Sponges as substrata and early life history of the tubulariid Zyzzyzus warreni (Cnidaria: Hydrozoa) in the Sao Sebastiao Channel, Brazil

The hydroid Zyzzyzus warreni is usually found in shallow coastal waters forming aggregations of solitary polyps embedded in demosponges. Early life history transformations and settlement responses by the actinulae of this hydroid were studied in the laboratory using 13 species of sponges and 2 species of algae collected in the Sao Sebastiao Channel (Brazil) as substrata. The absence of oral tentacles and mouth in the actinulae and early events of metamorphosis suggest that these larvae are unable to spend long periods in the plankton and attach quickly near conspecifics when a preferred substratum is encountered. The time required for settlement and the number of elicited settlings indicated four settlement responses: (a) frequent and short-time settlement, in actinulae exposed to Halichondria cebimarensis, Mycale angulosa, M. aff. americana, M. laxissima (skeleton) and Tedania ignis; (b) moderate and delayed settlement, in actinulae exposed to Aplysina caissara, A. fulva, Haliclona melana and M. microsigmatosa; (c) no settlement, in actinulae exposed to Suberites aurantiacus and to the algae Hypnea musciformis and Sargassum cymosum; and (d) lethal response, in actinulae exposed to Amphimedon viridis, Aplysilla rosea, Dragmacidon reticulatum and M. laxissima. These responses indicate a considerable degree of species discrimination by the actinulae and are consistent with substrata used by the hydroid in the natural environment.

Identifizierung und Charakterisierung neuer Proteine des Abwehrsystems der Porifera - ein Apoptoseregulator und ein antimikrobielles Protein aus dem Schwamm Suberites domuncula

