The mitochondrial transcription factor A functions in mitochondrial base excision repair

Mitochondrial transcription factor A (TFAM) is an essential component of mitochondrial nucleoids TFAM plays an important role in mitochondrial transcription and replication TFAM has been previously reported to inhibit nucleotide excision repair (NER) in vitro but NER has not yet been detected in mitochondria, whereas base excision repair (BER) has been comprehensively characterized in these organelles The BER proteins are associated with the inner membrane in mitochondria and thus with the mitochondrial nucleoid, where TFAM is also situated However, a function for TFAM in BER has not yet been investigated This study examines the role of TFAM in BER In vitro studies with purified recombinant TFAM indicate that it preferentially binds to DNA containing 8-oxoguanines, but not to abasic sites, uracils, or a gap in the sequence TFAM inhibited the in vitro incision activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1), uracil-DNA glycosylase (UDG), apurinic endonuclease 1 (APE1), and nucleotide incorporation by DNA polymerase gamma (pol gamma) On the other hand, a DNA binding-defective TFAM mutant, L58A, showed less inhibition of BER in vitro Characterization of TFAM knockdown (KD) cells revealed that these lysates had higher 8oxoG incision activity without changes in alpha OGG1 protein levels TFAM KD cells had mild resistance to menadione and increased damage accumulation in the mtDNA when compared to the control cells In addition, we found that the tumor suppressor p53, which has been shown to interact with and alter the DNA binding activity of TFAM, alleviates TFAM-Induced inhibition of BER proteins Together, the results suggest that TFAM modulates BER in mitochondria by virtue of its DNA binding activity and protein interactions Published by Elsevier B V

Representa����es sociais de enfermeiros brasileiros e portugueses sobre o estresse em servi��o de urg��ncia

This study aimed to analyze the social representations of Brazilian and Portuguese nurses on stress in the emergency service. A semi-structured interview and the free word association test, with "stress" as the inductive stimulus, were used as research instruments. Data were collected from 120 nurses, being 60 from an emergency hospital in the city of Natal, Brazil and 60 from an urgency hospital in the city of Aveiro, Portugal. Data from the word association test were analyzed with the EVOC 2002 program, after thematic categorical content analysis, enabling construction of a data bank. Data gathered from the interview were analyzed by ALCESTE 4.8 software. Nurse represent the stress in the urgency department as a generation of physical and mental detrition where adaptation is unsatisfactorily, resulting in the onset of fatigne, irritability, lack of concentration, lack of motivation, pessimism, impaired interpersonal relationship and low productivity. The solution is part of a complex whole, which demands an integrated way of acting that has demanded increasingly professional attitudes based on multidisciplinarity

Gene Mutations in Esophageal Mucosa of Chagas Disease Patients

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)

An��lise comparativa de genes das case��nas de b��falo

P��s-gradua����o em Gen��tica e Melhoramento Animal - FCAV

Estrutura e fun����o da prote��na YacG de Klebsiella pneumoniae e seus derivados pept��dicos

P��s-gradua����o em Biotecnologia - IQ

Entwicklung neuer Biomarker zur Detektion von Umweltbelastung

Es wurde bis heute meist mit relativ aufwendigen Methoden nach dem Vorkommen von Strangbr��chen in der DNA gesucht. Die hier verwendete Fast-Micromethod steht jetzt neben mehreren bereits etablierten Methoden zur qualitativen und quantitativen Erfassung von DNA-Strangbr��chen zur Verf��gung. Die Methode wurde zur schnellen und empfindlichen Messung von DNA-Sch��den und deren Reparatur unter Verwendung von PicoGreen, einem spezifisch an DNA-Einzelstr��nge bindenden Fluoreszenzfarbstoff, durchgef��hrt. Die Methode wurde in der vorliegenden Arbeit f��r verschiedene Zellarten wie HeLa-Zellen und Schwamm-Zellen mit Schwermetallionen verwendet. Sie wurde ebenfalls bei verschiedenen Strangbruch-induzierenden Stoffen wie NQO und physikalischen Faktoren wie UV-Bestrahlung und Gammastrahlung erfolgreich eingesetzt. Die Strangbr��che wurden bei HeLa-Zellen mit 10 ��M NQO nach 90 Minuten Inkubation und ebenso bei Gammastrahlung mit 16 Gy gemessen. An Schwammzellen wurden Effekte von Schwermetallionen und UV, auch einschlie��lich nachgeschalteter Reparaturaktivit��t, gemessen. Dabei war die Reparatur jedoch nicht ganz vollst��ndig. Durch die Fast-Micromethod wurde DNA-Sch��digung durch UV-Bestrahlung und Gentoxizit��t von Schwermetall-Ionen an HeLa-Zellen nachgewiesen. Die Schwammzellen wurden mit verschiedenen Schwermetall-Ionen in verschiedenen Konzentrationen getestet und mit UV bei verschiedenen Dosen bestrahlt. Teilweise wurde nach dem Einfluss die DNA-Reparatur erfasst. Schwammzellen wurden in den drei h��ufig verwendeten Medien CMFSW, CMFSW+EDTA und Seewasser aufgenommen. Im Seewasser waren die Zellen nach 60 Minuten Inkubationszeit aggregiert (Primmorphe). Im CMFSW+EDTA Medium lagen dagegen nur Einzellen vor, da die Zellen im EDTA-Medium dissoziiert wurden und auch nicht mehr proliferierten.

