Toll-like receptor 3 gene polymorphisms are not associated with the risk of hepatitis B and hepatitis C virus infection

INTRODUCTION: The present study investigated the prevalence of two single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in the Toll-like receptor 3 (TLR3) gene in patients infected with hepatitis B virus (HBV) and hepatitis C virus (HCV). METHODS: Samples collected from HCV (n = 74) and HBV (n = 35) carriers were subjected to quantitative real-time PCR (qPCR) to detect the presence of the SNPs rs5743305 and rs3775291 in TLR3 and to measure the following biomarkers: alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), and prothrombin time (PT). A healthy control group was investigated and consisted of 299 HCV- and HBV-seronegative individuals. RESULTS: No significant differences in allele, genotype and haplotype frequencies were observed between the investigated groups, and no association was observed between the polymorphisms and histopathological results. Nevertheless, genotypes TA/AA (rs5743305) and GG (rs3775291) appear to be associated with higher levels of ALT (p<0.01), AST (p<0.05) and PT (p<0.05). In addition, genotypes TT (rs5743305; p<0.05) and GG (rs3775291; p<0.05) were associated with higher GGT levels. CONCLUSIONS: This genetic analysis revealed the absence of an association between the polymorphisms investigated and susceptibility to HBV and HCV infection; however, these polymorphisms might be associated with a greater degree of biliary damage during the course of HCV infection.

Complexos Organometálicos: caracterização preliminar de compostos de vanádio e de moléculas libertadoras de CO como potenciais fármacos

Vários complexos metálicos têm sido explorados visando uma melhoria de atuais tratamentos das mais variadas doenças. Os compostos de vanádio apresentam uma capacidade de mimetizar a ação da insulina, insurgindo-se assim como uma aposta no tratamento da doença Diabetes mellitus. O monóxido de carbono (CO), outrora visto como apenas um agente tóxico, atualmente é explorado pelas suas capacidades anti-inflamatórias, tendo-se desenvolvido moléculas libertadoras de CO, os CORMs, de modo a tirar partido dos seus efeitos biológicos. Com vista a determinar a formação de aductos entre os complexos organometálicos de vanádio e diferentes proteínas e caracterizar o tipo de interação estabelecida recorreu-se à Cristalografia de raios-X. A estrutura cristalográfica do aducto VOIV(picolinato)2–tripsina bovina foi obtida a 1,09 Å de resolução, mostrando o complexo VOIV(pic)2 no centro ativo da enzima, coordenado à cadeia lateral da serina catalítica (Ser195), numa geometria octaédrica. Ensaios cinéticos preliminares realizados com o complexo VO(pic)2 foram efetuados para determinar potenciais efeitos inibitórios na atividade das enzimas lisozima da clara do ovo (HEWL) e tripsina. O potencial terapêutico dos CORMs associado à Nanotecnologia foi explorado para o [Ru(CO)3Cl(glicinato)] (CORM-3), visando desenvolver nanopartículas de ouro (AuNPs) funcionalizadas com o composto e diferentes proteínas. A toxicidade celular direta do CORM-3, bem como alguns potenciais efeitos biológicos de CORM-3–albumina de soro humano (BSA) e CORM-3–HEWL foram também avaliados, recorrendo a ensaios de viabilidade celular , riscados celulares, e RT-qPCR em várias linhas celulares tumorais e linha primária de fibroblastos humanos. Foi possível iniciar o desenvolvimento de nanosistemas de AuNPs@PEG@BSA e AuNPs@PEG@HEWL, seguindo-se futuramente a conjugação com o CORM-3. Não foi possível determinar o efeito anti-inflamatório do CORM-3 e seus conjugados através da análise dos genes de resposta por RT-qPCR em tempo real, no entanto determinou-se que o composto CORM-3 não possui toxicidade em linhas celulares tumorais, e que aparenta fomentar a regeneração celular em fibroblastos e células tumorais NINA, sendo este efeito potenciado aquando conjugação com BSA.

Avaliação do envolvimento das bombas de efluxo na fármaco-resistência ao Praziquantel em Schistosoma Mansonii

O Praziquantel (PZQ) é o fármaco de primeira linha no tratamento da schistosomose, com alta taxa de cura e sem efeitos secundários significativos. Têm sido reportados cada vez mais casos de resistência ou de aumento de tolerância a este fármaco, aumentando as preocupações de emergência de estirpes resistentes ao PZQ. O Verapamil, um bloqueador de canais de cálcio, inibe o fluxo de fármaco activo e tem sido descrito como um bom inibidor das glicoproteínas-P (P-gp), sendo, por isso, utilizado em diversos estudos de fármaco-resistência. No laboratório de Helmintologia da Unidade de Ensino e Investigação em Parasitologia Médica do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, foi seleccionada uma linha de S. mansoni, resistente a 800 mg/Kg de PZQ, após pressão de fármaco constante e crescente ao longo de vários ciclos. Para confirmar a existência de diferenças polimórficas entre a estirpes sensível e resistente de S. mansoni, extraiu-se o DNA de parasitas adultos de ambas as estirpes de S. mansoni e analisou-se por Random Amplified Polymorphic DNAPolymerase Chain Reaction (RAPD-PCR). As diferenças polimórficas entre a estirpe sensível e a resistente foram observadas e calculou-se o coeficiente de similaridade (Dice’s coefficient). Após confirmar a existência de polimorfismos entre as duas estirpes, a atividade das bombas de efluxo foi avaliada em ambas as estirpes. A avaliação foi realizada num ensaio de acumulação usando o composto Brometo de Etídio na presença e ausência de Verapamil. O papel das bombas de efluxo na resistência ao PZQ, foi ainda investigado comparando a resposta dos parasitas da estirpe sensível e resistente ao fármaco na ausência e na presença de diferentes doses de Verapamil, em cultura in vitro. Os resultados obtidos foram reforçados comparando os níveis e expressão do gene SmMDR2 em ambas as estirpes isogénicas por Real-Time PCR (qPCR). A estirpe resistente de S. mansoni, necessitou de concentrações mais elevadas de inibidor quando comparada com a estirpe sensível para obter níveis significativos de fluorescência de Brometo de Etídio. A cultura in vitro mostrou uma dose letal de PZQ mais elevada na estirpe resistente do que na estirpe sensível na ausência de Verapamil. Na presença de Verapamil houve uma redução na dose letal de PZQ nos machos de ambas as estirpes, sendo esta redução mais acentuada nos machos da estirpe resistente. As fêmeas não mostraram alterações significativas na dose letal de PZQ na presença e ausência e inibidor. Os resultados foram reforçados pela observação dos níveis do gene SmMDR2, onde os machos da estirpe resistente mostraram ter os maiores níveis de expressão e pelo aumento de expressão nos machos de ambas as estirpes após exposição ao PZQ. As fêmeas de ambas as estirpes não tiveram diferenças significativas na expressão do gene após exposição ao PZQ e as fêmeas da estirpe resistente tiveram mostraram ter os níveis de expressão do gene SmMDR2 mais baixos entre os machos e fêmeas de ambas as estirpes. Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que os machos da estirpe resistente têm maior atividade de bombas de efluxo do que os machos da estirpe sensível e que as bombas P-gp estão envolvidas na resposta e no aumento de tolerância dos machos de S. mansoni ao PZQ.

