882 resultados para Resistance (Psychoanalysis) in adolescence
Resumo:
A common complication of antibiotic use is the development of diarrheal illness. The pathogenesis of antibiotic associated diarrhea (AAD) may be mediated through alteration of intestinal microbiota, overgrowth of opportunistic pathogens, and direct drug toxicity on the gut. Alterations in the intestinal microbiota result in metabolic imbalances, loss of colonization resistance and in turn allow proliferation of opportunistic pathogens. Currently less than 33% of AAD cases can be attributable to Clostridium difficile leaving a large number of cases undiagnosed and poorly treated. Although the pathogenesis of Clostridium difficile infection (CDI) has been well documented, the role of other putative microbial etiologies (Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Klebsiella oxytoca, Candida species) and their pathogenic mechanisms in AAD has been unclear. This review provides a comprehensive and systematic approach to the existing data on AAD and includes concise descriptions of the pathogenesis of CDI and non-CDI AAD in the form of figures.^
Resumo:
The expression of P-glycoproteins encoded by the mdr gene family is associated with the emergence of multidrug-resistance phenotype in animal cells. This gene family includes two members, MDR1 and MDR2, in humans, and three members, mdr1a, mdr1b, and mdr2, in rodents. Among them, the rat mdr1b is known to be highly activated during hepatocarcinogenesis, and its expression is sensitive to the treatment with growth factors, cytotoxic drugs, as well as other physical or chemical stresses. It is believed that the transcriptional regulation plays an important role in above events, however little has been known about mechanisms involved.^ To elucidate how mdr1b expression is regulated, we isolated the genomic sequence of the rat mdr1b and functionally dissected its 5$\prime$ promoter region. Our results demonstrated that: (1) the transcription start site of the rat mdr1b is identical to that of the murine mdr1b homologue; (2) a palindromic sequence from bp $-$189 to $-$180 bp is essential for the basal promoter function of the rat mdr1b, and binds to a specific protein that appears to be a novel transcription factor implicated in the regulation of the rat mdr1b expression; (3) a NF-$\kappa$B-binding site from bp $-$167 to $-$159 is also involved in the basal promoter function. The p65/p50 subunits of the NF-$\kappa$B and raf-1 kinase are implicated in the insulin-inducible promoter activity of the mdr1b, suggesting the important role of NF-$\kappa$B in the regulation of the mdr1b by growth factors; (4) a p53-binding site from bp $-$199 to $-$180 is not only essential for the basal promoter activity but also responsible for the induction of mdr1b by cytotoxic agents. In addition, we provided evidence showing that endogenous mdr1b expression can be modulated by wild-type p53. On the basis of these findings, a model of transcriptional regulation of the rat mdr1b was proposed. ^
Resumo:
Los sistemas de brackets de baja fricción reducen la fricción en comparación con los convencionales. La fricción se define como la fuerza resistencia entre dos objetos en movimiento que entran en contacto. Junto con la fijación (binding) y la muesca (notching), la fricción es responsable de la resistencia de deslizamiento que se observa en ortodoncia en las etapas de alineado, nivelado y cierre de espacios. Se ha establecido que la alta fricción puede impedir que se alcancen los niveles fuerza óptima para los tejidos de soporte. Los estudios de laboratorio revelan que la fricción es menor en los sistemas de brackets de baja fricción y en los que han sido diseñados de forma correcta, la fijación es más importante en cuanto a la resistencia de deslizamiento. Los estudios clínicos apoyan la idea de que la resistencia de deslizamiento es la misma en brackets de baja fricción y en los convencionales. Además, aseguran que la fricción tiene poca influencia en el ambiente clínico. Una revisión sistemática de estudios clínicos supervisados concluye que existe poca evidencia confiable que apoye el uso de los sistemas fijos de brackets de baja fricción sobre los aparatos convencionales o viceversa. A la luz de la evidencia existente, la reducción en la fricción producida por sistemas de brackets de baja fricción no muestra ventaja clínica.
Resumo:
La finalidad de esta tesis es establecer un análisis de la metodología de entrenamiento de la resistencia especial en el futbolista. Su objetivo no está vinculado a realizar propuestas prácticas de entrenamiento, sino más bien, se tratará de abordar una posible justificación fisiológico - metabólica, a partir de la relevancia bioenergética de la creatina, en función de la creciente especialización que debe ir adquiriendo el proceso del entrenamiento deportivo a largo plazo, enfocado al logro de altos rendimientos deportivos. A partir del análisis de conceptos terminológicos de referencia, se asienta la idea general de este trabajo, es decir, la estructuración y desarrollo de la resistencia en los deportes de conjunto, como el fútbol. Los pilares de una adecuada planificación son el conocimiento y la aplicación de distintas leyes y principios del entrenamiento deportivo y su relación con los distintos medios y métodos de entrenamiento, como así también, los efectos de adaptación que provocan. Por lo tanto, a partir del análisis de los requerimientos morfológicos - funcionales de las competiciones de elite en fútbol, se pueden elaborar modelos que servirán de base y como objetivo final al cual debe ser orientado el proceso de entrenamiento. Es decir, que un entrenamiento multianual con miras a la formación de futbolistas de elite, debe respetar la especialización creciente de las cargas de entrenamiento, estableciendo una sucesión metodológica adecuada en función de los objetivos de cada etapa. En función de lo expuesto, se realiza un análisis que va desde la resistencia como capacidad física y su metodología de entrenamiento, recorriendo distintos conceptos y manifestaciones, pasando por el análisis de distintas zonas de intensidad o áreas funcionales, y desembocando en la metodología de entrenamiento intermitente de la resistencia o resistencia especial -en los deportes de conjunto-. Y es a partir de todo el análisis precedente que estamos en condiciones de abordar el entrenamiento específico en el fútbol, y más detalladamente la resistencia específica o intermitente que requiere este deporte. El entrenamiento intermitente puede ser considerado como una metodología cuyo énfasis es puesto en modificaciones que se producen a nivel muscular, por sobre factores centrales de rendimiento, presentándose como una variante óptima para el entrenamiento de la resistencia muscular local y específica del futbolista. Básicamente, el entrenamiento intermitente actuaría sobre dos puntos centrales: la mejora del sistema shuttle de la CrP, y sobre la rapidez de entrega de oxígeno al inicio del ejercicio. Aquí aparece la importancia de la suplementación con Cr: que al aumentar las concentraciones del sustrato, y junto con el entrenamiento, que mejora las reacciones enzimáticas implicadas, potenciaría las mejoras buscadas con este tipo de metodología. Queda por determinar cual es el preciso mecanismo de acción por el cual la recuperación de los fosfatos altamente energéticos se produce: si por biogénesis mitocondrial en las fibras reclutadas - generalmente FT -; o mediante el sistema de proteínas transportadoras de Cr - destacando la importancia de las ST - o por algún otro mecanismo no conocido. Su descubrimiento permitiría direccionar más precisamente el entrenamiento deportivo.
