Genetic characterization of Toxoplasma gondii isolates from eared doves (Zenaida auriculata) in Brazil

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Prevalence and geographical distribution of Toxoplasma gondii in dogs in the urban area of Botucatu, SP, Brazil

Toxoplasmosis is a worldwide zoonosis caused by Toxoplasma gondii, and can infect a wide variety of animals including humans. Domestic animals can be an important sentinel population for infection in the community. Occurrence of T. gondii infection was assessed in dogs in the urban area of Botucatu city, SP, Brazil. In the sample, 10% rate for error estimate, 95% confidence interval, and 5% significance level were established. Serum samples were collected from dogs during a rabies vaccination campaign, and were processed using modified agglutination test (MAT). Blood samples were collected from 670 dogs, with homogeneous distribution in five regions in the urban area, representing 3.74% of 17,910 animals vaccinated. In this sample, 17.3% (116/670) dogs (68 – 58.6% female and 48 – 41.4% male) were positive for T. gondii infection (p<0.03). Regarding age of the infected dogs 4.6% (4/88) were younger and 95.4% (84/88) were older than one year (p<0.01); the age of 28 positive animals were undetermined. The serum titers of anti-T. gondii antibodies were: 16 (69.8%; 81/116), 64 (13.8%; 16/116), 256 (15.5%; 18/116), and 1024 (0.9%; 1/116). Prevalence was distributed among the North 14.2% (19/134), South 18.0% (31/172), East 15.7% (19/121), West 21.6% (27/125), and Central 16.9% (20/118) regions of the municipality (p=0.5). In all these regions, females and dogs aged more than one year showed a higher occurrence of T. gondii infection (p<0.05).

Soroprevalência de anticorpos anti- Leptospira spp. e anti- Toxoplasma gondii em quatis (Nasua nasua) provenientes do Parque Ecológico do Tietê, São Paulo, Brasil

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Online Dictionary of Invertebrate Zoology: T

