Étude sur les fonctions in vivo des GEFs DOCK chez les mammifères

Dock1 (aussi nommé Dock180) est le membre prototypique de la famille Dock d’activateurs des petites GTPases de la famille Rho. Dock1 agit au sein d’une voie de signalisation conservée au cours de l’évolution et des études génétiques ont démontré que les orthologues de Dock1, myoblast city (mbc) chez la drosophile et Ced-5 chez le nématode, activent Rac dans divers processus biologiques. Notamment, mbc est un important régulateur de la fusion des myoblastes lors de la formation des fibres musculaires de drosophile. Mbc est aussi essentiel à la migration collective d’un groupe de cellules, appelées cellules de bordures, lors de leur migration dans la chambre de l’oeuf suite à l’activation de récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK). La migration collective des cellules de bordures récapitule certains des événements observés lorsque des cellules tumorales envahissent le tissu environnant lors de la formation de métastases. Chez les mammifères, des études réalisées en lignées cellulaires suggèrent que Dock1 est aussi un régulateur du cytosquelette lors de la migration cellulaire. De plus, certaines études ont démontré que la voie Dock1/Rac agit en aval de RTKs lors de l’invasion de cellules de glioblastome. Néanmoins, les fonctions in vivo de Dock1 chez les mammifères demeurent méconnues et le but de cette thèse est d’identifier et de caractériser certaines de ses fonctions. Guidés par la fonction de mbc, nous démontrons dans l’objectif no 1 un rôle essentiel pour ce gène au cours du développement embryonnaire grâce à la caractérisation d’une souris Dock1 knock-out. Des défauts sévères de fusion des myoblastes sont observés en absence de l’expression de Dock1 et ils contribuent à la réduction de la masse musculaire des souris mutantes. De plus, nous avons constaté une contribution du gène Dock5, un membre de la famille Dock proche de Dock1, au développement des fibres musculaires. Dans l’objectif no 2, nous avons observé que des hauts niveaux d’expression de DOCK1 corrèlent avec un mauvais pronostic chez les patientes atteintes de cancer du sein possédant une forte expression du gène codant pour le RTK HER2. Une surexpression ou une amplification du locus codant pour le récepteur HER2 est associée à près de 20% des cas de cancer du sein. Les cancers de ces patientes développent fréquemment des métastases et sont associés à un mauvais pronostic. Des études biochimiques ont révélé que DOCK1 interagit avec le récepteur HER2 dans des cellules de cancer du sein. De plus, DOCK1 est essentiel à l’activation de RAC et à la migration cellulaire induite par HER2 dans ces cellules. L’utilisation d’un modèle de cancer du sein médié par HER2 chez la souris combiné avec l’inactivation du gène Dock1 dans les glandes mammaires, nous a permis d’identifier Dock1 et Rac comme de nouveaux effecteurs de la croissance tumorale et de la formation de métastases régulées par l’oncogène HER2. Nous concluons que l’utilisation de différents modèles de souris knock-out pour le gène Dock1 nous a permis d’identifier des fonctions clés de ce gène. Tout comme son orthologue mbc, Dock1 joue un rôle important lors du développement embryonnaire en régulant notamment la fusion des myoblastes. Nos études ont également contribué à démontrer un important degré de conservation des mécanismes moléculaires de fusion entre les espèces. De plus, DOCK1 agit en aval du RTK HER2 et son expression dans les cellules épithéliales de glandes mammaires contribue au développement tumoral et à la formation de métastases induits par cet oncogène.

Use of cellular impedance to characterize ligand functional selectivity at G protein-coupled receptors