Resumo:
Los debates acerca de las actitudes de la sociedad civil frente a la última dictadura militar argentina oscilan entre la "teoría de los dos demonios" y las que responsabilizan a la sociedad toda. Para superar estas visiones maniqueas analizaremos algunos trabajos académicos relevantes sobre los autoritarismos europeos, con el fin de abordar nuevas perspectivas de interpretación que sean útiles al momento de pensar sobre la relación entre sociedad y dictadura en la bibliografía referida al caso argentino. Indagaremos las distintas actitudes sociales frente a la dictadura argentina desde los micro-contextos sociales a través de las producciones audiovisuales desarrolladas por los alumnos bonaerenses de nivel secundario realizadas en el Programa "Jóvenes y Memoria Recordamos para el futuro", propuesta desarrollada por la Comisión Provincial por la Memoria desde el año 2002. La elección de los audiovisuales desarrollados en el marco de este Programa apunta a su carácter testimonial y permite cuestionar la bipolaridad "complicidad-resistencia" en la que comúnmente suelen caracterizarse las actitudes sociales del período para pensar en una matriz que contiene distintos grises o gamas de acción.
Resumo:
La finalidad de esta tesis es establecer un análisis de la metodología de entrenamiento de la resistencia especial en el futbolista. Su objetivo no está vinculado a realizar propuestas prácticas de entrenamiento, sino más bien, se tratará de abordar una posible justificación fisiológico - metabólica, a partir de la relevancia bioenergética de la creatina, en función de la creciente especialización que debe ir adquiriendo el proceso del entrenamiento deportivo a largo plazo, enfocado al logro de altos rendimientos deportivos. A partir del análisis de conceptos terminológicos de referencia, se asienta la idea general de este trabajo, es decir, la estructuración y desarrollo de la resistencia en los deportes de conjunto, como el fútbol. Los pilares de una adecuada planificación son el conocimiento y la aplicación de distintas leyes y principios del entrenamiento deportivo y su relación con los distintos medios y métodos de entrenamiento, como así también, los efectos de adaptación que provocan. Por lo tanto, a partir del análisis de los requerimientos morfológicos - funcionales de las competiciones de elite en fútbol, se pueden elaborar modelos que servirán de base y como objetivo final al cual debe ser orientado el proceso de entrenamiento. Es decir, que un entrenamiento multianual con miras a la formación de futbolistas de elite, debe respetar la especialización creciente de las cargas de entrenamiento, estableciendo una sucesión metodológica adecuada en función de los objetivos de cada etapa. En función de lo expuesto, se realiza un análisis que va desde la resistencia como capacidad física y su metodología de entrenamiento, recorriendo distintos conceptos y manifestaciones, pasando por el análisis de distintas zonas de intensidad o áreas funcionales, y desembocando en la metodología de entrenamiento intermitente de la resistencia o resistencia especial -en los deportes de conjunto-. Y es a partir de todo el análisis precedente que estamos en condiciones de abordar el entrenamiento específico en el fútbol, y más detalladamente la resistencia específica o intermitente que requiere este deporte. El entrenamiento intermitente puede ser considerado como una metodología cuyo énfasis es puesto en modificaciones que se producen a nivel muscular, por sobre factores centrales de rendimiento, presentándose como una variante óptima para el entrenamiento de la resistencia muscular local y específica del futbolista. Básicamente, el entrenamiento intermitente actuaría sobre dos puntos centrales: la mejora del sistema shuttle de la CrP, y sobre la rapidez de entrega de oxígeno al inicio del ejercicio. Aquí aparece la importancia de la suplementación con Cr: que al aumentar las concentraciones del sustrato, y junto con el entrenamiento, que mejora las reacciones enzimáticas implicadas, potenciaría las mejoras buscadas con este tipo de metodología. Queda por determinar cual es el preciso mecanismo de acción por el cual la recuperación de los fosfatos altamente energéticos se produce: si por biogénesis mitocondrial en las fibras reclutadas - generalmente FT -; o mediante el sistema de proteínas transportadoras de Cr - destacando la importancia de las ST - o por algún otro mecanismo no conocido. Su descubrimiento permitiría direccionar más precisamente el entrenamiento deportivo.
Resumo:
Los debates acerca de las actitudes de la sociedad civil frente a la última dictadura militar argentina oscilan entre la "teoría de los dos demonios" y las que responsabilizan a la sociedad toda. Para superar estas visiones maniqueas analizaremos algunos trabajos académicos relevantes sobre los autoritarismos europeos, con el fin de abordar nuevas perspectivas de interpretación que sean útiles al momento de pensar sobre la relación entre sociedad y dictadura en la bibliografía referida al caso argentino. Indagaremos las distintas actitudes sociales frente a la dictadura argentina desde los micro-contextos sociales a través de las producciones audiovisuales desarrolladas por los alumnos bonaerenses de nivel secundario realizadas en el Programa "Jóvenes y Memoria Recordamos para el futuro", propuesta desarrollada por la Comisión Provincial por la Memoria desde el año 2002. La elección de los audiovisuales desarrollados en el marco de este Programa apunta a su carácter testimonial y permite cuestionar la bipolaridad "complicidad-resistencia" en la que comúnmente suelen caracterizarse las actitudes sociales del período para pensar en una matriz que contiene distintos grises o gamas de acción.
