondria; however HSP60 levels are indeed higher in the longer-lived species. HSP60 levels are also higher at the basal level in cultured mammalian myoblasts and after 1 hour of hydrogen peroxide exposure. GRP78 induction is not correlated to species MLSP at the basal level or following hydrogen peroxide exposure. Therefore, these results suggest that HSP60 is a correlate of longevity in endothermic vertebrate species, but neither the glutathione antioxidant defense system, nor GRP78, correlates to species longevity.

Assessing the Reproducibility of Clustering of Molecular Dynamics Conformations on Self-Organizing Maps

The goal of most clustering algorithms is to find the optimal number of clusters (i.e. fewest number of clusters). However, analysis of molecular conformations of biological macromolecules obtained from computer simulations may benefit from a larger array of clusters. The Self-Organizing Map (SOM) clustering method has the advantage of generating large numbers of clusters, but often gives ambiguous results. In this work, SOMs have been shown to be reproducible when the same conformational dataset is independently clustered multiple times (~100), with the help of the Cramérs V-index (C_v). The ability of C_v to determine which SOMs are reproduced is generalizable across different SOM source codes. The conformational ensembles produced from MD (molecular dynamics) and REMD (replica exchange molecular dynamics) simulations of the penta peptide Met-enkephalin (MET) and the 34 amino acid protein human Parathyroid Hormone (hPTH) were used to evaluate SOM reproducibility. The training length for the SOM has a huge impact on the reproducibility. Analysis of MET conformational data definitively determined that toroidal SOMs cluster data better than bordered maps due to the fact that toroidal maps do not have an edge effect. For the source code from MATLAB, it was determined that the learning rate function should be LINEAR with an initial learning rate factor of 0.05 and the SOM should be trained by a sequential algorithm. The trained SOMs can be used as a supervised classification for another dataset. The toroidal 10×10 hexagonal SOMs produced from the MATLAB program for hPTH conformational data produced three sets of reproducible clusters (27%, 15%, and 13% of 100 independent runs) which find similar partitionings to those of smaller 6×6 SOMs. The χ^2 values produced as part of the C_v calculation were used to locate clusters with identical conformational memberships on independently trained SOMs, even those with different dimensions. The χ^2 values could relate the different SOM partitionings to each other.

Single-Molecule Magnets and Multifunctional Molecular Magnetic Materials Based on Polynuclear Metal Complexes

Our work on single molecule magnets and multifunctional magnetic materials is presented in four projects. In the first project we show for first time that heteroatomic-type pseudohalides, such as OCN-, can be employed as structure-directing ligands and ferromagnetic couplers in higher oxidation state metal cluster chemistry. The initial use of cyanato groups in Mn cluster chemistry has afforded structurally interesting MnII/III14 (1) and MnII/III/IV16 (2) clusters in which the end-on bridging cyanates show a preference in binding through their O-atom. The Mn14 compound shows entirely visible out-of-phase alternating currect signals below 5 K and large hysteresis loops below 2 K. Furthermore, the amalgamation of azido groups with the triethanolamine tripodal ligand in manganese carboxylate cluster chemistry has led to the isolation of a new ferromagnetic, high-nuclearity and mixed-valence MnII/III15Na2 (3) cluster with a large ground-state spin value of S = 14. In the second project we demonstrate a new synthetic route to purely inorganic-bridged, transition metal-azido clusters [CoII7 (4) and NiII7 (5)] and coordination polymers [{FeII/III2}n (6)] which exhibit strong ferromagnetic, SMM and long-range magnetic ordering behaviors. We also show that access to such a unique ferromagnetic class of inorganic, N-rich and O-free materials is feasible through the use of Me3SiN3 as the azido-ligand precursor without requiring the addition of any organic chelating/bridging ligand. In the last projects we have tried to bring together molecular magnetism and optics via the synthesis of multifunctional magnetic materials based on 3d- or 4f-metal ions. We decided to approach such challenge from two different directions: firstly, in our third project, by the deliberate replacement of non-emissive carboxylato ligands in known 3d-SMMs with their fluorescent analogues, without perturbing the metal-core structure and SMM properties (complexes 7, 8, and 9). The second route (last project) involves the use of naphthalene or pyridine-based polyalcohol bridging ligands for the synthesis of new polynuclear LnIII metal clusters (Ln = lanthanide) with novel topologies, SMM behaviors and luminescent properties arising from the increased efficiency of the “antenna” organic group. This approach has led us to the isolation of two new families of LnIII8 (complexes 10-13) and LnIII4 (complexes 14-20) clusters.

