211 resultados para Udp-galnac


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Lääkeainemetabolialla tarkoitetaan entsymaattisia reaktioita, jotka muuttavat lääkeaineita paremmin elimistöstä poistuvaan muotoon. Lääkeaineet voivat vaikuttaa toistensa metaboliaan inhiboimalla tai indusoimalla metaboloivia entsyymejä. Tällaisten interaktioiden seurauksena lääkeaineen pitoisuus elimistössä voi kasvaa jopa toksiseksi tai vähentyä merkittävästi. Tämä on erityisesti ongelmana silloin, kun käytössä on useita lääkkeitä samanaikaisesti. Lääketutkimuksessa onkin keskitytty tällaisten interaktioiden ennustamiseen ja niitä yritetään välttää tai ainakin vähentää. Työssä tutkittiin medetomidiinia, jonka on äskettäin havaittu metaboloituvan UDP-glukuronosyylitransferaasien (UGT) välityksellä. Työn tarkoituksena oli löytää medetomidiinin glukuronidaatiota inhiboivia yhdisteitä. Lisäksi haluttiin selvittää mahdollisen inhibition mekanismeja. On yleistä tutkia tietyn entsyymin substraatin interaktioita muiden saman perheen entsyymien kanssa. On kuitenkin harvinaisempaa tutkia tällaisia interaktioita kahden eri entsyymiperheen välillä. Tässä työssä tutkittiin inhiboivatko mahdolliset sytokromi P450 -entsyymiä (CYP) inhiboivat yhdisteet myös medetomidiinia glukuronoivia UDP-glukuronosyylitransferaaseja. Glukuronidaation inhibitiota tutkittiin HPLC-menetelmällä, joka on kehitetty aiemmin medetomidiinin glukuronidaation tutkimiseen. Aluksi glukuronidaatiota tutkittiin ilman inhibiittoreita. Tämän jälkeen tutkittiin kolmen mahdollisen inhibiittoriyhdisteen vaikutuksia medetomidiinin glukuronidaatioon ja tuloksia verrattiin ilman inhibiittoria saatuihin tuloksiin. Kolmen tutkitun yhdisteen havaittiin inhiboivan medetomidiinin glukuronidaatiota. Tutkimuksessa havaittiin myös mielenkiintoinen ilmiö, jossa inhibiittoriyhdisteen sitoutuminen aiheutti entsyymikineettisiä muutoksia UDP-glukuronosyylitransferaasin toiminnassa. On mielenkiintoista, että samat yhdisteet inhiboivat sekä CYP- että UGT-metaboliaa. Tulosten perusteella voidaan päätellä, että jos CYP ja UGT metaboloivat samaa yhdistettä, on mahdollista että yhdisteen rakenteelliset analogit aiheuttavat interaktioita molempien entsyymien kanssa. Uusia lääkeaineita kehitettäessä onkin otettava huomioon yleisesti tunnettujen CYP-entsyymien lisäksi myös UGT:t ja niiden mahdolliset yhteisvaikutukset.

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Nucleoside di- and triphosphates and adenosine regulate several components of the mucocilairy clearance process (MCC) that protects the lung against infections, via activation of epithelial purinergic receptors. However, assessing the contribution of individual nucleotides to MCC functions remains difficult due to the complexity of the mechanisms of nucleotide release and metabolism. Enzymatic activities involved in the metabolism of extracellular nucleotides include ecto-ATPases and secreted nucleoside diphosphokinase (NDPK) and adenyl kinase, but potent and selective inhibitors of these activities are sparse. In the present study, we discovered that ebselen markedly reduced NDPK activity while having negligible effect on ecto-ATPase and adenyl kinase activities. Addition of radiotracer gamma P-32]ATP to human bronchial epithelial (HBE) cells resulted in rapid and robust accumulation of P-32]-inorganic phosphate ((32)Pi). Inclusion of UDP in the incubation medium resulted in conversion of gamma P-32]ATP to P-32]UTP, while inclusion of AMP resulted in conversion of gamma P-32]ATP to P-32]ADP. Ebselen markedly reduced P-32]UTP formation but displayed negligible effect on (32)Pi or P-32]ADP accumulations. Incubation of HBE cells with unlabeled UTP and ADP resulted in robust ebselen-sensitive formation of ATP (IC50=6.9 +/- 2 mu M). This NDPK activity was largely recovered in HBE cell secretions and supernatants from lung epithelial A549 cells. Kinetic analysis of NDPK activity indicated that ebselen reduced the V-max of the reaction (K-i=7.6 +/- 3 mu M), having negligible effect on KM values. Our study demonstrates that ebselen is a potent noncompetitive inhibitor of extracellular NDPK.

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We consider the simplest IEEE 802.11 WLAN networks for which analytical models are available and seek to provide an experimental validation of these models. Our experiments include the following cases: (i) two nodes with saturated queues, sending fixed-length UDP packets to each other, and (ii) a TCP-controlled transfer between two nodes. Our experiments are based entirely on Aruba AP-70 access points operating under Linux. We report our observations on certain non-standard behavior of the devices. In cases where the devices adhere to the standards, we find that the results from the analytical models estimate the experimental data with a mean error of 3-5%.