Clinical decisions in breast cancer, a heterogenous disease

RESUMO: Introdução: Tratamento do carcinoma da mama Este trabalho inicia-se com a história do tratamento do carcinoma da mama, desde os primeiros documentos que descrevem doentes com carcinoma da mama até 1950. Desde 1950 até 2000 o diagnóstico, risco e as modalidades terapêuticas usadas no tratamento das doentes são mais detalhadas com ênfase nas terapêuticas locais, regionais e sistémicas. Parte 1:Quem tratar com terapêutica sistémica adjuvante Capítulo 1: A classificação TNM não está morta no carcinoma da mama Tem sido dito que a classificação TNM não é adequada para usar como ferramenta de prognóstico e decisão terapêutica no carcinoma da mama, especialmente em doentes com carcinoma detectado através de rastreio, que tem geralmente menores dimensões. A razão desta classificação não ser adequada prendese com o facto de não estarem incluidos parâmetros biológicos na classificação TNM atual. Pusemos a hipótese de que numa população com alta percentagem de carcinoma da mama não detectado em exames de rastreio, com uma mediana de idade baixa e com alta percentagem de estadios II e III, o estadiamento clássico, pela classificação TNM, é mais descriminatório que as características biológicas na determinação do prognóstico. Para isto analisámos uma população de doentes com carcinoma da mama tratados consecutivamente na mesma instituição, durante 10 anos. Caracterizámos os fatores de prognóstico do estadiamento clássico incluídos na classificação TNM e as variantes biológicas, presentemente não incluídas na classificação TNM. Quantificámos a capacidade de cada um dos factores de prognóstico para para prever a sobrevivência. A população é de 1699 doentes com carcinoma da mama que foram tratádos com terapêutica sistémica adjuvante. Individualmente, cada um dos fatores de prognostico, clássicos ou biológicos, diferem significativamente entre doentes que sobrevivem e que não sobrevivem. Explicitamente, como previsto, doentes com tumores maiores, envolvimento dos gânglios axilares, estadios TNM mais avançados, que não expressam recetor de esrogéneo, com amplificação do gene Her2, triplos negativos ou de menor diferenciação têm menor sobrevida. Na análise multivariada, só os fatores de prognostico da classificação TNM, o grau histológico e a amplificação do gene Her2, esta última com menos significância estatistica são preditores independentes de sobrevivência. Capítulo 2: Em busca de novos factores de prognostico: Poder preditivo e mecanismo das alterações de centrossomas em carcinoma da mama Compilámos inúmeros grupos de experiências de genómica feitas em tumores primários de doentes com carcinoma da mama para as quais existe informação prognóstica. Estas experiências são feitas com o objectivo de descobrir novos factores de prognóstico. Reanalisámos os dados, repetindo a mesma pergunta: Quais são os genes com expressão diferencial estatisticamente significativa entre doentes que recaíram e doentes que não recaíram. Identificámos 65 genes nestas condições e o MKI67, o gene que codifica a proteina Ki67, estava nesse grupo. Identificámos vários genes que se sabe estarem envolvidos no processo de agregação de centrossomas. O gene que considerámos mais promissor foi a kinesina KiFC1, que já tinha sido identificada como regulador da agregação de centrossomas. Anomalias cetrossomais numéricas e estruturais têm sido observadas em neoplasias. Há dados correlacionando anolmalias centrossomais estruturais e e numéricas com o grau de malignidade e os eventos precoces da carcinogénese. Mas estas anomalias centrossomais têm um peso para a célula que deve adapatar-se ou entrará em apoptose. Os nossos resultados sugerem que existe um mecanismo adaptativo, a agregação de centrossomas, com impacto prognóstico negativo. O nosso objetivo foi quantificar o valor prognóstico das anomalias centrossomais no carcinoma da mama. Para isto usámos material de doentes dos quais sabemos a história natural. Avaliámos os genes de agregação de centrossomas, KIFC1 e TACC3, nas amostras tumorais arquivadas em parafina: primeiro com PCR (polymerase chain reaction) quantitativa e depois com imunohistoquímica (IHQ). Apenas a proteína KIFC1 foi discriminatória em IHQ, não se tendo conseguido otimizar o anticorpo da TACC3. Os níveis proteicos de KIFC1 correlacionam-se com mau prognóstico. Nas doentes que recaíram observámos, no tumor primário, maior abundância desta proteína com localização nuclear. Em seguida, demonstrámos que a agregação de centrossomas é um fenómeno que ocorre in vivo. Identificámos centrossomas agregados em amostras de tumores primários de doentes que recaíram. Tecnicamente usámos microscopia de fluorescência e IHQ contra proteínas centrossomais que avaliámos nos tumores primários arquivados em blocos de parafina. Observámos agregação de centrossomas num pequeno número de doentes que recaíram, não validámos, ainda, este fenótipo celular em larga escala. Parte 2: Como tratar com terapêutica sistémica os vários subtipos de carcinoma da mama Capítulo 3: Quantas doenças estão englobadas na definição carcinoma da mama triplo negativo? (revisão) O carcinoma da mama triplo negativo é um tumor que não expressa três proteínas: recetor de estrogénio, recetor de progesterona e o recetor do fator de crescimento epidermico tipo 2 (Her2). As doentes com estes tumores não são ainda tratadas com terapêutica dirigida, possivelmente porque esta definição negativa não tem ajudado. Sabemos apenas as alterações genéticas que estes tumores não têm, não as que eles têm. Talvez por esta razão, estes tumores são o subtipo mais agressivo de carcinoma da mama. No entanto, na prática clínica observamos que estas doentes não têm sempre mau prognóstico, além de que dados de histopatologia e epidemiologia sugerem que esta definição negativa não está a capturar um único subtipo de carcinoma da mama, mas vários. Avaliámos criticamente esta evidência, clínica, histopatológica, epidemiológica e molecular. Há evidência de heterogeneidade, mas não é claro quantos subtipos estão englobados nesta definição de carcinoma da mama triplo negativo. A resposta a esta pergunta, e a identificação do fundamento molecular desta heterogeneidade vai ajudar a melhor definir o prognóstico e eventualmente a definir novos alvos terapêuticos nesta população difícil. Capítulo 4: Terapêuica sistémica em carcinoma da mama triplo negativo (revisão) A quimioterapia é a única terapêutica sistémica disponível para as doentes com carcinoma da mama triplo negativo, ao contrário dos outros dois subtipo de carcinoma da mama que têm com a terapêutica antiestrogénica e anti Her2, importantes benefícios. Apesar de terem surgido várias opções terapêuticas para estes doentes nennhuma terapêutica dirigida foi validada pelos ensaios clínicos conduzidos, possivelmente porque a biologia deste carcinoma ainda não foi elucidada. Muitos ensaios demonstram que os tumores triplos negativos beneficiam com quimioterapia e que as mais altas taxas de resposta patológica completa à terapêutica neoadjuvante são observadas precisamente nestes tumors. A resposta patológica completa correlaciona-se com a sobrevivência. Estamos a estudar regimes adjuvantes específicos para doentes com estes tumors, mas, neste momento, regimes de terceira geração com taxanos e antraciclinas são os mais promissores. O papel de subgrupos de fármacos específicos, como os sais de platina, mantémse mal definido. Quanto às antraciclinas e taxanos, estes grupos não mostraram beneficio específico em carcinoma da mama triplo negativo quando comparado com os outros subtipos. Os próprios carcinomas da mama triplos negativos são heterogéneos e carcinomas da mama basais triplos negativos com elevada taxa de proliferação e carcinomas da mama triplos negativos surgidos em doentes com mutação germinal BRCA1 poderão ser mais sensíveis a sais de platino e menos sensíveis a taxanos. Como a definição molecular ainda não foi explicada a busca de terapêutica dirigida vai continuar. Capítulo 5: Ensaio randomizado de fase II do anticorpo monoclonal contra o recetor do fator de crescimento epidérmico tipo 1 combinado com cisplatino versus cisplatino em monoterapia em doentes com carcinoma da mama triplo negativo metastizado O recetor do fator de crescimento epidérmico tipo 1 está sobre expresso nos tumores das doentes com carcinoma da mama triplo negativo metastizado, um subtipo agressivo de carcinoma da mama. Este ensaio investigou a combinação de cetuximab e cisplatino versus cisplatino isolado em doentes deste tipo. Doentes em primeira ou segunda linha de terapêutica para doença metastizada foram randomizadas, num sistema de 2 para 1, para receber até 6 ciclos da combinação de cisplatino e cetuximab ou cisplatino isolado. Às doentes randomizadas para o braço de monoterapia podiamos, após progressão, acrescentar cetuximab ou tratá-las com cetuximab isolado. O objetivo primário foi a taxa de resposta global. Os objetivos secundários foram a sobrevivência livre de doença, a sobrevivência global e o perfil de segurança dos fármacos. A população em análise foram 115 doentes tratadas com a combinação e 58 doentes tratadas com cisplatino em monoterapia, 31 destas em quem se documentou progressão