Die eNOS als ein therapeutisches Zielmolek��l kardiovaskul��rer Erkrankungen

Die endotheliale NO-Synthase (eNOS) erf��llt ��� solange sie funktionell ist ��� vasoprotektive und anti-atherosklerotische Funktionen im kardiovaskul��ren System. So stellt die eNOS ein therapeutisches Zielmolek��l kardiovaskul��rer Erkrankungen dar. Unter pathophysiologischen Bedingungen wurden Hinweise auf eine ���eNOS-Entkopplung���, d.h. die NOS-katalysierte Produktion von reaktiven Sauerstoff-Spezies, gefunden. Wir haben in den letzten Jahren Substanzen identifiziert, die die eNOS-Expression steigern, aber auch gleichzeitig die eNOS-Entkopplung revertieren k��nnen. Midostaurin z.B. korrigierte einerseits die eNOS-Entkopplung durch Unterdr��ckung der Expression der vaskul��ren NADPH-Oxidasen und erh��hte andererseits die eNOS-Expression im Gef����-Endothel. Kombination dieser beiden Wirkungen f��hrte zur Relaxation der Widerstandsgef����e in atherosklerotischen M��usen und zur Blutdrucksenkung in spontan-hypertensiven Ratten. So scheint es eine praktikable Strategie f��r kardiovaskul��re Erkrankungen zu sein, die eNOS-Expression zu steigern und gleichzeitig die eNOS-Entkopplung zu verhindern bzw. eine bereits bestehende eNOS-Entkopplung zu revertieren.

Der enzymatische und anti-oxidative Mechanismus des anti-atherogenen Enzyms Paraoxonase-2

Das humane Enzym PON2 ist in eine Vielzahl pathophysiologischer Prozesse involviert und ist durch zwei Funktionen gekennzeichnet - eine enzymatische Laktonase-Aktivit��t und eine anti-oxidative Aktivit��t. Durch die Laktonase-Aktivit��t hydrolysiert PON2 vorwiegend das bakterielle Signalmolek��l 3oxoC12. PON2 ist als Bestandteil des angeborenen Immunsystems anzusehen und tr��gt wahrscheinlich zur Immunabwehr gegen Infektionen mit den human-pathogenen Pseudomonas aeruginosa Bakterien bei. Durch die anti-oxidative Aktivit��t vermindert PON2 oxidative Sch��den und verringert redox-abh��ngige pro-apoptotische Stimulation. Diese einzigartige Funktion von PON2 ist jedoch ambivalent zu betrachten, da hohe PON2-Spiegel zwar Arteriosklerose reduzieren k��nnen, aber im Verdacht stehen Tumorzellen zu stabilisieren.rnIn dieser Arbeit wurden die noch unbekannten Mechanismen und der Zusammenhang der enzymatischen und der anti-oxidativen Aktivit��t analysiert. In diesem Rahmen wurde gezeigt, dass PON2 spezifisch die Superoxidfreisetzung an Komplex I und III der Atmungskette in der inneren Mitochondrienmembran reduzieren kann. PON2 ver��nderte dabei weder die Aktivit��ten der Superoxiddismutasen noch die Cytochrom C-Expression. Weiterhin konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass PON2 O2- nicht direkt abbaut, sondern vielmehr dessen Bildung verhindert. Diese Erkenntnisse implizieren, dass PON2 die anti-oxidative Aktivit��t ��ber eine Beeinflussung des Quinon-Pools vermittelt. Anhand von verschiedenen Punktmutationen konnte gezeigt werden, dass die Histidinreste-114 und -133 f��r die Laktonase-Aktivit��t essentiell sind. Weiterhin wurden die Glykosylierungsstellen von PON2 identifiziert und gezeigt, dass die Glykosylierung, nicht aber der nat��rliche Polymorphismus Ser/Cys311 f��r die Laktonase-Aktivit��t von Bedeutung ist. Von besonderer Bedeutung ist, dass keine dieser Mutationen die anti-oxidative Aktivit��t beeinflusste, wodurch erstmals die Unabh��ngigkeit der beiden Funktionen von PON2 gezeigt werden konnte. rnEs war bekannt, dass PON2 gegen intrinsische und ER-Stress-induzierte Apoptose sch��tzt. Die Spezifit��t der anti-oxidativen / anti-apoptotischen Wirkung wurde hier an einem weiteren pathophysiologischen Modell untersucht. 7-Ketocholesterol (7-KC) ist der Hauptbestandteil des pro-arteriosklerotischen oxLDL und verursacht in Zellen des Gef����systems ER-Stress, oxidativen Stress und Apoptose. Unerwarteterweise konnte PON2 Endothelzellen nicht gegen den 7-KC-induzierten Zelltod sch��tzen. Mehrere unabh��ngige experimentelle Ans��tze belegen, dass 7-KC in Endothelzellen im Gegensatz zu Gef����muskelzellen den Zelltod ��ber Autophagie und nicht ��ber ER-Stress oder intrinsische Apoptose bewirkt. Weiterhin f��hrt 7-KC, wie auch 3oxoC12 und Thapsigargin zu einem Abbau der PON2-mRNA, die ��ber die 5���UTR der PON2-mRNA vermittelt wird. Diese Arbeit vermittelt detaillierte mechanistische Einsichten in die Funktionen von PON2, die f��r ihre Rolle bei Arteriosklerose, in der k��rpereigenen Immunabwehr und bei Krebs entscheidend sind.rn