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In this paper, we study how TCP and UDP flows interact with each other when the end system is a CPU resource constrained thin client. The problem addressed is twofold, 1) the throughput of TCP flows degrades severely in the presence of heavily loaded UDP flows 2) fairness and minimum QoS requirements of UDP are not maintained. First, we identify the factors affecting the TCP throughput by providing an in-depth analysis of end to end delay and packet loss variations. The results obtained from the first part leads us to our second contribution. We propose and study the use of an algorithm that ensures fairness across flows. The algorithm improves the performance of TCP flows in the presence of multiple UDP flows admitted under an admission algorithm and maintains the minimum QoS requirements of the UDP flows. The advantage of the algorithm is that it requires no changes to TCP/IP stack and control is achieved through receiver window control.

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Helburuak: Ariketa-bilduma honen helburu nagusia bikoitza da, 'Telekomunikazio-sare eta zerbitzuak' (2001eko ikasketa-planetako Telekomunikazio Ingeniaritza Teknikoetako 2. mailan irakasten zena) eta 'Telekomunikazio-sare eta zerbitzuak I' (1995eko ikasketa-planetako Telekomunikazio Ingeniaritzako 2. mailan irakasten zena) irakasgaietako ikasleentzat (hortaz, ikasketarako) zein irakasleentzat (hots, irakaskuntzarako) lagungarri izatea. Horregatik, teorian ikasitako kontzeptuen aplikazio praktikoa islatzen duten ariketak dira bilduma honetakoak. Aipatutako irakasgaien konplexutasuna dela eta, liburu hau, 'Telekomunikazio-sare eta zerbitzuak: Teoria' testu-liburuaren lagungarri gisa argitaratu dugu. Norentzat izan daiteke baliagarria: 2001eko ikasketa-planetako Telekomunikazio Ingeniaritza Teknikoetako 2. mailan irakasten zen 'Telekomunikazio-sare eta zerbitzuak' eta 1995eko ikasketa-planetako Telekomunikazio Ingeniaritzako 2. mailan irakasten zen 'Telekomunikazio-sare eta zerbitzuak I' irakasgaietako ikasleentzat zein irakasleentzat.

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Mannose receptor (MR) is widely expressed on macrophages, immature dendritic cells, and a variety of epithelial and endothelial cells. It is a 180 kD type I transmembrane receptor whose extracellular region consists of three parts: the amino-terminal cysteine-rich domain (Cys-MR); a fibronectin type II-like domain; and a series of eight tandem C-type lectin carbohydrate recognition domains (CRDs). Two portions of MR have distinct carbohydrate recognition properties: Cys-MR recognizes sulfated carbohydrates and the tandem CRD region binds terminal mannose, fucose, and N-acetyl-glucosamine (GlcNAc). The dual carbohydrate binding specificity allows MR to interact with sulfated and nonsulfated polysaccharide chains, and thereby facilitating the involvement of MR in immunological and physiological processes. The immunological functions of MR include antigen capturing (through binding non-sulfated carbohydrates) and antigen targeting (through binding sulfated carbohydrates), and the physiological roles include rapid clearance of circulatory luteinizing hormone (LH), which bears polysaccharide chains terminating with sulfated and non-sulfated carbohydrates.

We have crystallized and determined the X-ray structures of unliganded Cys-MR (2.0 Å) and Cys-MR complexed with different ligands, including Hepes (1.7 Å), 4SO_4-N-Acetylgalactosamine (4SO_4-GalNAc; 2.2 Å), 3SO_4-Lewis^x (2.2 Å), 3S04-Lewis^a (1.9 Å), and 6SO_4-GalNAc (2.5 Å). The overall structure of Cys-MR consists of 12 anti-parallel β-strands arranged in three lobes with approximate three fold internal symmetry. The structure contains three disulfide bonds, formed by the six cysteines in the Cys-MR sequence. The ligand-binding site is located in a neutral pocket within the third lobe, in which the sulfate group of ligand is buried. Our results show that optimal binding is achieved by a carbohydrate ligand with a sulfate group that anchors the ligand by forming numerous hydrogen bonds and a sugar ring that makes ring-stacking interactions with Trpll7 of CysMR. Using a fluorescence-based assay, we characterized the binding affinities between CysMR and its ligands, and rationalized the derived affinities based upon the crystal structures. These studies reveal the mechanism of sulfated carbohydrate recognition by Cys-MR and facilitate our understanding of the role of Cys-MR in MR recognition of its ligands.