Resumo:
Los debates acerca de las actitudes de la sociedad civil frente a la última dictadura militar argentina oscilan entre la "teoría de los dos demonios" y las que responsabilizan a la sociedad toda. Para superar estas visiones maniqueas analizaremos algunos trabajos académicos relevantes sobre los autoritarismos europeos, con el fin de abordar nuevas perspectivas de interpretación que sean útiles al momento de pensar sobre la relación entre sociedad y dictadura en la bibliografía referida al caso argentino. Indagaremos las distintas actitudes sociales frente a la dictadura argentina desde los micro-contextos sociales a través de las producciones audiovisuales desarrolladas por los alumnos bonaerenses de nivel secundario realizadas en el Programa "Jóvenes y Memoria Recordamos para el futuro", propuesta desarrollada por la Comisión Provincial por la Memoria desde el año 2002. La elección de los audiovisuales desarrollados en el marco de este Programa apunta a su carácter testimonial y permite cuestionar la bipolaridad "complicidad-resistencia" en la que comúnmente suelen caracterizarse las actitudes sociales del período para pensar en una matriz que contiene distintos grises o gamas de acción.
Resumo:
La finalidad de esta tesis es establecer un análisis de la metodología de entrenamiento de la resistencia especial en el futbolista. Su objetivo no está vinculado a realizar propuestas prácticas de entrenamiento, sino más bien, se tratará de abordar una posible justificación fisiológico - metabólica, a partir de la relevancia bioenergética de la creatina, en función de la creciente especialización que debe ir adquiriendo el proceso del entrenamiento deportivo a largo plazo, enfocado al logro de altos rendimientos deportivos. A partir del análisis de conceptos terminológicos de referencia, se asienta la idea general de este trabajo, es decir, la estructuración y desarrollo de la resistencia en los deportes de conjunto, como el fútbol. Los pilares de una adecuada planificación son el conocimiento y la aplicación de distintas leyes y principios del entrenamiento deportivo y su relación con los distintos medios y métodos de entrenamiento, como así también, los efectos de adaptación que provocan. Por lo tanto, a partir del análisis de los requerimientos morfológicos - funcionales de las competiciones de elite en fútbol, se pueden elaborar modelos que servirán de base y como objetivo final al cual debe ser orientado el proceso de entrenamiento. Es decir, que un entrenamiento multianual con miras a la formación de futbolistas de elite, debe respetar la especialización creciente de las cargas de entrenamiento, estableciendo una sucesión metodológica adecuada en función de los objetivos de cada etapa. En función de lo expuesto, se realiza un análisis que va desde la resistencia como capacidad física y su metodología de entrenamiento, recorriendo distintos conceptos y manifestaciones, pasando por el análisis de distintas zonas de intensidad o áreas funcionales, y desembocando en la metodología de entrenamiento intermitente de la resistencia o resistencia especial -en los deportes de conjunto-. Y es a partir de todo el análisis precedente que estamos en condiciones de abordar el entrenamiento específico en el fútbol, y más detalladamente la resistencia específica o intermitente que requiere este deporte. El entrenamiento intermitente puede ser considerado como una metodología cuyo énfasis es puesto en modificaciones que se producen a nivel muscular, por sobre factores centrales de rendimiento, presentándose como una variante óptima para el entrenamiento de la resistencia muscular local y específica del futbolista. Básicamente, el entrenamiento intermitente actuaría sobre dos puntos centrales: la mejora del sistema shuttle de la CrP, y sobre la rapidez de entrega de oxígeno al inicio del ejercicio. Aquí aparece la importancia de la suplementación con Cr: que al aumentar las concentraciones del sustrato, y junto con el entrenamiento, que mejora las reacciones enzimáticas implicadas, potenciaría las mejoras buscadas con este tipo de metodología. Queda por determinar cual es el preciso mecanismo de acción por el cual la recuperación de los fosfatos altamente energéticos se produce: si por biogénesis mitocondrial en las fibras reclutadas - generalmente FT -; o mediante el sistema de proteínas transportadoras de Cr - destacando la importancia de las ST - o por algún otro mecanismo no conocido. Su descubrimiento permitiría direccionar más precisamente el entrenamiento deportivo.