Identifizierung, Quantifizierung und Hemmung von ausgew��hlten Hefen im Wein

Hefen stellen einen gro��en und wichtigen Teil der Mikrobiota w��hrend der Weinbereitung dar, da ohne ihre alkoholische Fermentation die Umwandlung von Most und Wein nicht m��glich w��re. Ferner ist es ihre Vielzahl an Stoffwechselprodukten, die dem Aroma des fertigen Weines eine zus��tzliche Komplexit��t verleihen. Auf der anderen Seite steht durch den Metabolismus verschiedenster so genannter Wildhefen die Gefahr von Qualit��tsabstufungen der Weine, was allgemein als ���Weinfehler��� betrachtet wird. Ziel dieser Arbeit war zum einen die taxonomische Einordnung von Saccharomyces-Spezies, sowie die Quantifizierung und Hemmung von ausgew��hlten Wildhefen w��hrend der Weinbereitung.rnEin Teil dieser Arbeit umfasste die Identifizierung der nahverwandten Mitglieder der Saccharomyces sensu stricto-Gruppe. Durch den Einsatz des DNA-Fingerpinting-Systems SAPD-PCR konnten alle die Gruppe umfassenden Spezies anhand spezifischer Bandenmuster nachgewiesen werden, wodurch eine Einordnung dieser schwer zu differenzierenden Arten m��glich war. Die Differenzierung zwischen den einzelnen Spezies war in jedem Fall deutlicher als dies die Sequenzierung der 5.8S rDNA und ihre flankierenden ITS-Regionen vermochte. Die SAPD-PCR zeichnete sich zudem durch eine geringe Muster-Varianz bei verschiedenen St��mmen einer Art aus und konnte zuverl��ssig unbekannte St��mme bestimmen und bereits hinterlegte St��mme neu klassifizieren. Zudem konnte mit Hilfe dieses Systems Hybride aus Saccharomyces cerevisiae und S. bayanus bzw. S. cerevisiae und S. kudriavzevii detektiert werden, wenn diese Hybride aus relativ gleichen genomischen Anteilen der Eltern bestanden. rnZus��tzlich wurde ein quantitatives PCR-System entwickelt, um die Gattungen Saccharomyces, Hanseniaspora und Brettanomyces in Most und Wein detektieren und quantifizieren zu k��nnen. Die hierf��r entwickelten Primer zeigten sich spezifisch f��r die untersuchten Arten. Durch die serielle Verd��nnung definierter DNA-Mengen konnte f��r alle drei Systeme eine Kalibrierungskurve erstellt werden, mit Hilfe derer die tats��chlichen Quantifizierungen durchgef��hrt wurden. Die qPCR-Analyse lieferte ��hnliche Zellzahlen wie Lebendzellzahl-Bestimmungen und wurde nicht von anderen Spezies und von Traubensaft gest��rt. Die maximal detektierbare Zellzahl betrug 2 x 107 Zellen/ml, w��hrend die minimale Detektionsgrenze je nach Art zwischen 1 x 102 Zellen/ml und 1 x 103 Zellen/ml lag. Allerdings konnte eine effektive DNA-Isolierung dieser geringen Zellzahlen nur erreicht werden, wenn die Zellzahl durch artfremde Hefen k��nstlich erh��ht wurde. Die Analyse einer Most-Verg��rung mit den drei Spezies zeigte schlussendlich, dass die quantitative PCR sicher und schnell Ver��nderungen und Sukzessionen detektiert und so ein geeignetes Mittel darstellt, um Populationsdynamiken w��hrend der Weinherstellung zu beobachten. rnDer letzte Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Inhibierung von Schadhefen durch zellwand-hydrolysierende Enzyme. Es konnte hierbei eine endoglykosidisch wirkende ��-1,3-Glucanase aus dem Bakterium Delftia tsuruhatensis isoliert werden. Diese besa�� eine ungef��hre Masse von 28 kDa, einen isolektrischen Punkt von ca. 4,3 und wirkte mit einer spezifischen Aktivit��t von 10 U/mg Protein gegen das Glucan Laminarin. Zudem zeigte das Enzym ein Temperaturoptimum von 50 ��C und ein pH-Optimum bei pH 4,0. Weinparameter wie erh��hte Konzentrationen an Ethanol, Phenolen und Sulfit beeinflussten die Wirkung des Enzyms nicht oder nur wenig. Neben der allgemeinen Wirkung gegen ��-1,3-Glucane konnte hier auch gezeigt werden, dass ebenso gut die ��-1,3-Glucane in der Zellwand verschiedener Hefen hydrolysiert wurden. Fluoreszenz- und rasterelektronen-mikroskopische Aufnahmen von Hefezellen nach Inkubation mit der ��-1,3-Glucanase zeigten zus��tzlich die Zerst��rung der Zelloberfl��che der Hefen. Die lytische Wirkung des Enzyms wurde an verschiedenen weintypischen Hefen getestet. Hierbei zeigten sich stammspezifische Unterschiede in der Sensitivit��t gegen��ber dem Enzym. Au��erdem konnte festgestellt werden, dass sowohl Wachstumsphase als auch Medium der Hefen Einfluss auf deren Zellwand hat und somit auch auf die Wirkung des Enzyms.rn

