The ARIQUELI study: potentiation of quetiapine in bipolar I nonresponders with lithium versus aripiprazole

Abstract Background:The treatment of bipolar disorder (BD) remains a challenge due to the complexity of the disease. Current guidelines represent an effort to assist clinicians in routine practice but have several limitations, particularly concerning long-term treatment. The ARIQUELI (efficacy and tolerability of the combination of lithium or aripiprazole in young bipolar non or partial responders to quetiapine monotherapy) study aims to evaluate two different augmentation strategies for quetiapine nonresponders or partial responders in acute and maintenance phases of BD treatment. Methods/Design: The ARIQUELI study is a single-site, parallel-group, randomized, outcome assessor-blinded trial. BD I patients according to the DSM-IV-TR, in depressive, manic/hypomanic or mixed episode, aged 18 to 40 years, are eligible. After diagnostic assessments, patients initiated treatment in phase I with quetiapine. Nonresponders or partial responders after 8 weeks are allocated into one of two groups, potentiated with either lithium (0.5 to 0.8 mEq/l) or aripiprazole (10 or 15 mg). Patients will be followed up for 8 weeks in phase I (acute treatment), 6 months in phase II (continuation treatment) and 12 months in phase III (maintenance treatment). Outcome assessors are blinded to the treatment. The primary outcome is the evaluation of changes in mean scores on the CGI-BP-M between baseline and the endpoint at the end of each study phase. Discussion: The ARIQUELI study is currently in progress, with patients undergoing acute treatment (phase I), potentiation (phase II) and maintenance (phase III). The study will be extended until January 2015. Trials comparing lithium and aripiprazole with potentiate treatment in young BD I nonresponders to quetiapine in monotherapy can provide relevant information on the safety of these drugs in clinical practice. Long-term treatment is an issue of great importance and should be evaluated further through more in-depth studies given that BD is a chronic disease. Trial registration: ClinicalTrials.gov identifier: NCT01710163

Width of buccal and posterior corridors: differences between cases treated with asymmetric and symmetric extractions

OBJECTIVE: To verify if there is difference in the buccal and posterior corridor width in cases treated with extraction of one and four premolars. METHODS: Through posed smile photographs of 23 Class II patients, subdivision, treated with extraction of one premolar and 25 Class I and Class II patients, subdivision, treated with extraction of four premolars, the percentage of buccal and posterior corridor width was calculated. The two protocols of extractions were compared regarding the buccal and posterior corridor width by independent t tests. RESULTS: There was no statistically significant difference on the buccal and posterior corridor widths between patients treated with symmetric and asymmetric extraction. CONCLUSION: The buccal and posterior corridor did not differ between the evaluated protocols of extractions.

TLR2- and 4-independent immunomodulatory effect of high molecular weight components from Ascaris suum

Components of high molecular-weight (PI) obtained from Ascaris suum extract down-regulate the Th1/Th2-related immune responses induced by ovalbumin (OVA)-immunization in mice. Furthermore, the PI down-modulates the ability of dendritic cells (DCs) to activate T lymphocytes by an IL-10-mediated mechanism. Here, we evaluated the role of toll like receptors 2 and 4 (TLR2 and 4) in the modulatory effect of PI on OVA-specific immune response and the PI interference on DC full activation. An inhibition of OVA-specific cellular and humoral responses were observed in wild type (WT) or in deficient in TLR2 (TLR2(-/-)) or 4 (TLR4(-/-)) mice immunized with OVA plus PI when compared with OVA-immunized mice. Low expression of class II MHC, CD40, CD80 and CD86 molecules was observed in lymph node (LN) cells from WT, TLR2(-/-) or TLR4(-/-) mice immunized with OVA plus PI compared with OVA-primed cells. We also verified that PI was able to modulate the activation of DCs derived from bone marrow of WT, TLR2(-/-) or TLR4(-/-) mice induced in vitro by agonists of TLRs, as observed by a decreased expression of class II MHC and costimulatory molecules and by low secretion of pro-inflammatory cytokines. Its effect was accompanied by IL-10 synthesis. In this sense, the modulatory effect of PI on specific-immune response and DC activation is independent of TLR2 or TLR4.