passaram a ser tratadas com um regime que incluía cetuximab, isolado ou em combinação. A taxa de resposta global foi de 20% no braço da combinaçao e de 10% no braço da monoterapia (odds ratio, 2.13). A sobrevivência livre de doença foi de 3.7 meses no braço da combinação e de 1.5 meses no braço em monoterapia (hazard ratio, 0.67). A sobrevivência global foi de 12.9 meses no braço da combinação versus 9.4 meses no braço de cisplatino. Conclui-se que, apesar de não ter sido alcançado o objectivo primário, acrescentar cetuximab, duplica a resposta e prolonga tanto a sobrevivência livre de doença como a sobrevivência global. Capítulo 6: Bloquear a angiogénese para tratar o carcinoma da mama (revisão) A angiogénese é uma característica que define a neoplasia, porque tumores com mais de 1mm precisam de formar novos vasos para poderem crescer. Desde que se descobriram as moléculas que orquestram esta transformação, que se têm procurado desenvolver e testar fármacos que interfiram com este processo. No carcinoma da mama o bevacizumab foi o primeiro fármaco aprovado pela FDA em primeira linha para tratar doença metastática. Depois foram estudados um grupo de inibidores de tirosina cinase associados aos recetores transmembranares envolvidos na angiogénese como o VEGFR, PDGFR, KIT, RET, BRAF e Flt3: sunitinib, sorafenib, pazopanib e axitinib Neste capítulo, analisaram-se e resumiram-se os dados dos ensaios clínicos das drogas anti-angiogénicas no tratamaneto do carcinoma da mama. Os ensaios de fase III do bevacizumab em carcinoma da mama mostraram uma redução na progressão de doença de 22 a 52% e aumento da sobrevivência livre de doença de 1.2 a 5.5 meses mas nunca foi demonstrado prolongamento de sobrevivência. Os ensaios de fase III em carcinoma da mama adjuvante com bevacizumab são dois e foram ambos negativos. O ensaio de fase III com o inibidor da tirosina cinase, sunitinib foi negativo, enquanto que os ensaios de fase II com os inibidores da tirosina cinase sorafenib e pazopanib melhoraram alguns indicadores de resposta e sobrevivência. A endostatina foi testada no contexto neoadjuvante com antraciclinas e melhorou a taxa de resposta, mas, mais ensaios são necessários para estabelecer este fármaco. A maioria dos ensaios clínicos dos agentes antiangiogénicos em carcinoma da mama reportaram aumento da taxa de resposta e de sobrevivência livre de doença mas nunca aumento da sobrevivência global quando comparado com quimioterapia isolada o que levou ao cepticismo a que assistimos atualmente em relação ao bloqueio da angiogénese. Ensaios clínicos selecionados em doentes específicas com objetivos translacionais relacionados com material biológico colhido, preferefencialmente em diferentes intervalos da terapêutica, serão cruciais para o bloqueio da angiogénese sobreviver como estratégia terapêutica em carcinoma da mama. Capítulo 7: A resposta à hipoxia medeia a resistência primária ao sunitinib em carcinoma da mama localmente avançado O sunitinib é um fármaco antiangiogénico que nunca foi avaliado isolado em doentes com carcinoma da mama não tratadas. O nosso objetivo foi caracaterizar a atividade do sunitinib isolado e em combinação com o docetaxel em carcinoma da mama não tratado, localmente avançado ou operável, mas de dimensão superior a 2 cm, para compreender os mecanismos de resposta. Doze doentes foram tratadas com duas semanas iniciais de sunitinib seguido de quatro ciclos de combinação de sunitinib e docetaxel. A resposta, a reistência e a toxicidade foram avaliadas de acordo com parametros clínicos, ressonância magnética nuclear, tomografia de emissão de positrões, histopatologia e perfis de expressão genómica. Detetámos resistência primária ao sunitinib na janela inicial de duas semanas, evidenciada em quatro doentes que não responderam. À data da cirurgia, cinco doentes tinham tumor viável na mama e axila, quatro tinahm tumor viável na mama e três foram retiradas do ensaio. Não houve respostas patológicas completas. A comparação dos perfis de expressão genómica entre os respondedores e os não respondedores, aos quinze dias iniciais, permitiu-nos identificar sobre expressão de VEGF e outras vias angiogénicas nos não respondedores. Especificamente, em tumores resistentes ao sunitinib isolado detectámos uma resposta transcricional à hipoxia caracterizada por sobre expressão de vários dos genes alvo do HIF1α. Neste ensaio de sunitinib isolado em doentes não tratadas com carcinoma da mama localmente avançado, encontrámos evidência molecular de resistência primária ao sunitinib possivelmente mediada por sobre expressão de genes que respondem à hipoxia. Parte 3: Quando parar a terapêutica sistémica às doentes com carcinoma da mama Capítulo 8: Agressividade terapêutica ns últimos três meses de vida num estudo retrospetivo dum centro único Incluímos todos os adultos que morreram com tumores sólidos na instituição em 2003 e foram tratados com quimioterapia para tratar neoplaias metastizadas. Colhemos dados detalhados relacionados com quimioterapia e toxicidade nos últimos três meses de vida a partir do processo clínico. Trezentas e dezanove doentes foram incluídos, a mediana de idade foi 61 anos. A mediana de sobrevivência de doença metastática foi de 11 meses. 66% (211) dos doentes foram tratados com QT nos últimos 3 meses de vida, 37% foram tratados com QT no úlimo mês de vida e 21% nas últimas duas semanas. Nos doentes que foram tratados com QT nos últimos três meses de vida, 50% começaram um novo regime terapêutico neste período e 14% começaram um novo regime no último mês. Identificámos como determinantes de tratamento com QT no fim de vida a idade jovem, o carcinoma da mama, do ovário e do pâncreas. Concluímos que administrámos QT no fim de vida frequentemente e iniciámos novos regimes terapêuticos no último mês de vida em 14% dos casos. Precisamos de aprofundar este trabalho para compreender se esta atitude agressiva resulta em melhor paliação de sintomas e qualidade de vida no fim de vida dos doentes com neoplasias disseminadas. Capítulo 9: O tratamento do carcinoma da mama no fim de vida está a mudar? Quisémos caracterizar a modificação da tendência no uso de QT e de estratégias paliativas no fim de vida das doentes com carcinoma da mama em diferentes instituições e em intervalos de tempo diferentes. Para isto selecionámos doentes que morreram de carcinoma da mama durante 6 anos, entre 2007 e 2012, num hospital geral e comparámos com as doentes que morreram de carcinoma da mama em 2003 num centro oncológico. Avaliámos um total de 232 doentes. O grupo mais recente tem 114 doentes e o grupo anterior tem 118 doentes. Usámos estatística descritiva para caracterizar QT no fim de vida e o uso de estratégias paliativas. Ambas as coortes são comparáveis em termos das características do carcinoma da mama. Observámos aumento do uso de estatégias paliativas: consulta da dor, consulta de cuidados paliativos e radioterapia paliativa no cuidado das doentes com carcinoma da mama metastizado. Evidenciámos aumento do número de mortes em serviços de cuidados paliativos. No entanto, a QT paliativa continua a ser prolongada até aos últimos meses de vida, embora tenhamos mostrado uma diminuição desta prática. Outros indicadores de agressividade como a admissão hospitalar também mostraram diminuição. Confirmámos a nossa hipótese de que há maior integração da medicina paliativa multidisciplinar e menos agressividade na terapêutica sistémica das doentes com carcinoma da mama nos últimos meses de vida. Chapter 10: Porque é que os nossos doentes são tratados com quimioterapia até ao fim da vida? (editorial) Este capítulo começa por dar o exmeplo duma jovem de 22 anos que viveu três meses após começar QT paliatva. Este caso epitomiza a futilidade terapêutica e é usado como ponto de partida para explorar as razões pelas quais administramos QT no fim de vida aos doentes quando é inútil, tóxica, logisticamente complexa e cara. Será que estamos a prescrever QT até tarde demais? Os oncologistas fazem previsões excessivamente otimistas e têm uma atitude pró terapêutica excessiva e são criticados por outros intervenientes nas instituições de saúde por isto. Crescentemente doentes, familiares, associações de doentes, definidores de políticas de saúde, jornalistas e a sociedade em geral afloram este tema mas tornam-se inconsistentes quando se trata dum doente próximo em que se modifica o discurso para que se façam terapêuticas sitémicas agressivas. Há uma crescente cultura de preservação da qualidade de vida, paliação, abordagem sintomática, referenciação a unidades de cuidados paliativos e outros temas do fim de vida dos doentes oncológicos terminais. Infelizmente, este tema tem ganhado momentum não porque os oncologistas estejam a refletir criticamente sobre a sua prática, mas porque os custos dos cuidados de saúde são crescentes e incomportáveis. Seja qual fôr o motivo, as razões que levam os oncologistas a administrar QT no fim de vida devem ser criticamente elucidadas. Mas há poucos dados para nos guiar nesta fase delicada da vida dos doentes e os que existem são por vezes irreconciliáveis, é uma revisão destes dados que foi feita neste capítulo. Conclusão: A abordagem do carcinoma da mama no futuro? Na conclusão, tenta-se