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[ES]La interoperabilidad entre distintas redes ferroviarias europeas es muy escasa. Para dar solución a este problema, la Unión Europea creó el sistema europeo de gestión del tráfico ferroviario (ERTMS), encargado de crear un estándar único para toda la red europea. El objetivo de este proyecto es la implementación del sistema ETCS ( European Train Control System ) en un entorno cliente-servidor. La implementación incluye el sistema del tren y el del centro de control (RBC). Se ha implementado de forma que se pueda operar sobre dos protocolos de red transporte, de forma que será compatible tanto para redes orientadas a la conexión (TCP) como no orientadas a conexión (UDP).

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Apesar do desenvolvimento de novas drogas antifúngicas e da sua utilização como terapia profilática visando à prevenção de infecções fúngicas invasivas, estas ainda constituem-se num problema emergente, com elevadas taxas de mortalidade. Neste contexto, destaca-se a aspergilose invasiva, uma infecção fúngica oportunista que acomete pacientes com neutropenia profunda e prolongada, principalmente os pacientes com leucemia aguda ou submetidos a transplante de medula óssea. Aspergillus fumigatus, um fungo filamentoso, é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, sendo um patógeno angioinvasivo. As hifas deste fungo são capazes de causar injúria e ativação endotelial, induzindo o endotélio a um fenótipo pró-trombótico, que por sua vez, é mediado pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, em especial, o TNF-α. O presente trabalho teve como objetivo estudar a capacidade de cepas mutantes de A. fumigatus em ativar células endoteliais, avaliando o perfil de secreção de citocinas em meio condicionado e a expressão de fator tecidual. Resumidamente, monocamadas confluentes de células endoteliais isoladas da veia umbilical humana foram incubadas com conídios e tubos germinativos de cepas selvagens (Af293 e Ku80) e mutantes (Δugm1, ΔcalA, ΔcrzA, ΔprtT) de A. fumigatus. A taxa de adesão e endocitose destas cepas às monocamadas de HUVEC foi avaliada a partir de um ensaio quantitativo de imunofluorescência diferencial. O perfil cinético de secreção de citocinas foi determinado em meio condicionado das HUVECs, por ensaio de multiplex para IL-6, IL-8 e TNF-α. A ativação endotelial, por sua vez, foi determinada pela expressão de fator tecidual por RT-PCR em tempo real. Os resultados obtidos demonstraram que a mutante para o gene ugm1, responsável por codificar a enzima UDP-galactopiranose mutase, que converte resíduos de galactopiranose a galactofuranose, apresentou um fenótipo hiperaderente às células endoteliais e um estímulo 10 vezes maior à secreção de TNF-α e 2,5 vezes maior a secreção de IL-6, quando comparada a ativação observada para as cepas selvagens. A galactofuranose é um componente importante de glicoconjugados da parede celular de A. fumigatus. Dessa forma, a ausência desse monossacarídeo na célula fúngica leva a um mecanismo compensatório caracterizado por um aumento na expressão de moléculas de galactosaminogalactana na parede celular. De maneira contrária, mutantes para os genes calA e crzA, apresentaram um fenótipo hipoaderente às HUVECs e uma perda na capacidade de induzir a secreção de citocinas e ativar o endotélio. Essas mutantes apresentam deleções que interferem na via de cálcio/calcineurina, responsável por regular a morfogênese e virulência de A. fumigatus, além de apresentarem alterações no conteúdo de beta-1-3 glucana. Já a cepa ΔprtT, mutante para o fator de transcrição prtT que regula a secreção de múltiplas proteases, apresentou um fenótipo de adesão, estímulo e ativação endotelial semelhante ao observado para as cepas selvagens. A comparação entre a capacidade de conídios e tubos germinativos em ativar células endoteliais, corroborou achados anteriores da literatura que reportam que só hifas são capazes de ativar células endoteliais, independentemente da sua viabilidade. Os dados deste estudo permitiram concluir que dentre os componentes de superfície celular de A. fumigatus, os polímeros de galactose, em especial a galactosaminogalactana, parecem ser responsáveis, pelo menos em parte, pelos mecanismos de interação e ativação endotelial.