The immunogenicity of chemically derived zwitterionic polysaccharides

Bacterial capsular polysaccharides (PS) which naturally contain zwitterionic charge motifs (ZPS) possess specific immunostimulatory activity, leading to direct activation of antigen-presenting cells (APCs) through Toll-like receptor 2 (TLR2) and of T cells in co-culture systems. When administered intraperitoneally, ZPS and bacteria expressing them are involved in the induction or regulation of T-cell dependent inflammatory processes such as intra-abdominal abscess formation. Moreover it has been published that ZPSs are processed to low molecular weight carbohydrates and presented to T cells through a pathway similar to that used for protein antigens. These findings were in contrast with the paradigm according to which polysaccharides are T-independent antigens unable to be presented in association with MHC class II molecules and unable to induce a protective immune response. For this reason in glycoconjugate vaccines polysaccharides often need to be conjugated to a carrier protein to induce protection. The aim of our work was to generate vaccine candidates with antigen and adjuvant properties in one molecule by the chemical introduction of a positive charge into naturally anionic PS from group B streptococcus (GBS). The resulting zwitterionic PS (ZPS) has the ability to activate human and mouse APCs, and in mixed co-cultures of monocytes and T cells, ZPS induce MHC II-dependent T-cell proliferation and up-regulation of activation markers. TLR2 transfectants show reporter gene transcription upon incubation with ZPS and these stimulatory qualities can be blocked by anti-TLR2 mAbs or by the destruction of the zwitterionic motif. However, in vivo, ZPS used alone as vaccine antigen failed to induce protection against GBS challenge, a result which does not confirm the above mentioned postulate that ZPS are T-cell dependent Ags by virtue of their charge motif. Thus to make ZPS visible to the immune system we have conjugated ZPS with a carrier protein. ZPS-glycoconjugates induce higher T cell and Ab responses to carrier and PS, respectively, compared to control PS-glycoconjugates made with the native polysaccharide form. Moreover, protection of mothers or neonate offspring from lethal GBS challenge is better when mothers are immunized with ZPS-conjugates compared to immunization with PS-conjugates. In TLR2 knockout mice, ZPS-conjugates lose both their increased immunogenicity and protective effect after vaccination. When ZPS are co-administered as adjuvants with unconjugated tetanus toxoid (TT), they have the ability to increase the TT-specific antibody titer. In conclusion, glycoconjugates containing ZPS are potent vaccines. They target Ag to TLR2-expressing APCs and activate these APCs, leading to better T cell priming and ultimately to higher protective Ab titers. Thus, rational chemical design can generate potent novel PS-adjuvants with wide application, including glycoconjugates and co-administration with unrelated protein Ags.

New polymeric materials for vascular surgery

The dramatic impact that vascular diseases have on human life quality and expectancy nowadays is the reason why both medical and scientific communities put great effort in discovering new and effective ways to fight vascular pathologies. Among the many different treatments, endovascular surgery is a minimally-invasive technique that makes use of X-ray fluoroscopy to obtain real-time images of the patient during interventions. In this context radiopaque biomaterials, i.e. materials able to absorb X-ray radiation, play a fundamental role as they are employed both to enhance visibility of devices during interventions and to protect medical staff and patients from X-ray radiations. Organic-inorganic hybrids are materials that combine characteristics of organic polymers with those of inorganic metal oxides. These materials can be synthesized via the sol-gel process and can be easily applied as thin coatings on different kinds of substrates. Good radiopacity of organic-inorganic hybrids has been recently reported suggesting that these materials might find applications in medical fields where X-ray absorption and visibility is required. The present PhD thesis aimed at developing and characterizing new radiopaque organic-inorganic hybrid materials that can find application in the vascular surgery field as coatings for the improvement of medical devices traceability as well as for the production of X-ray shielding objects and garments. Novel organic-inorganic hybrids based on different polyesters (poly-lactic acid and poly-ε-caprolactone) and polycarbonate (poly-trimethylene carbonate) as the polymeric phase and on titanium oxide as the inorganic phase were synthesized. Study of the phase interactions in these materials allowed to demonstrate that Class II hybrids (where covalent bonds exists between the two phases) can be obtained starting from any kind of polyester or polycarbonate, without the need of polymer pre-functionalization, thanks to the occurrence of transesterification reactions operated by inorganic molecules on ester and carbonate moieties. Polyester based hybrids were successfully coated via dip coating on different kinds of textiles. Coated textiles showed improved radiopacity with respect to the plain fabric while remaining soft to the touch. The hybrid was able to coat single fibers of the yarn rather than coating the yarn as a whole. Openings between yarns were maintained and therefore fabric breathability was preserved. Such coatings are promising for the production of light-weight garments for X-ray protection of medical staff during interventional fluoroscopy, which will help preventing pathologies that stem from chronic X-ray exposure. A means to increase the protection capacity of hybrid-coated fabrics was also investigated and implemented in this thesis. By synthesizing the hybrid in the presence of a suspension of radiopaque tantalum nanoparticles, PDMS-titania hybrid materials with tunable radiopacity were developed and were successfully applied as coatings. A solution for enhancing medical device radiopacity was also successfully investigated. High metal radiopacity was associated with good mechanical and protective properties of organic-inorganic hybrids in the form of a double-layer coating. Tantalum was employed as the constituent of the first layer deposited on sample substrates by means of a sputtering technique. The second layer was composed of a hybrid whose constituents are well-known biocompatible organic and inorganic components, such as the two polymers PCL and PDMS, and titanium oxide, respectively. The metallic layer conferred to the substrate good X-ray visibility. A correlation between radiopacity and coating thickness derived during this study allows to tailor radiopacity simply by controlling the metal layer sputtering deposition time. The applied metal deposition technique also permits easy shaping of the radiopaque layer, allowing production of radiopaque markers for medical devices that can be unambiguously identified by surgeons during implantation and in subsequent radiological investigations. Synthesized PCL-titania and PDMS-titania hybrids strongly adhered to substrates and show good biocompatibility as highlighted by cytotoxicity tests. The PDMS-titania hybrid coating was also characterized by high flexibility that allows it to stand large substrate deformations without detaching nor cracking, thus being suitable for application on flexible medical devices.