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) représentent la plus grande famille de cibles thérapeutiques pour le traitement d’une panoplie de pathologies humaines. Bien que plusieurs décennies de recherche aient permis de façonner nos connaissances sur ces protéines membranaires, notre compréhension des déterminants moléculaires de leur activité signalétique reste encore limitée. De ces domaines de recherche, une avancée récente a mis à jour un nouveau phénomène, appelé sélectivité fonctionnelle des ligands, qui a bouleversé les paradigmes décrivant leu fonctionnement de ces récepteurs. Ce concept émane d’observations montrant que l’activité pharmacologique de certains ligands n’est pas nécessairement conservée sur tout le répertoire signalétiques connu du récepteur et peu se restreindre à l'activation sélective d’un sous-groupe de voies de signalisation.Ce nouveau modèle pharmacologique de l'activation des RCPG ouvre de nouvelles possibilités pour la découverte de médicaments plus efficace et sûr, ciblant les RCPGs. En effet, il permet la conception de molécules modulant spécifiquement les voies signalétiques d’intérêt thérapeutique, sans engager les autres voies qui pourraient mener à des effets secondaires indésirables ou de la tolérance. Cette thèse décrit l'utilisation d'une nouvelle approche sans marquage, basée sur la mesure du changement l'impédance cellulaire. Par la mesure des changements cellulaires, comme la morphologie, l’adhésion et/ou la redistribution des macromolécules, cette approche permet de mesurer de façon simultanée l'activité de plusieurs voies de signalisation impliqués dans ces réponses. Utilisant le récepteur β2-adrénergique (β2AR) comme modèle, nous avons démontré que les variations dans l’impédance cellulaire étaient directement liées à l’activation de multiples voies de signalisation suite à la stimulation du récepteur par son ligand. L’agoniste type du β2AR, l’isoprotérénol, s’est avéré induire une réponse d’impédance dose-dépendante constituée, dans le temps, de plusieurs caractéristiques distinctes pouvant être bloquées de façon compétitive par l’antagoniste ICI118,551 Par l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs, nous avons été en mesure de déterminer la contribution de plusieurs voies signalétiques canoniques, comme les voies dépendantes de Gs et Gi, la production d’AMPc et l’activation de ERK1/2, sur ces changements. De plus, la dissection de la réponse d’impédance a permis d’identifier une nouvelle voie de mobilisation du Ca2+ contribuant à la réponse globale des changements initiés par la stimulation du β2AR. Dans une autre étude, nous avons rapporté que la réponse calcique induite par le β2AR serait attribuable à une transactivation Gs-dépendant du récepteur purinergique P2Y11, lui-même couplé à la protéine Gq. La mesure d’impédance permettant de distinguer et de décrire une pléiade d’activités signalétiques, nous avons émis l’hypothèse que des ligands arborant des profils signalétiques différents généreraient des réponses d’impédance distinctes. Le criblage d’une librairie de ligands spécifiques au β2AR a révélé une grande variété de signatures d’impédance. Grâce au développement d’une approche computationnelle innovatrice, nous avons été en mesure de regrouper ces signatures en cinq classes de composés, un regroupement qui s’est avéré hautement corrélé avec le profil signalétique des différents ligands. Nous avons ensuite combiné le criblage de composés par impédance avec l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs de voies signalétiques afin d’augmenter la résolution du regroupement. En évaluant l’impact d’une voie signalétique donnée sur la signature d’impédance, nous avons été en mesure de révéler une plus grande variété de textures parmi les ligands. De plus, cette méthode s’est avérée efficace pour prédire le profil signalétique d’une librairie de composés non caractérisés, ciblant le β2AR. Ces travaux ont mené à l’élaboration d’une méthode permettant d’exprimer visuellement la sélectivité fonctionnelle de ligands et ont révélé de nouvelles classes de composés pour ce récepteur. Ces nouvelles classes de composés ont ensuite été testées sur des cardiomyocytes humains, confirmant que les composés regroupés dans différentes classes produisent des effets distincts sur la contractilité de ces cellules. Globalement, ces travaux démontrent la pertinence de l’utilisation de l’impédance cellulaire pour une évaluation précise des différences fonctionnelles parmi les composés ciblant les RCPGs. En fournissant une représentation pluridimensionnelle de la signalisation émanant des RCPGs à l’aide d’un seul essai ne requérant pas de marquage, les signatures d’impédance représentent une stratégie simple et innovante pour l’évaluation de la fonctionnalité sélective des ligands. Cette méthode pourrait être d’une grande utilité dans le processus de découverte de nouveaux médicaments.

Potential pathogenicity and antimicrobial resistance of Escherichia coli from pig and poultry feces on-farm and carcasses at the abattoir in Vietnam

E. coli avec potentiel zoonotique pourrait éclore dans les réservoirs porcins et avicoles. Cette étude consiste à examiner la présence de souches E. coli porteuses de gènes virulents associés aux STEC (E. coli producteurs de Shiga-toxines), EPEC (E. coli entéropathogène), et ExPEC (E. coli pathogène extra-intestinal) chez les porcs et volailles élevés au Vietnam. Des prélèvements d’excréments et de carcasses ont été effectués dans des fermes et abattoirs porcins et avicoles sélectionnés où les animaux ont été suivis de l’élevage à l’abattage. Un total de 13,1% des souches, toutes sources confondues, ont été catégorisées comme potentiellement contaminées par ExPEC, possédant un ou plusieurs gènes de virulence iucD, tsh, papC et cnf. Peu d’isolats d’autres pathotypes ont été observés. Tous les gènes de virulence ExPEC, à l’exception de cnf, ont été identifiés plus fréquemment dans les isolats de fèces et carcasses avicoles que dans les isolats porcins. Même constatation pour le groupe du phylogénétique D. Une multirésistance aux médicaments a été régulièrement observée chez les deux isolats ExPEC. Les isolats de fèces de volailles ont souvent été associés à une résistance à l’acide nalidixique et à la ciprofloxacine (P<0.05), de même qu’au gène blaTEM, alors que les gènes qnr et aac(6’)-Ib ont peu été rencontrés des deux côtés. Cette étude démontre que les isolats ExPEC avicoles sont potentiellement plus pathogèniques que ceux porcins et que les isolats ExPEC de carcasses porcines et avicoles peuvent provenir de leurs excréments par la contamination associée au processus d'abattage. Ainsi, la volaille, particulièrement, serait un facteur de transmission de souches ExPEC zoonotiques.

Rôle du système du trijumeau dans la locomotion chez le nouveau-né d’opossum (Monodelphis domestica)

