水飞蓟原生质体培养形成愈伤组织及组织培养再生植株

本论文对药用植物水飞蓟Silybum marianum Gaertn 进行了原生质体培养和组织培养的研究，获得如下结果： 1、以水飞蓟叶片愈伤组织为材料，系统地研究了植物材料生理状态，酶液配比及酶的浓度、酶解时间长短等对原生质体产率的影响。探讨了原生质体培养过程中材料的生理状态、激素、附加物及培养方法对于原生质体分裂频率的影响，还比较分析了培养后期不加液及加各种细胞培养液对原生质体来源的细胞团的影响，最后进行了愈伤组织分化的诱导。选取继代一年的水飞蓟叶愈伤组织转代十天后挑选愈伤组织表面生长旺盛的细胞层置于Onozuka R-103% Macerozyme R-10 0.8%的CPW混合酶液（PH 5.6～5.3）中，30℃下酶解5小时后所得原生质体产率最高。适合于水飞蓟原生质体培养的基本培养基为TCCW烟草原生质体培养基~[18]。用低融点琼脂糖（0.3%）平板培养法培养得到的分裂频率显著高于液体浅层法。在培养基中加入羟脯氨酸（100mg/l）和谷氨酰胺（200mg/l）可促进原生质体分裂。在飞蓟原生质体培养中能获得最高分裂频率（35.4%）的激素组合为2.4-D、1mg/l Kn0.5mg/l。在培养过程中每隔二周必须加液，否则细胞团褐化并全部死亡，同时要求降低细胞培养液的Kn浓度（由0.5mg/l、降到0.1mg/l）才能使细胞团继续长大。从水飞蓟原生质体培养得到的愈伤组织色浅黄，结构疏松，转至MS附加NAA0.8mg/l、6－BA 2mg/l、水解酪蛋白200mg/l的固体培养基上愈伤组织表面出现许多绿色芽点，但尚未得到再生植株。 2、以萌发两周后的水飞蓟种子无菌苗为材料，切取下胚轴于MS附加NAA0.8mg/l、6－BA0.5mg/l、水解酪蛋白200mg/l的固体培养基上诱导出愈伤组织，再转入MS附加NAA0.8mg/l、6－BA2mg/l、水解酪蛋白200mg/l的分化培养基后，愈伤组织表面分化出芽，再生苗的频率为75%，然后移至MS附加NAA0.5mg/l、IBA0.1mg/l、水解酪蛋白200mg/l的培养基上分化出大量的根，并得到了大量健壮的植株。

猕猴桃属两个种的原生质体培养与体细胞杂交

猕猴桃是重要的栽培果树，但目前栽培品种过于单一，不能满足生产和消费的需求。由于猕猴桃的雌雄异株特性、种间杂交亲合性差、遗传上高度杂合以及育种周期长等特点，常规杂交育种困难很大。现代生物技术，如原生质体培养和体细胞杂交等，为培育新品种提供了新途径。 毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)和软枣猕猴桃(A.arguta)是猕猴桃属中具有重要利用价值的两个种。毛花猕猴桃果实大小在猕猴桃属中次于中华猕猴桃(A.chinensis)和美味猕猴桃(A.deliciosa)列第三位，果实维生素C含量达1014 mg/l00 g FW。软枣猕猴桃极耐寒，在-40℃下可安全越冬，其果实表面光滑无毛。这两个种是品种改良的重要种质资源。 作为生物技术基础的组织培养与植株再生系统，在毛花猕猴桃上尚未见报道。软枣猕猴桃的组织培养仅有一例报道，且芽分化率和分化系数都很低。这两个种的原生质体培养及与美味猕猴桃的原生质体融合也未见报道。针对这种情况，本试验对毛花猕猴桃和软枣猕猴桃的组织培养、原生质体培养及其与美味猕猴桃品种“Hayward”的原生质体融合进行研究，结果建立了较理想的毛花猕猴桃和软枣猕猴桃组织培养系统;首次从毛花猕猴桃原生质体得到再生植株和从软枣猕猴桃原生质体培养再生愈伤组织;通过改进融合方法，建立了毛花猕猴桃+美味猕猴桃和软枣猕猴桃+美味猕猴桃的原生质体融合体系，并将异核体培养分裂得到细胞团。这些结果有利于今后毛花猕猴桃和软枣猕猴桃资源的开发利用。主要试验结果如下： 以毛花猕猴桃试管实生苗叶片和茎段为外植体，培养在附加一定浓度Zea或CPPU的MS培养基上，产生的愈伤组织不经转代就可分化芽。试管苗茎段在附加0.0025 mg/L CPPU和0.1 mg/LIAA的MS培养基上愈伤组织产生、芽分化和苗生长都较理想;试管苗叶片则以附加0.025 mg/L CPPU和0.l mg/LIAA或0.5 mg/L Zea和0.1 mg/LIAA的MS培养基较好。当苗生长至1.0 cm时经诱导生根形成完整植株。 在软枣猕猴桃组织培养中，外植体种类、诱导培养基的激素种类和诱导分化时细胞分裂素种类都有重要影响。无菌苗茎段容易愈伤组织化，但分化困难;叶片外植体产生愈伤组织较难，但分化容易。在含Zea的MS培养基上，两种外植体产生的愈伤组织不经转代即能分化芽。分化培养基中添加Zea能有效地诱导芽分化，其中以2.0 mg/L Zea芽的分化最好，而Kin和BAP在0.5- 2.0 mg/L浓度范围内愈伤组织不分化。 以毛花猕猴桃或软枣猕猴桃试管苗叶片为分离原生质体的材料。试管苗的培养条件对原生质体分离效果及其培养反应有显著影响。弱光培养条件对两个种试管苗的原生质体分离及其培养都有好处，试管苗培养基也有重要影响。毛花猕猴桃和软枣猕猴桃试管苗合适培养基分别为MS基本培养基（大量元素减半）和MS+0.00025 mg/L CPPU+ 0.1 mg/LIAA。在此条件下培养的两个种的试管苗叶片，经酶解后原生质体产量分别为0.7-1.8×l06和3.0-3.5×l06/1 g FW，其原生质体在合适培养基上能够分裂。 毛花猕猴桃原生质体培养在MS培养基（去除NH4N03）附加l.0mg/L2，4-D液体培养基中，约10天时发生第一次分裂，分裂能持续下去并在培养3个月时形成约2mm大小愈伤组织。直接将其转入固体培养基中使其增殖和分化。在附加Zea 0.5 mg/L+ O.l mg/L IAA的MS培养基上继代2次，愈伤组织开始分化芽。芽伸长后切下诱导生根，形成完整植株。软枣猕猴桃原生质体培养基中，MS培养基附加2，4-D配合Zea或Kin对启动分裂是必须的，其中以MS＋2，4-D 0.5 mg/L+ Zea 0.5 mg/L最好，在此培养基上原生质体第一次分裂发生在4-6天时，培养12-14天时见到第三次分裂，培养三周的分裂频率为23%。培养45天后形成许多小愈伤组织块。软枣猕猴桃原生质体再生的愈伤组织从液体培养基转入固体培养基后未见进一步分裂。 对18株毛花猕猴桃原生质体再生植株的体细胞染色体数目作了观察，其中12株为整倍体，二倍体和四倍体各六株;另外六株为混倍体，其染色体数目变化在59-203之间。还发现原生质体再生植株有丝分裂间期细胞存在多核现象，有多核细胞的共10株，细胞内多核数目以双核和三核较常见，最多的有七个核。原生质体供体植株为2n=2x=58，未发现多核细胞。原生质体再生植株体细胞多核现象未见报道。 利用毛花猕猴桃或软枣猕猴桃叶片原生质体分别与愈伤组织来源的美味猕猴桃原生质体进行融合，融合方法为高Ca++高pH值PEG法。对Kao等(1975)报道的融合步骤作了修改。影响融合效率的因素主要有PEG种类、融合作用时间和融合液中DMSO浓度。最佳的融合条件为40%PEG (Sigma，MW3350)+10%DMSO，作用40 min。毛花猕猴桃+美味猕猴桃和软枣猕猴桃+美味猕猴桃的融合频率分别可达14.5%和13.6%。异核体经培养可分裂并形成细胞团。