Ursachen der Anthrazyklin-induzierten Kardiotoxizit��t : Einfluss der individuellen genetischen Ausstattung, des oxidativen Stresses und der Metabolisierung

Doxorubizin (Dox) geh��rt zur Gruppe der Anthrazykline, welche seit mehreren Jahrzehnten erfolgreich gegen ein breites Spektrum an Tumoren eingesetzt wird. Neben der guten Wirksamkeit besitzt Dox jedoch auch ein sehr hohes Nebenwirkungspotential. Die wohl folgenschwerste Nebenwirkung stellt die irreversible Sch��digung des Herzens dar. Zahlreiche Faktoren, wie zum Beispiel die kumulative Dox-Dosis konnten bereits mit einer erh��hten Inzidenz an kardialen Sch��den in Verbindung gebracht werden. Bislang ungekl��rt war jedoch die Frage, warum Patienten unterschiedlich sensibel auf die Verabreichung von Dox reagierten. rnAn dem Patientenkollektiv der Ricover60-Studie wurde der Einfluss der individuellen genetischen Ausstattung auf die Entstehung der Anthrazyklin-induzierten Herzsch��digung untersucht. Alle Patienten mit Dox-induzierten Herzsch��den wurden identifiziert und auf das Vorhandensein von genetischen Polymorphismen der NAD(P)H-Oxidase (CYBA, RAC2 und NCF4) und der Anthrazyklin-Transporter (MRP1 und MRP2) untersucht. Sowohl f��r CYBA als auch f��r RAC2 konnte eine Anreicherung bestimmter Genotypen (CYBA: CT/TT; RAC2: TA/AA) in der Gruppe der herzgesch��digten Patienten nachgewiesen werden. In der Multivariaten Analyse von RAC2 erreichte diese Anreicherung ein signifikantes Niveau (p=0.028). Damit konnte f��r diesen Polymorphismus die klinische Relevanz best��tigt werden.rnDie Ursachen der Dox-induzierten Toxizit��t wurden au��erdem an verschiedenen M��usest��mmen und Zelllinien untersucht. Balb/c- und C57BL/6-M��use, die bekanntermassen unterschiedlich sensibel auf Dox reagierten, wurden mit Dox behandelt. Anschliessend wurden die Organe Herz, Leber und Blut via HPLC untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sich 1. die Hauptanreicherungsorte f��r Dox und Doxol (Balb/c: Herz und Blut versus C57BL/6: Leber), 2. die nachgewiesenen Gesamtmengen an Dox+Doxol+Doxon in den drei Organen (MengeC57BL/6 > MengeBalb/c) sowie 3. die An- und Abflutungsgeschwindigkeiten von Dox zwischen den beiden M��usest��mmen unterscheiden. Schlussendlich konnte im Vergleich zu den Balb/c-M��usen, bei den C57BL/6-M��usen eine st��rkere kardiale Anreicherung von Dox nach der mehrmaligen Dox-Injektion nachgewiesen werden. Somit scheinen der deutlich h��here Dox-Gehalt und die l��ngere Verweilzeit in den Herzen f��r die st��rkere kardiale Sch��digung der C57BL/6-M��use verantwortlich zu sein. Hingegen verlief die Art der Dox-Metabolisierung in beiden M��usest��mmen ��hnlich. rnBei der Betrachtung des oxidativen Stresses konnte gezeigt werden, dass in den Herzen der C57BL/6-M��usen ein gr����erer oxidativer Stress vorlag, als bei den Balb/c-M��usen. ��hnlich wie bei der Ricover60-Studie lie�� sich auch bei den M��usen eine Beteiligung der NAD(P)H-Oxidase am Dox-induzierten oxidativen Stress nachweisen. rnMit der HTETOP-Zelllinie konnte gezeigt werden, dass Dox unter physiologischen Bedingungen oxidativen Stress ausl��sen kann. Die Art und die Konzentration der gebildeten ROS waren abh��ngig von der Dox-Konzentration, der Einwirkzeit und der Kompensationsf��higkeit der Zellen. Durch die Gabe von Dex lie�� sich das Ausma�� des oxidativen Stresses lediglich in den M��useherzen reduzieren. In den HTETOP-Zellen zeigte Dex selbst stressausl��sende Eigenschaften. Durch die Behandlung mit Dex / DOXY konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der Topo II�� selbst oxidativen Stress in den HTETOP-Zellen ausl��st. Jedoch scheint weder die Topo IIalpha-Hemmung, noch der Dox-induzierte oxidative Stress bei physiologischen Dox-Konzentrationen (< 1 ��M) eine entscheidende Rolle f��r die Toxizit��t zu spielen. rnIn der Mikroarray-Analyse der HTETOP-Zellen konnten verschiedene Gene identifiziert werden, die in den oxidativen Stress involviert sind und die durch die Gabe von Dox differentiell reguliert werden. Durch die Komedikation mit Dex / DOXY lie��en sich diese Ver��nderungen teilweise modulieren. rn