Resumo:
La mosca mediterránea de la fruta Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) está considerada una de las plagas clave para la fruticultura. El malatión es un insecticida organofosforado que fue empleado mayoritariamente en España para el control de C. capitata hasta 2009, año en el que dejó de utilizarse por no estar incluido en el anexo I de la Directiva Europea 91/414/ECC. El incremento del uso del malatión, debido a las graves pérdidas económicas causadas por C. capitata, provocó la aparición de poblaciones de campo resistentes. El estudio de una población resistente a malatión, recogida en Castelló en 2004, permitió la identificación de dos mecanismos de resistencia: una mutación puntual (G328A) en la acetilcolinesterasa (AChE) y un mecanismo de resistencia metabólica, probablemente mediado por carboxilesterasas. Teniendo en cuenta estos antecedentes, nos propusimos estudiar los mecanismos implicados en la resistencia a malatión en C. capitata. Además, durante el desarrollo de esta Tesis, el malatión fue sustituido por otros insecticidas como el espinosad y la lambda-cialotrina para el control de la plaga. En este nuevo contexto, es extremadamente importante analizar la susceptibilidad de poblaciones de campo frente a espinosad y estudiar la posible existencia de resistencia cruzada a estos insecticidas, así como sentar las bases para el estudio de futuros mecanismos de resistencia. En primer lugar, analizamos mediante bioensayos con dosis discriminante la susceptibilidad a malatión y espinosad en doce poblaciones de C. capitata de Andalucía, Aragón, Cataluña, Comunidad Valenciana e Islas Baleares; y nuestros resultados sugirieron la presencia de individuos resistentes a malatión en la mayoría de las poblaciones analizadas. En el caso del espinosad, observamos que la susceptibilidad a este insecticida de origen biológico fue elevada en la mayoría de las poblaciones, sin embargo, la población recogida en Xàbia (Alicante) mostró un nivel de susceptibilidad unas dos veces menor al resto de poblaciones. Mediante la selección en laboratorio, obtuvimos dos líneas resistentes a malatión, W-4Km y W-10Km, con unos niveles de resistencia con respeto a la línea susceptible C de 178 y 400 veces, respectivamente. Además, se seleccionó por primera vez en C. capitata una línea altamente resistente a espinosad (Xàbia-W-100s), que actualmente es unas 500 veces más resistente que la línea de laboratorio C. Con el objetivo de escoger la estrategia más adecuada para el manejo de la plaga, estudiamos la susceptibilidad a diferentes tipos de insecticidas en la línea resistente a malatión W- 4Km. En esta línea detectamos resistencia cruzada moderada a los organofosforados fentión, diazinón, fosmet, triclorfón y metil-clorpirifos (de 7 a 16 veces) y frente al carbamato carbaril, al piretroide lambda-cialotrina y al quimioesterilizante lufenurón (de 4 a 6 veces). Por otra parte, la resistencia cruzada frente a espinosad fue baja (1,5 veces). Es importante destacar que los niveles de resistencia estimados frente a todos los insecticidas fueron de uno o dos órdenes de magnitud inferiores al observado en la línea W-4Km frente a malatión (178 veces), hecho que podría deberse, al menos, a dos posibles hipótesis: que la mutación AChE G328A confiera mayor insensibilidad al malaoxón (forma activa del malatión) que a otros insecticidas que tienen como diana la AChE y/o, en segundo lugar, que el mecanismo de resistencia mediado por carboxilesterasas hidrolice el malatión de manera más eficiente que los otros insecticidas analizados. En el estudio de nuevos mecanismos de resistencia en C. capitata, por un lado, analizamos la diversidad de enzimas citocromo P450, asociadas con resistencia metabólica en otras especies, y por otro lado, desarrollamos un sistema para la detección de nuevas mutaciones puntuales que pudiesen aparecer en los genes que codifican la AChE (Ccace2) y la aliesterasa (Ccae7). Mediante el empleo de cebadores degenerados obtuvimos 37 genes CYP, que codifican enzimas P450, pertenecientes a cinco familias. Posteriormente, en un estudio de inducción con fenobarbital, observamos que la expresión de cuatro de los seis genes analizados era susceptible de ser inducida. Por otro lado, se puso a punto un sistema que permite amplificar y secuenciar, a partir de DNA genómico, los exones de los genes Ccace2 y Ccae7 en los que se han encontrado mutaciones relacionadas con resistencia a insecticidas en otras especies. Los resultados obtenidos facilitarán el estudio de nuevos mecanismos de resistencia mediados por estas enzimas en C. capitata. Se diseñó un método PCR-RFLP para identificar los individuos portadores de la mutación AChE G328A (alelo de resistencia Ccace2R) sin la necesidad de realizar bioensayos y que, además, permite detectar resistencia cuando ésta se encuentra a baja frecuencia. Según el análisis realizado, el alelo Ccace2R se observó en 25 de las 27 localidades españolas muestreadas en el territorio español, incluyendo las Islas Baleares y Canarias. Sin embargo, este alelo no se detectó en poblaciones procedentes de once países y de cinco continentes. El análisis de la presencia del alelo Ccace2R en las líneas resistentes a malatión durante el proceso de selección en el laboratorio mostró una rápida disminución de los homocigotos, tanto para el alelo susceptible como para el alelo de resistencia, en favor de los individuos heterocigotos. Así, después de 52 generaciones de selección, se observó que la totalidad de los individuos analizados de la línea W-10Km presentaban un genotipo heterocigoto para la mutación AChE G328A. Este desequilibrio contradice la segregación mendeliana esperada para un gen con dos alelos pero podría ser explicado por la existencia de una duplicación del gen Ccace2. La demostración de la presencia de esta duplicación se realizó mediante: i) el cruzamiento de individuos heterocigotos de la línea W-10Km con homocigotos susceptibles de la línea C, que dio lugar a una descendencia en la que el 100% de los individuos eran heterocigotos; ii) la evaluación del número de copias del gen Ccace2 por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), que resultó dos veces mayor en individuos de la línea W-10Km en comparación con los de la línea C; iii) el análisis del nivel de expresión de Ccace2, que fue el doble en la línea W-10Km con respecto a la línea C, y iv) el estudio de la actividad AChE, que resultó mayor en los individuos de la línea W-10Km. Según los resultados obtenidos, una duplicación del gen Ccace2 provoca la coexistencia en un mismo cromosoma del alelo silvestre y del alelo mutado y, además, las dos copias del gen Ccace2, al estar ligadas, producen una heterocigosis permanente (Ccace2RS). De esta manera se explica que el hecho de que 100% de los individuos de la línea W-10Km mostrasen un perfil de restricción correspondiente a un individuo heterocigoto ya que, en realidad, eran homocigotos estructurales para la duplicación (genotipo CCace2RS/RS). Se ha detectado un coste biológico asociado a la duplicación que consiste en un incremento en la mortalidad acumulada de los adultos a partir del séptimo día después de la emergencia. La descripción de la