Aufgrund ihrer Lebensweise und -umgebung sind effiziente Strategien zur Abwehr bedrohender Einflüsse essentiell für die Porifera. Eine dieser Strategien stellen die Apoptose in höheren Metazoen, sowie ein effizientes Immunsystem dar. Diese sichern sowohl das Überleben des Organismus als auch die Entfernung beschädigter, infizierter oder redundanter Zellen. Bei Untersuchungen der Porifera auf Moleküle, die an diesen Prozessen beteiligt sind, konnten in den letzten Jahren beachtliche Erfolge erzielt werden. So konnten das in der Apoptose involvierte Protein GCDD2 (proapoptotisch), die antiapoptotischen GCBHP1 und GCBHP2 Proteine (Wiens et al., 2001), sowie ein LPS induzierbarer TNF (Wiens et al., 2007) und zwei Caspasen (Wiens et al., 2003) in Schwämmen identifiziert werden. Um diese essentiellen Mechanismen besser verstehen zu können, sollte ein möglicher Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor identifiziert werden. Hierzu wurde die SpongeBase Datenbank nach Proteinen mit Todesdomänen durchsucht und diese unter Anwendung von PCR- und Screening-Techniken in einer cDNA-Bank des marinen Schwammes S. domuncula komplettiert. Im Anschluss an ihre Sequenzierung wurde ein Klon ausgewählt, dessen Todesdomäne größte Homologie zu einem TNFR zeigte. Dieser Klon SD_TNFR-like (Suberites domuncula TNFR-homologes Protein) wurde anschließend diversen Sequenz- und Strukturanalysen unterzogen. Diese offenbarten die Existenz zweier funktional bedeutsamer Domänen (Ubiquitin-like und Todesdomäne). Vor allem die Todesdomäne impliziert eine Beteiligung des Proteins an apoptotischen Prozessen. Über einen „Yeast Two Hybrid Screen“ sollten Proteine identifiziert werden, welche mit dem Ausgangsprotein interagieren. Hierbei wurde ein Protein identifiziert, das Ähnlichkeit mit einem antimikrobiellen Peptid aufweist. Dieses Protein kann analog zu einer Gruppe von antimikrobiellen Peptiden, den α-helikalen kationischen Peptiden, in drei Teile gespalten werden. Das Signalpeptid sowie ein anionisches Propeptid werden abgespalten und es entsteht ein kationisches, antimykotisch wirksames Peptid. Beide Proteine sollten, sofern sie in die Abwehrreaktionen involviert sind, durch Inkubation mit mikrobiellen Strukturen vermehrt exprimiert werden. Eine Überprüfung der Transkription mittels Northern Blot Analysen bestätigte dies für das SD_TNFR-like nach Inkubation mit LPS und TNF- α sowie für SD_Brevinin-like nach Inkubation mit LPS, PAM und Hefe. Mit der Herstellung eines rekombinanten SD_TNFR-like-Proteins wurde die Immunisierung von Kaninchen und die folgende Gewinnung eines polyklonalen SD_TNFR-like-Antikörpers ermöglicht. Dieser gestattete den Nachweis der SD_TNFR-like -Expression mittels Western Blot-Analysen sowie die stressinduzierte erhöhte Expression mittels Dot Blot-Analysen auch auf Proteinebene. Um die Funktion des SD_TNFR-like Proteins zu charakterisierten, wurde ein Test mit RAW-Blue™-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse implizieren, dass das Protein Teil der Immunreaktion analog der der TLR- bzw. NLR- Reaktion ist. Auch die Interaktion mit einem antimikrobiellen Protein, welches für das Überleben des Organismus und die Bekämpfung der Mikroorganismen sorgt, deutet auf eine solche Beteiligung hin. Zusätzlich wird diese These durch ein Ergebnis der Strukturanalysen unterstützt, nämlich die Identifizierung einer TRAF2 Bindestelle. TRAF2 ist ein Adapterprotein der TNFR und aktiviert Überlebensfaktoren über den NF - B-Weg. Immunohistochemische Analysen zeigten, dass das SD_TNFR-like Protein im Organismus vor allem um die Bakteriozysten, um verschiedene Mikroorganismen und am Rand des Schwammes exprimiert wird, was ebenfalls für eine immunologische Funktionsweise spricht. Auch im restlichen Gewebe wird es kontinuierlich, auch ohne vorherige LPS Inkubation exprimiert. Diese Akkumulation zeigt deutlich, dass das Protein in einen Schutzmechanismus gegen äußere Bedrohungen involviert ist. Es scheint dabei direkt an den eindringenden Mikroorganismen zu wirken. Das SD_TNFR-like ist demnach ein potentieller Bestandteil der Immunantwort des Schwammes, welches Apoptose verhindern und Überlebensmechanismen aktivieren kann. Das SD_Brevinin-like Protein besitzt antimykotische Aktivität, wie in einem antimikrobiellen Test gezeigt werden konnte. Weiterhin scheint es für das SD_TNFR-like Protein als positiver bzw. negativer Regulator von Bedeutung zu sein, der eine Reaktion entweder beendet oder die Expression von Überlebensfaktoren verstärkt. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse und Schlussfolgerungen demonstrieren somit die Identifizierung eines neuen Schwammproteins, welches eine Rolle in der Immunantwort spielt, sowie eines neuen antimikrobiellen Peptids, welches die Wirkung des TNFR-like moduliert. Es müssen jedoch noch weitere Funktionsanalysen folgen, um den Mechanismus des SD_TNFR-like Proteins und seine Regulation genauer charakterisieren zu können

Klonierung und Charakterisierung der Luziferase und des Luziferin regenerierenden Enzyms aus dem marinen Schwamm Suberites domuncula