Untersuchungen zur Chemosensitivit��t von testikul��ren Tumorzellen gegen��ber Cisplatin

Metastasierender Krebs ist bei Erwachsenen in der Regel nicht heilbar. Eine Ausnahme stellen testikul��re Keimzelltumoren (TKZT) dar, da ��ber 75 % der Patienten mit fortgeschrittenen metastasierenden TKZT mit einer auf Cisplatin basierenden Kombinations-Chemotherapie geheilt werden k��nnen. Zelllinien, die aus TKZT isoliert wurden, behalten diese Cisplatin-Sensitivit��t in vitro bei. Somit spiegeln Testistumorzelllinien die klinische Situation wider und sind deswegen ein gutes Modellsystem um zu untersuchen, welche Faktoren der Cisplatin-Sensitivit��t zugrunde liegen. Die Ursachen der Cisplatin-Sensitivit��t in Testistumoren sind nicht bekannt. Es wurde bereits gezeigt, dass Testistumorzellen eine geringe Kapazit��t f��r die Entfernung von Cisplatin-induzierten DNA-Platinierungen aufweisen. Dieser Defekt in der DNA-Reparatur k��nnte ein Faktor f��r die beobachtete Cisplatin-Sensitivit��t sein. Cisplatin induziert sowohl Intrastrang-Vernetzungen als auch Interstrang-Vernetzungen (ICLs). Die Bildung und Reparatur der Cisplatin-induzierten Intrastrang-Vernetzungen wurde mittels DNA-Slot-Blot, die Bildung und Entfernung von Interstrang-Vernetzungen wurde mithilfe des Comet-Assays untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Reparatur von Intrastrang-Vernetzungen in Testis- und Blasentumorzelllinien vergleichbar ist. Somit sind Testistumorzellen in diesem Reparaturweg nicht beeintr��chtigt. Im Unterschied dazu zeigte sich, dass Testistumorzellen die ICLs nicht oder nur mit einer reduzierten Kapazit��t entfernen k��nnen.Da die ICL-Reparatur ��ber die Bildung von DNA-Doppelstrangbr��chen (DSB) mit anschlie��ender DSB-Reparatur verl��uft, wurde die Kinetik der DSB-Reparatur anhand der Immundetektion der Histon-Variante ��H2AX, die zur Visualisierung von DSB verwendet wird, verfolgt. ��H2AX Foci wurden nach Behandlung mit Cisplatin in Testistumorzellen und Blasentumorzellen gebildet. Anders als in Blasentumorzellen blieb der Prozentsatz an ��H2AX-positiven Zellen in Testistumorzellen bestehen. Offensichtlich konnten die Testistumorzellen die Cisplatin-induzierten ICLs nicht korrekt prozessieren, was dazu f��hrte, dass ��H2AX Foci persistierten. Da unreparierte DNA-L��sionen eine DNA-schadensabh��ngige Antwort einleiten k��nnen, wurde die Aktivierung der Hauptfaktoren dieser Signalwege untersucht. In den Testistumorzellen zeigte sich eine Erh��hung der p53 Proteinmenge nach Cisplatin-Behandlung. Des Weiteren wurde die durch Cisplatin induzierte Aktivierung von ATM/ATR, Chk1/Chk2, Bax und Noxa in Testis- und Blasentumorzellen vergleichend untersucht. Es wurde bereits gezeigt, dass der Reparaturfaktor ERCC1-XPF in Testistumorzelllinien reduziert vorliegt. Um eine m��gliche Rolle von ERCC1-XPF f��r die Reparatur-Defizienz der ICLs und Cisplatin-Sensitivit��t in Testistumorzellen zu analysieren, wurde ERCC1-XPF in der Testistumorenzelllinie 833K mithilfe eines Expressionsvektors ��berexprimiert, und der Einfluss von ERCC1-XPF auf ICL-Reparatur sowie Cisplatin-Sensitivit��t wurde ermittelt. ��berexpression von ERCC1-XPF f��hrte zur Reparatur der ICLs in 833K-Zellen und verminderte die Cisplatinsensitivit��t. Somit scheint die Cisplatinsensitivit��t der Testistumorzellen, zumindest zum Teil, auf einer verminderten ICL-Reparatur zu beruhen. Des Weiteren wurde in ���proof of principle��� Experimenten ERCC1-XPF in der Cisplatin-resistenten Blasentumorzelllinie MGH-U1 mittels siRNA herunterreguliert, und die Auswirkung der Herunterregulation auf die ICL-Reparatur und die Cisplatinsensitivit��t wurde gepr��ft. RNA-Interferenz-vermittelte Herunterregulierung von ERCC1-XPF reduzierte die Prozessierung der Cisplatin-induzierten ICLs und verst��rkte die Cisplatinsensitivit��t in MGH-U1 Zellen. Somit wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt, dass die Testistumorzellen in Vergleich zu Blasentumorzellen in der Reparatur von ICLs defizient sind, wobei die verminderte ICL-Reparatur auf die geringe Expression von ERCC1-XPF zur��ckgef��hrt werden konnte. Diese ICL-Reparatur-Defizienz k��nnte, zumindest zu einem Teil, f��r die Sensitivit��t der Testistumoren gegen��ber Cisplatin verantwortlich sein.