水稻胚囊发育畸变的细胞学和遗传学研究

1．水稻多卵卵器的起源：被子植物的卵器中通常只有一个卵细胞。我们在水稻多胚品系胚囊中观察到二卵卵器和三卵卵器，本研究对其大孢子发生和胚囊发育进行了细胞胚胎学观察，揭示了水稻多卵卵器的起源．观察结果表明，该品系能进行正常的大孢子发生。大孢子母细胞进行正常的减数分裂形成四个大孢子靠近合点端的大孢子发育，其它三个退化。功能大孢子第一次有丝分裂后两个子核被一中央大液泡分隔在胚囊珠孔端和合点端，与此同时胚囊出现不均衡生长，珠孔端迅速膨大，合点端几乎不增大，致使二核末期的胚囊呈倒梨形．紧接着发生第二次有丝分裂，合点端核分裂时纺锤丝与胚囊纵轴平行，而珠孔端核分裂时纺锤丝与胚囊纵轴成4 5度夹角．由此产生的四核胚囊中，合点端一核向胚囊中部或中上部（胚囊珠孔端）迁移，四核胚囊再经一次有丝分裂形成两种类型的核分布偏离蓼型的八核胚囊。一种类型是珠孔端四个核，中部与合点各二个核，在胚囊细胞化过程中，珠孔端四核 分化成四细胞卵器，其中卵细胞和助细胞各二个，中部的二核分化成二极核中央细胞，合点 端的二核形成反足细胞。另一种类型是珠孔端六个核，合点端二个核，在胚囊细胞化过程中， 两端各一核向中部迁移分化成二极核中央细胞，珠孔端剩余的五核分化成五细胞卵器，其 中卵细胞三个，助细胞二个，合点端的一核迅速分裂形成反足细胞． 2．水稻同源三倍体TAR的生殖特性：TAR的单穗结实率平均可达10%，核型分析表明此三倍体产生的后代个体仍为具有36条染色体的三倍体．细胞胚胎学初步观察显示TAR为一具兼性无融合生殖特性的水稻新种质，其胚珠几乎都能进行胚囊的分化，但其中仅有33%的胚囊有较正常的结构，9%的胚囊在散粉前进行胚胎发生，58%的胚囊发育显著异常，表现为极性紊乱、多极核或缺失雌性生殖单位等。 3．水稻亚种间杂种败育的细胞学基础：对普通栽培稻不同品种类型间杂种颖花败育的细胞学基础及雌性败育的过程进行的细胞学研究表明：1）引起杂种颖花败育的原因有胚囊败育，花粉败育、开花时花药不开裂和雌雄异熟．其中胚囊败育而丧失受精能力是引起低结实率的最重要的因素，开花时花药不开裂和雌雄异熟在一定程度上形成了雌雄性细胞时间和空间的隔离屏障。2）杂种植株的所有大孢子母细胞都能进行正常的减数分裂形成四个大孢子，败育主要发生在靠近合点端的功能大孢子分化形成胚囊的早期，有的胚囊母细胞在进行第一次有丝分裂前便萎缩解体，多数能完成一次或二次有丝分裂形成二核或四核败育胚囊．败育的共同特征是无液泡的分化，细胞质少或退化，在败育胚囊残迹部位，解体的珠心细胞和萎缩的胚囊残溃混杂垛叠．已受精的杂种子房没有观察到胚及胚乳发育的异常．籼粳杂种胚囊败育频率较高． 4．籼粳杂种生殖障碍的基因定位：应用具有1 37个标记位点的籼粳杂交窄叶青8号/京系17)F1花药培养获得的127个双单倍体OH）群体构建的R FLP图谱，对控制籼粳杂种颖花败育的基因座位进行了定位研究。结果在第1、3、4、5、6、7、8、1 2染色体上检测到1 0个基因座位，其中第3、12染色体上的2个不育基因位点str3和str12与同一杂交组合F2分离群体中发现的异常分离热点处于相同的染色体区段．stj-6的基因加性效应为负值，有增加籼粳亲和性的作用;其余的不育基因座位皆有增加籼梗杂种不育性的作用． 5．籼粳杂种胚囊败育的遗传分析和基因定位：利用DH系构建的分子图谱及DH系衍生的2个回交群体定位了引起籼梗杂种胚囊败育的2个互补的主效基因esa-l（E1或e1位点）和esa-2（E2或e2位点），它们分别位于第6和第1 2染色体．在不育基因位点，籼稻基因型为EIEle2e2，粳稻基因型为elelE 2E 2，杂交后代中基因型为EIE2，Ele2、elE 2的雌配子体正常发育，携带ele2基因型的雌配子体表现败育．胚囊育性受配子体基因型控制，孢予体遗传背景影响胚囊败育基因的表达.