L’opossum Monodelphis domestica naît très immature et grimpe sans aide de la mère, du sinus urogénital à une mamelle où il va s’attacher pour poursuivre son développement. Des informations sensorielles sont nécessaires pour guider le nouveau-né vers la mamelle et les candidats les plus probables sont le toucher, l’équilibre et l’olfaction. Pour tester l’action des différents systèmes sur la motricité chez l’opossum nouveau-né, des régions céphaliques du trijumeau, du vestibulaire et de l’olfaction ont été stimulées électriquement sur des préparations in vitro en comparaison avec une stimulation seuil T (intensité minimale de la stimulation à la moelle épinière cervicale induisant le mouvement des membres antérieurs). Par comparaison, un mouvement similaire était induit par des stimulations à ~2T du ganglion du trijumeau, à ~20 T du complexe vestibulaire, et à ~600 T des bulbes olfactifs. L’étude de l'innervation de la peau faciale et des voies relayant les informations du trijumeau vers la moelle épinière (ME) a été approfondie en utilisant de l’immunohistochimie pour les neurofilament-200 et du traçage rétrograde avec du Texas-Red couplé à des Dextrans Aminés. De nombreuses fibres nerveuses ont été révélées dans le derme de plusieurs régions de la tête. Quelques cellules du ganglion trigéminal projettent à la ME rostrale, mais la majorité projette vers la médulla caudale où se trouvent les neurones secondaires du trijumeau ou des cellules réticulospinales. Les résultats de cette étude indiquent une influence significative des systèmes du trijumeau et du vestibulaire, mais pas de l'olfaction, sur le mouvement des membres antérieurs des opossums nouveau-nés.

Étude de l’impact de la grossesse sur l’hépatite auto-immune dans un modèle expérimental murin

L’hépatite auto-immune (HAI) est une maladie chronique caractérisée par une destruction progressive du parenchyme hépatique par le système immunitaire. La majorité des patients atteints d’HAI sont des femmes (75% à 90% des cas). L’amélioration des traitements au cours des dernières années a permis à un grand nombre de ces femmes de devenir enceintes. Pendant la grossesse, une rémission spontanée de la maladie a pu être observée chez les femmes atteintes d’HAI. Cette rémission est temporaire et elle est généralement suivie d’une rechute suite à l’accouchement (post-partum). Les causes exactes de cette rémission associée à la grossesse et de la rechute post-partum ne sont pas connues à ce jour. Nous avons donc tenté de reproduire ces phénomènes dans un modèle murin d’HAI développé dans notre laboratoire, afin de déterminer les mécanismes possiblement impliqués. Notre modèle d’HAI consiste en une xéno-immunisation de souris C57BL/6 avec les auto-antigènes impliqués dans l’HAI de type 2 chez l’humain. Nous avons ainsi accouplées des souris préalablement xéno-immunisées, puis nous les avons sacrifiées au début de la 3e semaine de gestation ou 2 à 3 semaines post-partum, afin d’évaluer les dommages hépatiques et afin d’étudier la réponse immunitaire. Comme chez les femmes atteintes d’HAI, les souris présentent une rémission de la maladie pendant la grossesse. Nous en sommes venus à cette conclusion par l’observation d’une diminution de l’inflammation hépatique, des niveaux de transaminases sériques et des titres d’auto-anticorps circulants. À l’inverse des humains, les souris xéno-immunisées ne présentent pas de rechute post-partum. Une analyse des cellules régulatrices (cellules T régulatrices et cellules B productrices d'IL-10) suggère une implication des Tregs hépatiques dans la rémission, car ceux-ci sont augmentés pendant la gestation. Ces Tregs hépatiques sont majoritairement d’origine thymique et ne semblent pas particulièrement attirés au foie en réponse à l’inflammation. La polarisation TH2 est un phénomène connu pendant la grossesse, par contre elle ne semble pas influencer la réponse auto-immune dans nos souris. Une meilleure compréhension des mécanismes d’immunosuppression observés lors de la grossesse pourrait mener au développement d’une thérapie mieux ciblée.

Implication de la voie alternative NF-kappa B dans le cancer de la prostate

Le cancer de la prostate (CaP) est le plus diagnostiqué chez les hommes au Canada et représente le troisième cancer le plus meurtrier au sein de cette population. Malgré l’efficacité des traitements de première ligne, de nombreux patients finiront par développer une résistance et, le cas échéant, verront leur CaP progresser vers une forme plus agressive. Plusieurs paramètres, essentiellement cliniques, permettent de prédire la progression du CaP mais leur sensibilité, encore limitée, implique la nécessité de nouveaux biomarqueurs afin de combler cette lacune. Dans cette optique nous nous intéressons au facteur de transcription NF-κB. Des études réalisées au laboratoire et ailleurs, associent RelA(p65) à un potentiel clinique dans le CaP, soulignant ainsi l’importance de la voie classique NF-κB. L’implication de la voie alternative NF-κB dans la progression du CaP a aussi été suggérée dans une de nos études illustrant la corrélation entre la distribution nucléaire de RelB et le score de Gleason. Alors que la voie classique est largement documentée et son implication dans la progression du CaP établie, la voie alternative, elle, reste à explorer. La présente thèse vise à clarifier l’implication de la voie alternative NF-κB dans le CaP et répond à deux objectifs fixés dans ce but. Le premier objectif fut d’évaluer l’impact de l'activation de la voie alternative NF-κB sur la biologie des cellules cancéreuses prostatiques. L’étude de la surexpression de RelB a souligné les effets de la voie alternative NF-κB sur la prolifération et l'autophagie. Étant ainsi impliquée tant dans la croissance tumorale que dans un processus de plus en plus associée à la progression tumorale, quoique potentiellement létal pour les cellules cancéreuses, son impact sur la tumorigénèse du CaP reste encore difficile à définir. Il n'existe, à ce jour, aucune étude permettant de comparer le potentiel clinique des voies classique et alternative NF-κB. Le second objectif de ce projet fut donc l'analyse conjointe de RelA(p65) et RelB au sein de mêmes tissus de patients atteints de CaP afin de déterminer l'importance clinique des deux signalisations NF-κB, l'une par rapport à l'autre. Le marquage immunofluorescent de RelA(p65) et RelB en a permis l'analyse quantitative et objective par un logiciel d'imagerie. Nos travaux ont confirmé le potentiel clinique associé à RelA(p65). La variable RelA(p65)/RelB s’est, elle, avérée moins informative que RelA(p65). Par contre, aucune corrélation entre RelB et les paramètres cliniques inclus dans l'étude n’est ressortie. En définitive, mon projet de thèse aura permis de préciser l'implication de la voie alternative NF-κB sur la biologie du CaP. Son impact sur la croissance des cellules cancéreuses prostatiques ainsi que sur l'autophagie, dénote l’ambivalence de la voie alternative NF-κB face à la tumorigénèse du CaP. L’étude exhaustive de la signalisation NF-κB souligne davantage l'importance de la voie classique dont l’intérêt clinique est principalement associé au statut de RelA(p65). Ainsi, bien que RelB n’affiche aucun potentiel en tant que biomarqueur exploitable en clinique, l’analyse de l’intervention de la voie alternative NF-κB sur la biologie des cellules cancéreuses prostatiques reste d’intérêt pour la compréhension de son rôle exact dans la progression du CaP.