Bereits 1971 erkannte Reiswig bei einigen Schwämmen in der Kontraktion des Osculums eine Reaktion auf Licht. Nachfolgend konnte für eine Reihe von Schwämmen die Existenz von Lichtreaktionen beobachtet werden (Wapstra & van Soest, 1987). In dieser Arbeit sollten Gene eines Luziferin/Luziferase Systems im marinen Schwamm Suberites domuncula identifiziert werden, die eine Rolle bei der Bio¬lumineszenz spielen. Mit Hilfe der PCR-Technik konnten die in der cDNA-Bank identifizierten Fragmente einer Luziferase und eines Luziferin regenerierenden Enzyms erfolgreich vervollständigt, kloniert und analysiert werden. Datenbank¬analysen der abgeleiteten Aminosäuresequenzen ergeben sowohl für die Luziferase als auch für das Luziferin regenerierende Enzym Ähnlichkeiten zu den entsprechenden Proteinen aus Leuchtkäfern, wie z. B. Photinus pyralis. Ausgehend von der cDNA wurden zunächst beide Enzyme in E. coli rekombinant exprimiert und affinitätschromatographisch aufgereinigt. Für die Luziferase gelang es, spezifische Antikörper herzustellen, die im Anschluss an den im Western Blot durchgeführten Nachweis eine Identifizierung in histologischen Schwamm¬schnitten ermöglichte. Weitere Analysen konnten für Suberites domuncula sowohl im Schwammgewebe, im Proteinextrakt als auch für das rekombinante Protein die Licht-generierende Fähigkeit nachweisen. Das ermittelte in vitro Biolumineszenz-Emissionsspektrum der rekombinanten Luziferase weist eine Lichtemission im gelb-grünen Bereich des Spektrums mit einem Maximum bei 548 nm und einer Schulter bei 590 nm auf. Ausserdem bestätigte die Funktionanalyse des rekombinanten Enzyms die für Luziferasen bekannte ATP- und Temperatur¬abhängigkeit sowie den stimulierenden Effekt von Coenzym A. Die Existenz einer bioaktiven Luziferase in einem der ältesten, rezent vertretenen Metazoa deutet darauf hin, dass sich die Oxygenasefunktion der Luziferasen bereits früher entwickelte, als bisher von Viviani* vermutet. Die bisherigen Daten über die optischen Eigenschaften der Spiculae liefern gemeinsam mit den Ergebnissen dieser Arbeit – einer Licht-emittierenden Luziferase in S. domuncula – die Voraussetzungen für die mögliche Existenz eines Photorezeptionssystems in Schwämmen.

Identifizierung, Expression und Charakterisierung des Nanos-verwandten Proteins aus dem marinen Schwamm Suberites domuncula

Im Rahmen dieser Arbeit konnte in dem marinen Schwamm Suberites domuncula ein Gen identifiziert werden, dessen C-terminale konservierte Domäne eine hohe Sequenzähnlichkeit zu den Zinkfingerdomänen der Nanos-Proteine aufweist. Weiter konnte ein N-terminales Sequenzmotiv identifiziert werden, das eine hohe Sequenzidentität zu den konservierten NIM Motiven (CNOT1-interagierendes-Motiv) von Nanos zeigt. Nach der Klonierung der cDNA erfolgte die Expression des als Sd_nrp bezeichneten Proteins in E. coli Bakterien, für dessen 231 Aminosäuren umfassende Polypeptidkette eine theoretische Molekülmasse von 25.8 kDa berechnet wurde. Anschließend gelang ein Nachweis des Proteins mithilfe eines polyklonalen, gegen Sd_nrp gerichteten Antikörpers in drei Gewebetypen, dem Pinacoderm, den Primmorphen (3D-Zellaggregate) und den Gemmulae (Dauerstadien der Schwämme). Dabei konnte die höchste Expression von Sd_nrp in den als totipotent geltenden Stammzellen der Schwämme, den Archaeocyten innerhalb der Gemmulae beobachtet werden. Die Identifizierung der Zellstrukturen, erfolgte dabei aufgrund morphologischer Vergleiche. Speziell die Merkmale der Zellen in den Gemmulae, der große Nukleus, die amöboide Form sowie die granulären Reservesubstanzen, entsprechen den typischen morphologischen Eigenschaften der Archaeocyten, und bestätigen die Interpretation der Ergebnisse. Weiter konnte mit Hilfe des Anti-Sd_nrp Antikörpers das native Protein in Proteinextrakten aus Gewebe adulter Tiere nachgewiesen werden. Die vergleichende Sequenzanalyse von Sd_nrp mit dem Nanos-verwandten Protein der Schwammspezies Ephydatia fluviatilis und die phylogenetische Stammbaum-Analyse mit Nanos-Homologen unterschiedlicher Invertebraten und Vertebraten lässt die Schlussfolgerung zu, dass es sich bei dem hier identifizierten Protein Sd_nrp um ein Nanos-verwandtes Protein handelt. Darüber hinaus konnte anhand eines Homologiemodells bestätigt werden, dass es sich bei der konservierten C-terminalen Domäne des Proteins Sd_nrp um die für Nanos-Proteine spezifische Zinkfingerstruktur mit dem konservierten Sequenzmotiv CCHC handelt. Dieses Ergebnis konnte auch bei einem Vergleich der Zinkfingerdomäne von Sd_nrp mit den Zinkfingerdomänen der Nanos-Homologen unterschiedlicher Invertebraten- und Vertebratenspezies bestätigt werden.