青蒿的遗传转化及青蒿素生物合成的调控

利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)1601，1000，1500，15834，A4，均成功地转化了中药青蒿(Artemisia annua L.)并且建立了pRi1601，pRi15834，pRiA4诱导的发根培养。pRi1601，pRi15834的发根诱导率比其它质粒高。太老或太幼的叶片不利子发根的诱导;发根主要从叶脉的伤口处萌发;带顶芽或带侧芽的叶片容易诱导根，但不一定是发根。光照有利于发根的诱导和发根的生长。以每个发根的“绝对生长速率”(Gtowth Ratio，GR)和绝对“侧根”数量(Number of Side Roots，NSR），通过大量的发根系的筛选，建立了8个发根系，1601-L-1, 1601-L-2, 1601-L-3, 1601-L-4, 15834-L-1, 1601-P-I, 16 01-P-2，15834-L-2。Southern分子检测表明，160l-1-1，1801-L-2, 1601-L-3，1601-L-4，1601-P-1，1601-P-2均为转化子。8个建立的发根系之间无论生长或者QHS的合成存在明显的差异。比较光／暗(16/8hrs)，25℃条件下培养的16 01-L-1，1601-L-2，1601-L-3，1601-L-4，1601-P-l，和1601-P-2，其中16 01-L-3的生长最快，160l-L-1的生长最慢;但是，1601-L-1的QHS的含量最高（可达1. 048%），1601-1-3的QHS的含量最低。160Z-L-3，15834 -L-1和2583:1-L-2的生长速率相差不大。用盛有l000mLMS液体培养基的3000mL的锥形瓶扩大培养1601-L -3，15834-L-1和15834-L-2，转速为ll0rlpm，培养过程中发根容易形成发根球（Hairy Root Balis，HRB），HRB的形成严重影响发根的生长和QHs的合成，HpLC分析表明扩大培养发根中QHS的含量比较低。 改变MS基本培养基中的无机离子的浓度，研究不同无机离子对发根生长和QHS的合成的影响。 l、KN03为18.79×10-3M时有利于1601- L-1生长，为14. 84×10-3M时有利于QHS的合成。NH-4N0-3浓度在10.93-12. 49×10—3M范围内有利于1601-L-1生长，在0-20.62×10-3M范围内对QHS的合成影响不大，大于20. 62×lO-3M不利QHS的合成。培养基中NH-4+／N0-3-比值为0. 37-0. 4-0.52:1时有利于发根的生长，比值为0.52 - 0.58:1时有利于QHS的合成。 2、H-2P0-4-浓度为2.498×10-3M时有利于发根的生长在0-2. 498×l0-3M范围内，随着浓度的提高，促进发根的生长。培养基中的H2P4 -的浓度在0-1.249×lO-3M的范围内，随着浓度的提高，促进QHS的合成，为1.249×10-3M时QHS的含量最高。 3、培养基中最适16 01-L-1生长的Ca-2+浓度为0.198- 0.766×10-3M，大于或小于该浓度范围，显著地抑制发根的生长。但是，在0-3.695×10-3M范围内，随着培养基中Ca-2+浓度提高，促进QHS的合成，最适Ca-2+浓度为3.695×l0-3M。 4、培养基中不加Mg-2+时，完全抑制发根生长，在0. 142×10-3M-7.506×l0-3M浓度范围内，对发根生长影响没有明显的差别。但是，HPLC和UV分析发根中QHS含量，培养基中不加Mg-2+时，发根中QHS含量最高。 5、培养基中的Fe-2+浓度在0. 25 -1．0×10-3M范围内，同时有利于16 01- L-1的生长和QHS的形成。 6、培养基中最适合予16 01- L-3生长的KI浓度为2.5ppm，大于或小予该浓度均显著地抑制发根的生长，培养基中加入KI明显地降低发根中的QHS的含量。 7、H2BO3对l601-L-l生长影响不大，HPLC分析QHS的含量，培养基中的H3BO3浓度为100ppm和400ppm，QHS的含量分别为1.69mg/g和1.80mg/g(DW)。 8、Cu-2+对1601-L-3的生长影响显著，最适合1601-L-3生长的Cu-2+浓度为1.00ppm，在0 -1.00ppm的浓度范围内，随着培养基中的Cu+浓度的提高，发根的生物量不断增加。培养基中QHS合成的最适Cu2+浓度为0.05ppm，大于或小于该浓度均显著地抑制发根中QHS的合成。 比较光培养和暗培养对发根生长的影响，结果表明光照明显地促进1601-L-l的生长，暗培养明显不利于发根的生长。最适合于发根生长的温度为25℃，大于35℃显著地抑制发根的生长，影响发根的根尖细胞的正常分裂。 改变培养基中的蔗糖浓度和在发根培养的不同时期给培养基中添加蔗糖，试验结果表明蔗糖作为碳源对1601-L-3和1601-L-1的生长具有显著的影响。 (1)培养基中缺少蔗糖显著地抑制发根的生长。 (2)发根培养的前5天时间内，蔗糖浓度为30- 60glL昀培养基最有利于发根的生长，50glL的培养基中的发根生长最快，培养基中的蔗糖浓度大于60g/L小于30g／L时，发根的生物量增加较少。 (3)发根培养至第15天时，蔗糖浓度为60g/L的培养基最有利予发根的生物量的增加。发根培养至30天时，蔗糖浓度为60-90g/L的培养基，发根的生物量的增加相差不大，但是为蔗糖浓度为30-40g/L的培养基中的发根生物量一倍。 (4)发根培养过程中，分别于第5和15天给蔗糖浓度为30g/L的培养基中添加一次或二次蔗糖，使培养基中的蔗糖终浓度相当于60g/L或90g/L，培养至30天时，添加蔗糖的培养基中的发根的干重生物量相当于不添加蔗糖培养基中的发根生物量一倍，相当于初始蔗糖浓度为60g/L和90g/L培养基中发根的生物量。 (5)随着培养基中蔗糖浓度的提高，发根干重/鲜重比显著增加。培养基中的蔗糖的消耗量与发根生物量的增加呈正相关，蔗糖消耗越多，发根生物量的增加越大。 比较pH值对发根生长和QHS合成的影响表明，灭菌前pH值在5.O-6.5范围内的培养基适合予1601-L-1的生长，小于5.O不利于发根的生长，pH5.8有利于1601-1-1生长和QHS的生物合成。发根收获时培养基中的pH值一般为4.5-5.2. pH7.O抑制发根的生长，pHl0.O对发根具有强烈的致死作用。发根在培养过程中，对培养基中的pH值具有显著的调节作用，发根能在很短的时间内(24- 48hrs)使pl:l值为5.8、6.4、7.0培养基降低到pH4. 5-5.2，pH为5.8的培养基有利于QHS合成。 比较不同基本培养基对发根生长和QHS合成的影响，试验结果表明N6、DCR、Litvay培养基有利于1601-L-1的生长，WS、White、B5培养基不利于发根的生长。DCR培养基中的QHS含量最高。 根据三水平试验选用三水平正交表来安排试验的原则，选用三水平正交表L7(3-)，研究多因子效应对发根生长和QHS合成的影响，试验结果表明，Mg2+，Fe2+，Mn-2+，NH4NO3，KN03 ,KI,Ca-2+为发根生长的主要因子，NH4N03，KNOs，Mg2+，Ca2+，肌醇为QHS合成的主要因子。 通过TLC分析发根中QHS和其它化学成分，同时比较发根和无菌苗及野生植株的化学成分，发根和无菌苗均能合成包括QHS在内的野生青蒿叶片中的大部分非挥发性的化台 物。 研究青蒿植株在发育过程中QHS的含量的变化以及发根、无菌苗和野生青蒿中QHS的合成，HP分析结果表明，l、不同的单株青蒿之间的QHS量相差很大。2、同一植株幼 叶的QHS含量比老叶的QHS含量高。3、不同单株青蒿之间达到最高QHS含量的时间不一样，开花期或开花之前。4、无菌苗（带根）或者不带根丛生芽均能合成QHS，但是带根的无菌蕾的QHS量比丛生芽中的QIS的含量高。5、不同发根农杆菌转化的发根系1601-L-1和15834-L-1都能合成ＱＨＳ。