Effects of glucocorticoids on vascular NADPH oxidases and endothelial NO synthase

Glukokortikoide (GCs) stellen wichtige Hormone in der Regulation der metabolischen Hom��ostase dar. Synthetische GCs, wie Dexamethasone (DEX), spielen eine essentielle Rolle in der Behandlung inflammatorischer Krankheiten. Jedoch sind unter einer Dexamethason-Therapie zahlreiche Nebenwirkungen bekannt, so z.B. auch die Entwicklung einer Hypertonie, in deren Pathogenese oxidativer Stress eine entscheidende Rolle spielt. Obwohl sich in den vergangenen Jahren zahlreiche Studien zum Ziel setzten die GC-induzierte Hypertonie (GC-HT) aufzukl��ren, sind die genauen Mechanismen bis heute unklar. Eine erh��hte Expression von NADPH Oxidasen (Nox) und eine Entkopplung der endothelialen NO Synthase (eNOS), die Hauptquellen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) im vaskul��ren System, tragen ma��geblich zur Pathogenese kardiovaskul��rer Erkrankungen bei. Daher ist eine Beteiligung dieser Enzyme in GC-induziertem oxidativen Stress sehr wahrscheinlich. Folglich wurde die Hypothese aufgestellt, dass NADPH Oxidasen und eine entkoppelte eNOS die vielversprechendsten unter den zahlreichen involvierten pro- und anti-oxidativen Enzymen sind. Mit Fokus auf die oben genannten Systeme wurde in der vorliegenden Studie der Effekt von DEX mit Hilfe von in vivo (WKY Ratten) ebenso wie in vitro Experimenten (A7r5 und EA.hy 926 Zellen) untersucht. Dabei zeigte sich, dass Nox1, Nox4 und p22phox durch DEX unterschiedlich reguliert wurden. Nox1 wurde hoch-, Nox4 hingegen herunterreguliert, w��hrend p22phox unver��ndert blieb. Die Modufikation schien hierbei auf transkriptioneller und post-transkriptioneller Ebene stattzufinden. Durch die gegens��tzliche Regulation von Nox1 und Nox4 bleibt die Nettowirkung der verschiedenen Nox Isoformen unklar. Immer mehr Studien bringen vaskul��ren oxidativen Stress mit der Pathogenese einer GC-HT in Zusammenhang, welche letztendlich zu einer verminderten Bioverf��gbarkeit von Stickstoffmonoxid (NO) f��hrt. Durch die eNOS produziertes NO stellt einen essentiellen Schutzfaktor der Blutgef����e dar. Eine verminderte NO-Bioverf��gbarkeit k��nnte die Folge einer eNOS-Entkopplung darstellen, ausgel��st durch oxidativen Stress. Da die Verf��gbarkeit von Tetrahydrobiopterin (BH4) entscheident ist f��r die Aktivit��t und enzymatische Kopplung der eNOS, besch��ftigt sich die vorliegende Arbeit mit GC-induzierten Ver��nderungen in der BH4-Versorgung. Die Behandlung von EA.hy 926 Zellen mit DEX f��hrte zu einer zeit- und konzentrationsabh��ngigen Herunterregulation von eNOS auf mRNA- und Proteinebene. Gleichzeitig wurde die Phosphorylierung an Serine1177 vermindert. Als ma��geblicher ���Kopplungs-Schalter��� kann BH4 endogen ��ber zwei verschiedene Signalwege synthetisiert werden, welche durch die Enzyme GCH1 und DHFR reguliert werden. DEX f��hrte zu einer zeit- und konzentrationsabh��ngigen Herunterregulation von BH4, BH2 und Biopterin, wobei ebenso das BH4 / BH2 -Verh��ltnis vermindert wurde. Beide Enzyme, GCH1 genauso wie DHFR, wurden auf mRNA- und Proteinebene herunterreguliert, was auf einen Effekt von GCs auf beide rnBH4-produzierenden Signalwege schlie��en l��sst. Nach Behandlung mit DEX wurde die Produktion von NO in Endothelzellen ma��geblich vermindert. In ROS-Messungen zeigte sich eine Tendenz hin zu einer eNOS-Entkopplung, jedoch war es mit unserem experimentellen Aufbau nicht m��glich, diese endg��ltig zu beweisen.rnZusammenfassend l��sst sich sagen, dass die Behandlung mit GCs zu Ver��nderungen in beiden untersuchten Systemen, den NADPH Oxidasen ebenso wie dem eNOS-NO System, f��hrte. DEX erh��hte die Expression von Nox1 in glatten Muskelzellen und reduzierte die Nox4-Expression in Endothelzellen. Gleichzeitig verminderte DEX die Verf��gbarkeit von BH4 und inhibierte die Phosphorylierung / Aktivit��t von eNOS. Mithilfe weiterer Studien muss die endg��ltige Beteiligung von NADPH Oxidasen und einer eNOS-Entkopplung an oxidativem Stress in GC-HT abschlie��end aufgekl��rt werden.rn