tabula tabular tachyauxesis tachyblastic tachygen tachygenesis tachytelic tactic tactile tactoreceptors taenia taeniate taenidium taenioglossate tagma tagmata tagmosis tail tailfan Takakura's talon talus tandem tangent tangoreceptor tanylobous tapetal tapetum tapinoma-odor Tardigrada tardigrades tarsal tarsation tarsite tarsomere tarsungulus tarsus taste tautonomy tautonym taxa taxes taxis taxis taxodont taxometrics taxon taxonomic taxonomist taxonomy tectiform tectostracum tectum teeth teges tegillum tegmen tegmentum tegula tegular tegulum tegumen tegument tegumentary tela telaform telamon telegonic teleiochrysalis telenchium teleoconch teleodont teleology teleotrocha telepod telescope telescopic teletrophic telioderma teliophan telmophage telocentric telodendria telofemur telogonic telolecithal telomitic telophase telophragma telopod telopodite telorhabdions telosonic telostome telosynapsis telosyndesis telotarsus telotaxis telotroch telson template temporal tenacipeds tenaculum tenent teneral tensor tentacle tentacular tentaculocyst tentaculozooid tentilla tentorial tentorium tenuous teratocyte teratogen teratogenesis teratogyne teratology terebella terebra terebrant terebrate teres terete terga tergal tergite tergolateral tergopleural tergopore tergum tergum termen terminal terminalia termitarium termitophile terranes terrestrial terricolous territory tertiary tertibrach tertibrachial tessellate test testaceology testaceous test-cross testes testis testisac testudinate tetanus tetany tetractinal tetractine tetrad tetradelphic tetramerous tetramorphic tetraploid tetrapod tetrapterous tetrasomic tetrathyridial tetrathyridium tetraxon tetraxonid thalassophilous thallus thamnophilous thanatocoenosis thanatosis theca thecae thecal thecate thelycum thelygenesis thelygenous thelyotokous thelyotoky theory thermocline thermophile thermophobe thermoreceptor thermotaxis thickness thigmotactic thigmotaxis thigmotropism third-form thoraces thoracic thoracomere thoracopod(ite) thorax thoraxes thread thylacium thylacogen thyridial thyridium thyroid thysanuriform tibia tibial tibiotarsal tibiotarsus Tiedemann's tiled timbal tinctorial tine tissue tissue titilla titillae titillator tocopherol tocospermal tocospermia tocostome tokostome tomentose tomentum Tomosvary tone tonic tonofibrillae tonus topochemical topogamodeme topomorph topomorphic toponym topotype tori torma tormogen tornote tornus torose torpid torqueate torsion tortuose torulose torus totipotent totomount toxa toxicognath toxicology toxin toxinosis toxoglossate toxoid trabecula trabeculate trabeculated trachea tracheae tracheal tracheate tracheoblast tracheolar tracheoles trachychromatic tract Tragardh's tragus transad transcoxa transcurrent transect transection transformation transient transitional translocation translucent transmission transposed transscutal transstadial transtilla transverse trapeziform trapezium trapezoid trema tremata Trematoda trenchant trepan triact triactinal triad triaene triage triangle triangular triangulate triaulic triaxial triaxon tribe tribocytic trichite trichobothrium trichobranchia trichobranchiate trichocerous trichodes trichodeum trichodragmata trichogen trichoid trichomes trichophore trichopore trichosors trichostichal trichotomous trichroism tricolumella tricomes tricostate tricrepid tricuspid tricuspidate tridactyl trident tridentate trifid trifurcate triglycerides trignathan trigonal trigoneutism trilabiate trilateral trilobate trilocular trimorphic trimorphism Trinominal triordinal tripartite tripectinate triplet triploblastic triploid triquetral triquetrous triradiate triradiates tritocerebral tritocerebrum tritocerebrum tritonymph tritosternum triturate triungulin triungulinid trivial trivium trivoltine trixenic troch trochal trochalopodous trochantellus trochanter trochanteral trochantin trochi trochiform trochlea trocholophous trochophore trochosphere trochus troglobiont troglodytic troglophile trogloxene tropeic trophal trophallactic trophallaxis trophamnion trophi trophic trophidium trophobiont trophobiont trophobiosis trophobiotic trophocytes trophodisc trophogeny trophoporic trophorhinium trophosome trophotaxis trophothylax trophozooid trophus tropis tropism tropotaxis trumpet truncate truncation trunk trypsin tryptic tryptophan tryptophane T-tubule tube tube-feet tubercle tubercula tuberculate tuberculose tuberiferous tubicolous tubifacient tubule tubulus tubus tuft Tullgren tumefaction tumescence tumid tumulus tunic tunica tunicary tunicate turbinate turgid turreted turriculate tychoparthenogenesis tylasters tylenchoid tyli tyloid tyloides tylosis tylostyle tylote tylus tymbal tympanal tympanal tympanic tympanum Tyndall type typhlosole typologist typolysis typostasis

Postural control in elderly women with osteoporosis: comparison of balance, strengthening and stretching exercises. A randomized controlled trial

Objective: To compare the efficacy of balance training associated with muscle strengthening or stretching, relative to no intervention, in the postural control of elderly women with osteoporosis. Design: A randomized, controlled trial. Subjects and interventions: Sample consisted of 50 women aged 65 years or older, with osteoporosis, randomized into one of three groups: strengthening group (n = 17) performed balance training with muscle strengthening; stretching group (n = 17) performed balance training with stretching; and control group (n = 16), no activities. Interventions lasted eight weeks, twice a week, 60 minutes a day. Main measures: Postural control was evaluated by the modified Clinical Test of Sensory Interaction for Balance (CTSIBm) and Limits of Stability Test. Strength was assessed by dynamometry and the shortening of the hamstrings by goniometry. Results: Relative to controls, participants in the strengthening group displayed significantly increased dorsiflexion strength and knee flexion strength, as well as centre of pressure velocity, directional control, and oscillation velocity (CTSIBm test). The stretching group had significantly improvements in hamstring length, knee flexion strength, centre of pressure velocity, and amplitude of movements. Relative to the stretching group, the strengthening group yielded better knee extension strength and directional control. Conclusion: The results suggest that both interventions are effective in improving postural control when compared to the control group, and the strengthening group was superior to the stretching group in knee extension strength and in directional control.