Celiachia e difetti dello smalto in età evolutiva: correlazione tra periodo di esposizione al glutine, forme cliniche di celiachia e aplotipo HLA

The association between celiac disease (CD) and dental enamel defects (DED) is well known. AIM: This study was designed to investigate the prevalence of DED in CD children and to specifically find a possible correlation between DED and gluten exposure period, CD clinical forms, HLA class II haplotype. MATERIALS AND METHODS: This study was designed as a matched case-control study: 374 children were enrolled (187 celiac and 187 non celiac). Data about age at CD diagnosis, CD clinical form and HLA haplotype were recorded. RESULTS: DED were detected in 87 celiac subject while no dental lesions were found in the remaining 100 patients; in 187 healthy controls enamel lesion were significantly less frequent (5.3 % versus 46.5% ; p<0.005).We found a correlation between DED and gluten exposure period, since among CD patients the mean age at CD diagnosis was significantly (p= 0.0004) higher in the group with DED (3.41± 1.27) than without DED (1.26± 0.7). DED resulted more frequent in atypical and silent forms than in the typical one. The presence of HLA DR 52-53 and DQ7 antigens significantly increased the risk of DED (p=0.0017). CONCLUSIONS: Our results confirmed a possible correlation between CD clinical form, age at CD diagnosis, HLA antigens and DED. The origin of DED in CD children is due to multifactorial events and further studies are needed to investigate other determinants.

Ecological genetics and conservation genomics of wolf (Canis lupus)

In the present work, we apply both traditional and Next Generation Sequencing (NGS) tools to investigate some of the most important adaptive traits of wolves (Canis lupus). In the first part, we analyze the variability of three Major Histocompatibility Complex (MHC) class II genes in the Italian wolf population, also studying their possible role in mating choice and their influence on fitness traits. In the second section, as part of a larger canid genome project, we will exploit NGS data to investigate the transcript-level differences between the wolf and the dog genome that can be correlated to domestication.

Induktion und Analyse spezifischer Immunantworten nach intranodaler Immunisierung mit RNA im murinen Modell

Die Wirksamkeit einer Vakzine ist von vielen Parametern abhängig. Dazu gehören unter anderen: das ausgewählte Antigen, die Formulation in der das Antigen benutzt wird sowie die Applikationsroute. Antigen-kodierende Ribonukleinsäuren (RNA) gilt heutzutage als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptiden, rekombinanten Proteinen, viralen Systemen oder DNA basierten Impfstoffen. Bezüglich des Applikationsortes repräsentiert der Lymphknoten ein optimales Milieu für die Interaktion zwischen antigenpräsentierenden Zellen und T-Zellen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung dieser Arbeit, ein auf direktem in vivo Transfer von Antigen-kodierender in vitro transkribierter RNA (IVT-RNA) basierendes Impfverfahren zu entwickeln, zu charakterisieren und auf seine anti-tumorale Wirksamkeit zu testen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen (DCs) in vitro hocheffizient mit IVT-RNA transfiziert werden können und eine hohe stimulatorische Kapazität besitzen. Durch Sequenzmodifikation der IVT-RNA konnten wir die Transkriptstabilität und Translationseffizienz erhöhen was zu einer Steigerung der stimulatorischen Kapazität in vivo führte. Darüber hinaus untersuchten wir die Auswirkung der Insertion eines Signalpeptides 5’ sowie einer C-terminalen transmembran- und zytosolischen-Domäne eines MHC-Klasse-I-Moleküls am 3’ der Antigen-kodierenden Sequenz auf die Effizienz der MHC-Klasse-I und -II Präsentation. Wir konnten in vitro und in vivo nachweisen, dass diese Modifikation zu einer gesteigerten, simultanen Stimulation von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen führt. Auf der Basis der optimierten Vektorkassetten etablierten wir die intranodale (i.n.) Transfektion von antigenpräsentierenden Zellen in der Maus. Dazu nutzten wir verschiedene Reportersysteme (eGFP-RNA, fluoreszensmarkierte RNA) und konnten zeigen, dass die intranodale Applikation von IVT-RNA zu selektiven Transfektion und Maturation lymphknotenresidenter DCs führt. Zur Untersuchung der immunologischen Effekte wurden in erster Linie auf Influenza-Hemagglutinin-A und Ovalbumin basierende Modellantigensysteme verwendet. Beide Antigene wurden als Antigen-MHC-Fusionskonstrukte genutzt. Als Responderzellen wurden TCR-transgene Lymphozyten verwendet, die MHC-Klasse-I oder -Klasse-II restringierte Epitope des Influenza-Hemagglutinin-A bzw. des Ovalbumin-Proteins erkennen. Wir konnten in vivo zeigen, dass die intranodale Immunisierung mit IVT-RNA zu einer effizienten Stimulation und Expansion von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen in einer dosisabhängigen Weise führt. Funktionell konnte gezeigt werden, dass diese T-Zellen Zytokine sezernieren und zur Zytolyse befähigt sind. Wir waren in der Lage durch repetitive i.n. RNA Immunisierung ein ‚Priming’ CD8+ T-Zellen in naiven Mäusen sowohl gegen virale als auch gegen Tumor assoziierte Antigene zu erreichen. Die geprimten T-Zellen waren befähigt eine zytolytische Aktivität gegen mit spezifischem Peptid beladene Targetzellen zu generieren. Darüber hinaus waren wir in der Lage Gedächtnisszellen expandieren zu können. Abschließend konnten wir in Tumormodellen sowohl in prophylaktischen als auch in therapeutischen Experimenten zeigen dass die i.n. RNA Vakzination die Potenz zur Induktion einer anti-tumoralen Immunität besitzt.