Long-term trends in invertebrate–habitat relationships under protected and fished conditions

Few studies examine the long-term effects of changing predator size and abundance on the habitat associations of resident organisms despite that this knowledge is critical to understand the ecosystem effects of fishing. Marine reserves offer the opportunity to determine ecosystem-level effects of manipulated predator densities, while parallel monitoring of adjacent fished areas allows separating these effects from regional-scale change. Relationships between two measures of benthic habitat structure (reef architecture and topographic complexity) and key invertebrate species were followed over 17 years at fished and protected subtidal rocky reefs associated with two southern Australian marine reserves. Two commercially harvested species, the southern rock lobster (Jasus edwardsii) and blacklip abalone (Haliotis rubra) were initially weakly associated with habitat structure across all fished and protected sites. The strength of association with habitat for both species increased markedly at protected sites 2 years after marine reserve declaration, and then gradually weakened over subsequent years. The increasing size of rock lobster within reserves apparently reduced their dependency on reef shelters as refuges from predation. Rising predation by fish and rock lobster in the reserves corresponded with weakening invertebrate–habitat relationships for H. rubra and sea urchins (Heliocidaris erythrogramma). These results emphasise that animal–habitat relationships are not necessarily stable through time and highlight the value of marine reserves as reference sites. Our work shows that fishery closures to enhance populations of commercially important and keystone species should be in areas with a range of habitat features to accommodate shifting ecological requirements with ontogenesis.

1,3-Dimethylisoguanine

The structure of 1,3-dimethylisoguanine [ or 6-amino-1,3-dimethyl-1H-purin- 2(3H)- one], C7H9N5O, has been redetermined and the correct assignment of H atoms on the heterocycle is now reported. Intermolecular hydrogen-bonding interactions confirm that this form is the correct molecular structure; this form is also in agreement with an earlier reported structure of the trihydrate form.

Microsensors technology used to measure productivity and other biochemical processes in the upper regions of aquatic sediments

Carbonate sediments are dynamic three-dimensional environments where the surface layers are constantly moving and mixing due to the energy of the water column. It is also an environment of dynamic biological, chemical and physical interaction and modification. The biological community can actively influence changes to sediment characteristics and associated biochemistry. Bioturbation resulting from macrofaunal activity disrupts sediment structure and biochemical arrangements and reduces the critical shear forces required to move sediment particles, adding to the dynamic and complex physical and biogeochemical nature of the sediment. Laboratory studies using both planner optodes and glass needle microsensors were used to measure abiotic sediment characteristics such as the depth distribution and concentrations of PAR. The biochemical nature of coral reef sediment were also investigated, specifically the quantification and the distribution of dissolved oxygen within coarse and fine-grained sediments under regimes of light and darkness. Results highlighted the significant contribution microalgal productivity and bioturbation has on distribution of dissolved oxygen in the upper sediment layers. On the reef flat a shallow water lander system was employed to measure concentrations of O2, pH, S, Ca and temperature over periods of 24 to 48 hours in coarse and fine-grained sediments. Similarities between laboratory and in situ results where evident, however the in situ environment was more dynamic and the distribution and concentrations of dissolved oxygen were more complex and correlated to irradiance, temperature and biological activity. Microsensor technology provides us with the opportunity to study, at very high resolutions, the upper irradiated; photosynthetically active regions of aquatic sediments along with anoxic processes deeper in sub-euphotic regions of the sediments.