Caractérisation de l’interaction entre la protéine Lin28 et le précurseur du microARN let-7g

La régulation de l’expression des gènes est ce qui permet à nos cellules de s’adapter à leur environnement, de combattre les infections ou, plus généralement, de produire la quantité exacte de protéine nécessaire pour répondre à un besoin spécifique. Parmi les joueurs les plus importants dans cette régulation de l’expression des gènes on retrouve les microARN (miARN). Ces petits ARN de 22 nucléotides sont présents chez la majorité des espèces multicellulaires et sont responsables du contrôle direct de plus de 30% des gènes exprimant des protéines chez les vertébrés. La famille de miARN lethal-7 (let-7) est composée de miARN parmi les plus connus et ayant des fonctions cruciales pour la cellule. La régulation du niveau des miARN let-7 est essentielle au bon développement cellulaire. La biogenèse de ces miARN, du transcrit primaire jusqu’à leur forme mature, est régulée principalement par Lin28, une protéine pluripotente très conservée. Cette protéine est composée d’un domaine cold shock (CSD) et de deux domaines de liaison au zinc. C’est grâce à ces domaines de liaison à l’ARN que Lin28 peut lier et inhiber la maturation des miARN let-7. L’objectif de cette thèse est de caractériser l’interaction entre Lin28 et le microARN précurseur let-7g afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans l’inhibition de la biogenèse du miARN. À l’aide de techniques biochimiques et biophysiques, nous avons d’abord défini les principaux déterminants de l’interaction entre Lin28 et la boucle terminale du miARN précurseur let-7g (TL-let-7g). Nous avons conclu que le domaine C-terminal de Lin28, composé d’un motif riche en lysines et arginines ainsi que de deux motifs de liaison au zinc, permet à la protéine de lier spécifiquement et avec haute affinité un renflement riche en guanine conservé chez les précurseurs de la famille let-7. Aussi, parce que la séquence et la spécificité de liaison à l’ARN de ce domaine C-terminal sont semblables à celles de la protéine NCp7 du VIH, nous avons défini ce dernier comme le domaine NCp7-like de Lin28. Par la suite, nous avons caractérisé la multimérisation de trois protéines Lin28 sur la boucle terminale de pre-let-7g. Ceci a permis de réconcilier d’apparentes contradictions retrouvées dans la littérature actuelle concernant les sites de liaison de Lin28 lors de sa liaison aux miARN précurseurs. Nous avons identifié trois sites de liaison à haute affinité sur TL-let-7g qui sont liés dans un ordre précis par trois protéines Lin28. Lors de la formation du complexe multimérique, le CSD permet une déstabilisation de l’ARN, ce qui rend accessible plusieurs sites de liaison. Le domaine NCp7-like permet plutôt un assemblage ordonné de la protéine et facilite la liaison initiale de cette dernière. Ces nouveaux résultats rendent possible la mise au point d’un nouveau modèle de l’interaction entre Lin28 et le miARN précurseur let-7g. En conclusion, les études réalisées dans cette thèse apportent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle d’une importante famille de miARN et permettront de guider les futures études dans le domaine de recherche en pleine effervescence qu’est celui de la biogenèse des miARN.