duplicación Ccace2RS supone la identificación de un nuevo mecanismo de resistencia a malatión en C. capitata. Finalmente, mediante el diseño de un método de doble PCR-RFLP se determinó la presencia de la duplicación Ccace2RS en la mayoría de las poblaciones españolas. La proporción de individuos portadores de la duplicación osciló entre el 5% y el 35%, observándose los mayores valores de frecuencia en las poblaciones de C. capitata recogidas en la cuenca mediterránea. Podemos por lo tanto concluir que la resistencia a malatión asociada a la mutación AChE G328A y a la duplicación Ccace2RS está ampliamente establecida en las poblaciones españolas de C. capitata. Nuestros resultados desaconsejan la utilización del malatión (si fuera de nuevo autorizado) o de otros organofosforados para el control de esta plaga. Además, una de las líneas resistentes a malatión mostró resistencia cruzada frente a insecticidas con diferentes modos de acción y que se utilizan actualmente para el control de C. capitata, tales como lambda-cialotrina y lufenurón. La alta susceptibilidad a espinosad observada en las poblaciones españolas, así como la reducida resistencia cruzada estimada para este insecticida, sugieren que su utilización es adecuada para el control de la plaga. Sin embargo, la utilización de un sólo insecticida puede entrañar riesgos por favorecer la selección de resistencia, de hecho, mediante selección en laboratorio se obtuvo una población altamente resistente a espinosad. Por tanto, es recomendable implementar programas de control integrado y de manejo de la resistencia en C. capitata utilizando distintos sistemas de control e insecticidas con diferentes mecanismos de acción que permitan su sostenibilidad en el tiempo. Los sistemas de detección de alelos de resistencia desarrollados en este trabajo permitirán la detección precoz de resistencia en campo, facilitando la decisión sobre el sistema de control más adecuado. Además, los conocimientos generados podrán contribuir al desarrollo de nuevos sistemas de detección para otros mecanismos de resistencia. Abstract. The Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824), is considered one of the most harmful pests in fruit crops. Until 2009, when malathion use was banned due to its not inclusion in the Annex I of Directive 91/414/EEC, the application of this organophosphate (OP) insecticide in Spain increased gradually due to the large economic losses caused by C. capitata. The increase in the frequency of treatments resulted in the development of resistant field populations. The study of a malathion-resistant population, collected in 2004 in Castelló (Comunidad Valenciana), allowed the identification of two resistance mechanisms: a single point mutation (G328A) in the target acetylcholinesterase (AChE), as well as a metabolic resistance mechanism, most likely carboxylesterase-mediated. Taking all the preceding into account, we studied the malathion resistance mechanisms in C. capitata. During the development of this PhD Thesis malathion use was banned by the European Union, being replaced by other insecticides, such as spinosad and lambda-cyhalotrin. Within this new working frame, the need to analyse the possible existence of cross-resistance to these insecticides and the susceptibility to spinosad in field populations was raised. This would define the baseline for future studies on resistance mechanisms. Firstly, through discriminant dose bioassays, we analysed malathion and spinosad susceptibility in twelve C. capitata populations from Andalucia, Aragon, Cataluña, C. Valenciana and the Baleares Islands. Our results suggest the presence of malathion-resistant individuals in most of the populations analysed. Regarding spinosad, we noticed a high susceptibility to this biologically derived insecticide in most of the populations, but in the one collected in Xabia (Alicante), which had a susceptibility level two times lower than the rest of populations. Through laboratory selection, we obtained two malathion-resistant strains, W-4Km and W-10Km, with resistance levels 178- and 400-fold, respectively, compared to the control susceptible C strain. Besides, a strain highly-resistant to spinosad (Xabia-W-100s), 500-times more resistant than control C strain, was selected. In order to decide the most appropriate management strategy for the pest, we studied the susceptibility to different insecticides in the malathion-resistant W-4Km strain. We detected a moderated cross-resistance to the OPs fenthion, diazinon, phosmet, trichlorphon and methylchlorpyrifos (7- to 16-fold), and to the carbamate carbaryl, the pyretroid lambda-cyhalotrin and the chemosterilizer lufenuron (4- to 6-fold). On the other hand, cross-resistance to spinosad was low (1.5-fold). It is important to note that resistance levels to all insecticides were one or two orders of magnitude less than that observed against malathion in W-4Km strain (178-fold), a fact that might be due to, at least, two possible causes: mutation AChE G328A may provide a higher insensitivity to malaoxon (the active form of malathion) than to other insecticides having AChE as target, and/or, secondly, the carboxylesterase-mediated resistance mechanism hydrolyzes malathion more efficiently than all other analysed insecticides. To investigate new resistance mechanisms in C. capitata we analysed the diversity of the cytochrome P450 enzymes, which have been associated to metabolic resistance in insects, and we developed a new method to detect single point mutations in acetylcholinesterase (Ccace2) and aliesterase (Ccae7) genes that could appear. Using degenerate primers we obtained 37 CYP genes, coding P450 enzymes, included in five families. Afterwards, in a phenobarbital-induction study, we observed that the expression of 4 out of the 6 analysed genes could be induced. On the other hand, a system was set up to amplify and to sequence from genomic DNA the exons of genes Ccace2 and Ccae7 where mutations related to insecticide resistance have been found in other species. The results obtained could facilitate the study of new resistance mechanisms in C. capitata mediated by these enzymes. A PCR-RFLP method was designed to detect the presence of the mutation AChE G328A (resistance allele Ccace2R), with no need to perform bioassays and allowing detecting resistance at low frequency. According to the analysis, the resistance allele was found in 25 out of 27 sampled locations in Spain, including the Balearic and the Canary Islands. However, this allele was not detected in other populations collected in 11 countries from 5 continents. The follow-up of the presence of the allele Ccace2R in the malathion-resistant strains during the selection process in the laboratory showed a quick decrease in homozygous individuals, for both the susceptible and the resistant alleles, favouring heterozygous. Thus, after 52 generations of selection, all the individuals analysed from W-10Km strain showed a heterozygous genotype for mutation AChE G328A, contradicting mendelian segregation as expected for a gene with two alleles. Afterwards, we were able to demonstrate that this was caused by the presence of a duplication of the gene coding