olhar para o futuro e prever como será a tomada a cargo dum doente com carcioma da mama amanhã. Faz-se uma avaliação das várias àreas desde prevenção, rastreio, suscetibilidade genética e comportamental e terapêutica. Na terapêutica separa-se a terapêutica locoregional, sistémica adjuvante e da doença metastizada. Nos três últimos parágrafos a história duma mulher com um carcinoma localmente avançado que sobre expressa o recetor Her2, serve como ilustração de como devemos estar preparados para incorporar evolução, heterogeneidade e dinamismo no cuidado de doentes com carcinoma da mama. -------------------------------------------------------------------------------------------------- ABSTRACT: Introduction: Breast cancer care in the past This work starts with an overview of the treatment of breast cancer (BC). From the first reports of patients ill with BC until 1950. From 1950 until 2000, there is a more detailed account on how BC patients were treated with emphasis on the different modalities, local, regional and systemic treatments and their evolution. Part 1: Who to treat with adjuvant systemic therapy? Chapter 1: TNM is not dead in breast cancer It has been said that the current TNM staging system might not be suitable for predicting breast cancer (BC) outcomes and for making therapeutic decisions, especially for patients with screen detected BC which is smaller. The reason for this is also due to the non inclusion of tumor biology parameters in the current TNM system. We hypothesize that in a population where there is still a large abundance of non screen detected BC, with a low median age of incidence and abundance of high TNM staged lesions, biology is still second to classical staging in predicting prognosis. We analyzed a population of consecutive BC patients from a single institution during ten years. We characterized current established prognostic factors, classical staging variables included in the current TNM staging system and biological variables, currently not included in the TNM system. We quantified the capacity of individual prognostic factors to predict survival. We analyzed a population of 1699 consecutive BC patients. We found that individually both the TNM system prognostic factors and the biological prognostic factors are differing among BC survivors and dead patients in a statistically significant distribution. Explicitly, patients with larger tumors, positive nodes, higher stage lesions, ER negative, HER2 positive, TN or lower differentiation tumors show decreased survival. In the multivariate analysis we can conclude that in a population such as ours classical TNM staging variables, irrespective of tumor biological features, are still the most powerful outcome predictors. Chapter 2: Defining breast cancer prognosis: The predictive power and mechanism of centrosome alterations in breast cancer We performed a systematic analysis of the literature and compiled an extensive data set of gene expression data originated in primary tumours of BC patients with prognostic information. We analysed this data seeking for genes consistently up or down regulated in poor prognosis BC, i.e. that relapsed after initial treatment. In the course this bioinformatics analysis our lab identified 65 genes statistically significant across multiple datasets that can discriminate between relapsed and non-relapsed BC patients. Among the identified genes, we have detected genes such as MKI67, a marker of mitotic activity which is routinely used in the clinic. Unexpectedly, we also discovered several genes found to be involved in centrosome clustering, The most prominent of these is the kinesin KIFC1, also called HSET, and previously identified as regulator of centrosome clustering. Centrosome abnormalities (numerical, structural) have been observed in cancer. Indeed, compelling data has shown that cells from many cancers have multiple and abnormal centrosomes, that are either correlated with tumour malignancy or considered an early tumorigenesis event. However, extra centrosomes come at a cost and cells must be able to handle such abnormalities or otherwise die. Thus our results suggested a new mechanism of breast cancer progression with negative prognostic value. We aimed at quantifying the predictive power of centrosome clustering in BC clinical setting and at detecting this process in BC patient material. We validated the centrosome clustering genes KIFC1 and TACC3 in formalin fixed paraffin embedded (FFPE) BC patient material, using quantitative real-time PCR (RT-qPCR) technology. Our results indicate that the tested KIFC1 has a clear IHC signal (1) and that the protein expression patterns and levels correlate with prognosis, with relapsing patients having increased expression and nuclear localisation of this kinesin (2). Next we were able to show that centrosome clustering does occur in vivo. We identified centrosome amplification and clustering in breast cancer samples, and we established a fluorescence microscopy-based IHC approach by staining FFPE samples with centrosomal markers. Using this approach we have observed centrosome amplification and clustering in a small set of poor prognosis samples. By expanding the number of samples in which we have characterised the number of centrosomes, we were able to confirm our preliminary observation that centrosomes are clustered in relapsed BC. Part 2: How to treat breast cancer subtypes? Chapter 3: How many diseases is triple negative breast cancer? (review) Triple negative breast cancer is a subtype of breast cancer that does not express the estrogen receptor, the progesterone receptor and the epidermal growth factor receptor type 2 (Her2). These tumors are not yet treated with targeted therapies probably because no positive markers have been described to reliably classify them - they are described for what they are not. Perhaps for this reason, they are among the most aggressive of breast carcinomas, albeit with very heterogenous clinical behavior. The clinical observation that these patients do not carry a uniformly dismal prognosis, coupled with data coming from pathology and epidemiology, suggests that this negative definition is not capturing a single clinical entity, but several. We critically evaluate this evidence in this paper, reviewing clinical and epidemiological data, as well as molecular data. There is evidence for heterogeneity, but it is not clear how many diseases are grouped into triple negative breast cancer. Answering this question, and identifying the molecular basis of heterogeneity will help define prognosis and, eventually, the identification of new targeted therapies. Chapter 4: Systemic treatment for triple negative breast cancer (review) Chemotherapy remains the backbone of treatment for triple negative breast cancer (TNBC). Despite the appearance of new targeted and biologic agents there has been no targeted therapy validated for TNBC, possibly because the biology of TNBC has not been conclusively elucidated. Many studies have shown that TNBC derive significant benefit of chemotherapy in the neoadjuvant, adjuvant and metastatic treatment, possibly more benefit than other BC subtypes. Neoadjuvant chemotherapy studies have repeatedly shown higher response rates in TNBC than non-TNBC. Pathologic complete response has been shown to predict improved long term outcomes in BC. Although specific adjuvant regimens for TNBC are under study, third generation chemotherapy regimens utilizing dose dense or metronomic polychemotherapy are among the most effective tools presently available. The role of specific chemotherapy agents, namely platinum salts, in the treatment of TNBC remains undefined. Taxanes and anthracyclines are active in TNBC and remain important agents, but have not shown specific benefit over non-TNBC. TNBC is itself a heterogeneous group in which subgroups like basal like BC defined by higher proliferation and including those TNBC arising in BRCA1 mutation carriers may be more sensitive to platinum agents and relatively less sensitive to taxanes. The molecular characterization of TNBC is lacking and therefore the search for targeted therapy is still ongoing. Chapter 5: Randomized phase II study of the anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody cetuximab with cisplatin versus cisplatin alone in patients with metastatic triple-negative breast cancer Epidermal growth factor receptor is overexpressed in metastatic triple-negative breast cancers, an aggressive subtype of breast cancer. Our randomized phase II study investigated cisplatin with or without cetuximab in this setting. Patients who had received no more than one previous chemotherapy regimen were randomly assigned on a 2:1 schedule to receive no more than six cycles of cisplatin plus cetuximab or cisplatin alone. Patients receiving cisplatin alone could switch to cisplatin plus cetuximab or cetuximab alone on disease progression. The primary end point was overall response rate (ORR). Secondary end points studied included progressionfree survival (PFS), overall survival (OS), and safety profiles. The full analysis set comprised 115 patients receiving cisplatin plus cetuximab and 58 receiving cisplatin alone; 31 patients whose disease