Role of EFNBs and EphB4 in T cell development and function

Eph kinases are the largest family of cell surface receptor tyrosine kinases. The ligands of Ephs, ephrins (EFNs), are also cell surface molecules. Ephs interact with EFNs and the receptors and ligands transmit signals in both directions, i.e., from Ephs to EFNs and from EFNs to Ephs. Ephs and EFNs are widely involved in various developmental, physiological pathophysiological processes. Our group and others have reported the roles of Ephs/EFNs in the immune system. To further investigate the function of EphBs/EFNBs in T cell development and responses, we generated EFNB1, EFNB2, EphB4 conditional gene knockout (KO) mice and EFNB1/2 double KO mice. In the projects using EFNB1 and EFNB2 knockout mice, we specifically deleted EFNB1 or EFNB2 in T cells. The mice had normal size and cellularity of the thymus and spleen as well as normal T cell subpopulations in these organs. The bone marrow progenitors from KO mice and WT mice repopulated the host lymphoid organs to similar extents. The activation and proliferation of KO T cells was comparable to that of control mice. Naïve KO CD4 cells differentiated into Th1, Th2, Th17 and Treg cells similar to naïve control CD4 cells. In EFNB2 KO mice, we observed a significant relative increase of CD4CD8 double negative thymocytes in the thymus. Flowcytometry analysis revealed that there was a moderate increase in the DN3 subpopulation in the thymus. This suggests that EFNB2 is involved in thymocyte development. Our results indicate that the functions of EFNB1 and EFNB2 in the T cell compartment could be compensated by each other or by other members of the EFN family, and that such redundancy safeguards the pivotal roles of EFNB1 and EFNB2 in T cell development and function. In the project using EFNB1/B2 double knockout (dKO) model, we revealed a novel regulatory function of EFNb1 and EFNb2 in stabilizing IL-7Rα expression on the T cell surface. IL-7 plays important roles in thymocyte development, T cell homeostasis and survival. IL-7Rα undergoes internalization upon IL-7 binding. In the dKO mice, we observed reduced IL-7Rα expression in thymocytes and T cells. Moreover, the IL-7Rα internalization was accelerated in dKO CD4 cells upon IL-7 stimulation. In T cell lymphoma cell line, EL4, over-expression of either EFNB1 or EFNB2 retarded the internalization of IL-7Rα. We further demonstrated compromised IL-7 signaling and homeostatic proliferation of dKO T cells. Mechanism study using fluorescence resonance energy transfer and immunoprecipitation demonstrated that physical interaction of EFNB1 and EFNB2 with IL-7Rα was likely responsible for the retarded IL-7Rα internalization. In the last project, using medullary thymic epithelial cell (mTEC)-specific EphB4 knockout mice, we investigated T cell development and function after EphB4 deletion in mTEC. EphB4 KO mice demonstrated normal thymic weight and cellularity. T cell development and function were not influenced by the EphB4 deletion. Lastly, the KO mice developed normal delayed type hypersensitivity. Overall, our results suggest that comprehensive cross interaction between Eph and EFN family members could compensate function of a given deleted member in the T cell development, and only simultaneous deletion of multiple EFNBs will reveal their true function in the immune system. In fact, such redundancy signifies vital roles of Ephs and EFNs in the immune system.

Optimisation et évaluation d’un nouveau test PAMPA amélioré pour la prédiction de l’absorption intestinale de médicaments.

Ce mémoire rapporte l’optimisation et l’évaluation d’une nouvelle version du test PAMPA (Parallel Artificial Membrane Permeability Assay) appelée Néo-PAMPA. Ce test qui permet la prédiction de l’absorption intestinale de médicaments consiste en l’utilisation d’une membrane modèle de la paroi intestinale composée d’une bicouche lipidique déposée sur un coussin de polydopamine recouvrant un filtre poreux. En effet, nous nous sommes intéressés lors de ce projet à la mise en place d’une membrane artificielle qui serait plus représentative de la paroi intestinale humaine. Nous avons pu déterminer, suite à une étude comparative des propriétés de huit médicaments ainsi que les coefficients de perméabilité obtenus, que les filtres en polycarbonate présentaient le meilleur choix de support solide pour la membrane. Nous avons également vérifié la déposition du coussin de polydopamine qui apporte le caractère fluide à la bicouche lipidique. Les résultats des tests de perméabilité ont démontré que le coussin de polymère n’obstrue pas les pores du filtre après un dépôt de 4h. Nous avons par la suite étudié la déposition de la bicouche lipidique sur le filtre recouvert de polydopamine. Pour ce faire, deux méthodes de préparation de liposomes ainsi que plusieurs tailles de liposomes ont été testées. Aussi, la composition en phospholipides a été sujette à plusieurs changements. Tous ces travaux d’optimisation ont permis d’aboutir à des liposomes préparés selon la méthode du « film lipidique » à partir d’un mélange de dioléoylphosphatidylcholine (DOPC) et de cholestérol. Une dernière étape d’optimisation de la déposition de la bicouche reste à améliorer. Enfin, le test standard Caco-2, qui consiste à évaluer la perméabilité des médicaments à travers une monocouche de cellules cancéreuses du colon humain, a été implémenté avec succès dans le but de comparer des données de perméabilité avec un test de référence.

Étude de l’expression de « Bcl-2 modifying factor » (Bmf) et son implication dans la néphropathie diabétique

Objectif : Étudier les mécanismes apoptotiques impliqués dans la néphropathie diabétique en identifiant les gènes responsables de l’apoptose et activés par les espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules de tubules proximaux rénaux (RPTC) de différents modèles diabétiques. Méthodes : Une hybridation par puce à AND a été réalisée sur les ARN extraits à partir de RPTC de souris heterozygotes db/m+, db/db and db/db catalase (CAT)-transgénique (Tg) de 20 semaines. Des expériences de PCR en temps réel et d’immunohistochimie réalisées sur ces modèles et sur le modèle ou le diabète avait été induit par traitement au streptozotocin (STZ) ont permis de valider les gènes apoptotiques identifiés par puce à ADN. Des RPTC immortalisées de rat ont été utilisées pour montrer l’activité de ces gènes apoptotique et la régulation de leur expression. De plus, une étude additionnelle réalisée sur des sections rénales provenant de patients diabétiques et non diabétiques a démontré également une surexpression de ces gènes apoptotiques dans les IRPTC. Résultats: L’expression de Bcl-2-modifying factor (Bmf), une protéine apoptotique, semble augmentée dans les RPTC de souris db/db comparé aux souris contrôles db/m+, ou aux souris db/db CAT-tg. La surexpression de Bmf a également été identifiée dans les RPTC du modèle diabétique STZ. La normalisation de l’hyperglycémie chez ces souris par traitement à l’insuline semble normaliser également l’expression de Bmf. In vitro, la surexpression du cDNA de Bmf dans les RPTC promouvoit l’apoptose et augmente l’activité de caspase 3. La stimulation de RPTC de Rat avec le glucose élevé (25mM de D-glucose) semble augmenter l’expression de Bmf et le traitement de ces cellules avec la roténone, les Diphénylène iodonium, la catalase et l’apocynine semble renverser cette stimulation. L’inhibition de Bmf avec un siRNA semble réduire l’apoptose induite par le glucose élevé. L’expression de Bmf a également été démontrée dans les RPTC de patients diabétiques. Conclusion: Ces résultats ont démontré une surexpression de Bmf dans les RPTC de différents modèles diabétiques et suggèrent son potentiel rôle dans la régulation de l’apoptose et de l’atrophie tubulaire chez les diabétiques.

