Epigenetic regulation of the nitrosative stress response and intracellular macrophage survival by extraintestinal pathogenic Escherichia coli.

Extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) reside in the enteric tract as a commensal reservoir, but can transition to a pathogenic state by invading normally sterile niches, establishing infection and disseminating to invasive sites like the bloodstream. Macrophages are required for ExPEC dissemination, suggesting the pathogen has developed mechanisms to persist within professional phagocytes. Here, we report that FimX, an ExPEC-associated DNA invertase that regulates the major virulence factor type 1 pili (T1P), is also an epigenetic regulator of a LuxR-like response regulator HyxR. FimX regulated hyxR expression through bidirectional phase inversion of its promoter region at sites different from the type 1 pili promoter and independent of integration host factor (IHF). In vitro, transition from high to low HyxR expression produced enhanced tolerance of reactive nitrogen intermediates (RNIs), primarily through de-repression of hmpA, encoding a nitric oxide-detoxifying flavohaemoglobin. However, in the macrophage, HyxR produced large effects on intracellular survival in the presence and absence of RNI and independent of Hmp. Collectively, we have shown that the ability of ExPEC to survive in macrophages is contingent upon the proper transition from high to low HyxR expression through epigenetic regulatory control by FimX.

Delivery of rSLPI in a liposomal carrier for inhalation provides protection against cathepsin L degradation

Secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) is an endogenous serine protease inhibitor that protects the lungs from excessive tissue damage caused by leukocyte proteases released during inflammation. Recombinant SLPI (rSLPI) has shown potential as a treatment for inflammatory lung conditions. To date, its clinical application has been limited by rapid enzymatic cleavage by cathepsins and rapid clearance from the lungs after inhalation. In this study, rSLPI was encapsulated in 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine] : Cholesterol (DOPS : Chol) liposomes for inhalation. Incubation of rSLPI with cathepsin L leads to complete loss of activity while encapsulation of rSLPI in DOPS : Chol liposomes retained 92.6 of its activity after challenge with cathepsin L. rSLPI-loaded liposomes were aerosolized efficiently using a standard nebulizer with a minimal loss of activity and stability. This formulation was biocompatible and encapsulation did not appear to diminish access to intracellular sites of action in in vitro cell culture studies. Liposome encapsulation of rSLPI therefore improves stability and potentially reduces the level and frequency of dosing required for therapeutic effect after inhalation.

Comparison of a novel spray congealing procedure with emulsion-based methods for the micro-encapsulation of water-soluble drugs in low melting point triglycerides

The particle size characteristics and encapsulation efficiency of microparticles prepared using triglyceride materials and loaded with two model water-soluble drugs were evaluated. Two emulsification procedures based on o/w and w/o/w methodologies were compared to a novel spray congealing procedure. After extensive modification of both emulsification methods, encapsulation efficiencies of 13.04% tetracycline HCl and 11.27% lidocaine HCl were achievable in a Witepsol (R)-based microparticle. This compares to much improved encapsulation efficiencies close to 100% for the spray congealing method, which was shown to produce spherical particles of similar to 58 mu m. Drug release studies from a Witepsol (R) formulation loaded with lidocaine HCl showed a temperature-dependent release mechanism, which displayed diffusion-controlled kinetics at temperatures similar to 25 degrees C, but exhibited almost immediate release when triggered using temperatures close to that of skin. Therefore, such a system may find application in topical semi-solid formulations, where a temperature-induced burst release is preferred.

Développement d’une matrice prébiotique pour l’encapsulation des probiotiques bactériocinogènes, destinée à l’alimentation animale - de la physicochimie à la biopharmacie