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花粉管是种子植物受精过程中的雄性生殖单位的载体,由于其生长依赖于胞内Ca2+梯度,并具有典型的顶端极性生长的特点,因而成为近年来研究植物细胞相互识别、胞内和胞外信号传导理想的模式系统。裸子植物花粉与被子植物相比具有萌发时间长、生长缓慢等特点。Ca2+在裸子植物花粉萌发和花粉管生长中的作用机制目前尚不明确。本研究以裸子植物白皮松(Pinus bungeana)的花粉为材料,运用不同浓度钙通道抑制剂Nifedipine(Nif)处理,对其花粉萌发和花粉管生长进行了细胞学研究和蛋白质组学分析,以探讨Ca2+对白皮松花粉生长的调控机制,为进一步揭示裸子植物花粉萌发和花粉管生长机理提供参考。 本论文首先研究了钙通道抑制剂Nif和Ca2+螯合剂EGTA对白皮松花粉萌发和花粉管生长的影响。结果表明,用Nif处理花粉后,花粉萌发和花粉管生长均受到明显抑制。经Ca2+荧光探针Fluo-3AM标记,对Nif处理后Ca2+在花粉管中的分布模式进行了观察,发现Ca2+在正常生长的花粉管中呈梯度分布,并在其顶端的荧光最强。与对照相比,处理后的花粉管荧光强度明显减弱,且顶端Ca2+梯度消失。通过EGTA漂洗后的花粉粒,在正常培养基上萌发率较高,但其生长速率受到抑制。由此说明了细胞壁钙库对花粉管生长的抑制效应显著高于对花粉萌发的影响,是花粉管生长的限速因子。同时外加钙调素还可逆转EGTA对其花粉萌发和花粉管生长的抑制。上述结果表明,白皮松花粉萌发及花粉管生长需要外源Ca2+的内流,以及胞内形成的Ca2+浓度梯度。 用FM4-64探针标记结果发现,正常花粉管中的胞吞作用主要发生在顶端和亚顶端区域,胞吞的小泡也集中分布在这两个区域。经Nif处理后,既不影响花粉管的胞吞过程,同时胞吞发生的位置也与对照相似,只是胞吞的小泡分散于整个花粉管中。电子显微镜观察表明,各种细胞器在白皮松正常生长的花粉管中分布与被子植物存在较大差异,例如前者无明显地分区现象,不具胼胝质塞。白皮松花粉管顶端和亚顶端的壁旁体与质膜融合现象频繁发生。花粉管经Nif处理后,线粒体出现不同程度的解体和液泡化,内质网液泡化和核糖体脱落,液泡大量聚集在花粉管顶端,壁旁体与膜融合现象减少,以及花粉管壁明显变薄等。此外,通过微丝特异性探针鬼笔环肽标记结果表明,正常生长花粉管的微丝呈长轴向排列, Nif处理后微丝断裂,其断裂程度与处理浓度有关。由此可见,外源Ca2+对花粉管的胞吞无明显抑制或促进作用,但对胞吞小泡重回收可能有影响。当胞内Ca2+梯度消失后,则明显抑制了微丝骨架的聚合,进而使胞吐作用减缓,高尔基体分泌小泡聚集,多种细胞器液泡化,引起花粉管顶端膨大,细胞壁变薄,继而抑制花粉管的正常生长。 运用免疫荧光标记技术显示,正常生长的花粉管壁含有纤维素、胼胝质、果胶质和阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs),其中纤维素和胼胝质在细胞壁上呈均匀分布,而酸性果胶质只存在花粉管两侧壁上,酯化果胶分布于花粉管顶端。经过Nif处理后,胼胝质和酸性果胶质均在花粉管顶端累积,而AGPs和纤维素的分布却无明显变化。另外,傅里叶红外光谱分析结果也同样支持上述结论。通过花粉管壁蛋白的SDS-PAGE分析表明,Nif对细胞壁蛋白的合成也有较大的影响。 在花粉管的钙通道受到抑制后,应用蛋白质组学技术分析其蛋白质的表达图谱,通过双向电泳已分离出约1000个蛋白质斑点,经软件分析发现,除其中50个蛋白斑点外,大部分蛋白质的表达量均未发生变化。上述50个发生变化的蛋白斑点酶切后,再经过ESI-MS/MS鉴定和质谱数据库的搜索,共鉴定出28个蛋白,其中12个为上调蛋白,16个下调蛋白,根据其主要功能分为与代谢、细胞扩展、翻译后修饰以及信号相关的蛋白。经过Nif处理后,花粉管中碳水化合物代谢能力下降,ATP的产生受到抑制,参与细胞壁多糖合成及小泡运输的蛋白,如valosin containing protein(VCP)、reversibly glycolsylated polypeptide(RGP)、UDP-glucose dehydrogenase (UDPGDH)和α-tubulin表达下调。另外,通过上述方法还鉴定出与丝氨酸/苏氨酸激酶保守结构域同源的受体蛋白激酶等。 综上所述,白皮松花粉管钙通道受到抑制后,通过影响花粉管蛋白的表达,抑制微丝微管骨架的组装,致使胞吐速度变慢,花粉管壁酸性果胶质、胼胝质等多糖分布的变化及总多糖含量的减少,最终抑制了花粉管的正常生长。