Etude du rôle de la réponse UV sur le contrôle de la réparation par excision de nucléotides (NER) des dommages à l’ADN : rôle des voies MAPK et de l’ADN polymérase eta

La réponse cellulaire aux ultra-violets (UV), ou réponse UV, est une réponse complexe et spécialisée dans l’adaptation et la tolérance des dommages aux UV. Celle-ci est initiée par un grand nombre d’évènements moléculaires et de signalisation nucléaire mais aussi au niveau de la membrane plasmique ou du cytoplasme. L’importance et l’influence exactes de ces évènements sur la réparation par excision de nucléotides (NER) des dommages UV à l’ADN sont encore mal comprises et doivent encore être méthodiquement démontrées. Dans cette thèse, grâce à l’utilisation d’une méthode sensible d’analyse de la réparation NER basée sur la cytométrie en flux, il est montré, dans un premier temps, que l’activité des voies MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases), qui sont des voies de signalisation de stress UV d’origine cytoplsamique, ne participent pas à l’efficacité de réparation NER des dommages UV dans les cellules humaines. En effet, l’abrogation de la signalisation MAPK, par inhibition pharmacologique, par utilisation de mutants dominant-négatifs ou par inhibition de leur expression endogène, ne révèlent aucun changement de la cinétique de réparation des dommages UV par excision de nucléotides. Cependant, l’utilisation de cette même méthode de réparation, mais cette fois, appliquée pour l’étude de réparation NER en fonction du cycle cellulaire, a permis de mettre en évidence la nécessité fonctionnelle de l’ADN polymérase translésionnelle eta (Pol η) dans la réparation NER des dommages UV, uniquement en phase S. Cette observation fut initialement caractérisée dans les cellules de patients affectés du syndrome variant de xérodermie pigmentaire (XP-V) puis, confirmée ensuite par l’inhibition de l’expression de Pol η endogène ou par la complémentation avec des mutants non-fonctionnels dans les cellules XP-V. Ces résultats indiquent que, contrairement à la réponse UV MAPK cytoplasmique, les évènements nucléaires comme la synthèse translésionnelle, peuvent influencer l’efficacité de réparation NER en phase S. Plus particulièrement, ces données établissent un lien possible entre la réparation NER en phase S et les niveaux de stress réplicatifs, révélé ici par la déficience fonctionnelle Pol η ou ATR. Les observations, présentées dans cette thèse, renforcent un rôle du point de contrôle S aux UV sur l’efficacité de la réparation NER et suggèrent que l’inhibition NER, observée en phase S dans les cellules XP-V, est modulée par le stress réplicatif. Un tel moyen de contrôle pourrait avoir une action plutôt protectrice pendant cette phase critique du cycle cellulaire. Mots clés: UV, translésionnelle, eta, MAPK, NER, CPD, cytométrie, phase-S, tolérance.

Étude de protection conférée par vaccination ADN dans un modèle murin d’hépatite auto-immune

La vaccination ADN à l’aide de plasmides codant pour des autoantigènes s’est avérée efficace dans la protection contre plusieurs maladies auto-immunes. Le but de ce mémoire était dans un premier temps d’établir si un protocole de vaccination ADN composé de 3 injections de pCMV-CTLA-4-NP et de pVR-IL-12 à deux semaines d’intervalle avait un effet protecteur contre le développement d’une hépatite auto-immune chez la souris TTR-NP, un modèle murin transgénique de la maladie et précédemment développé au laboratoire. Dans un deuxième temps, le but était d’élucider, le cas échéant, les mécanismes sous-tendant la protection conférée par la vaccination ADN. Les hypothèses initiales étaient qu’une protection allait effectivement être conférée par la vaccination ADN et que celle-ci pouvait être attribuable à une déviation de la réponse typiquement Th1 de la maladie vers une réponse Th2, à un épuisement des cellules immunitaires et/ou à l’activation et à l’induction de prolifération de cellules régulatrices. Les résultats montrent que la vaccination ADN induit une protection transitoire contre le développement d’infiltrations lymphocytaires au foie. Cette protection se ferait via un épuisement des cellules CD4+, CD8+ et CD19+ se retrouvant à la rate et exprimant PD 1 dans une plus forte proportion à 3 mois, et ne serait médiée ni par les lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+FoxP3+, ni par les cellules CD8+FoxP3+. Une déviation de la réponse Th1 vers une réponse Th2 demeure une explication supplémentaire plausible à la protection conférée mais nécessiterait une caractérisation en situation plus physiologique avant de pouvoir inférer sur son implication réelle. La vaccination ADN n’influe ni sur la présence d’autoanticorps, ni sur les niveaux d’alanine aminotransférase, deux marqueurs de la maladie.