影响小麦遗传转化的因素及山菠菜BADH 基因导入研究

本研究在前人研究工作的基础上，以小麦转化系统的建立和完善为前提，将BADH基因导入小麦，获得外源BADH基因表达的小麦转基因植株。 （1）小麦不同基因型、不同外植体和不同器官对PPT或bialaphos选择的反应不同，两种试剂对小麦转化体的选择具有同样效果。轰击后的受体材料经过2-3天的恢复生长且植株分化时不用PPT选择可以提高转化效率。冀885-443和石90-4185两个品种对PPT敏感程度适中，具有较强的植株再生能力，得到的转基因植株数和转基因频率均较高。 （2）用pAHC25质粒转化冀885-443等小麦品种取得成功，获得转基因植株12株，平均转基因频率为0.4%。Southern杂交结果表明bar基因已经整合到小麦基因组中。根据研究结果认为，过快过高地提高PPT浓度是造成转基因频率低的主要原因。 （3）采用基因枪法成功地将山菠菜BADH基因（pABH9）导入到冀885-443等品种中。PCR检测和Southern杂交分析证实获得26株转基因植株，不同品种转化频率介于0.3-2.7%，外源BADH基因在转基因植株的叶片内表达。在胁迫条件下有15株转基因植株的BADH酶活力单位明显超过亲本;有6株的相对电导率显著比亲本低，说明这些植株在胁迫条件下细胞受到损伤比亲本低。 （4）采用花粉管通道法向小麦转化pAHC25，筛选出62株抗PPT，转化频率为3.97%。采用农杆菌介导转化冀885-443的成熟胚和幼胚愈伤组织，在转化愈伤组织中观察到gus基因的表达，也得到抗G418的愈伤组织，但没能得到再生植株。

Quantifying annual variation in catchability for commercial and research fishing

Biomass indices, from commercial catch per unit of effort (CPUE) or random trawl surveys, are commonly used in fisheries stock assessments. Uncertainty in such indices, often ex-pressed as a coefficient of variation (CV), has two components: observation error, and annual variation in catchability. Only the former can be estimated directly. As a result, the CVs used for these indices either ignore the annual-variation component or assume a value for it (often implicitly). Two types of data for New Zealand stocks were examined: 48 sets of residuals and catchability estimates from stock assessments using either CPUE or trawl survey indices; and biomass estimates from 17 time series of trawl surveys with between 4 and 25 species per time series. These data show clear evidence of significant annual variation in catchability. With the trawl survey data, catchability was detectably extreme for many species in about one year in six. The assessment data suggest that this annual variability typically has a CV of about 0.2. For commercial CPUE the variability is slightly less, and a typical total CV (including both components) of 0.15 to 0.2. This is much less than the values of 0.3 to 0.35 that have commonly been assumed in New Zealand. Some estimates of catchability are shown to be implausible.