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Biomarkern beim Glaukom

Das Glaukom ist, nach dem Katarakt, die zweith��ufigste Ursache f��r Erblindungen weltweit mit Milionen von Betroffenen, die von dieser zun��chst weitgehend symptomfreien neurodegenerativen Erkrankung heimgesucht werden. Die M��glichkeiten auf dem Feld der Diagnose beschr��nken sich bislang weitestgehend auf die Messung des Augeninnendrucks und der Beurteilung des Augenhintergrundes durch einen erfahrenen Augenarzt. Eine labordiagnostische Prophylaxe ist bis heute nicht verf��gbar, die Zahl unerkannter Erkrankungen dementsprechend hoch. Hierdurch geht wertvolle Zeit verloren, die man f��r eine effektive Therapie nutzen k��nnte.rnBez��glich der Pathogenese des Glaukoms geht man heute von mehreren, miteinander wechselwirkenden Pathomechanismen aus, zu denen neben mechanischen Einfl��ssen durch einen erh��hten IOD auch Hypoxie, verminderte Neutrophinversorgung, Exzitotoxizit��t, oxidativer Stress und eine Beteiligung autoimmuner Prozesse gez��hlt werden. Unabh��ngig vom Pathomechanismus folgt stets die Etablierung umfangreicher degenerativer Prozesse im Sehnervenkopf, den retinalen Ganglienzellen und den Axonen des Sehnerven, die letztlich im irreversiblen Untergang dieser Neuronen m��nden. Diese pathologischen Prozesse im ZNS hinterlassen auf Proteomebene Spuren, die mithilfe moderner massenspektrometrischer Methoden in Kombination mit multivariaten statistischen Methoden detektierbar und als sogenannte Biomarker-Kandidaten mit definiertem Molekulargewicht darstellbar sind. In dieser Arbeit wurde ein ���Workflow��� entwickelt, der es erm��glicht, diese Biomarker-Kandidaten im Blutserum und in der Tr��nenfl��ssigkeit in einfachen, reproduzierbaren Schritten zu identifizieren und zu charakterisieren. Abweichend von der etablierten Methotik der Bottom-Up-Proteomics musste hierf��r eine Methode entsprechend einer Top-Down-Philosophie entwickelt werden, die es erlaubt, die Spuren des Glaukoms im Proteom zu detektieren und zu charakterisieren.rnDies erfolgte in dieser Arbeit durch sowohl massenspektroskopischen Methoden wie SELDI-TOF�� und MALDI-Tof-Tof als auch durch Bead-, Gel- und Fl��ssigkeits-chromatographisch-basierte Separations und Fraktionierungstechniken.rnDie erfolgreiche Kombination dieser Methoden f��hrte zu Identifikationen einer ganzen Reihe von Biomarker-Kandidaten. Unter den identifizierten Proteinen, die bez��glich ihres korrespondierenden SELDI-Peaks im Massenbereich von Biomarker-Kandidaten liegen, finden sich Zytokine und Effektormolek��le der angeborernen Immunit��t, stressinduzierbare Kinasen, Faktoren, die zum Schutz der Telomeren dienen, Proliferationsmarker, neuronale Antigene und Transportproteine. Dar��ber hinaus wurden Komponenten identifiziert, die an der neuronalen Neutrophinversorgung beteiligt sind, neuronale Rezeptoren und Antigene, Komponenten des Komplementsystems und des MHC-I-Komplexes. All diese identifizierten Proteine sind bez��glich ihrer Funktion und m��glichen Rolle innerhalb der Pathogenese des Glaukoms detailliert beschrieben und charakterisiert. Dies erlaubt einen umfassenden Einblick in alle Pathomechanismen, denen nach heutigem Kenntnisstand, eine Rolle an der Pathogenese des Glaukoms unterstellt wird.rn

Pharmakologische Hemmung strahleninduzierter Tumorzell-Endothelzell-Interaktionen in vitro und Metastasierungsprozesse in vivo