Einfluss prebiotischer Oligosaccharide und probiotischer Bakterien auf den Phänotyp und die Funktion dendritischer Zellen

Neben der Therapie allergischer Erkrankungen, wie dem allergischen Asthma oder der atopischen Dermatitis, nehmen präventive Maßnahmen zur Vermeidung einer Sensibilisierung einen immer höheren Stellenwert ein. Hierbei scheint der Einsatz von Pre- und Probiotika vielversprechend zu sein. rnrnIm Rahmen dieser Dissertation wurde der Einfluss von Pre- und Probiotika auf den Phänotyp und die Funktion von DCs untersucht. Hierzu wurden unreife DCs aus Vorläuferzellen im Knochenmark von Mäusen differenziert (BM-DCs). Nach Behandlung der Kulturen während der Differenzierung der BM-DCs mit neutrale Humanmilch-analoge Oligosaccharide-enthaltenden Präparationen (NOS-Präparationen) konnte ein Einfluss auf die Zellen nachgewiesen werden; die NOS-Präparationen sind in der Lage, die durch LPS induzierte Ausreifung der BM-DCs zu supprimieren. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die primärstimulatorische Kapazität LPS-stimulierter BM-DCs, die in Anwesenheit von NOS-Präparationen differenziert wurden, sowohl für allogene als auch für syngene T-Zellen signifikant vermindert war. Die Charakterisierung dieser T-Zellen ergab zwar eine verstärkte Expression des für regulatorische T-Zellen charakteristischen Transkriptionsfaktors FoxP3, auf funktioneller Ebene konnte jedoch keine Induktion von regulatorischen T-Zellen beobachtet werden; allerdings wurde in diesen T-Zellen eine Anergie induziert. Der Befund, dass verschiedene NOS-Präparationen unterschiedliche Wirkungen auf die Differenzierung von BM-DCs aufweisen, muss weitergehend untersucht werden. rnrnWeiterhin wurden im Rahmen dieser Arbeit die Auswirkungen einer Kultivierung der BM-DCs mit den beiden probiotischen Bakterien Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) und Lactobacillus fermentum analysiert. Hier induzierte ein Kontakt unreifer BM-DCs mit den Bakterien eine Maturierung der Zellen. Das Potential zur Produktion von IL-10 konnte dabei nicht erhöht werden. Im Gegensatz dazu induzierte eine Supplementierung der Kulturen während der Differenzierungsphase der DCs konträre Effekte; die LGG-Gabe resultierte hier in einer unvollständigen Ausreifung der DCs nach LPS-Stimulus. Dies konnte auch auf funktioneller Ebene als stark vermindertes Potential zur T-Zellstimulation bestätigt werden. Inwieweit die Supplementierung mit LGG in tolerogenen DCs resultiert, welche Tregs induzieren können, muss weiter analysiert werden.