Spawning cycles and habitats for ballyhoo (Hemiramphus brasiliensis) and balao (H. balao) in south Florida

Two halfbeak species, ballyhoo (Hemiramphus brasiliensis) and balao (H. balao), are harvested as bait in south Florida waters, and recent changes in fishing effort and regulations prompted this investigation of the overlap of halfbeak fishing grounds and spawning grounds. Halfbeaks were sampled aboard commercial fishing vessels, and during fishery-independent trips, to determine spatial and temporal spawning patterns of both species. Cyclic patterns of gonadosomatic indices (GSIs) indicated that both species spawned during spring and summer months. Histological analysis demonstrated that specific stages of oocyte development can be predicted from GSI values; for example, female ballyhoo with GSIs >6.0 had hydrated oocytes that were 2.0−3.5 mm diameter. Diel changes in oocyte diameters and histological criteria demonstrated that final oocyte maturation occurred over a 30- to 36-hour period and that ballyhoo spawned at dusk. Hydration of oocytes began in the morning, and ovulation occurred at sunset of that same day; therefore females with hydrated oocytes were ready to spawn within hours. We compared maps of all locations where fish were collected to maps of locations where spawning females (i.e. females with GSIs >6.0) were collected to determine the degree of overlap of halfbeak fishing and spawning grounds. We also used geographic information system (GIS) data to describe the depth and bottom type of halfbeak spawning grounds. Ballyhoo spawned all along the coral reef tract of the Atlantic Ocean, inshore of the reef tract, and in association with bank habitats within Florida Bay. In the Atlantic Ocean, balao spawned along the reef tract and in deeper, more offshore waters than did ballyhoo; balao were not found inshore of the coral reef tract or in Florida Bay. Both halfbeak species, considered together, spawned throughout the fishing grounds of south Florida.

The early life history of swordfish (Xiphias gladius) in the western North Atlantic

Lengths and ages of sword-fish (Xiphias gladius) estimated from increments on otoliths of larvae collected in the Caribbean Sea, Florida Straits, and off the southeastern United States, indicated two growth phases. Larvae complete yolk and oil globule absorption 5 to 6 days after hatching (DAH). Larvae <13 mm preserved standard length (PSL) grow slowly (~0.3 mm/d); larvae from 13 to 115 mm PSL grow rapidly (~6 mm/d). The acceleration in growth rate at 13 days follows an abrupt (within 3 days) change in diet, and in jaw and alimentary canal structure. The diet of swordfish larvae is limited. Larvae <8 mm PSL from the Caribbean, Gulf of Mexico, and off the southeastern United States eat exclusively copepods, primarily of one genus, Corycaeus. Larvae 9 to 11 mm eat copepods and chaetognaths; larvae >11 mm eat exclusively neustonic fish larvae. This diet indicates that young larvae <11 mm occupy the near-surface pelagia, whereas, older and longer larvae are neustonic. Spawning dates for larvae collected in various regions of the western North Atlantic, along with the abundance and spatial distribution of the youngest larvae, indicate that spawning peaks in three seasons and in five regions. Swordfish spawn in the Caribbean Sea, or possibly to the east, in winter, and in the western Gulf of Mexico in spring. Elsewhere swordfish spawn year-round, but spawning peaks in the spring in the north-central Gulf of Mexico, in the summer off southern Florida, and in the spring and early summer off the southeastern United States. The western Gulf Stream frontal zone is the focus of spawning off the southeastern coast of the United States, whereas spawning in the Gulf of Mexico seems to be focused in the vicinity of the Gulf Loop Current. Larvae may use the Gulf of Mexico and the outer continental shelf off the east coast of the United States as nursery areas. Some larvae may be transported northward, but trans-Atlantic transport of larvae is unlikely.

青蒿素生物合成调控的研究章焰生

青蒿 (Artemisia annua) 是目前唯一用来生产抗疟药剂青蒿素的一种药用植物，由于青蒿植株中青蒿素的含量过低，使得青蒿素的生产不能满足市场的需要，提高青蒿植株中青蒿素的含量显得尤为重要，本论文围绕着调控青蒿素的生物合成作出了以下一些研究： 一、紫穗槐二烯合酶基因启动子的克隆 　紫穗槐二烯合酶是参与青蒿素生物合成的一个关键酶，以法呢基焦磷酸为底物，催化形成青蒿素分子所具有的杜松烯环状结构, 此酶被认为是青蒿素分支途径中的第一个关键限速酶，因此它的表达水平高低关系着流向青蒿素生物合成的碳流量。为了了解紫穗槐二烯合酶的表达模式，用Tail-PCR的方法我们从青蒿高产株系001中克隆得到紫穗槐二烯合酶基因的两个启动子，分别命名为AMSP1与AMSP2，序列比较分析可看出两启动子有三处大的差异片段，由此推测紫穗槐二烯合酶基因在青蒿基因组中可能是一个多拷贝形式存在，Southern杂交验证了这一点，结果表明，紫穗槐二烯合酶基因在青蒿基因组中至少存在三个copy;利用PLACE数据库对克隆的启动子的顺式作用元件进行分析，发现其中有光、茉莉酸甲酯等调控元件。5'RACE分析确定了紫穗槐二烯合酶基因的转录起始位点位于翻译起始位点上游44bp处。通过PCR的方法，我们对启动子AMSP2进行5′端缺失，缺失的5个启动子片段克隆进报告基因GUS的上游，以进行下一步启动子的特性分析。 二、紫穗槐二烯合酶的表达特性分析 　　RT-PCR半定量分析表明：光正调控于紫穗槐二烯合酶的转录表达，黑暗培养条件下，青蒿植株中紫穗槐二烯合酶的转录水平较低，一旦进行光照培养，紫穗槐二烯合酶的转录水平显著上升;茉莉酸甲酯对青蒿植株中紫穗槐二烯合酶的表达调控具有光依赖性，在连续黑暗条件下，茉莉酸甲酯对紫穗槐二烯合酶的转录水平并无影响，而在正常光照与黑暗循环培养条件下，茉莉酸甲酯明显诱导了青蒿植株中紫穗槐二烯合酶的转录表达。鉴于在正常的培养条件下，茉莉酸甲酯正调控于紫穗槐二烯合酶的转录表达，我们研究了茉莉酸甲酯对青蒿植株中青蒿素生物合成的影响，结果表明，茉莉酸甲酯并未促进青蒿素的生物合成，却诱导了青蒿素生物合成的前体青蒿酸的生物合成。 三、真空介导农杆菌转化青蒿植株瞬时表达系统的建立 　　探讨了真空强度、青蒿苗龄、农杆菌的浓度、共培养方式、共培养时间以及光对青蒿植株瞬时表达的影响，结果表明真空强度70－80mbar、30天的青蒿苗龄以及侵染农杆菌浓度OD600为2.0时有利于青蒿植株的瞬时表达;液体共培养极大地抑制了外源基因在青蒿植株的瞬时表达，固体共培养与滤纸共培养适合于青蒿植株的瞬时表达系统，二者之间无明显差异;共培养时间也是影响基因瞬时表达的关键因素，结果表明，3天或4天较2天共培养有利于外源基因在青蒿植株的瞬时表达;光对青蒿植株的瞬时表达有极大地抑制作用，而黑暗条件适合于青蒿植株的瞬时表达;此系统可用于不同基因型的青蒿植株。 四、青蒿过氧化物酶基因的克隆及功能分析 　　利用RACE方法，从青蒿高产株系001中克隆了一个第三大类植物过氧化物酶的cDNA。克隆的青蒿过氧化物酶氨基酸序列与白羽扇豆、辣根菜、小麦、烟草、蕃茄的过氧化物酶的同源性分别为42.0%、36.2%、38.9%、33.6%和32.8%。青蒿过氧化物酶的编码区被克隆进原核表达载体PET-30a，并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达，过量表达产物主要以包涵体形式存在，但也有相当一部分可溶性蛋白出现。表达的蛋白具有明显催化抗坏血酸、愈创木酚的过氧化物酶活性，催化愈创木酚活性大约是催化抗坏血酸的1.8倍。氨基酸同源性分析与过氧化反应表明克隆的过氧化物酶属于植物第三大类过氧化物酶。青蒿过氧化物酶间接促进了青蒿细胞提取液中青蒿酸向青蒿素的生物转化，但不能直接以青蒿酸作为催化底物。 五、外源赤霉素处理与开花对青蒿素、青蒿酸生物合成的影响 　　研究结果发现在青蒿的营养生长期喷施外源赤霉素明显促进了青蒿素的生物合成，同时青蒿酸含量呈下降趋势;从营养期至生殖期，青蒿酸的含量逐渐下降，至开化前期青蒿酸含量下降到最低，从开化前期至开花后期，青蒿酸的含量无多大变化，随着青蒿的发育，从营养生长期至开花期，青蒿素的含量呈上升趋势，至开化盛期时青蒿素含量达到最高。外源赤霉素处理与开花打破了青蒿素生物合成的瓶颈，诱导了青蒿酸向青蒿素的生物转化。