progressed on cisplatin alone switched to cetuximab-containing therapy. The ORR was 20% with cisplatin plus cetuximab and 10% with cisplatin alone (odds ratio, 2.13). Cisplatin plus cetuximab resulted in longer PFS compared with cisplatin alone (median, 3.7 v 1.5 months; hazard ratio, 0.67. Corresponding median OS was 12.9 versus 9.4 months. While the primary study end point was not met, adding cetuximab to cisplatin doubled the ORR and appeared to prolong PFS and OS, warranting further investigation in mTNBC. Chapter 6: Blocking angiogenesis to treat breast cancer (review) Angiogenesis is a hallmark of cancer because tumors larger than 1mm need new vessels to sustain their growth. Since the discovery of the molecular players of this process and some inhibitors, that angiogenesis became a promising therapeutic target. Bevacizumab was the first molecular-targeted antiangiogenic therapy approved by the FDA and is used as first-line therapy in metastatic breast cancer. A second class of approved inhibitors (sunitinib, sorafenib, pazopanib and axitinib) include oral small-molecule tyrosine kinase inhibitors that target vascular endothelial growth factor receptors, platelet-derived growth factor receptors, and other kinases including KIT, Ret, BRAF and Flt-3, but none of these have gained approval to treat breast cancer. This review analyzes and summarizes data from clinical trials of anti-angiogenic agents in the treatment of BC. Phase III trials of bevacizumab in advanced BC have demonstrated a reduction in disease progression (22–52%), increased response rates and improvements in progression-free survival of 1.2 to 5.5 months, but no improvements in OS. Bevacizumab phase III trials in early BC have both been negative. Bevacizumab combined with chemotherapy is associated with more adverse events. Phase III trials of the tyrosine kinase inhibitor sunitinib were negative, while randomized phase II trials of sorafenib and pazopanib have improved some outcomes. Endostatin has been tested in neoadjuvant clinical trials in combination with anthracyclinebased chemotherapy in treatment-naive patients and has increased the clinical response rate, but more trials are needed to establish this drug. Most trials of anti-angiogenic agents in BC have reported improved RR and PFS but no increase in OS compared to chemotherapy alone, leading to skepticism towards blocking angiogenesis. Selected trials in selected BC populations with translational endpoints related to harvested tumor tissue and other biological material samples, preferentially at several timepoints, will be crucial if antiangiogenesis is to survive as a strategy to treat BC. Chapter 7: Does hypoxic response mediate primary resistance to sunitinib in untreated locally advanced breast cancer? The antiangiogenic drug sunitinib has never been evaluated as single agent in untreated BC patients. We aimed to characterize the activity of sunitinib, alone and with docetaxel, in untreated locally advanced or operable BC, and, to uncover the mechanisms of response. Twelve patients were treated with an upfront window of sunitinib followed by four cycles of sunitinib plus docetaxel. Response, resistance and toxicity were evaluated according to standard clinical parameters, magnetic resonance imaging, positron emission tomography, pathology characterization and gene expression profiling. We detected primary resistance to sunitinib upfront window in untreated BC, as evidenced by four non-responding patients. At surgery, five patients had viable disease in the breast and axilla, four had viable tumor cells in the breast alone and three were taken off study due to unacceptable toxicity and thus not evaluated. Early functional imaging was useful in predicting response. There were no pathologic complete responses (pCR). Comparison of gene expression profiling tumor data between early responders and non-responders allowed us to identify upregulation of VEGF and angiogenic pathways in non responders. Specifically, in tumors resistant to the single-agent sunitinib we detected a transcriptional response to hypoxia characterized by over-expression of several HIF1α target genes. In this report of single-agent sunitinib treatment of untreated localized BC patients, we found molecular evidence of primary resistance to sunitinib likely mediated by up-regulation of hypoxia responsive genes. Part 3: When to stop systemic treatment of breast cancer patients? Chapter 8: The aggressiveness of cancer care in the last three months of life: a retrospective single centre analysis. All adult patients with solid tumors who died in our hospital in 2003 and received chemotherapy for advanced cancer, were included. Detailed data concerning chemotherapy and toxicity, in the last three months of life, were collected from patientsʼ clinical charts. A total of 319 patients were included. Median age was 61 years. Median time from diagnosis of metastatic disease to death was 11 months. The proportion of patients who received chemotherapy in the last three months of life was 66% (n=211), in the last month 37% and in the last two weeks 21%. Among patients who received chemotherapy in the last three months of life, 50% started a new chemotherapy regimen in this period and 14% in the last month. There was an increased probability of receiving chemotherapy in the last three months of life in younger patients and in patients with breast, ovarian and pancreatic carcinomas. There was a large proportion of patients who received chemotherapy in the last three months of life, including initiation of a new regimen within the last 30 days. Thus, further study is needed to evaluate if such aggressive attitude results in better palliation of symptoms at the end of life. Chapter 9: Is breast cancer treatment in the end of life changing? We aimed to characterize the shifting trends in use of anti-cancer chemotherapy and palliative care approaches in the end of life of BC patients in different institutions and times. For this, we selected women that died of BC during six years, from 2007 to 2012, and were treated in a central acute care general hospital and compared it with the BC patients that died in 2003 and were treated in a large cancer center. We analyzed a total of 232 patients: the more recent group has 114 women and the older cohort has 118. We used descriptive statistics to characterize CT in the EoL and use of palliative care resources. Both populations were similar in terms of BC characteristics. We observed more palliative care resources, pain clinic, palliative care teams and palliative radiotherapy, involved in the care of MBC patients and a shift towards more deaths at hospices. Systemic anti cancer treatments continue to be prolonged until very late in patients’ lives, notwithstanding, we could show a decrease in the use of such treatments. Other indicators of aggressiveness, namely hospital admissions, also show a decrease. We confirmed our hypothesis that there is more integration of multidisciplinary palliative care and less aggressiveness in the treatment of metastatic cancer patients, specifically, use of palliative anti-cancer treatment and hospital admissions. Nonetheless, we use systemic therapy until too late with underutilization of palliative medicine. Chapter 10: Why do our patients get chemotherapy until the end of life? (editorial) The editorial starts with a clinical case of a 21 year old patient that lives three months after starting palliative chemotherapy for the first time, a case that illustrates therapeutic futility at the end of life. Why are we not ceasing chemotherapy when it is useless, toxic, logistically complex and expensive? Are we prescribing chemotherapy until too late in solid tumor patientsʼ lives? Medical oncologists have overly optimistic predictions and, excessive, treatment-prone attitude and they are criticized by other health care providers for this. Increasingly, patients, their families, advocacy groups, policy makers, journalists and society at large dwell on this topic, which is a perplexing conundrum, because sometimes they are the ones demanding not to stop aggressive systemic anticancer treatments, when it comes to their loved ones. There is a growing culture of awareness toward preserving quality of life, palliative care, symptom-directed care, hospice referral and end of life issues regarding terminal cancer patients. Sadly, this issue is gaining momentum, not because oncologists are questioning their practice but because health care costs are soaring. Whatever the motive, the reasons for administering chemotherapy at the end of life should be known. There are few and conflicting scientific data to guide treatments in this delicate setting and we review this evidence in this paper. Conclusion: What is the future of breast cancer care? This work ends with a view into the future of BC care. Looking into the different areas from prevention, screening, hereditary BC, local, regional and systemic treatments of adjuvant and metastatic patients. The last three paragraphs are a final comment where the story of a patient with Her2 positive locally advanced breast cancer is used as paradigm of evolution, heterogeneity and dynamism in the management of BC.