High-Spin and Emissive Molecular Materials: Synthesis and Characterization of New Polynuclear Ni(II) Complexes from the Use of Aromatic Schiff Bases as Bridging Ligands

The employment of the bridging/chelating Schiff bases, N-salicylidene-4-methyl-o-aminophenol (samphH2) and N-naphthalidene-2-amino-5-chlorobenzoic acid (nacbH2), in nickel cluster chemistry has afforded eight polynuclear Ni(II) complexes with new structural motifs, interesting magnetic and optical properties, and unexpected organic ligand transformations. In the present thesis, Chapter 1 deals with all the fundamental aspects of polynuclear metal complexes, molecular magnetism and optics, while research results are reported in Chapters 2 and 3. In the first project (Chapter 2), I investigated the coordination chemistry of the organic chelating/bridging ligand, N-salicylidene-4-methyl-o-aminophenol (samphH2). The general NiII/tBuCO2-/samphH2 reaction system afforded two new tetranuclear NiII clusters, namely [Ni4(samph)4(EtOH)4] (1) and [Ni4(samph)4(DMF)2] (2), with different structural motifs. Complex 1 possessed a cubane core while in complex 2 the four NiII ions were located at the four vertices of a defective dicubane. The nature of the organic solvent was found to be of pivotal importance, leading to compounds with the same nuclearity, but different structural topologies and magnetic properties. The second project, the results of which are summarized in Chapter 3, included the systematic study of a new optically-active Schiff base ligand, N-naphthalidene-2-amino-5-chlorobenzoic acid (nacbH2), in NiII cluster chemistry. Various reactions between NiX2 (X- = inorganic anions) and nacbH2 were performed under basic conditions to yield six new polynuclear NiII complexes, namely (NHEt3)[Ni12(nacb)12(H2O)4](ClO4) (3), (NHEt3)2[Ni5(nacb)4(L)(LH)2(MeOH)] (4), [Ni5(OH)2(nacb)4(DMF)4] (5), [Ni5(OMe)Cl(nacb)4(MeOH)3(MeCN)] (6), (NHEt3)2[Ni6(OH)2(nacb)6(H2O)4] (7), and [Ni6(nacb)6(H2O)3(MeOH)6] (8). The nature of the solvent, the inorganic anion, X-, and the organic base were all found to be of critical importance, leading to products with different structural topologies and nuclearities (i.e., {Ni5}, {Ni6} and {Ni12}). Magnetic studies on all synthesized complexes revealed an overall ferromagnetic behavior for complexes 4 and 8, with the remaining complexes being dominated by antiferromagnetic exchange interactions. In order to assess the optical efficiency of the organic ligand when bound to the metal centers, photoluminescence studies were performed on all synthesized compounds. Complexes 4 and 5 show strong emission in the visible region of the electromagnetic spectrum. Finally, the ligand nacbH2 allowed for some unexpected organic transformations to occur; for instance, the pentanuclear compound 5 comprises both nacb2- groups and a new organic chelate, namely the anion of 5-chloro-2-[(3-hydroxy-4-oxo-1,4-dihydronaphthalen-1-yl)amino]benzoic acid. In the last section of this thesis, an attempt to compare the NiII cluster chemistry of the N-naphthalidene-2-amino-5-chlorobenzoic acid ligand with that of the structurally similar but less bulky, N-salicylidene-2-amino-5-chlorobenzoic acid (sacbH2), was made.

Development of a Blood Antigen Molecular Profiling Panel using Genotyping Technologies for Patients Requiring Frequent Transfusions