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花粉是高度退化的两细胞或三细胞生物体。作为雄配子体,花粉储藏了父本的全部遗传信息,并通过与柱头识别、萌发和花粉管极性生长将精子送到雌性的胚囊中,完成双受精作用。由于花粉在植物有性生殖过程中的特殊作用和花粉管极性生长的独特细胞学过程,几十年来一直被作为研究这一系列精细细胞学过程的模式,但是其中关键事件的分子机制并不十分清楚。 我们利用蛋白质组学技术鉴定了水稻成熟花粉三个不同组分(花粉外被蛋白、花粉外被/细胞壁相关和可释放蛋白、花粉内在蛋白)中表达的共322种蛋白质。其中,参与信号转导(10%)、细胞壁重塑和代谢(11%)、蛋白质代谢(14%)以及糖类和能量代谢(25%)的蛋白质被高度代表。并且很多是首次被在成熟花粉中得到鉴定的具有重要功能的蛋白质,包括蛋白激酶、受体激酶相互作用蛋白、GDP解聚抑制因子、含有C2结构域蛋白质和亲环蛋白等参与信号转导的蛋白质,eIF4A、线粒体加工肽酶、UFD1和AAA+ATP酶等参与蛋白质合成、装配和降解的蛋白质,以及逆糖基化多肽、似纤维素合酶OsCsLF7等参与细胞壁重塑和代谢的蛋白质等。生物信息学分析表明,在我们鉴定的蛋白质中有11%的蛋白质功能未知并且不含有任何已知的功能结构域。另外,我们利用从头测序技术鉴定了5种新蛋白质。这些首次在花粉中被鉴定的蛋白质、未知功能蛋白质和新蛋白质在花粉萌发过程中的生物学功能值得进一步研究。 进而,我们利用比较蛋白质组学技术获得了水稻花粉体外萌发过程中差异表达的160个鉴定结果(代表120种蛋白质),生物信息学分析表明它们隶属于13个功能类群。其中,参与细胞壁代谢(占24%,如UDP-葡萄糖焦磷酸化酶和第三类过氧化物酶)、蛋白质代谢(占11%,如eIF4A和20S蛋白酶体的亚基)、细胞骨架动力学(占8%,如肌动蛋白、微管蛋白和profilin)和胁迫反应(占7%,如抗坏血酸过氧化物酶)以及糖类和能量代谢(占24%)的蛋白质被高度代表。共有94个鉴定结果(73种蛋白质)在花粉萌发过程中表达丰度上调,包括几乎全部参与蛋白质代谢的蛋白质,多数参与细胞骨架动态变化和离子转运的蛋白质,以及部分参与糖类和能量代谢的蛋白质等。并且有53个鉴定结果(41种蛋白质)可能在萌发过程中被释放到培养基中(柱头上),可能参与了柱头细胞和花粉管通道细胞细胞壁的松弛和水解(如第三类过氧化物酶家族成员、多聚半乳糖醛酸酶、1,4-beta-木聚糖酶和一些花粉过敏源蛋白),或者参与了花粉.柱头的信号识别过程(如钙网蛋白和含有C2结构域的蛋白)。有8种传统认为是参与糖类和能量代谢的酶可能在萌发过程中被释放到培养基中(柱头上),如烯醇酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸甘油酸激酶。 同时,我们发现在鉴定的成熟花粉表达的蛋白质中,有23%的蛋白质以多个同工型的形式存在,并且有29种蛋白质的多个同工型的表达丰度在萌发过程中发生变化。它们主要参与了细胞壁代谢、糖类和能量代谢、细胞骨架、胁迫反应和离子运输等代谢过程。我们利用荧光染色技术,检测到其中14种蛋白质可能被磷酸化或者糖基化修饰。这意味着由于翻译后修饰形成的同工型蛋白质在花粉萌发和花粉管生长过程中具有重要作用。 总之,我们以水稻为模式研究其成熟花粉和萌发花粉的蛋白质表达特征,首次报道了单子叶植物成熟花粉不同组分中表达的蛋白质及其功能类群特征,并且首次报道了被子植物花粉萌发过程中表达丰度变化蛋白质的功能类群特征,为进一步揭示花粉萌发和花粉管生长的分子机制提供了重要的蛋白质水平信息。