Exposition von Endothelzellen mit ionisierender Strahlung (IR) oder Behandlung mit inflammatorischen Zytokinen (z. B. TNFa) induziert ��ber eine Rho-GTPasen abh��ngige NF-kB-Aktivierung die Expression verschiedener Zelladh��sionsmolek��le, u. a. auch von E-Selektin. E-Selektin vermittelt die Adh��sion von Tumorzellen (TC) an Endothelzellen und ist daher vermutlich an der Extravasation von zirkulierenden Tumorzellen beteiligt. HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren (Statine), welche eine breite klinische Anwendung als Lipidsenker erfahren, sind in der Lage, Rho-GTPasen und die durch sie vermittelten Signalwege zu hemmen. Daher sollten Statine wie Lovastatin auch Zell-Zell-Adh��sionsvorg��nge beeinflussen. Die vorliegende Arbeit widmet sich den Mechanismen, mit denen IR und TNF��� in Endothel- und/oder Tumorzellen pro-adh��sive Faktoren induzieren k��nnen und ob diese Effekte durch Lovastatin beeinflussbar sind. Zu diesem Zweck wurde mittels eines ELISA-basierenden Zelladh��sions-Assays die Auswirkung von IR und TNF��� auf Zell-Zell-Kontakte zwischen humanen Tumorzellen (u. a. Kolonkarzinomzellen (HT29)) und humanen, ven��sen Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) analysiert. Zudem wurden die Effekte einer Lovastatinvorbehandlung von TC und/oder HUVEC auf TC-HUVEC-Adh��sion untersucht. Des Weiteren wurden die Wirkungen des sLex-Mimetikums Glycyrrhizin und des Rac1-spezifischen ���small-molecule��� Inhibitors NSC23766 auf TC-HUVEC-Adh��sion ��berpr��ft. Zus��tzlich wurde die strahleninduzierbare mRNA-Expression von diversen Zelladh��sionsmolek��len, Metastasierungsfaktoren und DNA-Reparatur-Genen mittels qRT-PCR (Real-Time Analysen) quantitativ erfasst. Um die erhaltenen in vitro Ergebnisse auch in vivo zu best��tigen, untersuchten wir den Effekt einer Ganzk��rperbestrahlung (TBI) von BALB/c-M��usen auf die Expression von pro-adh��siven Faktoren. Zur Analyse der Tumorzell-Extravasation wurden Tumorzellen in die laterale Schwanzvene immundefizienter M��use injiziert und anschlie��end eine Ganzk��rperbestrahlung durchgef��hrt (4 Gy). Nach einer Wartezeit von 4 Wochen wurde ein erh��htes Auftreten von Lungenmetastasen beobachtet, welches durch Vorbehandlung der Tiere mit Statinen, NSC23766 oder Glycyrrhizin blockiert werden konnte. Zusammenfassend konnte somit ein Einfluss von IR auf die Expression verschiedener Zelladh��sionsmolek��le in vitro und auf die Extravasation zirkulierender Tumorzellen in vivo festgestellt werden. Diese pro-metastatischen Strahleneffekte konnten durch pharmakologische Hemmung Rho-regulierter Signalwege abgeschw��cht werden.

The role of SENP1 in B cell development and differentiation

SUMOylation is a highly dynamic and reversible posttranslational protein modification closely related to ubiquitination. SUMOylation regulates a vast array of different cellular functions, such as cell cycle, nuclear transport, DNA damage response, proliferation and transcriptional activation. Several groups have shown in in vitro studies how important SUMOylation is for early B cell development and survival as well as for later plasma cell differentiation. This thesis focuses on the deSUMOylation protease SENP1 and its in vivo effects on B cell development and differentiation. For this a conditional SENP1 knockout mouse model was crossed to the CD19-Cre mouse strain to generate a B cell specific SENP1 knockout mouse.rnIn our conditional SENP1ff CD19-Cre mouse model we observed normal numbers of all B cell subsets in the bone marrow. However in the spleen we observed an impairment of B cell survival, based on a 50% reduction of the follicular B cell compartment, whereas the marginal zone B cell compartment was unchanged. T cell numbers were comparable to control mice. rnFurther, impairments of B cell survival in SENP1ff CD19-Cre mice were analysed after in vivo blocking of IL7R signalling. The ��IL7R treatment in mature mice blocked new B cell formation in the bone marrow and increased apoptosis rates could be observed in splenic SENP1 KO B cells. Additionally, a higher turnover rate of B cells was measured by in vivo BrdU incorporation.rnSince it is known that the majority of transcription factors that are important for the maintenance of the germinal centre reaction or for induction of plasma cell development are SUMOylated, the question arose, how defective deSUMOylation will manifest itself in these processes. The majority of in vitro cultured splenic B cells, stimulated to undergo class switch recombination and plasma cell differentiation underwent activation induced cell death. However, the surviving cells increasingly differentiated into IgM expressing plasma cells. Class switch recombination to IgG1 was reduced. These observations stood in line with observation made in in vivo sheep red blood cell immunization experiments, which showed increased amounts of germinal centres and germinal centre B cells, as well as increased amounts of plasma cells differentiation in combination with decreased class switch to IgG1.rnThese results lead to the conclusion that SENP1 KO B cells increasingly undergo apoptosis, however, B cells that survive SENP1 deficiency are more prone to undergo plasma cell differentiation. Further, the precursors of these plasma cells either are not as capable of undergoing class switch recombination or they do switch to IgG1 and succumb to activation induced cell death. One possible explanation for both scenarios could be a defective DNA damage response mechanisms during class switch recombination, caused by impaired deSUMOylation. rn