The influence of kaolin application on key metabolic pathways associated with grape berry quality: a molecular and biochemical analysis

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas

Grapevine (Vitis vinifera L.) is a perennial woody plant with huge importance in national and global economy, widely grown in areas with typical Mediterranean climates, such as the Douro Demarcated Region (Denomination of Origin Douro/Porto). This region is usually affected by extended dry and hot summers that lead to productivity issues and are thus a main concern to viticulturists. The exogenous application of kaolin, an inert mineral that reflects ultraviolet and infrared radiation but not photosynthetically active radiation, is currently being experimented in Douro vineyards as a mitigation strategy to prevent drought and high temperature stresses in ‘Touriga Nacional’ grapevine. This approach yielded promising results on an eco-physiological level, so, the main purpose of this study was to perform a thorough molecular and biochemical analysis on the influence of kaolin application on key metabolic pathways associated with grape berry quality, in particular sugar transport/metabolism and phenolics biosynthesis, including flavonoids - anthocyanins and flavonols – and stilbenoids. The work was performed in close collaboration with laboratory headed by Prof. José Moutinho Pereira at Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro. A broad metabolomic analysis was also performed by GC-TOF-MS, and it demonstrated that kaolin exogenous application had a variable effect on general grape berry primary metabolome at the mature stage, in sugars, sugars-phosphate, polyols, amino acids and organic acids. Trancriptional analysis by real-time qPCR revealed that the gene expression of the sugar transporters VvSUC12, VvHT1, VvHT3, VvTMT1 and VvSWEET11 was enhanced in the latter ripening stages of berries from kaolin-treated vines, which suggests an improvement in sugar transport capacity, despite the fact that only fructose concentration was significantly increased according to HPLC quantification. A parallel metabolomic analysis focused on secondary metabolism, performed by reverse phase LC-QTOF-MS, combined with total phenolic and anthocyanin quantifications showed that phenolic and anthocyanin concentrations were clearly enhanced at the latter ripening stages in response to kaolin foliar application. The increased biochemical activity of PAL, flavonol synthase (FLS) and UFGT, key enzymes in phenolic and/or anthocyanin biosynthesis was clearly a factor accounting for this observation, as well as the higher transcript levels observed in many key genes involved in the phenylpropanoid, stilbenoid, flavonoid (flavonols and anthocyanins) pathways, detected in berries from kaolin-treated plants by qPCR. In conclusion, kaolin exogenous application in grapevine shows great potential as summer stress mitigation strategy, due to stimulating several molecular mechanisms associated with grape berry quality, from primary to secondary metabolism, in addition to the protection previously observed by the group of Prof. José Moutinho Pereira through eco-physiological studies.

A videira (Vitis vinifera L.) é uma planta perene com extrema importância na economia nacional e mundial. Predomina em climas mediterrâneos, como a Região Demarcada do Douro (Denominação de Origem Douro/Porto), onde a principal preocupação advém de verões frequentemente quentes e secos. A aplicação exógena de caulino, um mineral inerte que reflete radiação ultravioleta e infravermelha sem afetar a radiação fotossinteticamente ativa, está a ser estudada em vinhas localizadas na região do Douro como uma estratégia de mitigação da secura e das elevadas temperaturas em videiras da variedade Touriga Nacional. Esta estratégia tem demonstrado resultados promissores observados ao nível eco-fisiológico, por isso o principal objetivo deste estudo consistiu na análise molecular e bioquímica da influência da aplicação de caulino em vias metabólicas associadas à qualidade do fruto, em particular no transporte/metabolismo de açúcares e na biossíntese de fenólicos, incluindo flavonóides – antocianinas e flavonóis - e stilbenóides. O trabalho foi desenvolvido em estreita colaboração com o laboratório liderado pelo Prof. José Moutinho Pereira da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro. Uma análise metabolómica efetuada por GC-TOF-MS demonstrou que a aplicação exógena de caulino efetivamente influenciou o metaboloma primário do bago maduro, particularmente ao nível de açúcares, açucares-fosfato, polióis, aminoácidos e ácidos orgânicos. Uma análise transcricional por qPCR em tempo-real revelou que a expressão de vários genes que codificam transportadores de açúcares, nomeadamente, VvSUC12, VvHT1, VvHT3, VvTMT1 e VvSWEET11, estava aumentada em bagos maduros de videiras tratadas com caulino, o que sugere um melhoramento da capacidade de transporte de açúcares ao nível do bago em plantas tratadas com caulino, embora apenas a concentração de frutose tenha sido ligeiramente aumentada segundo a quantificação por HPLC. Paralelamente, uma análise metabolómica por LC-QTOF-MS focada no metabolismo secundário, juntamente com a quantificação de fenólicos e antocianinas totais revelou que a concentração de fenólicos e antocianinas estava claramente aumentada nas últimas fases do amadurecimento em resposta à aplicação foliar de caulino. Para este facto terá claramente contribuído o aumento nas atividades das enzimas PAL, flanonol sintetase (FLS) e da UFGT, enzimas-chave na síntese fenólicos e/ou de antocianinas, bem como os superiores níveis de expressão de vários genes envolvidos nas vias de biossíntese de fenilpropanóides, stilbenóides e flavonóides (flavonóis e antocianinas) observados em bagos provenientes de videiras tratadas com caulino, por qPCR. Em suma, a aplicação exógena de caulino em folhas de videira demonstrou elevado potencial como estratégia de mitigação de stresse associado a verões mais severos, devido à estimulação de mecanismos moleculares associados à qualidade do bago, desde o metabolismo primário ao secundário, em adição ao efeito protetor já previamente observado pelo grupo do Prof. José Moutinho Pereira em estudos eco-fisiológicos.

PTDC/AGR-ALI/110877/2009 – “ClimVineSafe - Short-term climate change mitigation strategies for Mediterranean vineyards”

Norte-07-0124-FEDER-000032 - “Enoexcel - from vineyard to wine: targeting grape and wine excellency”