acetylcholinesterase by: i) crossing heterozygous individuals from W-10Km strain with susceptible homozygous from C strain, originating a F1 population in which 100% of individuals were heterozygous; ii) evaluating the number of copies of gen Ccace2 by quantitative PCR in real time (qPCR), that happened to be twice higher in individuals from W-10Km VII strain when compared with C strain; iii) analysing the level of expression of Ccace2, twice in W- 10Km strain when compared to C strain; iv) studying the acetylcholinesterase activity, that was higher in individuals from W-10Km strain. According to these results, duplication of gen Ccace2 originates the coexistence of the susceptible and the resistant allele in the same chromosome. The two linked copies of the gene Ccace2 provoke the existence of permanent heterozygosis (Ccace2RS). This explains why the 100% of individuals from W-10Km strain showed an heterozygous restriction pattern since, in fact, they were structural homozygotes for the duplication (genotype Ccace2RS/RS). A biological cost has been detected associated to this duplication, consisting in a rise in accumulated adult mortality from the seventh day after emergence. The Ccace2RS duplication described in this study represents a new resistance mechanism to malathion in C. capitata. Finally, by the design of a double PCR-RFLP method, the presence of Ccace2RS duplication was confirmed in most of the Spanish populations. We observed that the proportion of individuals carrying the duplication oscillated between 5 and 35%, the frequency being higher in those C. capitata populations collected in the area of the Mediterranean basin. Therefore, we can conclude that malathion resistance associated to mutation AChE G328A and to Ccace2RS duplication are widely distributed in Spanish populations of C. capitata. Our results advice against the use of malathion (if it came to be newly authorized for use) or other OPs for the control of this pest. Besides, one of the malathion-resistant strains showed cross-resistance against insecticides with diverse action modes that are currently used for pest control, such as lambdacyhalotrin and lufenuron. High susceptibility to spinosad in the Spanish populations, as well as the reduced cross-resistance estimated for this insecticide suggests its adequacy for Medfly control. However, the use of a single insecticide is a risky strategy since it favours the selection of resistance. In fact, a population highly resistant to spinosad was obtained through laboratory selection. Therefore, it is advisable to implement integrated pest management (IPM) and resistance management programs for C. capitata control. Using insecticides with different modes of action and diverse control systems would contribute to the sustainability of the pest control. The resistance allele detection systems developed through this work will allow the early detection of resistance in the field, making possible the selection of the most appropriate method for pest control. Besides, the generated knowledge may also contribute to the development of new detection systems for other resistance mechanisms.
Resumo:
Monilinia spp. (M. laxa, M. fructigena y M. fructicola) causa marchitez en brotes y flores, chancros en ramas y podredumbre de la fruta de hueso provocando pérdidas económicas importantes en años con climatología favorable para el desarrollo de la enfermedad, particularmente en variedades tardías de melocotonero y nectarino. En estos huéspedes en España, hasta el momento, la especie predominante es M. laxa y, en menor proporción, M. fructigena. La reciente introducción en Europa de la especie de cuarentena M. fructicola hace necesaria una detección e identificación rápida de cada una de las especies. Además, hay diversos aspectos de la etiología y epidemiología de la enfermedad que no se conocen en las condiciones de cultivo españolas. En un primer objetivo de esta Tesis se ha abordado la detección e identificación de las especies de Monilinia spp. causantes de podredumbre parda. El estudio de las bases epidemiológicas para el control de la enfermedad constituye el fin del segundo objetivo. Para la detección del género Monilinia en material vegetal por PCR, diferenciándolo de otros hongos presentes en la superficie del melocotonero, se diseñaron una pareja de cebadores siguiendo un análisis del ADN ribosomal. La discriminación entre especies de Monilinia se consiguió utilizando marcadores SCAR (región amplificada de secuencia caracterizada), obtenidos después de un estudio de marcadores polimórficos de ADN amplificados al azar (RAPDs). También fue diseñado un control interno de amplificación (CI) basado en la utilización de un plásmido con secuencias de los cebadores diferenciadores del género, para ser utilizado en el protocolo de diagnóstico de la podredumbre parda con el fin de reconocer falsos negativos debidos a la inhibición de PCR por componentes celulares del material vegetal. Se disponía de un kit comercial que permitía distinguir Monilinia de otros géneros y M. fructicola del resto de especies mediante anticuerpos monoclonales utilizando la técnica DAS-ELISA. En esta Tesis se probaron diferentes fuentes de material como micelio ó conidias procedentes de cultivos en APD, o el micelio de la superficie de frutas o de momias frescas, como formas de antígeno. Los resultados obtenidos con ELISA se compararon con la identificación por métodos morfológico-culturales y por PCR con los cebadores desarrollados en esta Tesis. Los resultados demostraron la posibilidad de una detección temprana en frutas frescas por este método, realzando las posibilidades de una diagnosis temprana para una prevención más eficaz de M. fructicola en fruta de hueso. El estudio epidemiológico de la enfermedad comenzó con la determinación de las principales fuentes de inóculo primario y su importancia relativa en melocotoneros y nectarinos del valle del Ebro. Para ello se muestrearon 9 huertos durante los años 2003 a 2005 recogiendo todas las momias, frutos abortados, gomas, chancros, y brotes necróticos en los árboles. También se recogieron brotes aparentemente sanos y muestras de material vegetal situados en el suelo. En estas muestras se determinó la presencia de Monilinia spp. Los resultados mostraron que la fuente principal de inóculo son las momias que se quedan en los árboles en las que la supervivencia del hongo tras el invierno es muy alta. También son fuentes de inóculo las momias del suelo y los brotes necróticos. De aquí se deriva que una recomendación importante para los agricultores es que deben eliminar este material de los huertos. Un aspecto no estudiado en melocotonero o nectarino en España es la posible relación que puede darse entre la incidencia de infecciones latentes en los frutos inmaduros a lo largo del cultivo y la incidencia de podredumbre en los frutos en el momento de la recolección y en postcosecha. Esta relación se había observado previamente en otros frutales de hueso infectados con M. fructicola en diversos países del mundo. Para estudiar esta relación se realizaron ensayos en cinco huertos comerciales de melocotonero y nectarino situados en el Valle del Ebro en cuatro estados fenológicos