Modulation of the secretome of hBMSCs by tailoring the macromolecular gradient in hydrogels to generate tissue-to-tissue interfaces

Tissue-to-tissue interfaces are commonly present in all tissues exhibiting structural, biological and chemical gradients serving a wide range of physiological functions. These interfaces are responsible for mediation of load transfer between two adjacent tissues. They are also important structures in sustaining the cellular communications to retain tissueâ s functional integration and homeostasis. [1] All cells have the capacity to sense and respond to physical and chemical stimulus and when cultured in three-dimensional (3D) environments they tend to perform their function better than in two-dimensional (2D) environments. Spatial and temporal 3D gradient hydrogels better resemble the natural environment of cells in mimicking their extracellular matrix. [2] In this study we hypothesize that differential functional properties can be engineered by modulation of macromolecule gradients in a cell seeded threedimensional hydrogel system. Specifically, differential paracrine secretory profiles can be engineered using human Bone Marrow Stem Cells (hBMSCâ s). Hence, the specific objectives of this study are to: assemble the macromolecular gradient hydrogels to evaluate the suitablity for hBMSCâ s encapsulation by cellular viability and biofunctionality by assessing the paracrine secretion of hBMSCâ s over time. The gradient hydrogels solutions were prepared by blend of macromolecules in one solution such as hyaluronic (HA) acid and collagen (Col) at different ratios. The gradient hydrogels were fabricated into cylindrical silicon moulds with higher ratio solutions assembled at the bottom of the mould and adding the two solutions consecutively on top of each other. The labelling of the macromolecules was performed to confirm the gradient through fluorescence microscopy. Additionally, AFM was conducted to assess the gradient hydrogels stiffness. Gradient hydrogels characterization was performed by HA and Col degradation assay, degree of crosslinking and stability. hBMSCâ s at P3 were encapsulated into each batch solution at 106 cells/ml solution and gradient hydrogels were produced as previously described. The hBMSCâ s were observed under confocal microscopy to assess viability by Live/Dead® staining. Cellular behaviour concerning proliferation and matrix deposition was also performed. Secretory cytokine measurement for pro-inflammatory and angiogenesis factors was carried out using ELISA. At genomic level, qPCR was carried out. The 3D gradient hydrogels platform made of different macromolecules showed to be a suitable environment for hBMSCâ s. The hBMSCâ s gradient hydrogels supported high cell survival and exhibited biofunctionality. Besides, the 3D gradient hydrogels demonstrated differentially secretion of pro-inflammatory and angiogenic factors by the encapsulated hBMSCâ s. References: 1. Mikos, AG. et al., Engineering complex tissues. Tissue Engineering 12,3307, 2006 2. Phillips, JE. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 26:12170-5, 2008