Serologic and molecular diagnostic and bioassay in mice for detection of Toxoplasma gondii in free ranges chickens from Pantanal of Mato Grosso do Sul

Holsback L., Pena H.F.J., Ragozo A., Lopes E. G., Gennari S. M. & Soares R. M. 2012. Serologic and molecular diagnostic and bioassay in mice for detection of Toxoplasma gondii in free range chickens from Pantanal of Mato Grosso do Sul. Pesquisa Veterinaria Brasileira 32(8): 721-726. Setor de Veterinaria e Producao Animal, Universidade Estadual do Norte do Parana, Campus Luiz Meneghel, Rodovia BR 369 Km 54, Bandeirantes, PR 86360-000, Brazil. E-mail: lhsfertonani@uenp.edu.br The aim of this study was to investigate the occurrence of Toxoplasma gondii and compare the results obtained in the Modified Agglutination Test (MAT), Polimerase Chain Reaction (PCR) and bioassay in mice. In order to accomplish this, 40 free-range chickens from eight farms in neighboring areas to the Pantanal in Nhecolandia, Mato Grosso do Sul, were euthanized and blood samples, brain and heart were collected. The occurrence of anti-T. gondii antibodies found in chickens was 67.5% (27 samples), considering as a cutoff point the dilution 1:5. Among the samples analyzed, 7 (25.9%) were positive in the dilution 1: 5, 3 (11.1%) in 1: 10, 2 (7.4%) in 1: 20, 3 (11.1%) in 1: 320, 1 (3.7%) in 1: 640, 3 (11.1%) in 1: 1280, 2 (7.4%) in 1: 2560, 4 (14.8%) in 1: 5120 and 2 (7.4%) in 1: 10.240. From the mixture of tissue samples (brain and heart) from the chickens analyzed, 16 (40%) presented electrophoretic bands compatible with T. gondii by PCR (gene B1). In the comparison of techniques, 59.26% positivity in PCR was revealed among animals that were seropositive in MAT (cutoff 1: 5). From 141 inoculated mice, six (4.44%) died of acute toxoplasmosis between 15 and 23 days after inoculation. Surviving mice were sacrificed at 74 days after inoculation, and a total of 28 cysts were found in the brains of 10 distinct groups. From the seropositive hens, 27 bioassays were performed and 11 (40.7%) isolates were obtained. A greater number of isolations happened in mice that were inoculated with tissues from chickens that had high titers for anti-T. gondii antibodies. Chronic infection in mice was observed in nine groups (33.3%) from five different properties. Among the surviving mice, 25.6% were positive for T. gondii in MAT (1: 25). From mice positive in PCR, 87.5% were also positive in MAT. Among the PCR-negative mice, 5.2% were positive for T. gondii in MAT. It can be concluded through this study that the occurrence of infecton by T. gondii in the rural properties studied was high, that PCR directed to gene B1 does not confirm the viability of the parasite, but it can be used as a screening method for the selection of chickens infected by T. gondii, that the animals with titer greater than 10 must be prioritized for the selection of animals for bioassay, since for them, the chances of isolating the parasite are greater and that seroconversion in experimentally infected mice is not a good indicator for isolating the agent.

OCCURRENCE OF ANTIBODIES TO TOXOPLASMA GONDII AND LEPSTOSPIRA SPP. IN MANATEES (TRICHECHUS INUNGUIS) OF THE BRAZILIAN AMAZON

The presence of Toxoplasma gondii and Leptospira spp. antibodies was investigated in 74 manatees (Trichechus inunguis [Mammalia: Sirenia]) kept in captivity in two rescue units in the northern region of Brazil. Antibodies to T gondii were detected in 29 (39.2%) of 74 animals by using the modified agglutination test (titer, 1:25). For antibodies against Leptospira spp., sera were diluted 1:50 and tested against 24 strains of leptospires by microscopic agglutination microtechnique, and positive samples were end titrated. Twenty-three (31.1%) of 74 animals were reactive to four serovars (Patoc 21/23, Castellonis 2/23, Icterohaemorrhagiae 1/23, and Butembo 1/23), with titers ranging from 100 to 1,600. This is the first report of antibodies against T gondii and Leptospira spp. in T. inunguis from the Brazilian Amazon.