durante los años 2000-2002. No se observaron infecciones latentes en botón rosa, dándose la máxima incidencia en precosecha, aunque en algunos huertos se daba otro pico en el endurecimiento del embrión. La especie prevaleciente fue M. laxa. Se obtuvo una correlación positiva significativa entre la incidencia de infecciones latentes y la incidencia de podredumbre en postcosecha. Se desarrolló también un modelo de predicción de las infecciones latentes en función de la temperatura (T) y el periodo de humectación (W). Este modelo indicaba que T y W explicaban el 83% de la variación en la incidencia de infecciones latentes causadas por Monilinia spp. Por debajo de 8ºC no se predecían latentes, necesitándose más de 22h de W para predecir la ocurrencia de latentes con T = 8ºC, mientras que solo se necesitaban 5h de W a 25ºC. Se hicieron también ensayos en condiciones controladas para determinar la relación entre la incidencia de las infecciones latentes, las condiciones ambientales (T y W), la concentración de inóculo del patógeno (I) y el estado de desarrollo del huésped (S) y para validar el modelo de predicción desarrollado con los experimentos de campo. Estos ensayos se llevaron cabo con flores y frutos de nectarino procedentes de un huerto comercial en seis estados fenológicos en los años 2004 y 2005, demostrándose que la incidencia de podredumbre en postcosecha y de infecciones latentes estaba afectada por T, W, I y S. En los frutos se producían infecciones latentes cuando la T no era adecuada para el desarrollo de podredumbre. Una vez desarrollado el embrión eran necesarias más de 4-5h de W al día y un inóculo superior a 104 conidias ml-1 para que se desarrollase o podredumbre o infección latente. La ecuación del modelo obtenido con los datos de campo era capaz de predecir los datos observados en estos experimentos. Para evaluar el efecto del inóculo de Monilinia spp. en la incidencia de infecciones latentes y de podredumbre de frutos en postcosecha se hicieron 11 experimentos en huertos comerciales de melocotonero y nectarino del Valle del Ebro durante 2002 a 2005. Se observó una correlación positiva entre los números de conidias de Monilinia spp. en la superficie de los frutos y la incidencia de infecciones latentes De los estudios anteriores se deducen otras dos recomendaciones importantes para los agricultores: las estrategias de control deben tener en cuenta las infecciones latentes y estimar el riesgo potencial de las mismas basándose en la T y W. Deben tener también en cuenta la concentración de esporas de Monilinia spp. en la superficie de los frutos para disminuir el riesgo de podredumbre parda. El conocimiento de la estructura poblacional de los patógenos sienta las bases para establecer métodos más eficaces de manejo de las enfermedades. Por ello en esta Tesis se ha estudiado el grado de diversidad genética entre distintas poblaciones de M. laxa en diferentes localidades españolas utilizando 144 marcadores RAPDs (59 polimórficos y 85 monomórficos) y 21 aislados. El análisis de la estructura de la población reveló que la diversidad genética dentro de las subpoblaciones (huertos) (HS) representaba el 97% de la diversidad genética (HT), mientras que la diversidad genética entre subpoblaciones (DST) sólo representaba un 3% del total de esta diversidad. La magnitud relativa de la diferenciación génica entre subpoblaciones (GST) alcanzaba 0,032 y el número estimado de migrantes por generación (Nm) fue de 15,1. Los resultados obtenidos en los dendrogramas estaban de acuerdo con el análisis de diversidad génica. Las agrupaciones obtenidas eran independientes del huerto de procedencia, año o huésped. En la Tesis se discute la importancia relativa de las diferentes fuentes evolutivas en las poblaciones de M. laxa. Finalmente se realizó un muestreo en distintos huertos de melocotonero y nectarino del Valle del Ebro para determinar la existencia o no de aislados resistentes a los fungicidas del grupo de los benzimidazoles y las dicarboximidas, fungicidas utilizados habitualmente para el control de la podredumbre parda y con alto riesgo de desarrollar resistencia en las poblaciones patógenas. El análisis de 114 aislados de M. laxa con los fungicidas Benomilo (bencimidazol) (1Bg m.a ml-1), e Iprodiona (dicarboximida) (5Bg m.a ml-1), mostró que ninguno era resistente en las dosis ensayadas. Monilinia spp. (M. laxa, M. fructigena and M. fructicola) cause bud and flower wilt, canker in branches and stone fruit rot giving rise important economic losses in years with appropriate environmental conditions, it is particularly important in late varieties of peach and nectarine. Right now, M. laxa is the major species for peach and nectarine in Spain followed by M. fructigena, in a smaller proportion. The recent introduction of the quarantine organism M. fructicola in Europe makes detection and identification of each one of the species necessary. In addition, there are different aspects of disease etiology and epidemiology that are not well known in Spain conditions. The first goal of this Thesis was the detection and identification of Monilinia spp. causing brown rot. Study of the epidemiology basis for disease control was the second objective. A pair of primers for PCR detection was designed based on the ribosomal DNA sequence in order to detect Monilinia spp. in plant material and to discriminate it from other fungi colonizing peach tree surface. Discrimination among Monilinia spp. was successful by SCAR markers (Sequence Characterized Amplified Region), obtained after a random amplified polymorphic DNA markers (RAPDs) study. An internal control for the PCR (CI) based on the use of a mimic plasmid designed on the primers specific for Monilinia was constructed to be used in diagnosis protocol for brown rot in order to avoid false negatives due to the inhibition of PCR as consequence of remained plant material. A commercial kit based on DAS-ELISA and monoclonals antibodies was successfully tested to distinguish Monilinia from other fungus genera and M. fructicola from other Monilinia species. Different materials such as micelium or conidias from APD cultures, or micelium from fresh fruit surfaces or mummies were tested in this Thesis, as antigens. Results obtained by ELISA were compared to classical identification by morphologic methods and PCR with the primers developed in this Thesis. Results demonstrated the possibility of an early detection in fresh fruits by this method for a more effective prevention of M. fructicola in stone fruit. The epidemiology study of the disease started with the determination of the main sources of primary inoculum and its relative importance in peach trees and nectarines in the Ebro valley. Nine orchards were evaluated during years 2003 to 2005 collecting all mummies, aborted fruits, rubbers, cankers, and necrotic buds from the trees. Apparently healthy buds and plant material located in the ground were also collected. In these samples presence of Monilinia spp. was determined. Results showed that the main inoculum sources are mummies that stay in the trees and where fungus survival after the winter is very high. Mummies on the ground and the necrotics buds are also sources