Contexte. Les phénotypes ABO et Rh(D) des donneurs de sang ainsi que des patients transfusés sont analysés de façon routinière pour assurer une complète compatibilité. Ces analyses sont accomplies par agglutination suite à une réaction anticorps-antigènes. Cependant, pour des questions de coûts et de temps d’analyses faramineux, les dons de sang ne sont pas testés sur une base routinière pour les antigènes mineurs du sang. Cette lacune peut résulter à une allo-immunisation des patients receveurs contre un ou plusieurs antigènes mineurs et ainsi amener des sévères complications pour de futures transfusions. Plan d’étude et Méthodes. Pour ainsi aborder le problème, nous avons produit un panel génétique basé sur la technologie « GenomeLab _SNPstream» de Beckman Coulter, dans l’optique d’analyser simultanément 22 antigènes mineurs du sang. La source d’ADN provient des globules blancs des patients préalablement isolés sur papiers FTA. Résultats. Les résultats démontrent que le taux de discordance des génotypes, mesuré par la corrélation des résultats de génotypage venant des deux directions de l’ADN, ainsi que le taux d’échec de génotypage sont très bas (0,1%). Également, la corrélation entre les résultats de phénotypes prédit par génotypage et les phénotypes réels obtenus par sérologie des globules rouges et plaquettes sanguines, varient entre 97% et 100%. Les erreurs expérimentales ou encore de traitement des bases de données ainsi que de rares polymorphismes influençant la conformation des antigènes, pourraient expliquer les différences de résultats. Cependant, compte tenu du fait que les résultats de phénotypages obtenus par génotypes seront toujours co-vérifiés avant toute transfusion sanguine par les technologies standards approuvés par les instances gouvernementales, les taux de corrélation obtenus sont de loin supérieurs aux critères de succès attendus pour le projet. Conclusion. Le profilage génétique des antigènes mineurs du sang permettra de créer une banque informatique centralisée des phénotypes des donneurs, permettant ainsi aux banques de sang de rapidement retrouver les profiles compatibles entre les donneurs et les receveurs.

Molecular biodiversity of microbial communities in polluted soils and their role in soil phytoremediation

Les métaux lourds (ML) s’accumulent de plus en plus dans les sols à l’échelle mondiale, d’une part à cause des engrais minéraux et divers produits chimiques utilisés en agriculture intensive, et d’autre part à cause des activités industrielles. Toutes ces activités génèrent des déchets toxiques qui s’accumulent dans l’environnement. Les ML ne sont pas biodégradables et leur accumulation cause donc des problèmes de toxicité des sols et affecte la biodiversité des microorganismes qui y vivent. La fertilisation en azote (N) est une pratique courante en agriculture à grande échelle qui permet d’augmenter la fertilité des sols et la productivité des cultures. Cependant, son utilisation à long terme cause plusieurs effets néfastes pour l'environnement. Par exemple, elle augmente la quantité des ML dans les sols, les nappes phréatiques et les plantes. En outre, ces effets néfastes réduisent et changent considérablement la biodiversité des écosystèmes terrestres. La structure des communautés des champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) a été étudiée dans des sols contaminés par des ML issus de la fertilisation à long terme en N. Le rôle des différentes espèces de CMA dans l'absorption et la séquestration des ML a été aussi investigué. Dans une première expérience, la structure des communautés de CMA a été analysée à partir d’échantillons de sols de sites contaminés par des ML et de sites témoins non-contaminés. Nous avons constaté que la diversité des CMA indigènes a été plus faible dans les sols et les racines des plantes récoltées à partir de sites contaminés par rapport aux sites noncontaminés. Nous avons également constaté que la structure de la communauté d'AMF a été modifiée par la présence des ML dans les sols. Certains ribotypes des CMA ont été plus souvent associés aux sites contaminés, alors que d’autres ribotypes ont été associés aux sites non-contaminés. Cependant, certains ribotypes ont été observés aussi bien dans les sols pollués que non-pollués. Dans une deuxième expérience, les effets de la fertilisation organique et minérale (N) sur les différentes structures des communautés des CMA ont été étudiés. La variation de la structure de la communauté de CMA colonisant les racines a été analysée en fonction du type de fertilisation. Certains ribotypes de CMA étaient associés à la fertilisation organique et d'autres à la fertilisation minérale. En revanche, la fertilisation minérale a réduit le nombre de ribotypes de CMA alors que la fertilisation organique l’a augmenté. Dans cette expérience, j’ai démontré que le changement de structure des communautés de CMA colonisant des racines a eu un effet significatif sur la productivité des plantes. Dans une troisième expérience, le rôle de deux espèces de CMA (Glomus irregulare et G. mosseae) dans l'absorption du cadmium (Cd) par des plants de tournesol cultivés dans des sols amendés avec trois niveaux différents de Cd a été évalué. J’ai démontré que les deux espèces de CMA affectent différemment l’absorption ou la séquestration de ce ML par les plants de tournesol. Cette expérience a permis de mieux comprendre le rôle potentiel des CMA dans l'absorption des ML selon la concentration de cadmium dans le sol et les espèces de CMA. Mes recherches de doctorat démontrent donc que la fertilisation en N affecte la structure des communautés des CMA dans les racines et le sol. Le changement de structure de la communauté de CMA colonisant les racines affecte de manière significative la productivité des plantes. J’ai aussi démontré que, sous nos conditions expériemntales, l’espèce de CMA G. irregulare a été observée dans tous les sites (pollués et non-pollués), tandis que le G. mosseae n’a été observé en abondance que dans les sites contaminés. Par conséquent, j’ai étudié le rôle de ces deux espèces (G. irregulare et G. mosseae) dans l'absorption du Cd par le tournesol cultivé dans des sols amendés avec trois différents niveaux de Cd en serre. Les résultats indiquent que les espèces de CMA ont un potentiel différent pour atténuer la toxicité des ML dans les plantes hôtes, selon le niveau de concentration en Cd. En conclusion, mes travaux suggèrent que le G. irregulare est une espèce potentiellement importante pour la phytoextration du Cd, alors que le G. mosseae pourrait être une espèce appropriée pour phytostabilisation du Cd et du Zn.