L’antibiorésistance est un problème de santé publique majeur, causé principalement par l’usage abusif d’antibiotiques dans les élevages. Les probiotiques sont une alternative potentielle aux antibiotiques. Cependant, acheminer ces microorganismes vivants et fonctionnels jusqu’au côlon est un grand défi, à cause du pH et des sels biliaires à affronter lors du passage gastro-intestinal. L’objectif de ce travail était de développer une matrice prébiotique capable de maintenir la survie et l’activité des probiotiques pendant le transit gastro-intestinal et de permettre leur libération dans le côlon. Pour atteindre cet objectif, cinq types de matrices sphériques (A, AI5, AI10, AI15, AI20) à base d’inuline (0 %, 5 %, 10 %, 15 % et 20 %) et d’alginate (2 %) ont été préparés par la méthode d’extrusion/gélification ionotropique. Trois souches probiotiques ont été utilisées au cours du développement des billes : Pediococcus acidilactici UL5 (UL5), Lactobacillus reuteri (LR) et Lactobacillus salivarius (LS). Dans un premier temps, toutes les formulations ont été caractérisées d’un point de vue physicochimique et microbiologique. Ces analyses ont permis de révéler une distribution homogène de l’inuline et de l’alginate au sein des matrices et ont démontré que la viabilité et la capacité antimicrobienne des souches utilisées n’étaient pas affectées par l’encapsulation. À la lumière de ces résultats, trois formulations A, AI5 et AI20 ont été sélectionnées pour la suite de l’étude. Dans un deuxième temps, la mucoadhésion et le comportement des billes A, AI5 et AI20 ont été étudiés dans les parties supérieures du tractus gastro-intestinal. Ces études ont démontré que la présence de l’inuline améliore les propriétés mucoadhésives des billes. Elles ont également établi que seule la formulation AI5 résiste jusqu’à la fin de la digestion. Ce comportement est expliqué en partie par l’interaction alginate-inuline décelée par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR). Cette interaction était stable pour les billes AI5 au pH 6,8 mais instable pour la formulation AI20. Enfin, le comportement et la dynamique bactérienne de la formulation AI5 dans les milieux coliques fermenté et non fermenté ont été étudiés. Cette étude a révélé que les billes AI5 se dégradent et libèrent la totalité des bactéries après environ 4 heures d’incubation dans le milieu fermenté. Cette dégradation est due aux enzymes très abondantes dans ce milieu. En conclusion, la formulation AI5 s’est avérée être un très bon véhicule pour protéger les bactéries dans les parties supérieures du tube digestif et favoriser leur libération dans le côlon. Elle pourrait donc, être utilisée pour une application en alimentation animale.

Novel particulate antibiotic-loaded platforms as sustained drug delivery systems for bone infection treatment

Tese de doutoramento, Farmácia (Tecnologia Farmacêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2015

Test and development of microcapsules for rigid polyurethane foam

Tese de mestrado em Química Tecnológica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016

Biotransformations of water insoluble substrates in aqueous, two-phase and encapsulated systems /

The biotransformation of water insoluble substrates by mammalian and bacterial cells has been problematic, since these whole cell reactions are primarily performed in an aqueous environment The implementation of a twophase or encapsulated system has the advantages of providing a low water system along with the physiological environment the cells require to sustain themselves. Encapsulation of mammalian cells by formation of polyamide capsules via interfacial polymerization illustrated that the cells could not survive this type of encapsulation process. Biotransformation of the steroid spironolactone [3] by human kidney carcinoma cells was performed in a substrate-encapsulated system, yielding canrenone [4] in 70% yield. Encapsulation of nitrile-metabolizing Rhodococcus rhodochrous cells using a polyamide membrane yielded leaky capsules, but biotransformation of 2-(4- chlorophenyl)-3-methylbutyronitrile (CPIN) [6] in a free cell system yielded CPIN amide [7] in 40% yield and 94% ee. A two-phase biotransformation of CPIN consisting of a 5:1 ratio of tris buffer, pH 7.2 to octane respectively, gave CPIN acid [8] in 30% yield and 97% ee. It was concluded that Rhodococcus rhodochrous ATCC 17895 contained a nonselective nitrile hydratase and a highly selective amidase enzyme.

Biocompatibilité des microcapsules d'alginate : purification d'alginate, réaction immunitaire de l'hôte et protection du receveur