Effet de la mutation du gène lrpprc sur l'activité de l'AMPK dans les fibroblastes des patients atteints du syndrome de Leigh, type canadien français

Le syndrome de Leigh, type canadien français (LSFC) est une maladie infantile orpheline causée par une mutation du gène lrpprc. Elle se caractérise par une déficience tissu spécifique de cytochrome c oxydase (COX), une dysfonction mitochondriale et la survenue de crises d’acidose lactique fatales dans plus de 80% de cas. Selon les familles des patients, ces crises apparaissent lors d’une demande excessive d’énergie. Malheureusement, les mécanismes sous-jacents à l’apparition des crises et notamment la physiopathologie du LSFC demeurent inconnus. Afin de mieux comprendre les mécanismes de régulation du métabolisme énergétique chez les patients LSFC, nous avons examiné la régulation de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), une enzyme clé de l'homéostasie énergétique, de même que certaines de ses voies cibles (SIRT1/PGC1α et Akt/mTOR) dans les fibroblastes de patients LSFC et de témoins en conditions basales et conditions de stress. En conditions basales, l’activité de l’AMPK était similaire dans les cellules LSFC et les témoins. Par contre, les cellules LSFC montraient une surexpression significative des voies Akt/mTOR et SIRT1/PGC1α comparativement aux cellules témoins. Nous avons aussi examiné ces voies de signalisation suite à une incubation de 4h avec 10 mM de lactate et 1 mM de palmitate (LP), nous permettant de mimer les conditions de « crise ». Nos résultats ont démontré que le LP augmentait les niveaux de phosphorylation de l’AMPK de 90% (p<0,01) dans les cellules témoins mais pas dans les cellules LSFC. Pourtant, l’AMPK est activée dans les cellules LSFC en réponse à une hypoxie chimique induite par le 2,4 dinitrophénol. Dans les cellules témoins, le LP augmentait aussi les niveaux d’expression de SIRT1 (57%, p<0,05), de LRPPRC (23%, p=0,045) et de COXIV (19%, p<0,05). Un prétraitement de 48h au ZMP, un activateur pharmacologique de l’AMPK, a eu un effet additif avec le LP et des augmentations de SIRT1 phosphorylée (120%, p<0,05), de SIRT1 total (75%, p<0,01), de LRPPRC (63%, p<0,001) et de COXIV (38%, p<0,001) ont été observées. Tous ces effets étaient aussi abolis dans les cellules LSFC. En conclusion, nos résultats ont démontré des altérations importantes de la régulation du métabolisme énergétique dans les fibroblastes de patients LSFC.

Caractérisation pharmacologique et moléculaire des dyskinésies tardives chez un modèle de primate non humain

Les dyskinésies tardives (DT) sont des troubles moteurs associés à l’utilisation chronique des antagonistes des récepteurs dopaminergiques D2 tels que les antipsychotiques et le métoclopramide. Ces dyskinésies correspondent à une incoordination motrice portant préférentiellement sur la musculature oro-faciale. La gestion des DT s'est imposée comme défi de santé publique surtout en l’absence d’une alternative thérapeutique efficace et abordable. L’hypothèse classiquement avancée pour expliquer la physiopathologie des DT inhérente au traitement par les antipsychotiques s’articule autour de l’hypersensibilité des récepteurs dopaminergiques D2, cibles principales de ces molécules. Néanmoins, plusieurs données remettent la véracité de cette hypothèse en question. Hypothèse: nous proposons que le blocage chronique des récepteurs dopaminergiques soit effectivement responsable d’un phénomène d’hypersensibilisation mais contrairement à l’hypothèse classique, cette hypersensibilisation porterait sur des paramètres de la transmission dopaminergique autres que les récepteurs D2. De même nous postulons que cette hypersensibilisation se traduirait par des altérations des cascades signalétiques au niveau des cellules du striatum. Ces altérations aboutissent à des changements portant sur le récepteur nucléaire (Nur77), qui est hautement associé au système dopaminergique; l’induction de ces récepteurs déclencherait des cascades associées à la compensation ou à la genèse des DT. Matériels et méthodes: 23 femelles Cebus apella, réparties en 3 groupes: groupe halopéridol, groupe clozapine, et groupe contrôle, ont été exposées aux traitements respectifs pendant 6-36 mois. Après l’analyse comportementale, les animaux ont été décapités et leurs cerveaux isolés pour fin d’analyse. Hybridation in situ: nous avons fait appel à cette technique pour mesurer l’expression de l’ARNm de Nur77 et du neuropeptide enképhaline. Hybridation in situ double: nous avons exploités cette technique pour identifier les populations neuronales exprimant les récepteurs dopaminergiques D3 et localiser leur éventuelle induction. Autoradiographies des récepteurs dopaminergiques D1, D2 et D3 et autoradiographies des récepteurs i glutamatergiques mGluR5. Ces autoradiographies avaient pour objectif d’évaluer l’expression de ces différents récepteurs. Mutagenèse dirigée et transfection cellulaire: nous faisons appel à ces techniques pour reproduire le polymorphisme identifié au niveau de la région 3’UTR de l’ARNm Nur77 et évaluer l’impact que pourrait avoir ce polymorphisme sur la stabilité de l’ARNm Nur77 sinon sur l’expression de la protèine Nur77. Western Blot des kinases ERK 1 et 2: cette technique nous a servi comme moyen pour quantifier l’expression globale de ces kinases. Analyses statistiques: l’expression de l’ARNm Nur77 a été évaluée en utilisant l’analyse de la variance à un seul facteur (One way ANOVA). Nous avons procédé de la même façon pour mesurer l’expression des récepteurs D2, D3 et mGluR5. Résultats: le groupe des animaux traités par l’halopéridol montre une plus forte expression des récepteurs D3 par rapport aux sujets des autres groupes. Cette expression se produit au niveau des neurones de la voie directe. De plus, cette augmentation corrèle positivement avec la sévérité des DT. L’expression des récepteurs D2 et mGluR5 reste relativement inchangée entre les différents groupes, alors qu’un gradient d’expression a été observé pour le récepteur D1. Par ailleurs, Nur77 est induit par l’halopéridol, alors que son expression semble baisser chez les animaux traités par la clozapine. L’induction de l’expression de Nur77 par l’halopéridol est plus accrue chez les animaux non dyskinétiques. Les animaux traités par la clozapine démontrent une expression amoindrie de l’ARNm de Nur77 qui tend à être plus faible que l’expression de base. D’autre part, la présence du polymorphisme au niveau de la région 3’UTR semble affecter l’expression cellulaire de Nur77. Conclusion: ces résultats confortent notre hypothèse concernant l’existence d’un phénomène d’hypersensibilisation prenant place suite un traitement chronique par les antipsychotiques. Ce phénomène s’est traduit par une augmentation de l’expression des récepteurs D3 sans porter sur les récepteurs D2 tel que prôné classiquement. Cette hypersensibilisation des récepteurs D3 implique également l’existence d’un débalancement des voies striatales pouvant ainsi sous tendre l’apparition des DT. Ces résultats dévoilent ainsi un nouveau mécanisme qui pourrait contribuer à l’apparition des DT et pourraient permettre une meilleure gestion, nous l’espérons, des DT à l’échelle clinique.