Elementary steps in aqueous proton transfer reactions : a first principles molecular dynamics study

La nature des acides dans un environnement aqueux est primordiale dans de nombreux aspects de la chimie et de la biologie. La caractéristique principale d'un acide est sa capacité à transférer un proton vers une molécule d'eau ou vers n'importe quelle base, mais ce procédé n'est pas aussi simple qu'il y paraît. Il peut au contraire être extrêmement complexe et dépendre de manière cruciale de la solvatation des différents intermédiaires de réaction impliqués. Cette thèse décrit les études computationnelles basées sur des simulations de dynamique moléculaire ab initio qui ont pour but d'obtenir une description à l'échelle moléculaire des divers procédés de transferts de proton entre acide et bases dans un milieu aqueux. Pour cela, nous avons étudié une serie de système, dont l'acide hydrofluorique aqueux, l'acide trifluoroacétique aqueux, et un système modèle constitué d'un phénol et d'une entité carboxylate reliés entre eux par une molécule d'eau en solution aqueuse. Deux états intermédiaires ont été identifiés pour le transfert d'un proton depuis un acide. Ces intermédiaires apparaissent stabilisés par un motif local de solvatation via des ponts H. Leurs signatures spectroscopiques ont été caractérisées au moyen de la spectroscopie infrarouge, en utilisant le formalisme de la dynamique moléculaire ab initio, qui inclut l'effet quantique nucléaire de manière explicite. Cette étude a aussi identifié trois chemins de réaction élémentaire, qui sont responsable pour le transfert d'un proton d'un acide à une base, ainsi que leurs échelles de temps caractéristiques. Les conclusions tirées de ces études sont discutées dans les détails, au niveau moléculaire, avec une emphase sur les comparaisons entre les résultats théoriques et les mesures expérimentales obtenues dans a littérature ou via des collaborateurs.