The influence of kaolin application on key metabolic pathways associated with grape berry quality: a molecular and biochemical analysis

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas

MMP-9/RECK imbalance: a mechanism associated with high-grade cervical lesions and genital infection by Human Papillomavirus (HPV) and Chlamydia trachomatis

"Manuscript"

Anaerobic oxidation of methane associated with sulfate reduction in a natural freshwater gas source

The occurrence of anaerobic oxidation of methane (AOM) and trace methane oxidation (TMO) was investigated in a freshwater natural gas source. Sediment samples were taken and analyzed for potential electron acceptors coupled to AOM. Long-term incubations with 13C-labeled CH4 (13CH4) and different electron acceptors showed that both AOM and TMO occurred. In most conditions, 13C-labeled CO2 (13CO2) simultaneously increased with methane formation, which is typical for TMO. In the presence of nitrate, neither methane formation nor methane oxidation occurred. Net AOM was measured only with sulfate as electron acceptor. Here, sulfide production occurred simultaneously with 13CO2 production and no methanogenesis occurred, excluding TMO as a possible source for 13CO2 production from 13CH4. Archaeal 16S rRNA gene analysis showed the highest presence of ANME-2a/b (ANaerobic MEthane oxidizing archaea) and AAA (AOM Associated Archaea) sequences in the incubations with methane and sulfate as compared with only methane addition. Higher abundance of ANME-2a/b in incubations with methane and sulfate as compared with only sulfate addition was shown by qPCR analysis. Bacterial 16S rRNA gene analysis showed the presence of sulfate-reducing bacteria belonging to SEEP-SRB1. This is the first report that explicitly shows that AOM is associated with sulfate reduction in an enrichment culture of ANME-2a/b and AAA methanotrophs and SEEP-SRB1 sulfate reducers from a low-saline environment.

Avaliação da expressão de mediadores imunitários em amostras de cetáceos capturados acidentalmente em Portugal Continental

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária

Evaluación de la interacción virus-hospedante-vector- endosimbiontes y su influencia en la transmisión del Mal de Río Cuarto en infecciones simples y mixtas con el Cereal Rhabdovirus.

El “Mal de Río Cuarto” es la enfermedad más importante del maíz en la Argentina. El agente causal es un fijivirus denominado Mal de Río Cuarto virus (MRCV). Se transmite únicamente a través de delfácidos (Hemiptera-Delphacidae) de forma persistente propagativa. Se han descripto diversas especies con demostrada capacidad vectora, entre ellos Delphacodes kuscheli Fennah y Toya propinqua Fieber. La primera es de gran importancia tanto por su abundancia en las zonas maiceras de nuestro país como por su eficiencia de transmisión mientras que T. propinqua es una especie cosmopolita que se encuentra ampliamente distribuida en toda el área productiva. Ambas especies poseen una demostrada capacidad de transmisión a cereales de grano fino, importantes epidemiológicamente por su rol como reservorios del virus y el vector en época invernal. Un aspecto que requiere especial atención es la aparición de una nueva virosis, un Cytorhabdovirus, en infecciones mixtas con MRCV en cereales de invierno en el sur de la provincia de Córdoba (región endémica del Mal de Río Cuarto). Al igual que este último el rhabdovirus se transmite por insectos delfácidos, por lo que sería relevante estudiar las posibles interacciones entre la coinfección por ambos patógenos y sus consecuencias en la transmisión del MRCV. La capacidad vectora puede estar afectada por diversos aspectos biológicos, entre los que se pueden mencionar el estadío del insecto al momento de la adquisición del virus, los niveles de concentración viral alcanzados en el organismo del vector, la existencia de barreras morfofisiológicas (como las membranas basales del intestino medio y glándulas salivales, y mecanismos de inmunidad innata) y la presencia de endosimbiontes. Se conoce que existen diferencias en la transmisión según el MRCV se adquiera como ninfa de primer o tercer estadío, por lo que se propone realizar estudios comparativos entre ambos grupos. Se plantea además evaluar el efecto de diferencias de concentración del MRCV en el organismo del insecto en la transmisión mediante RT-qPCR, en infecciones simples y mixtas. Se analizará la posible existencia de barreras morfofisiológicas observando el tropismo de las partículas virales en los tejidos del vector a través de inmunomicroscopía confocal y la activación diferencial de genes de inmunidad innata con RT-qPCR. Dado que existen antecedentes de la presencia de endosimbiontes, como Wolbachia pipientis en este grupo de insectos, se propone además estudiar la prevalencia de esta bacteria y analizar las cepas existentes en poblaciones de delfácidos del área maicera. Este objetivo es importante por dos razones. En primer lugar, W pipientis es ampliamente estudiada como potencial biocontrolador de vectores debido al fenómeno de incompatibilidad citoplasmática que expresa en sus hospedantes. En segundo lugar, esta bacteria influye en la eficiencia de transmisión de enfermedades ya que se conoce que los endosimbiontes producen proteínas denominadas simbioninas que protegen las partículas virales de la degradación enzimática durante su circulación por la hemolinfa. De este modo, la presencia de Wolbachia podría condicionar la replicación, estabilidad y persistencia de las partículas virales en insectos vectores, fenómenos comprobados para otros patosistemas. Este proyecto tiene como objetivo final profundizar los conocimientos acerca del fenómeno de la transmisión viral y establecer bases para el manejo integrado del vector y la enfermedad.

Expressao genica associada ao estresse oxidativo no coracao de camundongo apos isquemia intestinal

FUNDAMENTO: O fenômeno da isquemia e reperfusão intestinal é um evento frequente na clínica e está associado a repercussões deletérias em órgãos a distância, em especial ao coração. OBJETIVO: Investigar a expressão gênica do estresse oxidativo e defesa antioxidante no coração de camundongos isogênicos, submetidos a isquemia e reperfusão intestinal (IR). MÉTODOS: Doze camundongos (C57BL/6) foram distribuídos em dois grupos: Grupo IR (GIR) com 60 min de oclusão da artéria mesentérica superior, seguidos de 60 min de reperfusão. Grupo Controle (GC) submetidos a anestesia e a laparotomia sem o procedimento de IR observados por 120 min. As amostras de intestino e coração foram processadas pelo método (RT-qPCR / Reverse transcriptase - quantitative Polymerase Chain Reaction) para determinar a expressão gênica de 84 genes relacionados ao estresse oxidativo ("t" de Student, p < 0,05). RESULTADOS: Observou-se no tecido intestinal (GIR) uma expressão significantemente aumentada em 65 (74,71%) genes em relação ao tecido normal (GC), e 37 (44,04%) genes estiveram hiperexpressos (maior que três vezes o limiar permitido pelo algoritmo). No tocante aos efeitos da I/R intestinal a distância no tecido cardíaco verificou-se a expressão significantemente aumentada de 28 genes (33,33%), mas somente oito genes (9,52%) se hiperexpressaram três vezes acima do limiar. Quatro (7,14%) desses oito genes se expressaram simultaneamente nos tecidos intestinal e cardíaco. No GIR notaram-se cardiomiócitos com núcleos de menor tamanho, picnóticos, ricos em heterocromatina e raros nucléolos, indicando sofrimento cardíaco. CONCLUSÃO: A I/R intestinal promoveu a hiperexpressão estatisticamente significante de oito genes associados ao estresse oxidativo a distância no tecido miocárdico.