白皮松（Pinus bungeana）和青杄（Picea wilsonii）花粉脱壁技术建立及细胞学研究

花粉是种子植物受精过程中雄性生殖细胞的载体，在有性生殖过程中起着非常重要的作用。花粉与柱头、花柱、子房等都有相互作用，起识别作用的是细胞壁蛋白，而花粉粒的壁有明显的两层：内壁和外壁。裸子植物花粉与被子植物相比具有萌发时间长、生长缓慢、授粉－受精时间长等特点。花粉的内壁与外壁在花粉萌发和生长过程中的功能仍然缺乏研究，但是迄今为止现有的分子生物学技术在获得裸子植物花粉壁突变体方面并没有发挥作用。本研究以裸子植物白皮松(Pinus bungeana)和青杄（Picea wilsonii）花粉为材料建立裸子植物花粉脱壁的体系，包 括脱外壁花粉和花粉原生质体的制备，即将花粉的两层壁逐层剥离，并在此基础上进行了细胞学研究。 本文首先建立了裸子植物脱外壁花粉的分离技术。实验表明低浓度的酶组合短暂酶解后，辅以机械研磨，可以释放出大量的脱外壁花粉。其中在这两种裸子植物中的处理稍有不同，白皮松的脱外壁花粉在含12％蔗糖，0.5%纤维素酶和0.3%离析酶的溶液，pH 5.8 ，孵育半小时，辅以一定力度机械研磨的方法获得，而青杄脱外壁花粉的条件是0.8%纤维素酶和0.5%离析酶、12％蔗糖的溶液，其它条件类似。 其次我们成功建立了一种快速、有效、可重复的分离白皮松和青杄花粉原生质体的系统，分离频率可高达70%。对白皮松而言，最好的分离条件是2% 纤维素酶、1.5%离析酶、15%蔗糖、pH 5.8，黑暗、24℃条件下轻微振荡、酶解6 小时。3％纤维素酶和2％离析酶组合比较适宜青杄花粉原生质体的分离，同时需要较低浓度的蔗糖溶液（12％）。青杄花粉原生质体要远大于白皮松花粉原生质体，前者直径为80µm，后者为40µm。强烈的FDA 荧光显示很好的活性。在制备的过程中，酶的浓度、酶的配比、酶解时间、渗透压调节剂、起始材料对分离率都有影响。 运用免疫荧光标记技术显示，脱外壁花粉的表面存在纤维素、果胶质、阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）和凝集素结合位点，其中纤维素在整个表面都有分布，但在萌发孔附近的荧光最强;白皮松脱外壁花粉表面有胼胝质的存在，主要位于靠近气囊的部位，而青杄脱外壁花粉表面未能检测到胼胝质;酸性果胶质在白皮松脱外壁花粉靠近萌发孔处的荧光稍弱于其它部位，而在青杄脱外壁花粉的表面近极端的荧光要强于远极端;白皮松脱外壁花粉表面有酯化果胶的沉积，而青杄脱外壁花粉表面缺失酯化果胶;白皮松和青杄两种植物脱外壁花粉表面均有阿拉伯半乳糖的分布，而白皮松脱外壁花粉的荧光要远强于青杄;白皮松和青杄脱外壁花粉表面有伴刀豆凝集素（Conconavalin agglutinin, Con A ）和大豆凝集素（soybean agglutinin, SBA ）结合位点的分布，而缺失麦胚凝集素（wheat germ agglutinin, WGA）结合位点。另外，傅立叶红外光谱(FTIR) 分析结果也同样支持上述结论。