Amidverknüpfte Ferrocene - schaltbare molekulare Drähte und Sensoren

In dieser Arbeit werden Synthesen und Eigenschaften von Verbindungen mit einer oder mehreren Ferrocen- bzw. Biferroceneinheiten beschrieben, die über Amid-, Anhydrid- oder Harnstoff-Funktionen verknüpft oder mittels Amidfunktion an α-Aminosäurederivate gebunden sind. Als Zentralbausteine dienen die künstlichen Aminosäuren 1’-Aminoferrocen-1-carbonsäure (Fca) bzw. 1’-Aminobiferrocen-1-carbonsäure (Bfca). Die Ferroceneinheit agiert als redoxschaltbares Gelenk, die Amidfunktion ermöglicht die Ausbildung von Sekundärstrukturen und die Bindung von Anionen. Das redoxschaltbare „Multiwellenlängen“-Sensorpaar [Dansyl-Ala-Fca-Ala-CH2-Naphthyl]0/+ ist in der Lage, insgesamt sieben Anionen aufgrund von sechs einfach zu erhaltenden optischen Messwerten eindeutig zu diskriminieren. Die Vorzugskonformation des neutralen Rezeptors mit intramolekularen Wasserstoffbrücken wird mittels X-Ray, NMR- und DFT-Methoden im Festkörper, in Lösung und in der Gasphase bestimmt. Die oligomeren Fca-Verbindungen SG-Fcan-HN-Fc (SG = Boc, Fmoc; n = 1, 2) und SG-Fca2-OMe (SG = Boc, Fmoc) werden mittels Peptidkupplung in Lösung hergestellt, Fmoc-Fca3-Gly-OMe, Fmoc-Fcan-OMe (n = 3-5) und Fmoc-Fca4-NH2 dagegen durch ein neu entwickeltes Festphasensynthese-Protokoll. Die amidverknüpften Verbindungen bilden eine „Zick-Zack“-Struktur mit 1,2’-Konformation der Fca-Einheiten und achtgliedrigen intramolekularen Wasserstoffbrücken-Ringen, wie durch X-Ray, 2D-NMR-, DFT-Methoden und Dipolmoment-Bestimmung gezeigt wird. Elektrochemische Experimente belegen eine elektronische Wechselwirkung der Eisenzentren. Die gemischt-valenten Verbindungen zeichnen sich durch IVCT-Banden im nahen Infrarot aus. Die elektronische Kopplungskonstante beträgt Hab ≈ 145-215 cm–1 für einen einzelnen FeII/FeIII-Übergang und belegt die Zugehörigkeit der Verbindungen zur Robin-Day-Klasse II. Im Festkörper sind die Valenzen gemäß Mößbauerspektren lokalisiert. Die vollständig oxidierten Verbindungen liegen nach DFT-Rechnungen nicht mehr in einer „Zick-Zack“-Struktur, sondern in einer gestreckten Konformation vor. Als Nebenprodukte bei der Amidkupplung werden die Anhydride SG-(Fca)2O (SG = Ac, Boc, Fmoc) isoliert. Diese zählen aufgrund des Fehlens einer IVCT-Bande zur Klasse I-II. Die ferrocenyloge Bfca wird in Form der N- und C-geschützten Bfca auf zwei Wegen synthetisiert. Schlüsselschritte stellen die Cu(II)-vermittelte Homokupplung bzw. die Pd-katalysierte Stille-Kupplung dar. Bfca und die amid- und harnstoffverknüpften Bis-Bfca-Verbindungen besitzen keine nachweisbare Vorzugskonformation in Lösung. Die gemischt-valenten Bfca-Kationen zeigen eine IVCT-Bande (Hab ≈ 300-600 cm–1) und gehören eher zur Klasse II-III. Die gemischt-valenten Verbindungen des als Nebenprodukt isolierten Tetraferrocenylstannans Sn[Fn(COOMe)4] (Fn = 1,1’-Ferrocenylen) mit einatomiger σ-Brücke zwischen den Ferroceneinheiten, zeigen IVCT-Banden im NIR-Spektrum und gehören somit zur Klasse II. Die elektronischen Kopplungen in Sn[Fn(COOMe)4]+/2+ betragen Hab ≈ 145 und 220 cm–1.

Assessing the role of sCYLD and Bcl-3 in immune regulation

CYLD is a deubiquitinating enzyme, which negatively regulates NF-κB signaling by removing Lys63-linked polyubiquitin chains from its substrates. In mice, there are two variants of CYLD: full-length CYLD (FL-CYLD) and its short splice variant sCYLD. sCYLD lacks the NEMO and TRAF2 binding sites and CYLDex7/8 mice, which have been generated in our laboratory, overexpress sCYLD in the absence of the full length transcript. In this thesis, we show that bone marrow-derived macrophages (BMDCs) overexpressing sCYLD display a hyperactive phenotype. They have increased levels of the inflammatory cytokines IL-6 and TNFα, have exaggerated stimulatory capacity and fail to induce tolerance in in vivo experiments. CYLDex7/8 BMDCs have increased levels of nuclear Bcl-3, which we could show to be directly induced by sCYLD expression. NF-κB signaling was markedly upregulated in CYLDex7/8 BMDCs.rnBcl-3 overexpressing BMDCs with normal CYLD expression, however, were not hyperactive, suggesting that Bcl-3 overexpression is not sufficient for causing the observed phenotype. Taken together we propose a model in which the exclusive overexpression of sCYLD with high nuclear levels of Bcl-3 in BMDCs is accompanied by an increased NF-κB activation, resulting in a hyperactive phenotype.rnWe further analyzed macrophages overexpressing sCYLD using the LysMcre CyldFL/FL strain, but could not detect differences in activation marker expression, cytokine secretion or iNOS production. LysMcre CyldFL/FL mice immunized with MOG35-55 peptide showed a more severe course of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), which could not be explained by enhanced levels of MHC class II on CNS-resident macrophages and microglia or increased T cell infiltration.rnMice overexpressing Bcl-3 in T cells develop spontaneous colitis. They have less peripheral memory/effector T cells and less Th1 cells, whereas Th17 numbers are normal. Naïve T cells overexpressing Bcl-3 show defects in in vitro differentiation to the Th1 or Th17 fate. CD4+ T cells overexpressing Bcl-3 show enhanced survival capacity in in vitro culture, but have a defect in proliferative capacity when stimulated in vitro or when adoptively transferred into lymphopenic hosts.