Seroprevalence and isolation of Toxoplasma gondii from free-range chickens from Espirito Santo state, southeastern Brazil

Prevalence of Toxoplasma gondii infection in 510 free-range (FR) chickens (380 from 33 small farms, and 130 from a slaughter house for FR chickens) from Espirito Santo state, southeastern Brazil, was investigated. Antibodies to T. gondii were sought using commercial indirect haemagglutination (IHAT, Imuno-HAI Toxo (R), Wama Diagnostica, Sao Paulo, Brazil, cut-off 1:16) and the modified agglutination test (MAT, cut-off 1:25) tests. Attempts were made to isolate viable T. gondii from seropositive chickens by bioassay in mice. Pooled samples of brain, heart and quadriceps muscle of one thigh (total 40 g) from 64 chickens with IHAT titers of >= 1:16 were minced, digested in pepsin and bioassayed in mice. Antibodies to T. gondii were found in 40.4% (206/510) FR chickens by IHAT (titer >= 1:16) and 38.8% (198/510) by MAT (titer >= 1:25); concordance between IHAT and MAT was 81.6% (kappa index = 0.614). Viable T. gondii was isolated (designated TgCkBr234-281) from 48 of 64(75%) seropositive (IHAT titers >= 1:32) FR chickens. Most isolates of T. gondii were virulent for mice; 100% of mice inoculated with 44 of 48 isolates died of toxoplasmosis within 30 days post inoculation (p.i). An epidemiological investigation revealed that people living in rural areas have little knowledge about the parasite and about the risk of acquiring it from raw meat. Results indicated that the locally available IHAT was useful for screening of chicken sera for T. gondii antibodies. (C) 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.

Hydrodynamics and solid dosage form disintegration/dissolution : immediate release tablets and novel in situ polyelectrolyte gastroretentive drug delivery systems

Solid oral dosage form disintegration in the human stomach is a highly complex process dependent on physicochemical properties of the stomach contents as well as on physical variables such as hydrodynamics and mechanical stress. Understanding the role of hydrodynamics and forces in disintegration of oral solid dosage forms can help to improve in vitro disintegration testing and the predictive power of the in vitro test. The aim of this work was to obtain a deep understanding of the influence of changing hydrodynamic conditions on solid oral dosage form performance. Therefore, the hydrodynamic conditions and forces present in the compendial PhEur/USP disintegration test device were characterized using a computational fluid dynamics (CFD) approach. Furthermore, a modified device was developed and the hydrodynamic conditions present were simulated using CFD. This modified device was applied in two case studies comprising immediate release (IR) tablets and gastroretentive drug delivery systems (GRDDS). Due to the description of movement provided in the PhEur, the movement velocity of the basket-rack assembly follows a sinusoidal profile. Therefore, hydrodynamic conditions are changing continually throughout the movement cycle. CFD simulations revealed that the dosage form is exposed to a wide range of fluid velocities and shear forces during the test. The hydrodynamic conditions in the compendial device are highly variable and cannot be controlled. A new, modified disintegration test device based on computerized numerical control (CNC) technique was developed. The modified device can be moved in all three dimensions and radial movement is also possible. Simple and complex moving profiles can be developed and the influence of the hydrodynamic conditions on oral solid dosage form performance can be evaluated. Furthermore, a modified basket was designed that allows two-sided fluid flow. CFD simulations of the hydrodynamics and forces in the modified device revealed significant differences in the fluid flow field and forces when compared to the compendial device. Due to the CNC technique moving velocity and direction are arbitrary and hydrodynamics become controllable. The modified disintegration test device was utilized to examine the influence of moving velocity on disintegration times of IR tablets. Insights into the influence of moving speed, medium viscosity and basket design on disintegration times were obtained. An exponential relationship between moving velocity of the modified basket and disintegration times was established in simulated gastric fluid. The same relationship was found between the disintegration times and the CFD predicted average shear stress on the tablet surface. Furthermore, a GRDDS was developed based on the approach of an in situ polyelectrolyte complex (PEC). Different complexes composed of different grades of chitosan and carrageenan and different ratios of those were investigated for their swelling behavior, mechanical stability, and in vitro drug release. With an optimized formulation the influence of changing hydrodynamic conditions on the swelling behavior and the drug release profile was demonstrated using the modified disintegration test device. Both, swelling behavior and drug release, were largely dependent on the hydrodynamic conditions. Concluding, it has been shown within this thesis that the application of the modified disintegration test device allows for detailed insights into the influence of hydrodynamic conditions on solid oral dosage form disintegration and dissolution. By the application of appropriate test conditions, the predictive power of in vitro disintegration testing can be improved using the modified disintegration test device. Furthermore, CFD has proven a powerful tool to examine the hydrodynamics and forces in the compendial as well as in the modified disintegration test device. rn

