1000 resultados para signalisation cellulaire
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La forme canadienne-franaise du syndrome de Leigh (LSFC) est une maladie mtabolique associe une dficience en cytochrome oxydase (COX) et caractrise par des crises dacidose lactique, menant une mort prmature. Les mcanismes qui sous-tendent linduction des crises restent inconnus et il nexiste aucune thrapie efficace pour les prvenir. Cette tude vise caractriser l'effet de facteurs mtaboliques priphriques potentiellement altrs chez les patients LSFC sur la mort de lignes cellulaires issues de ces patients et de tmoins puis, identifier des agents thrapeutiques pouvant la prvenir. Nous postulons que (i) ces facteurs mtaboliques induiront une mort prmature des cellules de patients et que (ii) les interventions susceptibles de la prvenir pallieront les consquences de la dficience en COX, soit la diminution des taux dadnosine triphosphate (ATP) et laugmentation du stress oxydant, du nicotinamide adnine dinuclotide (NADH) et des lipides toxiques. Un criblage de 8 facteurs sanguins et 10 agents thrapeutiques a t ralis. Les paramtres mesurs incluent la ncrose, lapoptose, lATP et lactivit de la COX. Les fibroblastes LSFC sont plus susceptibles la mort par ncrose (396%) induite par du palmitate plus lactate, un effet associ des niveaux dATP diminus (538%). La mort cellulaire est rduite de moiti par lajout combin dagents ciblant le NADH, lATP et les lipides toxiques, alors que lajout dantioxydants laugmente. Ainsi, un excs de nutriments pourrait induire la mort prmature des cellules LSFC et, pour attnuer cette mort, il serait important de combiner plusieurs interventions ciblant diffrents mcanismes.
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La drgulation du compartiment B est une consquence importante de linfection par le virus de limmunodficience humaine (VIH), qui peut mener des manifestations autoimmunes et ultimement des lymphomes B. Parmi les premires anomalies dtectes, on dnote lactivation polyclonale, reflte par la prsence dhyperglobulinmie (hyper-Ig) et des titres levs dautoanticorps chez les patients. On observe galement une altration des dynamiques des populations, notamment une expansion de la population des cellules matures actives. De plus, les patients voluent vers lincapacit de gnrer une rponse humorale efficace, et sont sujets une perte de la mmoire immunologique en phase chronique, caractrise par une diminution de la population des cellules mmoires et par lpuisement cellulaire. Toutefois, on connat trs peu les mcanismes impliqus dans de telles altrations. Les cellules dendritiques (DC) sont parmi les premires populations cellulaires rencontrer et propager le VIH lors dune infection, et sen trouvent affectes directement et indirectement, par le virus et ses composantes. On retrouve en effet une diminution des frquences de DC dans le sang, les muqueuses et les organes lymphodes de patients infects par le VIH, ainsi quun blocage au niveau de la maturation cellulaire. Toutefois, un dbat perdure quant lapparition de ces altrations durant la phase aige de linfection, et la restauration des frquences et des fonctions des DC chez les patients sous traitement. Cette controverse est due la raret des tudes longitudinales incluant des suivis qui schelonnent de la phase aige la phase chronique de linfection. Les DC jouent un rle important dans le dveloppement, la survie et lactivation des lymphocytes B, de faon T-dpendante et T-indpendante, notamment via des facteurs de croissance tel que BLyS (B lymphocyte stimulator). Par consquent, nous formulons lhypothse que dans le cadre dune infection VIH, les altrations observes au niveau des cellules B sont modules par les DC. Lobjectif majeur de cette tude est donc dvaluer limplication potentielle des DC dans les altrations des cellules B au cours de linfection par le VIH. Pour ce faire, nous avons dabord caractris de faon longitudinale le statut des populations de DC du sang priphrique de patients infects au VIH et prsentant