全球变化的植被——环境相关性：中国和东北样带（NECT）研究

全球变化与陆地生态系统(GCTE)的研究一直是国际地圈一生物圈计划(IGBP)．全球变化研究的焦点之一，其中植被与环境，尤其是气候的关系研究，虽然古老却又包含许多新的涵义，而陆地样带(Terrestrial Transect)则是近年来发起于GCTE，并拓展到IGBP其它核心项目的研究热点．博士后研究的主要工作有：将全球变化作为主线，以单个树种青冈(Cyclobalanopsisgtauco)为对象，研究其过去、现在和将来的地理分布与气候的关系;分别利用气温和降水指标，拓展Kira指标形成生物热量指数和干湿度指数，以及建立水热积指数，在宏观尺度上研究了中国植被与气候的关系;结合生物群区和植物功能型概念的发展以及生物多样性的研究，进行了以生物多样性保育为目的的我国生态地理区划;在熟悉IGBP陆地样带的科学计划并总结其最新发展动态的基础上，分析了中国东北样带的基本生态地理特征;最后，粗略分析r生物性多样保育与自然保护区建设和管理的关系问题。 1.植被一环境（气候）分类：指标、系统和模型 植被一气候关系是一个古老的命题，但在当今的全球变化研究中成为最基础和最具活力的工作。从单一因子的或多因子简单组合的分类指标，如Koppen，Box指标等，到以可能蒸散为基础的综合分类指标，如Penman，Thornthwaite, Holdridge，Budyko，Kira指标等，科学家们发展了众多的植被一气候分类系统和模型，如Koppen．Thornthwaite，Holdridge. Kira. Box. Neilson.Woodward, Budyko, Prentice系统，以及Holdridge，Uvardy，Matthews. Olson. Bailey．Woodward.Prentice. Box模型，为现今植被一气候关系的研究以及全球变化对陆地生态系统的影响，和大气C02增加对潜在植被变化的响应预测奠定了良好的基础。 2.基于物种的植被一气候关系研究：中国青冈的地理分布与气候的关系 在广泛收集青冈[Cyclobalanopsis glauca (Thunb.) Oerst.]地理分布资料的基础上，利用目前国际上比较流行的研究植被与气候相互关系的指标和方法，包括Kira的水热指标、Penman的公式、Thomthwaite的指标和气候分类、Holdridge的生命地带分类系统指标， 以及年平均气温(TEMP). 1月均温(Tl)、’7月均温(T7)、极端最高气温(TMAX)、极端最低气温(TMIN).≥10℃积温(AT)和年降水量(PREC)，研究了青冈在中国的地理分布与气候的关系，讨论了青冈垂直分布的上限、下限以及北界的Kira热量指标状况。根据孢粉资料和历史文献，探讨r历史时期青冈在中国大陆的分布与变迁及其与气候的关系，并利用Holdridge生命地带分类系统指标预测了C02浓度倍增条件下中国青冈分布区的可能变化。 3.宏观尺度上的中国植被一气候关系 1）用气温、降水指标研究中国植被一气候关系 能够在气象台站直接、方便地测试到的年平均气温、降水量指标，与其它水热气候因子有显著的相关性，用它们来研究中国植被与气候的关系是可行且有用的。利用全国689个气象站点的气象记录，计算得出了中国各植被地带、亚地带的年平均气温，年降水量指标和温雨系数，利用生态信息系统EIS作出了各气候指标在中国的分布，并将年平均气温和降水量作散点图，均较好地表现了中国各植被类型与气候指标的关系和格局。总结可得中国各植被地带的气候指标范围及界限。综合孢粉，古生物等资料信息，前人确定在全新世中期中国存在一个大暖期，其中稳定暖湿的鼎盛阶段在7.2—6,0 Ka．B.P.，其时中国境内大部分地区的年平均气温比现在高2℃左右，年降水平均高于现在100 mm，通过数学处理，利用生态信息系统恢复重建了全新世大暖期中国大陆的气温和降水分布状况．参考孢粉、古植物和他人研究资料及现代植被气候关系，恢复编制了大暖期鼎盛阶段中国大陆的植被区划图，与现代植被区划相比较，东部各个植被带在大暖期盛时表现出明显的北迁，温带植被的迁移幅度大于亚热带和热带植被;西部的植被带出现了经向西迁，西北部的草原范围扩张，荒漠缩小;青藏高原地区高寒半荒漠和荒漠植被的范围大大缩小，而且植被带仍有不同程度向北迁移的表现。这可为预测与阐明未来的气候变化和植被变迁提供有力的证据． 2）KIRA指标的拓展及其在中国植被与气候关系研究中的应用 根据Kira以月平均气温5℃为界的热量指数和干湿度指数概念，提出了以月平均气温10℃为界的生物热量指数，包括生物温暖指数BWI和生物寒冷指数BCI，并修正其干湿度指数为生物干湿度指数BK。利用中国689个标准气象台站的资料，分析我国主要植被类型分布与热量因子和干湿度因子的关系，得出两者之间有较好的相关性，生物温暖指数、寒冷指数和干湿度指数的散点图，较好地表现了中国各植被类型与气候指标的关系和格局。并得出中国各植被地带的气候指标范围及界限，以1 0℃为界的生物温暖指数不仅对我国森林植被的地理分布和温度气候带的划分具有较好的指示作用，而且对西南部高山、亚高山地区的植被与气候关系指示性较强;生物寒冷指数则对亚热带和热带的指示性很好，能够较好区分亚热带南部及热带地区;由热量指数和降水量综合得出的生物干湿度指数，对中国西北部干旱、半干旱区以至全国的植被分布与水分、热量因子的关系分析有较好的应用价值。 3）水热积指数的估算及其在中国植被与气候关系研究中的应用 试图利用大气年平均气温、年降水量、可能蒸散和土壤水分平衡之间的关系建立一个水热积指数，并应用年平均气温．水分盈亏值和水热积指数三个气候变量来限定植物群落组合，构成一个圆形的生命-气候图式．