Verhalten von Recycling-Materialien in der Umwelt : Labor- und Feldversuche

Im Baugewerbe fallen jährlich mehrere Millionen Tonnen an Baureststoffen an, die nach erfolgter Aufbereitung als Recycling-Baustoffe erneut verwendet werden können. Allerdings besteht Unklarheit hinsichtlich der Stofffreisetzung aus Recycling-Materialien sowie der Parameter, die zur Beurteilung im Wesentlichen heranzuziehen sind. Des Weiteren gilt es der Frage nachzugehen, welche Laborversuche eine realistische Prognose zum Stoffaustrag unter Freilandbedingungen ermöglichen. Ein Ergebnisvergleich aus Feld- und Laborversuchen mit Recycling-Materialien zeigt, dass weder Ammoniumnitrat-Extraktion, pH-stat Versuch noch S4- und Modifizierter S4-Test genauere Prognosen zum Stoffaustrag unter Freilandbedingungen ermöglichen. Mit einem Langzeit-Standtest sowie Schüttelversuchen mit unterschiedlichen Wasser/Feststoff-Verhältnissen lässt sich der Einfluss durch verschiedene Korngrößen sowie Materialabrieb besser kontrollieren. Diese Versuchskombination erlaubt Rückschlüsse auf die Löslichkeit und Verfügbarkeit von Stoffen in den Recycling-Materialien. Die Ergebnisse aus Säulenversuchen weisen auf eine gute Vergleichbarkeit mit den Feldversuchen hin, was sich an denselben vorherrschenden Prozessen bei der Freisetzung für eine Reihe von Stoffen zeigt. Bei mehreren Stoffen treten ähnliche Konzen-trationshöchstwerte bei Säulen- und Feldversuch auf, ebenso zeigt der Vergleich aufsummierter Massenanteile für den Säulenversuch, dass bei einer Reihe von Stoffen eine grobe Abschätzbarkeit für eine Langzeitprognose unter Freilandbedingungen existiert. Als wesentliche Parameter für die Stofffreisetzung aus den Recycling-Materialien sind neben CO2-Einfluss und pH-Wert ebenfalls Temperatureinfluss, Material-Heterogenität sowie einzusetzende Korngröße anzusehen.

Seropositivity and Risk Factors Associated with Toxoplasma gondii Infection in Wild Birds from Spain

Toxoplasma gondii is a zoonotic intracellular protozoan parasite of worldwide distribution that infects many species of warm-blooded animals, including birds. To date, there is scant information about the seropositivity of T. gondii and the risk factors associated with T. gondii infection in wild bird populations. In the present study, T. gondii infection was evaluated on sera obtained from 1079 wild birds belonging to 56 species (including Falconiformes (n = 610), Strigiformes (n = 260), Ciconiiformes (n = 156), Gruiformes (n = 21), and other orders (n = 32), from different areas of Spain. Antibodies to T. gondii (modified agglutination test, MAT titer ≥1:25) were found in 282 (26.1%, IC95%:23.5–28.7) of the 1079 birds. This study constitute the first extensive survey in wild birds species in Spain and reports for the first time T. gondii antibodies in the griffon vulture (Gyps fulvus), short-toed snake-eagle (Circaetus gallicus), Bonelli's eagle (Aquila fasciata), golden eagle (Aquila chrysaetos), bearded vulture (Gypaetus barbatus), osprey (Pandion haliaetus), Montagu's harrier (Circus pygargus), Western marsh-harrier (Circus aeruginosus), peregrine falcon (Falco peregrinus), long-eared owl (Asio otus), common scops owl (Otus scops), Eurasian spoonbill (Platalea leucorodia), white stork (Ciconia ciconia), grey heron (Ardea cinerea), common moorhen (Gallinula chloropus); in the International Union for Conservation of Nature (IUCN) “vulnerable” Spanish imperial eagle (Aquila adalberti), lesser kestrel (Falco naumanni) and great bustard (Otis tarda); and in the IUCN “near threatened” red kite (Milvus milvus). The highest seropositivity by species was observed in the Eurasian eagle owl (Bubo bubo) (68.1%, 98 of 144). The main risk factors associated with T. gondii seropositivity in wild birds were age and diet, with the highest exposure in older animals and in carnivorous wild birds. The results showed that T. gondii infection is widespread and can be at a high level in many wild birds in Spain, most likely related to their feeding behaviour.