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Ⅰ 虎杖聚酮类化合物生物合成相关基因的克隆及功能分析 虎杖 (Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc) 属于蓼科蓼属多年生草本植物,在中国和日本民间曾被广泛用于动脉粥样硬化、高血压、咳嗽、化脓性皮肤炎以及淋病的治疗,具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰等功效。而在现代医学上最令人瞩目和具有发展前景的是其在抗肿瘤、心血管保护、抗氧化方面的作用,相关疗效主要来自于虎杖中结构迥异、种类丰富的聚酮化合物及其衍生物资源。这些聚酮类化合物主要包括蒽醌、大黄素、大黄素-甲醚、大黄酚、芪类以及类黄酮化合物等。其中,大部分聚酮类化合物生物合成途径机制尚不明确,但可以肯定的是植物类型III聚酮合酶type III polyketide synthases (PKSs) 在这些聚酮化合物的生物合成起始反应中行使着关键的作用。因此,除了我们所熟悉的类黄酮化合物、芪类化合物之外,进一步分离和分析虎杖中其它重要聚酮类化合物生物合成所涉及的类型III聚酮合酶基因的是非常值得期待的。 目前,已经有14个植物类型III PKS基因被克隆和功能分析。植物类型III PKS的共同特征包括基因结构、序列相似性、保守的活性中心、酶学性质以及共同的催化机制等。显花植物(裸子植物和被子植物)中,植物类型III PKS的基因结构绝对保守,除了一个早期报道的金鱼草(Antirrhinum majus)查尔酮合酶chalcone synthase (CHS) 含有第二个内含子外,迄今为止所有已知的植物类型III PKS基因均含有一个内含子且该内含子位置保守。有趣的是,在本研究中,两个含有3个内含子的类型III PKS基因从虎杖中被分离,且两个基因3个内含子的位置完全保守,这是三内含子类型III PKS基因首次得到分离。除了新奇的基因结构外,体外功能分析显示上述两个基因还具有特殊的酶学性质和功能。 本论文围绕上述2个三内含子基因开展了以下工作: 虎杖中一个由三内含子基因编码的新型类型III聚酮合酶 一个类型III PKS的cDNA及其相应的基因(PcPKS2)从药用植物虎杖中被克隆。序列分析结果表明,PcPKS2的开放阅读框被3个内含子分隔,这是一个出人意料的发现,因为截至到目前为止,除了金鱼草一个CHS基因外,所有已知的类型III PKS基因均在固定位置上含有一个内含子。除了特殊的基因结构外,PcPKS2显示了一些有趣的特性:(i) CHS“守卫”苯丙氨酸——Phe215和Phe265在PcPKS2中双双缺失,它们分别被亮氨酸和半胱氨酸取代;(ii) 体外功能分析结果表明,当酶促反应体系的pH值为6.5-8.5时,大肠杆菌中过表达的重组PcPKS2高效地合成丁烯酮非环化产物——4-香豆酰甘油酸内酯(4-coumaroyltriacetic acid lactone (CTAL))为主产物,而丙烯酮非环化产物bis-noryangonin (BNY) 以及苯亚甲基丙酮为副产物;而当酶促反应体系的pH值为9.0时,PcPKS2高效地合成苯亚甲基丙酮为主产物,而CTAL、BNY为副产物。另外,除了上述3种产物外,在不同的pH条件下,还有痕量的柚皮素查尔酮能被检测到。此外,在4-香豆酰辅酶A(4-coumaroyl-CoA)的类似化合物中,除了4-香豆酰辅酶A外,只有feruloyl-CoA能够被PcPKS2接受作为起始底物。PcPKS2不接受脂肪酰辅酶A——异丁酰基辅酶A(isobutyryl-CoA)、异戊酰基辅酶A(isovaleryl-CoA)以及乙酰辅酶A(acetyl-CoA)作为起始底物。Southern blot杂交结果表明,在虎杖基因组中存在2-4个PcPKS2基因的拷贝。Northern blot杂交结果表明,在根茎和幼叶中,PcPKS2表达量很高,而在根中无表达。叶中的PcPKS2的表达受病原菌诱导,但不受伤诱导。 虎杖中一个编码双功能类型III聚酮合酶的三内含子基因的鉴定 显花植物中,所有已知的类型III PKS 基因均含有一个内含子且位置绝对保守。本研究中,综合运用PCR技术,从富含聚酮类化合物的植物虎杖中克隆得到一个类型III PKS 基因(PcPKS1)及其cDNA。序列分析结果表明,PcPKS1含有3个内含子。系统发育分析结果表明,PcPKS1与其它植物的CHSs归为一类。然而,体外功能分析结果表明,当酶促反应体系pH值为7.0时,大肠杆菌中过表达的重组PcPKS1高效地合成柚皮素查尔酮(naringenin)为单一产物;而当pH值为9.0时,苯亚甲基丙酮(p-hydroxybenzalacetone)几乎为重组PcPKS1的唯一产物。后续的研究表明,与典型的CHSs相比,PcPKS1具有另外一些不同的特点:在pH值为9.0时(PcPKS1的苯亚甲基丙酮合成活性最适pH值),在4-香豆酰辅酶A的类似化合物中,只有feruloyl-CoA能够被PcPKS1接受作为起始底物。与CHSs展现出的对脂肪酰辅酶A宽泛的底物特异性不同,在不同的pH条件下,PcPKS1不接受异丁酰基辅酶A(isobutyryl-CoA)、异戊酰基辅酶A(isovaleryl-CoA)以及乙酰辅酶A(acetyl-CoA)作为起始底物。以上数据指出重组PcPKS1是一个具有查尔酮合酶(CHS)和苯亚甲基丙酮合酶(BAS)活性的双功能酶。Southern blot杂交结果表明,在虎杖基因组中存在2-4个PcPKS1基因的拷贝。Northern blot杂交结果表明,PcPKS1可能在防御病原菌和草食动物方面起着重要作用。PcPKS1和PcPKS2共同从虎杖中被分离的事实极有可能暗示了苯丁烷类化合物(phenylbutanoid)及其衍生物存在于虎杖中。 Ⅱ 高山红景天酪醇生物合成代谢途径机制研究 高山红景天(Rhodiola sachalinensis A. Bor)是景天科(Crassulaceae)红景天属多年生草本植物,作为一种适应原性中草药在中国的应用史已经超过800年。最近红景天提取物作为一种重要的商业药用制剂资源,其应用遍及欧洲、亚洲和美国,其主要治疗范围包括抗变应性和消炎,提高心理机敏性等。目前已经非常明确,红景天甙(salidroside)和甙元酪醇(tyrosol)是红景天属植物的主要功效成分,主要分布于这类植物的根中并且具有抗缺氧、抗疲劳、延缓衰老、预防紫外线辐射伤害等功效。红景天甙为酪醇8-O-β-D葡萄糖甙,是酪醇在葡萄糖基转移酶UDP-glucosyltransferase (UGT) 的催化下糖基化后形成的,可以认为是酪醇在植物体内的贮存形式。酪醇作为一种重要的活性分子,同样存在于橄榄树和葡萄酒中。 虽然已经非常明确酪醇来自于莽草酸代谢途径,然而其具体的生物合成途径及其调控仍不明确。总结以往的报道,在酪醇的生物合成上主要存在两种观点:一是酪醇可能来自于苯丙烷代谢途径产生的4-香豆酸(4-coumaric acid)前体;二是来自于酪氨酸的酪胺(tyramine)可能是酪醇生物合成的直接前体。我们的工作兴趣主要围绕着鉴别高山红景天中的酪醇生物合成途径展开: 高山红景天内源苯丙氨酸解氨酶PALrs1的过表达对红景天甙积累的影响 红景天甙是来自于药用植物高山红景天的一种适应原性新型药物,其生物合成途径可能起始于苯丙氨酸或酪氨酸。由于高山红景天野生植物资源的匮乏和相对含量很低,阐明红景天甙的生物合成途径对于增加红景天甙的供给至关重要。在我们以前的工作中,运用cDNA末端快速扩增技术(RACE),一个编码苯丙氨酸解氨酶phenylalanine ammonia-lyase (PAL)的cDNA从高山红景天中被克隆,命名为PALrs1。在本研究中,PALrs1置于35S启动子+Ω增强子序列的控制下通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化回高山红景天。PCR 和 PCR–Southern blot分析结果表明,PALrs1已经整合到了转基因植物的基因组上。Northern blot杂交结果表明,PALrs1已经获得在转录水平上的高水平表达。与预期的结果相同,高效液相色谱High-performance liquid chromatography (HPLC)测定结果显示PALrs1的过表达引起4-香豆酸含量增长3.3倍。然而,与之相反的是,酪醇和红景天甙含量与对照相比反而分别下降4.7和7.7倍。此外,我们发现PALrs1的过表达造成酪氨酸含量下降2.6倍。这些数据暗示着PALrs1的过表达和4-香豆酸的积累并不能促进酪醇的生物合成。酪醇,作为一种苯乙烷类衍生物并非来自苯丙氨酸,而酪氨酸含量的下降则极有可能是酪醇生物合成和红景天甙积累大规模下降的直接原因。