Generation and characterisation of acute myeloid leukaemia-reactive CD4 + T cells and their potential to eliminate human leukaemia blasts in NSG mice

Acute myeloid leukaemia (AML) is a cancer of the haematopoietic system, which can in many cases only be cured by haematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and donor lymphocyte infusion (DLI) (Burnett et al., 2011). This therapy is associated with the beneficial graft-versus-leukaemia (GvL) effect mediated by transplanted donor T and NK cells that either recognise mismatch HLA molecules or polymorphic peptides, so-called minor histocompatibility antigens, leukaemia-associated or leukaemia-specific antigens in the patient and thus eliminate remaining leukaemic blasts. Nevertheless, the mature donor-derived cells often trigger graft-versus-host disease (GvHD), leading to severe damages in patients’ epithelial tissue, mainly skin, liver and intestine (Bleakley & Riddell, 2004). Therefore, approaches for the selective mediation of strong GvL effects are needed, also in order to prevent relapse after transplantation. One promising opportunity is the in vitro generation of AML-reactive CD4+ T cells for adoptive transfer. CD4+ T cells are advantageous compared to CD8+ T cells, as HLA class II molecules are under non-inflammatory conditions only expressed on haematopoietic cells; a fact that would minimise GvHD (Klein & Sato, 2000). In this study, naive CD4+ T cells were isolated from healthy donors and were successfully stimulated against primary AML blasts in mini-mixed lymphocyte/leukaemia cell cultures (mini-MLLC) in eight patient/donor pairs. After three to seven weekly restimulations, T cells were shown to produce TH1 type cytokines and to be partially of monoclonal origin according to their TCR Vβ chain usage. Furthermore, they exhibited lytic activity towards AML blasts, which was mediated by the release of granzymes A and B and perforin. The patient/donor pairs used in this study were fully HLA-class I matched, except for one pair, and also matched for HLA-DR and -DQ, whereas -DP was mismatched in one or both alleles, reflecting the actual donor selection procedure in the clinic (Begovich et al., 1992). Antibody blocking experiments suggested that the generated CD4+ T cells were directed against the HLA-DP mismatches, which could be confirmed by the recognition of donor-derived lymphoblastoid cell lines (LCLs) electroporated with the mismatched DP alleles. Under non-inflammatory conditions primary fibroblasts did not express HLA-DP and were thus not recognised, supporting the idea of a safer application of CD4+ T cells regarding induction of GvHD. For the assessment of the biological significance of these T cells, they were adoptively transferred into NSG mice engrafted with human AML blasts, where they migrated to the bone marrow and lymphoid tissue and succeeded in eliminating the leukaemic burden after only one week. Therefore, AML-reactive CD4+ T cells expanded from the naive compartment by in vitro stimulation with primary leukaemia blasts appear to be a potent tool for DLI in HSCT patients and promise to mediate specific GvL effects without causing GvHD.

Individualisierte Krebstherapie : präklinischer „proof of concept“ einer mutationsspezifischen Immuntherapie