ModelDB in Computational Neuroscience Education - A research tool as interactive educational media

ModelDB's mission is to link computational models and publications, supporting the field of computational neuroscience (CNS) by making model source code readily available. It is continually expanding, and currently contains source code for more than 300 models that cover more than 41 topics. Investigators, educators, and students can use it to obtain working models that reproduce published results and can be modified to test for new domains of applicability. Users can browse ModelDB to survey the field of computational neuroscience, or pursue more focused explorations of specific topics. Here we describe tutorials and initial experiences with ModelDB as an interactive educational tool.

Psychophysiological evidence for the genuineness of swimming-style colour synaesthesia

Recently, swimming-style colour synaesthesia was introduced as a new form of synaesthesia. A synaesthetic Stroop test was used to establish its genuineness. Since Stroop interference can occur for any type of overlearned association, in the present study we used a modified Stroop test and psychophysiological synaesthetic conditioning to further establish the genuineness of this form of synaesthesia. We compared the performance of a swimming-style colour synaesthete and a control who was trained on swimming-style colour associations. Our results showed that behavioural aspects of swimming-style colour synaesthesia can be mimicked in a trained control. Importantly, however, our results showed a psychophysiological conditioning effect for the synaesthete only. We discuss the theoretical relevance of swimming-style colour synaesthesia according to different models of synaesthesia. We conclude that swimming-style colour synaesthesia is a genuine form of synaesthesia, can be mimicked behaviourally in non-synaesthetes, and is best explained by a re-entrant feedback model.

Stiffness, Strength, and Failure Modes of Implant-Supported Monolithic Lithium Disilicate Crowns: Influence of Titanium and Zirconia Abutments

PURPOSE The objective of this study was to evaluate stiffness, strength, and failure modes of monolithic crowns produced using computer-aided design/computer-assisted manufacture, which are connected to diverse titanium and zirconia abutments on an implant system with tapered, internal connections. MATERIALS AND METHODS Twenty monolithic lithium disilicate (LS2) crowns were constructed and loaded on bone level-type implants in a universal testing machine under quasistatic conditions according to DIN ISO 14801. Comparative analysis included a 2 × 2 format: prefabricated titanium abutments using proprietary bonding bases (group A) vs nonproprietary bonding bases (group B), and customized zirconia abutments using proprietary Straumann CARES (group C) vs nonproprietary Astra Atlantis (group D) material. Stiffness and strength were assessed and calculated statistically with the Wilcoxon rank sum test. Cross-sections of each tested group were inspected microscopically. RESULTS Loaded LS2 crowns, implants, and abutment screws in all tested specimens (groups A, B, C, and D) did not show any visible fractures. For an analysis of titanium abutments (groups A and B), stiffness and strength showed equally high stability. In contrast, proprietary and nonproprietary customized zirconia abutments exhibited statistically significant differences with a mean strength of 366 N (Astra) and 541 N (CARES) (P < .05); as well as a mean stiffness of 884 N/mm (Astra) and 1,751 N/mm (CARES) (P < .05), respectively. Microscopic cross-sections revealed cracks in all zirconia abutments (groups C and D) below the implant shoulder. CONCLUSION Depending on the abutment design, prefabricated titanium abutment and proprietary customized zirconia implant-abutment connections in conjunction with monolithic LS2 crowns had the best results in this laboratory investigation.

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.