Molecular determinants of congenital hypothyroidism due to thyroid dysgenesis

L’hypothyroïdie congénitale par dysgénésie thyroïdienne (HCDT) est la condition endocrinienne néonatale la plus fréquemment rencontrée, avec une incidence d’un cas sur 4000 naissances vivantes. L’HCDT comprend toutes les anomalies du développement de la thyroïde. Parmi ces anomalies, le diagnostic le plus fréquent est l’ectopie thyroïdienne (~ 50% des cas). L’HCDT est fréquemment associée à un déficit sévère en hormones thyroïdiennes (hypothyroïdisme) pouvant conduire à un retard mental sévère si non traitée. Le programme de dépistage néonatal assure un diagnostic et un traitement précoce par hormones thyroïdiennes. Cependant, même avec un traitement précoce (en moyenne à 9 jours de vie), un retard de développement est toujours observé, surtout dans les cas les plus sévères (c.-à-d., perte de 10 points de QI). Bien que des cas familiaux soient rapportés (2% des cas), l’HCTD est essentiellement considérée comme une entité sporadique. De plus, plus de 92% des jumeaux monozygotiques sont discordants pour les dysgénésies thyroïdiennes et une prédominance féminine est rapportée (spécialement dans le cas d’ectopies thyroïdiennes), ces deux observations étant clairement incompatible avec un mode de transmission héréditaire mendélien. Il est donc cohérent de constater que des mutations germinales dans les facteurs de transcription thyroïdiens connus (NKX2.1, PAX8, FOXE1, and NKX2.5) ont été identifiées dans seulement 3% des cas sporadiques testés et furent, de plus, exclues lors d’analyse d’association dans certaines familles multiplex. Collectivement, ces données suggèrent que des mécanismes non mendéliens sont à l’origine de la majorité des cas de dysgénésie thyroïdienne. Parmi ces mécanismes, nous devons considérer des modifications épigénétiques, des mutations somatiques précoces (au stade du bourgeon thyroïdien lors des premiers stades de l’embryogenèse) ou des défauts développementaux stochastiques (c.-à-d., accumulation aléatoire de mutations germinales ou somatiques). Voilà pourquoi nous proposons un modèle «2 hits » combinant des mutations (épi)génétiques germinales et somatiques; ce modèle étant compatible avec le manque de transmission familial observé dans la majorité des cas d’HCDT. Dans cette thèse, nous avons déterminé si des variations somatiques (épi)génétiques sont associées à l’HCTD via une approche génomique et une approche gène candidat. Notre approche génomique a révélé que les thyroïdes ectopiques ont un profil d’expression différent des thyroïdes eutopiques (contrôles) et que ce profil d’expression est enrichi en gènes de la voie de signalisation Wnt. La voie des Wnt est cruciale pour la migration cellulaire et pour le développement de plusieurs organes dérivés de l’endoderme (p.ex. le pancréas). De plus, le rôle de la voie des Wnt dans la morphogénèse thyroïdienne est supporté par de récentes études sur le poisson-zèbre qui montrent des anomalies du développement thyroïdien lors de la perturbation de la voie des Wnt durant différentes étapes de l’organogénèse. Par conséquent, l’implication de la voie des Wnt dans l’étiologie de la dysgénésie thyroïdienne est biologiquement plausible. Une trouvaille inattendue de notre approche génomique fut de constater que la calcitonine était exprimée autant dans les thyroïdes ectopiques que dans les thyroïdes eutopiques (contrôles). Cette trouvaille remet en doute un dogme de l’embryologie de la thyroïde voulant que les cellules sécrétant la calcitonine (cellules C) proviennent exclusivement d’une structure extrathyroïdienne (les corps ultimobranchiaux) fusionnant seulement avec la thyroïde en fin de développement, lorsque la thyroïde a atteint son emplacement anatomique définitif. Notre approche gène candidat ne démontra aucune différence épigénétique (c.-à-d. de profil de méthylation) entre thyroïdes ectopiques et eutopiques, mais elle révéla la présence d’une région différentiellement méthylée (RDM) entre thyroïdes et leucocytes dans le promoteur de FOXE1. Le rôle crucial de FOXE1 dans la migration thyroïdienne lors du développement est connu et démontré dans le modèle murin. Nous avons démontré in vivo et in vitro que le statut de méthylation de cette RDM est corrélé avec l’expression de FOXE1 dans les tissus non tumoraux (c.-à-d., thyroïdes et leucocytes). Fort de ces résultats et sachant que les RDMs sont de potentiels points chauds de variations (épi)génétiques, nous avons lancé une étude cas-contrôles afin de déterminer si des variants génétiques rares localisés dans cette RDM sont associés à la dysgénésie thyroïdienne. Tous ces résultats générés lors de mes études doctorales ont dévoilé de nouveaux mécanismes pouvant expliquer la pathogenèse de la dysgénésie thyroïdienne, condition dont l’étiologie reste toujours une énigme. Ces résultats ouvrent aussi plusieurs champs de recherche prometteurs et vont aider à mieux comprendre tant les causes des dysgénésies thyroïdiennes que le développement embryonnaire normal de la thyroïde chez l’homme.

Molecular characterization of the contribution of autophagy to antigen presentation using quantitative proteomics