Da nicht-synonyme tumorspezifische Punktmutationen nur in malignen Geweben vorkommen und das veränderte Proteinprodukt vom Immunsystem als „fremd“ erkannt werden kann, stellen diese einen bisher ungenutzten Pool von Zielstrukturen für die Immuntherapie dar. Menschliche Tumore können individuell bis zu tausenden nicht-synonymer Punktmutationen in ihrem Genom tragen, welche nicht der zentralen Immuntoleranz unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Hypothese zu untersuchen, dass das Immunsystem in der Lage sein sollte, mutierte Epitope auf Tumorzellen zu erkennen und zu klären, ob auf dieser Basis eine wirksame mRNA (RNA) basierte anti-tumorale Vakzinierung etabliert werden kann. Hierzu wurde von Ugur Sahin und Kollegen, das gesamte Genom des murinen B16-F10 Melanoms sequenziert und bioinformatisch analysiert. Im Rahmen der NGS Sequenzierung wurden mehr als 500 nicht-synonyme Punktmutationen identifiziert, von welchen 50 Mutationen selektiert und durch Sanger Sequenzierung validiert wurden. rnNach der Etablierung des immunologischen Testsysteme war eine Hauptfragestellung dieser Arbeit, die selektierten nicht-synonyme Punktmutationen in einem in vivo Ansatz systematisch auf Antigenität zu testen. Für diese Studien wurden mutierte Sequenzen in einer Länge von 27 Aminosäuren genutzt, in denen die mutierte Aminosäure zentral positioniert war. Durch die Länge der Peptide können prinzipiell alle möglichen MHC Klasse-I und -II Epitope abgedeckt werden, welche die Mutation enthalten. Eine Grundidee des Projektes Ansatzes ist es, einen auf in vitro transkribierter RNA basierten oligotopen Impfstoff zu entwickeln. Daher wurden die Impfungen naiver Mäuse sowohl mit langen Peptiden, als auch in einem unabhängigen Ansatz mit peptidkodierender RNA durchgeführt. Die Immunphänotypisierung der Impfstoff induzierten T-Zellen zeigte, dass insgesamt 16 der 50 (32%) mutierten Sequenzen eine T-Zellreaktivität induzierten. rnDie Verwendung der vorhergesagten Epitope in therapeutischen Vakzinierungsstudien bestätigten die Hypothese das mutierte Neo-Epitope potente Zielstrukturen einer anti-tumoralen Impftherapie darstellen können. So wurde in therapeutischen Tumorstudien gezeigt, dass auf Basis von RNA 9 von 12 bestätigten Epitopen einen anti-tumoralen Effekt zeigte.rnÜberaschenderweise wurde bei einem MHC Klasse-II restringierten mutiertem Epitop (Mut-30) sowohl in einem subkutanen, als auch in einem unabhängigen therapeutischen Lungenmetastasen Modell ein starker anti-tumoraler Effekt auf B16-F10 beobachtet, der dieses Epitop als neues immundominantes Epitop für das B16-F10 Melanom etabliert. Um den immunologischen Mechanismus hinter diesem Effekt näher zu untersuchen wurde in verschieden Experimenten die Rolle von CD4+, CD8+ sowie NK-Zellen zu verschieden Zeitpunkten der Tumorentwicklung untersucht. Die Analyse des Tumorgewebes ergab, eine signifikante erhöhte Frequenz von NK-Zellen in den mit Mut-30 RNA vakzinierten Tieren. Das NK Zellen in der frühen Phase der Therapie eine entscheidende Rolle spielen wurde anhand von Depletionsstudien bestätigt. Daran anschließend wurde gezeigt, dass im fortgeschrittenen Tumorstadium die NK Zellen keinen weiteren relevanten Beitrag zum anti-tumoralen Effekt der RNA Vakzinierung leisten, sondern die Vakzine induzierte adaptive Immunantwort. Durch die Isolierung von Lymphozyten aus dem Tumorgewebe und deren Einsatz als Effektorzellen im IFN-γ ELISPOT wurde nachgewiesen, dass Mut-30 spezifische T-Zellen das Tumorgewebe infiltrieren und dort u.a. IFN-γ sekretieren. Dass diese spezifische IFN-γ Ausschüttung für den beobachteten antitumoralen Effekt eine zentrale Rolle einnimmt wurde unter der Verwendung von IFN-γ -/- K.O. Mäusen bestätigt.rnDas Konzept der individuellen RNA basierten mutationsspezifischen Vakzine sieht vor, nicht nur mit einem mutations-spezifischen Epitop, sondern mit mehreren RNA-kodierten Mutationen Patienten zu impfen um der Entstehung von „escape“-Mutanten entgegenzuwirken. Da es nur Erfahrung mit der Herstellung und Verabreichung von Monotop-RNA gab, also RNA die für ein Epitop kodiert, war eine wichtige Fragestellungen, inwieweit Oligotope, welche die mutierten Sequenzen sequentiell durch Linker verbunden als Fusionsprotein kodieren, Immunantworten induzieren können. Hierzu wurden Pentatope mit variierender Position des einzelnen Epitopes hinsichtlich ihrer in vivo induzierten T-Zellreaktivitäten charakterisiert. Die Experimente zeigten, dass es möglich ist, unabhängig von der Position im Pentatop eine Immunantwort gegen ein Epitop zu induzieren. Des weiteren wurde beobachtet, dass die induzierten T-Zellfrequenzen nach Pentatop Vakzinierung im Vergleich zur Nutzung von Monotopen signifikant gesteigert werden kann.rnZusammenfassend wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit präklinisch erstmalig nachgewiesen, dass nicht-synonyme Mutationen eine numerisch relevante Quelle von Zielstrukturen für die anti-tumorale Immuntherapie darstellen. Überraschenderweise zeigte sich eine dominante Induktion MHC-II restringierter Immunantworten, welche partiell in der Lage waren massive Tumorabstoßungsreaktionen zu induzieren. Im Sinne einer Translation der gewonnenen Erkenntnisse wurde ein RNA basiertes Oligotop-Format etabliert, welches Eingang in die klinische Testung des Konzeptes fand.rn

FaSSIF-C, a Cholesterol containing biorelevant intestinal model medium for development and test of oral drug formulations