diffrents types de progression de la maladie. Cela nous a permis dvaluer la prsence dune corrlation entre les dynamiques de DC et le type de progression. Par la suite, nous avons valu la capacit des DC exprimer BLyS, puis mesur sa concentration ainsi que celles dautres facteurs de croissance des cellules B dans le plasma des patients. Enfin, nous avons caractris le statut des lymphocytes B, en fonction du stade de linfection et du taux de progression clinique des patients. Cette tude dmontre une diminution de la frquence des populations de DC mylodes (mDC) dans le sang de patients infects par le VIH sujets une progression clinique. Cette diminution est observe ds le stade aigu de linfection et au-del du traitement antirtroviral (ART). Des concentrations leves de MCP-1 (monocyte chemotactic protein), MIP (macrophage inflammatory protein) -3 et MIP-3 suggrent la possibilit dun drainage vers des sites priphriques. Nous observons galement des niveaux suprieurs la normale de prcurseurs CD11c+CD14+CD16- en phase chronique, possiblement lis une tendence de rgnration des DC. Les patients en phase chronique prsentent de hautes concentrations plasmatiques de BLyS, reflte par un haut taux dexpression de cette cytokine par les mDC et leurs prcurseurs. Paralllement, nous observons une expansion des cellules B matures actives ainsi que des taux levs dIgG et IgA dans le sang de ces patients. De plus, nous constatons lexpansion dune population de cellules B qui prsente la fois des caractristiques de cellules B immatures transitionnelles (TI, transitional immature), et de cellules B recirculantes actives de la zone marginale (MZ, marginal zone), considres ici comme des prcurseurs/actives de la MZ. Cette tude dmontre aussi, chez les progresseurs lents, une meilleure prservation du compartiment des DC du sang priphrique, accompagne dune augmentation de prcurseurs des DC de phnotype CD11c+CD14+CD16+, ainsi que des concentrations plasmatiques et niveaux dexpression normaux de BLyS. Consquemment, nous navons pas observ daugmentation des cellules B matures actives et des cellules B prcurseurs/actives de la MZ. Toutefois, la frquence des cellules B matures de la MZ est diminue, refltant possiblement leur recrutement vers des sites priphriques et leur contribution un mcanisme actif de contrle de la progression de la maladie. Lensemble de ce travail suggre que dans le cadre dune infection au VIH, les altrations observes au niveau des DC modulent les anomalies des cellules B. Par consquent, le maintien de lquilibre des fonctions DC, notamment les fonctions noninflammatoires, pourrait avoir un impact important dans la prvention de la progression de maladies associes aux altrations du compartiment des cellules B.
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TDP-43 est une protine multifonctionnelle possdant des rles dans la transcription, l'pissage des pr-ARNm, la stabilit et le transport des ARNm. TDP-43 interagit avec d'autres hnRNP, incluant hnRNP A2, via son extrmit C-terminale. Plusieurs membres de la famille des hnRNP tant impliqus dans la rponse au stress cellulaire, alors nous avons mis lhypothse que TDP-43 pouvait y participer aussi. Nos rsultats dmontrent que TDP-43 et hnRNP A2 sont localiss au niveau des granules de stress, la suite dun stress oxydatif, dun choc thermique, et lors de lexposition la thapsigargine. TDP-43 contribue la fois l'assemblage et au maintien des granules de stress en rponse au stress oxydatif. TDP-43 rgule aussi de faon diffrentielle les composants cls des granules de stress, notamment TIA-1 et G3BP. L'agrgation contrle de TIA-1 est perturbe en l'absence de TDP-43. En outre, TDP-43 rgule le niveau d`ARNm de G3BP, un facteur de granule de stress de nuclation. La mutation associe la sclrose latrale amyotrophique, TDP-43R361S, compromet la formation de granules de stress. Ainsi, la fonction cellulaire de TDP-43 s'tend au-del de lpissage; TDP-43 est aussi un composant de la rponse cellulaire au stress central et un acteur actif dans le stockage des ARNs.