L’immuno-isolation des îlots de Langerhans est proposée comme moyen d’effectuer des transplantations sans prise d’immunosuppresseurs par le patient. Cette immuno-isolation, par l’entremise d’une microcapsule composée d’alginate et de poly-L-lysine (microcapsule APA), protège le greffon d’une éventuelle attaque du système immunitaire du receveur grâce à sa membrane semi-perméable. Cette membrane empêche le système immunitaire du receveur de pénétrer la microcapsule tout en laissant diffuser librement les nutriments, le glucose et l’insuline. Avant l’application de cette technique chez l’humain, quelques défis doivent encore être relevés, dont la biocompatibilité de ce système. La biocompatibilité fait ici référence à la biocompatibilité du biomatériau utilisé pour la fabrication des microcapsules, l’alginate, mais aussi la biocompatibilité des microcapsules reliée à leur stabilité. En effet, il a été remarqué que, lors d’implantation in vivo de microcapsules fabriquées avec de l’alginate non purifiée, ceci induisait un phénomène nommé Réaction de l’Hôte contre la Microcapsule (RHM). De plus, il est connu que la stabilité des microcapsules APA peut influencer leur biocompatibilité puisqu’une microcapsule endommagée ou brisée pourrait laisser s’échapper les cellules du greffon chez le receveur. Nous croyons qu’une compréhension des processus d’initiation de la RHM en fonction de l’efficacité des procédés de purification d’alginate (et donc des quantités de contaminants présents dans l’alginate) ainsi que l’augmentation de la stabilité des microcapsules APA pourront améliorer la biocompatibilité de ce dispositif, ce que tente de démontrer les résultats présentés dans cette thèse. En effet, les résultats obtenus suggèrent que les protéines qui contaminent l’alginate jouent un rôle clé dans l’initiation de la RHM et qu’en diminuant ces quantités de protéines par l’amélioration des procédés de purification d’alginate, on améliore la biocompatibilité de l’alginate. Afin d’augmenter la stabilité des microcapsules APA, nous décrivons une nouvelle technique de fabrication des microcapsules qui implique la présence de liaisons covalentes. Ces nouvelles microcapsules APA réticulées sont très résistantes, n’affectent pas de façon négative la survie des cellules encapsulées et confinent les cellules du greffon à l’intérieur des microcapsules. Cette dernière caractéristique nous permet donc d’augmenter la biocompatibilité des microcapsules APA en protégeant le receveur contre les cellules du greffon.

Amélioration de la résistance à l'hypoxie des îlots de Langerhans microencapsulés par l’utilisation d’agrégats de cellules dispersées

La transplantation d’îlots de Langerhans microencapsulés est un traitement prometteur du diabète de type 1. La microcapsule protège l’îlot du système immunitaire, tout en permettant la diffusion de petites molécules. Comme la microcapsule empêche la revascularisation des îlots, leur oxygénation se fait par diffusion d’oxygène et ils sont exposés à l’hypoxie. Le manque d’oxygène est un facteur limitant dans la survie des îlots microencapsulés. Il est connu que les plus petits îlots sont plus résistant à l’hypoxie à cause d’une meilleure diffusion de l’oxygène. À cette fin, les agrégats de cellules dispersées d’îlots seront étudiés. Lorsque les cellules des îlots sont dispersées, elles ont la propriété de se ré-assembler dans une structure semblable à celle des îlots. La présente étude a permis de mettre au point une technique de formation des agrégats, de les caractériser et de comparer la résistance à l’hypoxie des îlots et des agrégats. Ceux-ci ont une structure semblable aux îlots et ils sont de plus petite taille. Pour cette raison, ils sont plus viables après un choc hypoxique tout en renversant efficacement l’hyperglycémie de souris diabétiques. Les agrégats sont une alternative intéressante pour la transplantation d’îlots microencapsulés puisque leur oxygénation est plus efficace.

Développement d’un microréacteur à base d’enzyme microencapsulée en vue d’un couplage en ligne à un système d’électrophorèse capillaire

Réalisé en codirection avec Karen C. Waldron et Dominic Rochefort.

Immobilisation d'enzymes par microcapsules polymérisées pour le développement de biocapteurs

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Fabrication, caractérisation et étude électrochimique de microcapsules conductrices à base de dérivés carbazole aminés pour la conception de biopiles enzymatiques