根据全国689个标准气象台站的气候资料，计算了中国8个植被地带和26个亚地带的年平均气温、年水分盈亏和水热积指数，绘制了各气候指标在中国的分布图及散点图，较好表现了中国各植被类型与气候指标的关系和格局，包括寒温带针叶林、冷温带针阔叶混交林、暖温带落叶阔叶林、亚热带常绿阔叶林、热带雨林和季雨林、温带草原、温带荒漠、青藏高原高寒植被，并得到了中国各植被地带的气候指标范围及界限。通过分析可以看出，年平均气温的等值线较好地反映了中国大陆的热量梯度，经度和纬度方向的区分均较明显;土壤水分盈亏曲线的等值线则比较零乱;综合了热量和水分差异的水热积指数，其等值线与热量梯度和水分梯度均有一定的对应性，与植被类型的对应也较好。这是在宏观尺度上进行的植被与气候关系研究的一种尝试，有待于增加机理性的内容，使其得到进一步的改进。 4.生物多样性保育和全球变化研究中的陆地生物群区类型 Biome(生物群区)是当今生物多样性保育和全球变化研究中的一个重要概念，根据此概念及植物功能型概念的发展，评述了9个重要的世界陆地生物群区分类系统，并根据中国的植被分类和区划，尝试划分了在中国的生物多样性保育和全球变化研究中所需要的陆地生物群区类型。 5.中国生物多样性的生态地理区划 利用各种生态地理因子，包括气候指标如与植物耐寒性有关的绝对最低温度(TMrN)，最冷月平均气温(TJAN)，最冷月日平均温度的最大值(MXT)和最小值(MIT);与需热性有关的植物生长季积温(AT);年降水量的季节分配，包括最冷月降水(PJAN)，最热月降水(PJUL)，年降水量，年降水的统计标准差(PSD)和变异系数(年变率PCV);植被指标如植被类型(VEGET)、，植被区划类型(VEGED)、植被的净第一性生产力(NPP)、植物区系类型(FLORA)、动物区系类型(FA UNA).植物特有属的丰富度(EDGENUS)以及度量植物多样性的植物种丰富度(属数GENUS、种数SPECIES);土壤指标如土壤类型(SOILT)，土壤理化性质如土壤酸碱度(SOILPH)、土壤表层阳离子交换量(SOILEXC)等;地形和地貌特征如经度(LONG)、纬度(LAT)和海拔高度(ALT)，利用模糊聚类的手段，综合进行了中国生物多样性的生态地理区划。采用四级区划，即：生物大区(biodomain) -生物亚区(subbiodomain) -生物群区(biome) -生物区(bioregion).全国划分为5个生物大区，7个生物亚区和1 8个生物群区。 I北方森林大区 I A欧亚北方森林亚区 I Al南泰加山地寒温针叶林 IA2北亚针阔叶混交林 II北方草原荒漠大区 II B欧亚草原亚区 II Bl内亚温带高草草原 II B2黄土高原森林草原（灌木草原） il C亚非荒漠亚区 II Cl中亚温带荒漠 ⅡC2蒙古／内亚温带荒漠 III东亚大区 III D东亚落叶阔叶林亚区 m DI东亚落叶阔叶林 III E东亚常绿阔叶林亚区 III El东亚落叶•常绿阔叶混交林 III E2东亚常绿阔叶林 ⅡI E3东亚季风常绿阔叶林 III E4西部山地常绿阔叶林 IV旧热带大区 IV F印度一马来热带森林亚区 IV Fl北热带雨林、季雨林 IV F2热带海岛植被 V亚洲高原大区 vG青藏高原亚区V Gl青藏高寒灌丛草甸V G2青藏高寒草原V G3青藏高寒荒漠V G4青藏温性草原V Gs青藏温性荒漠IGBP陆地样带：科学计划与最新进展 作为国际地圈一生物圈计划(IGBP)的交叉项目(Interproject)的陆地样带(Terrestrial Transect)，已成为IGBP的全球变化研究中最引人重视的发展和新研究方法之一。它以一系列综合性的全球变化研究计划为基础，是由沿着一个主要全球变化驱动因素（如温度、降水、土地利用强度等）的梯度上的一系列研究站点所构成研究区域，并配合以模型模拟和综合分析，其地理范围为1000 km或更大的长度，数百公里的宽度，以涵盖大气环流模型(GCM)运作的最小单元。本节论述了IGBP陆地样带的概念和研究的意义，样带的类型、一般设计和选择标准，国际上IGBP样带的初步设置，包括①经受土地利用变化的潮湿热带系统;②从北方森林到冻原的高纬度地区;③从干旱森林到灌丛的半干旱热带地区;④从森林或灌丛过渡到草地的中纬度半干旱地区，以及其它的一些样带和PAGES核心计划中的PEP样带，主要内容有样带设置的原因、研究内容和主要样带特点等，并总结了样带的最新研究进展和动态． 6.中国东北样带(N ECT)的生态地理特征分析 陆地样带研究已成为国际地圈-生物圈计划(IGBP):全球变化研究的重要手段与热点。中国东北森林-草原样带(NECT)已被列为IGBP国际全球变化陆地样带之一。该样带在东经1120与130030’之间沿北纬43030’设置，长约l 600 km，是一条中纬度温带以降水为驱动因素的梯度，具有由温带针阔叶混交林向温带草原的3个亚地带：草甸草原、典型草原与荒漠草原过渡的空间系列。本文给出了样带的基本生态地理特征及其梯度分析，包括其地理位置、设置意义、地形地貌、气候梯度、土壤类型、土地利用格局、植被类型、主要优势种和群落类型的生态地理特征以及全新世适宜期（大暖期）的植被分布格局。NECT将成为我国全球变化与陆地生态系统(GCTE)与其它IGBP核心项目研究的前沿阵地。 7.自然保护区的作用、建设和管理及其与生物多样性的关系 一般而言，“就地保护”是保护生物多样性的主要措施和最根本的途径，生境的“就地保护”是生物多样性保护最为有力和最为高效的保护方法，而就地保护的措施就是建立自然保护区，通过对自然保护区的建设和有效管理，使生物多样性得到切实有效的人为保护。从自然保护区定义和类型划分及生物多样性的定义本身可以看出，自然保护区的主要保护对象是世界上丰富多彩的生物多样性，自然保护区是生物多样性就地保护的重要基地，是物种多样性的基因库，是留给野生动植物的宝贵栖息地，应把保护区的建设和生物多样性的保护与持续利用密切结合起来，合理开发利用自然资源，促进生物多样性的可持续发展。