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水稻既是我国三大粮食作物之一,又是基因组学研究的模式材料,在生产实践和科学研究中都占有极其重要的地位。基因组学研究取得的巨大成就以前所未有的深度和广度推动了生命科学各个研究领域的飞速发展。水稻基因组的破译是水稻科学研究的重要里程碑,同时也宣告了功能基因组学时代的到来。蛋白质组学是研究细胞内全部蛋白质的动态表达及其相互关系的新兴学科,是功能基因组学研究的重要组成部分和战略制高点。 本论文采用高分辨率的蛋白质双向电泳分离技术和高通量的蛋白质质谱分析技术以及生物信息学等手段,开展水稻灌浆期茎蛋白质组表达模式和水稻幼苗脱黄化过程的比较蛋白质组学研究,探讨茎生长发育规律和水稻应答光信号相关蛋白质及其网络调控机制,是学科前沿与实际应用的有机结合,在科研和生产实践中都具有重要的意义。 首先,分别构建了灌浆期水稻顶端茎段和水稻黄化幼苗的蛋白质组表达谱。并对其中185个目的蛋白点进行了MALDI-TOF/MS分析和数据库检索鉴定。共有149个蛋白质得到了鉴定,蛋白质鉴定的成功率为80.5%。这些被鉴定的蛋白质分属118个基因的表达产物,根据它们功能可以分为13种不同的类别,其中绝大多数为能量产生和代谢以及抗性相关的蛋白质。 在水稻灌浆期顶端茎段表达的蛋白质中,与能量和物质代谢相关的蛋白质例如ATPase、磷酸丙糖异构酶,6-磷酸葡萄糖异构酶等占有很高比例,说明茎段组织中具有很强的代谢活动。与生长发育相关的蛋白质包括beta-tubulins、无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase)、液泡质子ATP酶(vacuolar proton-ATPase)以及UDP葡萄糖焦磷酸酶等的大量累积,显示出顶端茎段细胞分裂和生长迅速;同时,贮存多糖和结构多糖也在旺盛合成。G蛋白、GDP释放抑制因子等信号传导蛋白以及苯丙氨酸氨解酶、谷胱苷肽S转移酶(glutathione S-transferase,GST)、抗坏血酸过氧化酶(ascorbate peroxidase,APX)以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等抗性相关蛋白质在该时期丰度表达,表明在灌浆期水稻顶端茎段能够迅速感受并传递外界信号,从而使得其在遭受胁迫时能够立刻启动抗逆防御系统,最大限度地降低不利环境对种子发育的影响。 在黑暗中萌发和生长的水稻黄化幼苗随着光照时间(0~24小时)的延长,能通过双向电泳后检测到的蛋白质逐渐变少,24小时后趋于稳定,相当于正常光照条件下生长的水稻幼苗蛋白质组表达谱。进一步分析表明,在黄化苗中,分解代谢及能量产生相关的蛋白如丙糖磷酸异构酶、琥珀酰辅酶A连接酶、异戊酰辅酶A脱氢酶与ATPase等的表达量比较丰富;另外,还可能启动了脂肪酸的α氧化分解途径,以供黑暗中生长所需的物质和能量。当黄化幼苗光照后,与光合作用及物质合成相关的一些蛋白质表达量增加,而那些分解代谢相关酶类则有所下降。同时,鸟核苷酸结合蛋白β亚基类似蛋白、20S proteasome以及Bowman Birk trypsin inhibitor等信号传递及抗性相关蛋白随着光照时间的延长而减少,说明黑暗胁迫条件下水稻幼苗启动了相关的抗逆途径。叶绿素合成途径中的蛋白酶胆色素原脱氨基酶和金属鳌合酶在脱黄化过程中表达量有所下降,可能是因为叶绿素合成产物具有反馈抑制作用。 本研究首次利用蛋白质组学方法来解析水稻灌浆期茎蛋白质组表达模式和水稻黄化幼苗响应光因子的蛋白质组变化情况,鉴定了一些有价值的蛋白质,并得到了它们的表达特点和相关数据,为更好地理解水稻顶端茎秆的生长特点和功效、水稻应答黑暗胁迫和光形态建成以及光合作用机理等提供了分子证据。