L’autophagie est une voie hautement conservée de dégradation lysosomale des constituants cellulaires qui est essentiel à l’homéostasie cellulaire et contribue à l’apprêtement et à la présentation des antigènes. Les rôles relativement récents de l'autophagie dans l'immunité innée et acquise sous-tendent de nouveaux paradigmes immunologiques pouvant faciliter le développement de nouvelles thérapies où la dérégulation de l’autophagie est associée à des maladies auto-immunes. Cependant, l'étude in vivo de la réponse autophagique est difficile en raison du nombre limité de méthodes d'analyse pouvant fournir une définition dynamique des protéines clés impliquées dans cette voie. En conséquence, nous avons développé un programme de recherche en protéomique intégrée afin d’identifier et de quantifier les proteines associées à l'autophagie et de déterminer les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l’autophagosome dans la présentation antigénique en utilisant une approche de biologie des systèmes. Pour étudier comment l'autophagie et la présentation antigénique sont activement régulés dans les macrophages, nous avons d'abord procédé à une étude protéomique à grande échelle sous différentes conditions connues pour stimuler l'autophagie, tels l’activation par les cytokines et l’infection virale. La cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) est l'une des principales cytokines pro-inflammatoires qui intervient dans les réactions locales et systémiques afin de développer une réponse immune adaptative. La protéomique quantitative d'extraits membranaires de macrophages contrôles et stimulés avec le TNF-alpha a révélé que l'activation des macrophages a entrainé la dégradation de protéines mitochondriales et des changements d’abondance de plusieurs protéines impliquées dans le trafic vésiculaire et la réponse immunitaire. Nous avons constaté que la dégradation des protéines mitochondriales était sous le contrôle de la voie ATG5, et était spécifique au TNF-alpha. En outre, l’utilisation d’un nouveau système de présentation antigènique, nous a permi de constater que l'induction de la mitophagie par le TNF-alpha a entrainée l’apprêtement et la présentation d’antigènes mitochondriaux par des molécules du CMH de classe I, contribuant ainsi la variation du répertoire immunopeptidomique à la surface cellulaire. Ces résultats mettent en évidence un rôle insoupçonné du TNF-alpha dans la mitophagie et permet une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la présentation d’auto-antigènes par les molécules du CMH de classe I. Une interaction complexe existe également entre infection virale et l'autophagie. Récemment, notre laboratoire a fourni une première preuve suggérant que la macroautophagie peut contribuer à la présentation de protéines virales par les molécules du CMH de classe I lors de l’infection virale par l'herpès simplex virus de type 1 (HSV-1). Le virus HSV1 fait parti des virus humains les plus complexes et les plus répandues. Bien que la composition des particules virales a été étudiée précédemment, on connaît moins bien l'expression de l'ensemble du protéome viral lors de l’infection des cellules hôtes. Afin de caractériser les changements dynamiques de l’expression des protéines virales lors de l’infection, nous avons analysé par LC-MS/MS le protéome du HSV1 dans les macrophages infectés. Ces analyses nous ont permis d’identifier un total de 67 protéines virales structurales et non structurales (82% du protéome HSV1) en utilisant le spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Nous avons également identifié 90 nouveaux sites de phosphorylation et de dix nouveaux sites d’ubiquitylation sur différentes protéines virales. Suite à l’ubiquitylation, les protéines virales peuvent se localiser au noyau ou participer à des événements de fusion avec la membrane nucléaire, suggérant ainsi que cette modification pourrait influer le trafic vésiculaire des protéines virales. Le traitement avec des inhibiteurs de la réplication de l'ADN induit des changements sur l'abondance et la modification des protéines virales, mettant en évidence l'interdépendance des protéines virales au cours du cycle de vie du virus. Compte tenu de l'importance de la dynamique d'expression, de l’ubiquitylation et la phosphorylation sur la fonction des proteines virales, ces résultats ouvriront la voie vers de nouvelles études sur la biologie des virus de l'herpès. Fait intéressant, l'infection HSV1 dans les macrophages déclenche une nouvelle forme d'autophagie qui diffère remarquablement de la macroautophagie. Ce processus, appelé autophagie associée à l’enveloppe nucléaire (nuclear envelope derived autophagy, NEDA), conduit à la formation de vésicules membranaires contenant 4 couches lipidiques provenant de l'enveloppe nucléaire où on retrouve une grande proportion de certaines protéines virales, telle la glycoprotéine B. Les mécanismes régissant NEDA et leur importance lors de l’infection virale sont encore méconnus. En utilisant un essai de présentation antigénique, nous avons pu montrer que la voie NEDA est indépendante d’ATG5 et participe à l’apprêtement et la présentation d’antigènes viraux par le CMH de classe I. Pour comprendre l'implication de NEDA dans la présentation des antigènes, il est essentiel de caractériser le protéome des autophagosomes isolés à partir de macrophages infectés par HSV1. Aussi, nous avons développé une nouvelle approche de fractionnement basé sur l’isolation de lysosomes chargés de billes de latex, nous permettant ainsi d’obtenir des extraits cellulaires enrichis en autophagosomes. Le transfert des antigènes HSV1 dans les autophagosomes a été determine par protéomique quantitative. Les protéines provenant de l’enveloppe nucléaire ont été préférentiellement transférées dans les autophagosome lors de l'infection des macrophages par le HSV1. Les analyses protéomiques d’autophagosomes impliquant NEDA ou la macroautophagie ont permis de decouvrir des mécanismes jouant un rôle clé dans l’immunodominance de la glycoprotéine B lors de l'infection HSV1. Ces analyses ont également révélées que diverses voies autophagiques peuvent être induites pour favoriser la capture sélective de protéines virales, façonnant de façon dynamique la nature de la réponse immunitaire lors d'une infection. En conclusion, l'application des méthodes de protéomique quantitative a joué un rôle clé dans l'identification et la quantification des protéines ayant des rôles importants dans la régulation de l'autophagie chez les macrophages, et nous a permis d'identifier les changements qui se produisent lors de la formation des autophagosomes lors de maladies inflammatoires ou d’infection virale. En outre, notre approche de biologie des systèmes, qui combine la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse avec des essais fonctionnels tels la présentation antigénique, nous a permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l'autophagie lors de la présentation antigénique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra de réduire les effets nuisibles de l'immunodominance suite à l'infection virale ou lors du développement du cancer en mettant en place une réponse immunitaire appropriée.