Role of microRNAs 221/222 on Statin Induced Nitric Oxide Release in Human Endothelial Cells

Background: Nitric oxide (NO) has been largely associated with cardiovascular protection through improvement of endothelial function. Recently, new evidence about modulation of NO release by microRNAs (miRs) has been reported, which could be involved with statin-dependent pleiotropic effects, including anti-inflammatory properties related to vascular endothelium function. Objective: To evaluate the effects of cholesterol-lowering drugs including the inhibitors of cholesterol synthesis, atorvastatin and simvastatin, and the inhibitor of cholesterol absorption ezetimibe on NO release, NOS3 mRNA expression and miRs potentially involved in NO bioavailability. Methods: Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were exposed to atorvastatin, simvastatin or ezetimibe (0 to 5.0 μM). Cells were submitted to total RNA extraction and relative quantification of NOS3 mRNA and miRs -221, -222 and -1303 by qPCR. NO release was measured in supernatants by ozone-chemiluminescence. Results: Both statins increased NO levels and NOS3 mRNA expression but no influence was observed for ezetimibe treatment. Atorvastatin, simvastatin and ezetimibe down-regulated the expression of miR-221, whereas miR-222 was reduced only after the atorvastatin treatment. The magnitude of the reduction of miR-221 and miR-222 after treatment with statins correlated with the increment in NOS3 mRNA levels. No influence was observed on the miR-1303 expression after treatments. Conclusion: NO release in endothelial cells is increased by statins but not by the inhibitor of cholesterol absorption, ezetimibe. Our results provide new evidence about the participation of regulatory miRs 221/222 on NO release induction mediated by statins. Although ezetimibe did not modulate NO levels, the down-regulation of miR-221 could involve potential effects on endothelial function.

Charakterisierung von Kartoffelpflanzen mit reduzierter THT-Genexpression

Diese Masterarbeit wurde im Verlauf des Sommersemesters 2014 am Leibniz Institut für Pflanzenbiochemie (IPB) in Halle angefertigt. Gegenstand dabei war die Charakterisierung von Kartoffelpflanzen (Solanum tuberosum cv Désirée), welche durch RNA-Interferenz reduzierte Mengen der Tyramin-Hydroxyzimtsäure-Transferase (THT) besaßen. Durch Southern- und Northern-Blot-Analysen wurden die korrekte Insertion als auch der RNAi-Effekt überprüft und bestätigt. Infizierte Blätter und die dazugehörenden Infektionstropfen wurden in Methanol gelöst und massenspektrometrisch nachgewiesen. Darauf aufbauend wurde das Wachstum von Phytophthora infestans auf transformierten Linien untersucht, wobei dessen Biomasse nach 3-tägiger Infektion durch qPCR bestimmt wurde. Während der Betreuung der transformierten Linien in Sterilkultur wurde ein Phänotyp ersichtlich. Nach Dokumentation der äußeren Erscheinungen und nach Prüfung auf Einfluss von Pathogenen, wurden diese Pflanzen für Knollenversuche im Gewächshaus ausgepflanzt und analysiert. Zuletzt wurde die Sequenz von THT analysiert und kloniert, woraufhin drei Fragmente generiert wurden, welche für weitere Versuche genutzt werden können.

A novel gene expression signature in peripheral blood mononuclear cells for early detection of colorectal cancer.

BACKGROUND: Early detection and treatment of colorectal adenomatous polyps (AP) and colorectal cancer (CRC) is associated with decreased mortality for CRC. However, accurate, non-invasive and compliant tests to screen for AP and early stages of CRC are not yet available. A blood-based screening test is highly attractive due to limited invasiveness and high acceptance rate among patients. AIM: To demonstrate whether gene expression signatures in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were able to detect the presence of AP and early stages CRC. METHODS: A total of 85 PBMC samples derived from colonoscopy-verified subjects without lesion (controls) (n = 41), with AP (n = 21) or with CRC (n = 23) were used as training sets. A 42-gene panel for CRC and AP discrimination, including genes identified by Digital Gene Expression-tag profiling of PBMC, and genes previously characterised and reported in the literature, was validated on the training set by qPCR. Logistic regression analysis followed by bootstrap validation determined CRC- and AP-specific classifiers, which discriminate patients with CRC and AP from controls. RESULTS: The CRC and AP classifiers were able to detect CRC with a sensitivity of 78% and AP with a sensitivity of 46% respectively. Both classifiers had a specificity of 92% with very low false-positive detection when applied on subjects with inflammatory bowel disease (n = 23) or tumours other than CRC (n = 14). CONCLUSION: This pilot study demonstrates the potential of developing a minimally invasive, accurate test to screen patients at average risk for colorectal cancer, based on gene expression analysis of peripheral blood mononuclear cells obtained from a simple blood sample.

Fungi, bacteria and soil pH: the oxalate-carbonate pathway as a model for metabolic interaction

The oxalatecarbonate pathway involves the oxidation of calcium oxalate to low-magnesium calcite and represents a potential long-term terrestrial sink for atmospheric CO2. In this pathway, bacterial oxalate degradation is associated with a strong local alkalinization and subsequent carbonate precipitation. In order to test whether this process occurs in soil, the role of bacteria, fungi and calcium oxalate amendments was studied using microcosms. In a model system with sterile soil amended with laboratory cultures of oxalotrophic bacteria and fungi, the addition of calcium oxalate induced a distinct pH shift and led to the final precipitation of calcite. However, the simultaneous presence of bacteria and fungi was essential to drive this pH shift. Growth of both oxalotrophic bacteria and fungi was confirmed by qPCR on the frc (oxalotrophic bacteria) and 16S rRNA genes, and the quantification of ergosterol (active fungal biomass) respectively. The experiment was replicated in microcosms with non-sterilized soil. In this case, the bacterial and fungal contribution to oxalate degradation was evaluated by treatments with specific biocides (cycloheximide and bronopol). Results showed that the autochthonous microflora oxidized calcium oxalate and induced a significant soil alkalinization. Moreover, data confirmed the results from the model soil showing that bacteria are essentially responsible for the pH shift, but require the presence of fungi for their oxalotrophic activity. The combined results highlight that the interaction between bacteria and fungi is essential to drive metabolic processes in complex environments such as soil.