L’objectif général de cette thèse est de développer une plateforme d’immobilisation d’enzymes efficace pour application en biopile. Grâce à la microencapsulation ainsi qu’au choix judicieux des matériaux polymériques pour la fabrication de la plateforme d’immobilisation, l’efficacité du transfert électronique entre l’enzyme encapsulée et l’électrode serait amélioré. Du même coup, les biopiles employant cette plateforme d’immobilisation d’enzymes pourrait voir leur puissance délivrée être grandement augmentée et atteindre les niveaux nécessaires à l’alimentation d’implants artificiels pouvant remplacer des organes telque le pancréas, les reins, le sphincter urinaire et le coeur. Dans un premier temps, le p-phénylènediamine a été employé comme substrat pour la caractérisation de la laccase encapsulée dans des microcapsules de poly(éthylèneimine). La diffusion de ce substrat à travers les microcapsules a été étudiée sous diverses conditions par l’entremise de son oxidation électrochimique et enzymatique afin d’en évaluer sa réversibilité et sa stabilité. La voltampérométrie cyclique, l’électrode à disque tournante (rotating disk electrode - RDE) et l’électrode à O2 ont été les techniques employées pour cette étude. Par la suite, la famille des poly(aminocarbazoles) et leurs dérivés a été identifée pour remplacer le poly(éthylèneimine) dans la conception de microcapsules. Ces polymères possèdent sur leurs unités de répétition (mono- ou diamino) des amines primaires qui seraient disponibles lors de la polymérisation interfaciale avec un agent réticulant tel qu’un chlorure de diacide. De plus, le 1,8-diaminocarbazole (unité de répétition) possède, une fois polymérisé, les propriétés électrochimiques recherchées pour un transfert d’électrons efficace entre l’enzyme et l’électrode. Il a toutefois été nécessaire de développer une route de synthèse afin d’obtenir le 1,8-diaminocarbazole puisque le protocole de synthèse disponible dans la littérature a été jugé non viable pour être utilisé à grande échelle. De plus, aucun protocole de synthèse pour obtenir du poly(1,8-diaminocarbazole) directement n’a été trouvé. Ainsi, deux isomères de structure (1,6 et 1,8-diaminocarbazole) ont pu être synthétisés en deux étapes. La première étape consistait en une substitution électrophile du 3,6-dibromocarbazole en positions 1,8 et/ou 1,6 par des groupements nitro. Par la suite, une réaction de déhalogénation réductive à été réalisée en utilisant le Et3N et 10% Pd/C comme catalyseur dans le méthanol sous atmosphère d’hydrogène. De plus, lors de la première étape de synthèse, le composé 3,6-dibromo-1-nitro-carbazole a été obtenu; un monomère clé pour la synthèse du copolymère conducteur employé. Finalement, la fabrication de microcapsules conductrices a été réalisée en incorporant le copolymère poly[(9H-octylcarbazol-3,6-diyl)-alt-co-(2-amino-9H-carbazol-3,6-diyl)] au PEI. Ce copolymère a pu être synthétisé en grande quantité pour en permettre son utilisation lors de la fabrication de microcapsules. Son comportement électrochimique s’apparentait à celui du poly(1,8-diaminocarbazole). Ces microcapsules, avec laccase encapsulée, sont suffisamment perméables au PPD pour permettre une activité enzymatique détectable par électrode à O2. Par la suite, la modification de la surface d’une électrode de platine a pu être réalisée en utilisant ces microcapsules pour l’obtention d’une bioélectrode. Ainsi, la validité de cette plateforme d’immobilisation d’enzymes développée, au cours de cette thèse, a été démontrée par le biais de l’augmentation de l’efficacité du transfert électronique entre l’enzyme encapsulée et l’électrode.

Acid activated montmorillonite: an efficient immobilization support for improving reusability, storage stability and operational stability of enzymes

Three enzymes, α-amylase, glucoamylase and invertase, were immobilized on acid activated montmorillonite K 10 via two independent techniques, adsorption and covalent binding. The immobilized enzymes were characterized by XRD, N2 adsorption measurements and 27Al MAS-NMR spectroscopy. The XRD patterns showed that all enzymes were intercalated into the clay inter-layer space. The entire protein backbone was situated at the periphery of the clay matrix. Intercalation occurred through the side chains of the amino acid residues. A decrease in surface area and pore volume upon immobilization supported this observation. The extent of intercalation was greater for the covalently bound systems. NMR data showed that tetrahedral Al species were involved during enzyme adsorption whereas octahedral Al was involved during covalent binding. The immobilized enzymes demonstrated enhanced storage stability. While the free enzymes lost all activity within a period of 10 days, the immobilized forms retained appreciable activity even after 30 days of storage. Reusability also improved upon immobilization. Here again, covalently bound enzymes exhibited better characteristics than their adsorbed counterparts. The immobilized enzymes could be successfully used continuously in the packed bed reactor for about 96 hours without much loss in activity. Immobilized glucoamylase demonstrated the best results.

Chitosan as a wall material for a microencapsulated delivery system for Macrobrachium rosenbergii(de Man) larvae

Chitosan has beenwidely accepted as awall material for preparing microcapsules of various purposes in human medicine. The possibility of using chitosan as a wall material for microencapsulating nutrients and drugs for aquaculture purposes, speci¢cally to Macrobrachium rosenbergii larvae was evaluated in this study. Two types of chitosan-coated microcapsules were prepared using either acetone (MEC-A) or NaOH (MEC-N) as the cross-linking agents. They were compared with a microbound diet relative to total leaching of nutrients and free amino acids (FAA). Among the microcapsules, MEC-N showed the lowest level of total leaching of nutrients (23.3%) during 5 h of immersion in seawater and released 65% FAA after 60min. During laboratory trials,75% larvae had accepted the MEC-N capsule. The results of the study suggest that chitosan can be used as a wall material for preparing microcapsules to deliver drugs and nutrients to M. rosenbergii larvae.