Investigations on the cation induced liquid crystalline phases of high molecular weight DNA

Liquid Crystalline DNA is emerging as an active area of research, due to its potential applications in diverse fields, ranging from nanoelectronics to therapeutics. Since, counter ion neutralization is an essential requirement for the expression of LC DNA, and the present level of understanding on the LC phase behavior of high molecular weight DNA is inadequate, a thorough investigation is required to understand the nature and stability of these phases under the influence of various cationic species. The present study is, therefore mainly focused on a comparative investigation of the effect of metal ions of varying charge, size, hydration and binding modes on the LC phase behavior of high molecular weight DNA. The main objectives of the works are investigations on the induction and stabilization of LC phases of high molecular weight DNA by alkali metal ions, investigations on the induction and stabilization of LC phases of high molecular weight DNA by alkaline earth metal ions, effects of multivalent, transition and heavy metal ions on the LC phase behavior of high molecular weight DNA and investigations on spermine induced LC behavior of high molecular weight DNA in the presence of alkali and alkaline earth metal ions. The critical DNA concentration (CD) required for the expression of LC phases, phase transitions and their stability varied considerably when the binding site of the metal ions changed from phosphate groups to the nitrogenous bases of DNA, with Li+ giving the highest stability. Multiple LC phases with different textures, sometimes diffused and unstable or otherwise mainly distinct and clear, were observed on mixing metal ions with DNA solutions, which in turn depended on the charge, size, hydration factor, binding modes, concentration of the metal ions and time. Molecular modeling studies on binding of selected metal ions to DNA supported the experimental findings

Tuning mesoporous molecular sieve SBA-15 for the immobilization of α-amylase

The present work describes the immobilization of α-amylase over well ordered mesoporous molecular sieve SBA-15 with different pore diameters synthesized by post synthesis treatment (PST) hydrothermally after reaction at 40°C. The materials were characterized by N 2 adsorption–desorption studies, small angle X-ray diffraction, scanning electron microscopy and high resolution transmission electron microscopy. Since α-amylase obtained from Bacillus subtilis has dimensions of 35 × 40 × 70 Å it is expected that the protein have access to the pore of SBA-15 (PST-120°C) with diameter 74 Å. The pore dimension is appropriate to prevent considerable leaching. The rate of adsorption of the enzyme on silica of various pore sizes revealed the influence of morphology, pore diameter, pore volume and pH.

Molecular Biological investigations on viral diseases affecting farmed penaeid shrimps in Kerala

This thesis covers various aspects of viral diseases affecting shrimp aquaculture. The research component of this thesis can be divided into four areas. The areas covered are: I) A study to determine the prevalence of WSSV among the crustaceans in the Vembanad estuary, the shrimp aquaculture farms surrounding the estuary, and the sea off Cochin coast, India using two , sets of nested PCR primers. 2) An investigation to compare the sequence of six major structural proteins of WSSV; vp28, vp26, vp 19, vp68, vp281, vp466 from different geographical locations with that of an isolate from India. 3) Simultaneous occurrence of HPV, IHHNV, MBV and WSSV in postlarvae of P. monodon from hatcheries in India was monitored by Polymerase Chain Reaction. 4) A real time PCR procedure was developed for the quantitative analysis of WSSV infection. The viral load of postlarvae from hatcheries in Kerala meant for aquaculture was also determined using the quantitative PCR.