of inoculum. As consequence of this an important recommendation for the growers is the removal of this material of the orchards. An important issue not well studied in peach or nectarine in Spain is the possible relationship between the incidence of latent infections in the immature fruits and the incidence of fruit rot at harvesting and postharvesting. This relationship had been previously shown in other stone fruit trees infected with M. fructicola in different countries over the world. In order to study this relationship experiments were run in five commercial peach and nectarine orchards located in the Ebro Valley in four phenologic states from 2000 to 2002. Latent infections were not observed in pink button, the maxima incidence arise in preharvest, although in some orchards another increase occurred in the embryo hardening. The most prevalence species was M. laxa. A significant positive correlation between the incidence of latent infections and the incidence of rot in postharvest was obtained. A prediction model of the latent infections based on the temperature (T) and the wetness duration (W) was also developed. This model showed that T and W explained 83% of the variation in latent infection incidence caused by Monilinia spp. Below 8ºC latent infection was not predicted, more than 22h of W with T = 8ºC were needed to predict latent infection occurrence of, whereas at 25ºC just 5h of W were enough. Tests under controlled conditions were also made to determine the relationship among latent infections incidence, environmental conditions (T and W), inoculum concentration of the pathogen (I) and development state of the host (S) to validate the prediction model developed on the field experiments. These tests were made with flowers and fruits of nectarine coming from a commercial orchard, in six phenologic states in 2004 and 2005, showing that incidence of rot in postharvest and latent infections were affected by T, W, I and S. In fruits latent infections took place when the T was not suitable for rot development. Once developed the embryo, more than 4-5h of W per day and higher inoculums (104 conidia ml-1) were necessary for rot or latent infection development. The equation of the model obtained with the field data was able to predict the data observed in these experiments. In order to evaluate the effect of inoculum of Monilinia spp. in the incidence of latent infections and of rot of fruits in postharvest, 11 experiments in commercial orchards of peach and nectarine of the Ebro Valley were performed from 2002 to 2005. A positive correlation between the conidial numbers of Monilinia spp. in the surface of the fruits and the incidence of latent infections was observed. Based on those studies other two important recommendations for the agriculturists are deduced: control strategies must consider the latent infections and potential risk based on the T and W. Spores concentration of Monilinia spp. in the surface of fruits must be also taken in concern to reduce the brown rot risk. The knowledge of the population structure of the pathogens determines the bases to establish more effective methods of diseases handling. For that reason in this Thesis the degree of genetic diversity among different M. laxa populations has been studied in different Spanish locations using 144 RAPDs markers (59 polymorphic and 85 monomorphics) on 21 fungal isolates. The analysis of the structure of the population revealed that the genetic diversity within the subpopulations (orchards) (HS) represented 97% of the genetic diversity (HT), whereas the genetic diversity between subpopulations (DST) only represented a 3% of the total of this diversity. The relative magnitude of the genic differentiation between subpopulations (GST) reached 0.032 and the considered number of migrantes by generation (Nm) was of 15.1. The results obtained in dendrograms were in agreement with the analysis of genic diversity. The obtained groupings were independent of the orchard of origin, year or host. In the Thesis the relative importance of the different evolutionary sources in the populations from M. laxa is discussed. Finally a sampling of resistant isolates in different orchards from peach and nectarine of Ebro Valley was made to determine the existence of fungicide resistance of the group of benzimidazoles and the dicarboximidas, fungicides used habitually for the control of rot brown and with high risk of resistance developing in the pathogenic populations. The analysis of 114 isolated ones of M. laxa with the fungicides Benomilo (bencimidazol) (1Bg m.a ml-1), and Iprodiona (dicarboximida) (5Bg m.a ml-1), showed no resistant in the doses evaluated.
Resumo:
La siguiente investigación está centrada en establecer las diferencias en la reutilización, en los hormigones de consistencia seca, de dos tipos de caucho obtenidos en el proceso del reciclado del neumático, caucho reciclado del neumático (CRN): los tamaños del granulado (4-8 mm) de caucho reciclado de alta calidad (CR: Caucho Limpio) y el desecho del proceso del reciclado: fibra textil y de acero con trazas de caucho (desecho del caucho reciclado, IR: Caucho de impurezas). Ambos tipos fueron clasificados y añadidos como árido en sustitución del árido grueso (grava) desde el 20 al 100% del volumen. El comportamiento físico y mecánico del IR en los hormigones fue comparado con el hormigón de referencia y las series con el CR para el futuro uso en piezas de hormigón prefabricado. En ambos casos se aprecia una reducción de las resistencias mecánicas en proporción con las cantidades de caucho de sustitución, pero menos en series con IR con una combinación satisfactoria de fibra textil y metálica. El IR muestra mayores pérdidas en propiedades tales como trabajabilidad y densidad, pero también con un incremento de la porosidad. Estos hechos facilitan nuevas opciones para los desechos procedentes del CRN en los hormigones y por lo tanto menores gastos de energía, logrando una tasa de éxito en el proceso de reciclado cercano al 100%. The following research is focused on establishing the differences in the re-use as aggregate in dry consistency concretes of two types of rubber obtained in the process of tyre recycling, recycled rubber from tyres (RRT): granulated sizes (4–8 mm) of high quality recycled rubber (CR: Clean Rubber) and the waste of the recycling process: steel and textile fibers with rubber tracks (waste from recycled rubber, WRR). Both types were classified and added as aggregate in substitution of coarse aggregates from 20 to 100 % by volume. The physical and mechanical behavior of IR in concretes was compared with reference concrete and series with CR for a future use in precast concrete pieces. In both samples a reduction of mechanical resistance occurs in proportion with the amounts of rubber of substitution, but less in serials with IR with a successful combination of steel and textile fiber. IR shows furthermore a reduction in properties such as workability and density, but also an increment in porosity. These facts facilitate new options for waste from CRN in concretes and therefore lower energy costs, achieving a success rate in the recycling process close to 100 %.