Les autotransporteurs auto-associatifs d’Escherichia coli : de facteurs de virulence à déterminants sociaux

Les autotransporteurs monomériques représentent le système de sécrétion le plus simple et le plus utilisé chez les bactéries à Gram négatif. Les autotransporteurs monomériques sont des protéines modulaires qui contiennent toute l’information pour leur sécrétion dans leur séquence. Les phénotypes associés à l’expression d’un autotransporteur peuvent être très variés et, souvent, les autotransporteurs sont des protéines multifonctionnelles. C’est le cas notamment des autotransporteurs AIDA-I, TibA et Ag43 d’Escherichia coli qui promouvoient l’adhésion et l’invasion de cellules épithéliales, l’auto-agrégation des bactéries et la formation de biofilm. Ces trois autotransporteurs ont d’ailleurs été regroupés dans une même famille, appelée les autotransporteurs auto-associatifs (SAATs). À cause de leur fonctionnalité, les SAATs sont considérés comme étant d’importants facteurs de virulence d’Escherichia coli. Toutefois, il existe plusieurs différences entre les SAATs qui ne sont pas bien comprises, si bien que leur rôle pour les bactéries n’est toujours pas bien compris. Nous avons donc d’abord caractérisé TibA, le membre des SAATs le moins bien étudié à l’aide d’une étude structure-fonction. Nous avons observé que TibA était une protéine modulaire et que son domaine fonctionnel était composé de deux modules : un module d’auto-agrégation en N-terminal et un module d’adhésion en C-terminal. En comparant nos résultats avec ceux obtenus pour les autres SAATs, nous avons réalisé que l’organisation des trois SAATs était très variée, c’est-à-dire que les trois SAATs sont composés de modules différents. Nous avons par ailleurs observé cet arrangement en modules lorsque nous avons analysé plusieurs séquences d’aidA, suggérant qu’un mécanisme d’échange et d’acquisition de modules était à la base de l’évolution des SAATs. Sans surprise, nous avons aussi observé que la famille des SAATs ne se limitait pas à AIDA-I, TibA et Ag43 et ne se limitait pas à Escherichia coli. La comparaison a aussi révélé l’importance du phénotype d’auto-agrégation dans la fonctionnalité des SAATs. Nous avons donc entrepris une étude du mécanisme d’auto-agrégation. Nos résultats on montré que l’auto-agrégation était le résultat d’une interaction directe SAAT/SAAT et ont mis en évidence un mécanisme similaire à celui utilisé par les cadhérines eucaryotes. De plus, nous avons observé que, comme les cadhérines, les SAATs étaient impliqués dans des interactions homophiliques; un SAAT interagit donc spécifiquement avec lui-même et non avec un différent SAAT. Finalement, les SAATs font parties des quelques protéines qui sont glycosylées chez Escherichia coli. Nous avons déterminé que le rôle de la glycosylation de TibA était de stabiliser la protéine et de lui donner la flexibilité nécessaire pour moduler sa conformation et, ainsi, être pleinement fonctionnelle. Globalement, nos résultats suggèrent que les SAATs sont des molécules « cadhérines-like » qui permettent la reconnaissance de soi chez les bactéries. Une telle habilité à discriminer entre le soi et le non-soi pourrait donc être utilisée par les bactéries pour organiser les communautés bactériennes.