Biochemical and molecular characterization of pathogenic vibrios from hatcheries and aquaculture farms

Vibrio are important during hatchery rearing. aquaculture phase and post-harvest quality of shrimps. Vibrio spp are of concern to shrimp farmers and hatchery operators because certain species can cause Vibriosis. Vibrio species are of concern to humans because certain species cause serious diseases.With the progress in aquaculture, intensive systems used for shrimp aquaculture create an artificial environment that increases bacterial growth. To maintain the productivity of such an intensive aquaculture, high inputs of fish protein have to be employed for feeding together with high levels of water exchange and the massive use of antibiotics/ probiotics / chemicals. It seems that the combination of these conditions favours the proliferation of vibrios and enhances their virulence and disease prevalence. The risk of a microbial infection is high, mainly at larval stages. The effect and severity are related to Vibrio species and dose, water, feed, shrimp quality and aquaculture management.Consumption of seafood can occasionally result in food-bome illnesses due to the proliferation of indigenous pathogens like Vibrio.Of the l2 pathogenic Vibrio species, 8 species are known to be directly food associated. Strict quality guidelines have been laid by the importing nations, for the food products that enter their markets. The microbiological quality requirement for export of frozen shrimp products is that V.cholerae, V.parahaemolyticus and V. vulnificus should be absent in 25g of the processed shrimp (Export Inspection Council of India, 1995). The mere presence of these pathogenic Vibrios is sufficient for the rejection of the exported product.The export rejections cause serious economic loss to the shrimp industry and might harm the brand image of the shrimp products from the countiy.There is a need for an independent study on the incidence of different pathogenic vibrios in shrimp aquaculture and investigate their biochemical characteristics to have a better understanding about the growth and survival of these organisms in the shrimp aquaculture niche. PCR based methods (conventional PCR, duplex PCR, multiplex-PCR and Real Time PCR) for the detection of the pathogenic Vibrios is important for rapid post-harvest quality assessment. Studies on the genetic heterogeneity among the specific pathogenic vibrio species isolated from shrimp aquaculture system provide; valuable information on the extent of genetic diversity of the pathogenic vibrios, the shrimp aquaculture system.So the present study was undertaken to study the incidence of pathogenic Vibrio spp. in Penaeus monodon shrimp hatcheries and aquaculture farms, to carry out biochemical investigations of the pathogenic Vibrio spp isolated from P. monodon hatchery and. aquaculture environments, to assess the effect of salt (NaCl) on the growth and enzymatic activities of pathogenic Vibrio spp., to study the effect of preservatives, and chemicals on the growth of pathogenic Vibrio spp. and to employ polymerase chain reaction (PCR) methods for the detection of pathogenic V ibrio spp.Samples of water (n=7) and post-larvae (n=7) were obtained from seven Penaeus monodon hatcheries and samples of water (n=5), sediment (n=5) and shrimp (n=5) were obtained from five P. monodon aquaculture farms located on the East Coast of lndia. The microbiological examination of water, sediment, post-larvae and shrimp samples was carried out employing standard methods and by using standard media.The higher bacterial loads were obtained in pond sediments which can be attributed to the accumulation of organic matter at the pond bottom which stimulated bacterial growth.Shrimp head. (4.78 x 105 +/- 3.0 x 104 cfu/g) had relatively higher bacterial load when compared to shrimp muscle 2.7 x 105 +/- 1.95 x 104 cfu/g). ln shrimp hatchery samples, the post-larvae (2.2 x 106 +/- 1.9 x 106 cfu/g) had higher bacterial load than water (5.6 x 103 +/- 3890 cfu/ml).The mean E.coli counts were higher in aquaculture pond sediment (204+/-13 cfu/g) and pond water (124+/-88 cfu/ml). Relatively lower Escherichia coli counts were obtained from shrimp samples (12+/-11 to 16+/-16.7 cfu/g). The presence of E.coli in aquaculture environment might have been from the source water. E.coli was not detected in hatchery waters and post-larvae.