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MicroARN (miARN) ont rcemment merg comme un acteur central du gne rseau de rgulation impliqus dans la prise du destin cellulaire. L'apoptose, un actif processus, par lequel des cellules dclenchent leur auto-destruction en rponse un signal, peut tre contrl par les miARN. Il a galement t impliqu dans une varit de maladies humaines, comme les maladies du cur, et a t pens comme une cible pour le traitement de la maladie. Tanshinone IIA (TIIA), un monomre de phenanthrenequinones utilis pour traiter maladies cardiovasculaires, est connu pour exercer des effets cardioprotecteurs de l'infarctus du myocarde en ciblant l'apoptose par le renforcement de Bcl-2 expression. Pour explorer les liens potentiels entre le miARN et l'action anti-apoptotique de TIIA, nous tudi l'implication possible des miARN. Nous avons constat que l'expression de tous les trois membres de la famille miR-34, miR-34a, miR-34b et miR-34c ont t fortement rgule la hausse aprs l'exposition soit la doxorubicine, un agent endommageant l'ADN ou de pro-oxydant H2O2 pendant 24 heures. Cette rgulation la hausse caus significativement la mort cellulaire par apoptose, comme dtermin par fragmentation de l'ADN, et les effets ont t renverss par les ARNs antisens de ces miARN. Le prtraitement des cellules avec TIIA avant l'incubation avec la doxorubicine ou H2O2 a empch surexpression de miR-34 et a rduit des apoptose. Nous avons ensuite tabli BCL2L2, API5 et TCL1, en plus de BCL2, comme les gnes nouveaux cibles pour miR-34. Nous avons galement lucid que la rpression des ces gnes par MiR-34 explique l'effet proapoptotique dans les cardiomyocytes. Ce que la rgulation positive de ces gnes par TIIA realise par la rpression de l'expression de miR-34 est probable le mcanisme molculaire de son effet bnfique contre ischmique lsions cardiaques.
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Thse ralise en cotutelle avec l'universit Montpellier2 dans le laboratoire de pharmacologie molculaire de Jean-Philippe Pin l'institut de gnomique fonctionnelle (IGF), Montpellier, France.
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Les topoisomrases I (topA) et III (topB) sont les deux topoisomrases (topos) de type IA dEscherichia coli. La fonction principale de la topo I est la relaxation de lexcs de surenroulement ngatif, tandis que peu dinformation est disponible sur le rle de la topo III. Les cellules pour lesquelles les deux topoisomrases de type IA sont manquantes souffrent dune croissance difficile ainsi que de dfauts de sgrgation svres. Nous dmontrons que ces problmes sont majoritairement attribuables des mutations dans la gyrase qui empchent laccumulation dexcs de surenroulement ngatif chez les mutants sans topA. Laugmentation de lactivit de la gyrase ralise par le remplacement de lallle gyrB(Ts) par le gne de type sauvage ou par lexposition des souches gyrB(Ts) une temprature permissive, permet la correction significative de la croissance et de la sgrgation des cellules topos de type IA. Nous dmontrons galement que les mutants topB sont hypersensibles linhibition de la gyrase par la novobiocine. La rplication non-rgule en labsence de topA et de rnhA (RNase HI) augmente la ncessit de lactivit de la topoisomrase III. De plus, en labsence de topA et de rnhA, la surproduction de la topoisomrase III permet de rduire la dgradation importante dADN qui est observe en labsence de recA (RecA). Nous proposons un rle pour la topoisomrase III dans la sgrgation des chromosomes lorsque lactivit de la gyrase nest pas optimale, par la rduction des collisions fourches de rplication sobservant particulirement en labsence de la topo I et de la RNase HI.
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Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur crbrale la plus commune et ltale chez ladulte. Malgr les avancs fulgurantes dans la dernire dcennie au niveau des thrapies contre le cancer, le pronostique reste inchang. Le manque de spcificit des traitements est la cause premire de la rcurrence de cette tumeur. Une meilleure comprhension au niveau des mcanismes molculaires et biologiques de cette tumeur est imprative. La dcouverte des cellules souches cancreuses (CD133+) au niveau du GBM offre une nouvelle opportunit thrapeutique contre cette tumeur. Effectivement, les cellules CD133+ seraient responsables de ltablissement, le maintien et la progression du GBM. De plus, elles sont galement la cause de la rsistance du GBM faces aux traitements de radiothrapies. Ces cellules reprsentent une cible de choix dans le but dradiquer le GBM. Loncogne BMI1 a t associ plusieurs types de tumeurs et est galement essentielle au maintien de diffrentes populations de cellules souches normales et cancreuses. Une forte expression de BMI1 est observe au niveau du GBM et plus prcisment, un