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分离提取海洋无脊椎动物贻贝(Crenomytilus grayanus)凝集素,考察其抗HIV活性。采用半乳糖-Sepharose 6B亲和层析和Sephacryl S-200层析分离提取贻贝凝集素(Crenomytilus grayanus lectin,CGL),以光镜检查合胞体抑制试验,以ELSA测定HIVp24抗原表达水平。从海洋无脊椎动物贻贝中分离出的凝集素(CGL),为N-乙酰半乳糖胺/半乳糖(GalNAc/Gal)特异性的凝集素。CGL在27.88mg.L-1浓度时,对HIV诱导细胞病变的抑制达50%;在45.70mg.L-1时,对HIV-1复制的抑制达50%;同时在35.12mg.L-1浓度时,对HIV感染细胞融合的阻断达50%。

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Using degenerate primers based on conserved regions of the UDP-glucose dehydrogenase (UDPGDH) gene, an initial 476-bp DNA fragment was amplified from the water-bloom forming cyanobacterium, Microcystis aeruginosa FACHB 905. TAIL-PCR and ligation-mediated PCR were used to amplify the flanking regions to isolate an about 2.5-kb genomic DNA fragment. Sequence analysis revealed an ORF encoding a putative 462 amino acid protein, designated Mud for Microcystis UDPGDH. The Mud amino acid sequence is closely related to UDPGDH sequences from cyanobacterium Synechocystis PCC6803 (73% identity, 81% similarity), and bacterium Bacillus subtilis (51% identity and 67% similarity). The cloned mud gene was expressed in Escherichia coli using the pGEX-4T-1 fusion expression vector system to generate a GST-Mud fusion protein that exhibited UDPGDH activity. The cytosolic fraction of M aeruginosa FACHB 905 was subjected to Western analysis with an anti-Mud antibody, which revealed a single band of approximately 49 kD, consistent with the deduced molecular mass of the enzyme. The Mud protein could thus be characterized as a UDP-glucose dehydrogenase, which was a key enzyme for polysaccharide synthesis and has, for the first time, been studied in algae.

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Silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) samples were collected from five selected sites that represent diverse levels of downgraded persistent organic pollutants (POPs) contamination in Ya-Er Lake in October 1999. Hepatic ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) and UDP glucuronosyltransferase (UDPGT) activities, hepatosomatic index (HSI), hepatic retinoids, serum thyroid hormones were measured. It was found that hepatic retinol and serum free 3,5,3'- tetraiodothyronine (FT3) significantly increased (P < 0.01) when both hepatic EROD and UDPGT activities significantly declined (P < 0.01) from pond 1 to 5 with decrease in the degree of pollution. This significant negative correlation (P < 0.01) suggests that the persistent organochlorinated contaminants could induce hepatic EROD and UDPGT activities, alter retinoid and thyroid hormone homeostasis, and finally lead to the reduction of retinol and FT3, the two biologically active forms of retinoids and thyroid hormone in silver carp of Ya-Er Lake. (C) 2002 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.