Biorelevante Medien sind entwickelt worden, um die Bedingungen im Magen-Darm-Trakt vor und nach der Mahlzeit zu imitieren. Mit FaSSIF und FeSSIF wurden Medien eingeführt, die nicht nur die pH- und Puffer-Kapazität des Dünndarms widerspiegeln, sondern auch Lipid und physiologische Tensid-Arten enthalten. Diese Medien (FaSSIF-V2 und FaSSlFmod6.5) wurden für Bioverfügbarkeitstudien in der Medikamentenentwicklung im Laufe der Jahre kontinuierlich weiterentwickelt. Dennoch sind die auf dem Markt verfügbaren Medien immer noch nicht in der Lage, die realen physiologischen Bedingungen zu simulieren. In der jetzigen Zusammensetzung sind nicht alle Kompetenten enthalten, welche natürlicher Weise im Duodenum vorkommen. Darüber hinaus wird nur eine 1:5 Verdünnung von FeSSIF zu FaSSIF angenommen, die individuelle Wasserzufuhr bei Medikamentengabe wird hierdurch jedoch nur eingeschränkt simuliert, obwohl diese von Patient zu Patient schwanken kann. rnZiel dieser Dissertation war die Verbesserung der Vorhersage der Auflösung und Absorption lipophiler Arzneistoffe durch Simulation der Bedingungen im zweiten Teil des Zwölffingerdarms mit neuen biorelevanten Medien, sowie unter Einwirkung zusätzlicher Detergention als Wirkstoffträger. rnUm den Effekt der Verdünnungsrate und Zeit im Dünndarm zu untersuchen, wurde die Entwicklung der Nanopartikel in der Magen-Darm-Flüssigkeit FaSSIFmod6.5 zu verschiedenen Zeitpunkten und Wassergehalten untersucht. Dafür wurden kinetische Studien an verschieden konzentrierten Modellmedien nach Verdünnungssprung untersucht. Das Modell entspricht der Vermischung der Gallenflüssigkeit mit dem Darminhalt bei variablem Volumen. Die Ergebnisse zeigen, dass Art und Größe der Nanopartikel stark von Verdünnung und Einirkungszeit abhängen. rnrnDie menschliche Darmflüssigkeit enthält Cholesterin, welches in allen früheren Modellmedien fehlt. Daher wurden biokompatible und physiologische Modellflüssigkeiten, FaSSIF-C, entwickelt. Der Cholesteringehalt von FaSSIF - 7C entspricht der Gallenflüssigkeit einer gesunden Frau, FaSSIF - 10C der einer gesunden männlichen Person und FaSSIF - 13C der in einigen Krankheitszuständen. Die intestinale Teilchen-Struktur-Untersuchung mit dynamische Lichtstreuung (DLS) und Neutronen-Kleinwinkelstreuung (SANS) ergab, dass die Korngröße von Vesikeln mit zunehmender Cholesterin-Konzentration abnahm. Zu hohe Cholesterin-Konzentration bewirkte zusätzlich sehr große Partikel, welche vermutlich aus Cholesterin-reichen “Disks“ bestehen. Die Löslichkeiten einiger BCS Klasse II Wirkstoffe (Fenofibrat, Griseofulvin, Carbamazepin, Danazol) in diesen neuen Medien zeigten, dass die Löslichkeit in unterschiedlicher Weise mit der Cholesteringehalt zusammen hing und dieser Effekt selektiv für die Droge war. rnDarüber hinaus wurde die Wirkung von einigen Tensiden auf die kolloidale Struktur und Löslichkeit von Fenofibrat in FaSSIFmod6.5 und FaSSIF -7C untersucht. Struktur und Löslichkeit waren Tensid- und Konzentrations-abhängig. Im Falle von FaSSIFmod6.5 zeigten die Ergebnisse eine dreifache Verzweigung der Lösungswege. Im Bereich mittlerer Tensidkonzentration wurde eine Löslichkeitslücke der Droge zwischen der Zerstörung der Galle-Liposomen und der Bildung von Tensid-reichen Mizellen beobachtet. In FaSSIF - 7C, zerstörten Tenside in höherer Konzentration die Liposomenstruktur trotz der allgemeinen Stabilisierung der Membranen durch Cholesterin. rnDie in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse ergeben, dass die Anwesenheit von Cholesterin als eine fehlende Komponente der menschlichen Darmflüssigkeit in biorelevanten Medien wichtig ist und dazu beitragen kann, das in vivo Verhalten schwerlöslicher Arzneistoffe im Körper besser vorhersagen zu können. Der Verdünnungsgrad hat einen Einfluss auf die Nanopartikel-Struktur und Tenside beeinflussen die Löslichkeit von Medikamenten in biorelevanten Medien: Dieser Effekt ist sowohl von der Konzentration das Tensids abhängig, als auch dessen Typ.rnrn

Expression of human cathepsin L or human cathepsin V in mouse thymus mediates positive selection of T helper cells in cathepsin L knock-out mice

A genetic deficiency of the cysteine protease cathepsin L (Ctsl) in mice results in impaired positive selection of conventional CD4+ T helper cells as a result of an incomplete processing of the MHC class II associated invariant chain or incomplete proteolytic generation of positively selecting peptide ligands. The human genome encodes, in contrast to the mouse genome, for two cathepsin L proteases, namely cathepsin L (CTSL) and cathepsin V (CTSV; alternatively cathepsin L2). In the human thymic cortex, CTSV is the predominately expressed protease as compared to CTSL or other cysteine cathepsins. In order to analyze the functions of CTSL and CTSV in the positive selection of CD4+ T cells we employed Ctsl knock-out mice crossed either with transgenic mice expressing CTSL under the control of its genuine human promoter or with transgenic mice expressing CTSV under the control of the keratin 14 (K14) promoter, which drives expression to the cortical epithelium. Both human proteases are expressed in the thymus of the transgenic mice, and independent expression of both CTSL and CTSV rescues the reduced frequency of CD4+ T cells in Ctsl-deficient mice. Moreover, the expression of the human cathepsins does not change the number of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells, but the normalization of the frequency of conventional CD4+ T cell in the transgenic mice results in a rebalancing of conventional T cells and regulatory T cells. We conclude that the functional differences of CTSL and CTSV in vivo are not mainly determined by their inherent biochemical properties, but rather by their tissue specific expression pattern.