enrichissement prfrentiel de cette protine est not au niveau des cellules CD133+. Lobjectif principal de cette thse est dvaluer le rle potentiel de BMI1 dans le maintien et la radiorsistance des cellules souches cancreuses (CSC), CD133+ du GBM. La fonction principale de BMI1 est la rgulation ngative du locus INK4A/ARF. Ce locus est impliqu dans lactivation de deux voies majeurs anti-tumorales : P53 et RB. Or, la perte de BMI1 induit in vitro une diminution des capacits prolifratives, une augmentation de la diffrentiation et de lapoptose, ainsi quune augmentation de la radiosensibilit des CSC du GBM indpendamment de la prsence du locus INK4A/ARF. Effectivement, deux tumeurs sur trois possdent une dltion de ce locus, ce qui suggre que BMI1 possde dautre(s) cible(s) transcriptionnelle(s). Parmi ces nouvelles cibles ont retrouve la protine P21, un rgulateur ngatif du cycle cellulaire. De plus, la perte de BMI1 inhibe ltablissement dune tumeur crbrale lors dtudes de xnogreffe chez la souris NOD/SCID. galement, une nouvelle fonction de BMI1 indpendante de son activit transcriptionnel a t dmontre. Effectivement, suite linduction dun bris double brin (BDB) de lADN, BMI1 est rapidement recrut au niveau de la lsion et influence le recrutement des protines de reconnaissance du dommage lADN. La perte de BMI1 mne un dfaut au niveau de la reconnaissance et la rparation de lADN, alors que sa surexpression induit plutt une augmentation de ces mcanismes et procure une radiorsistance. Ces rsultats dcrivent pour la premire fois limportance de BMI1 au niveau du maintien, de lauto-renouvellement et la radiorsistance des CSC du GBM. Ainsi, ces travaux dmontrent que la protine BMI1 reprsente une cible thrapeutique de choix dans le but dradiquer le GBM, une tumeur crbrale ltale.
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Les virus sont utiliss depuis longtemps dans la recherche sur le cancer et ont grandement contribu lavancement des connaissances de mme qu ltablissement de prceptes importants encore valables aujourdhui dans le domaine. Lun des dfis actuels est de mieux dfinir les tapes menant la transition dune cellule normale une cellule transforme et cest sur cette problmatique que nous nous sommes penchs. Pour ce faire, nous avons tir profit de lutilisation de lantigne grand-T du virus de polyome (PyLT), un virus capable dinduire des tumeurs chez les rongeurs. Cet oncogne viral lui seul possde des proprits intressantes qui suggrent que, en plus de limmortalisation, il peut galement contribuer aux vnements prcoces de la carcinognse. Ceci repose principalement sur la capacit de PyLT induire des tumeurs en souris transgniques et ce, avec une certaine latence ce qui suggre que des vnements supplmentaires sont ncessaires. Ainsi, lutilisation de PyLT dans un modle de culture cellulaire permet de dissquer les changements qui lui sont attribuables. Dans un premier temps, ltablissement du profil d'expression gnique associ l'expression de PyLT dans un modle murin nous a permis de slectionner un bon nombre de gnes, parmi lesquels figurait Necdin. Nous avons choisi dtudier Necdin plus en dtail puisque peu dattention tait accorde cette protine dans le domaine du cancer, malgr que diffrentes donnes de la littrature lui suggrent la fois des fonctions suppresseurs de tumeur et oncogniques. Nous avons dmontr que, malgr sa fonction propose de suppresseur de croissance, lexpression de Necdin nest pas incompatible avec la prolifration dans la ligne cellulaire de souris NIH 3T3 et les cellules primaires humaines (IMR90), bien que linhibition de son expression par shARN confre un avantage prolifratif. Nous avons confirm que Necdin est un gne cible de p53 induit par diffrents agents gnotoxiques, toutefois son expression peut galement tre rgule de faon p53-indpendante. De plus, Necdin agit ngativement sur larrt du cycle cellulaire en rponse lactivation de p53. Ceci suggre que Necdin est impliqu dans une boucle de rgulation ngative de la voie de p53 et que laugmentation anormale de lexpression de Necdin pourrait contribuer la perturbation la voie du suppresseur de tumeur p53. Lactivation de p53 permet larrt transitoire du cycle cellulaire en condition de stress, mais est aussi implique dans ltablissement dun arrt permanent nomm snescence. La snescence est un mcanisme de protection contre laccumulation de mutations qui peut contribuer linitiation du cancer. Vu lintressante implication de Necdin dans la rgulation de lactivit de p53, nous avons transpos les connaissances acquises du modle murin un modle humain, plus adapt pour ltude de la snescence. La caractrisation de lexpression de Necdin dans des fibroblastes primaires humains diffrents passages montre que les jeunes cellules en prolifration active expriment Necdin et que son niveau diminue avec ltablissement de la snescence rplicative. Le mme phnomne est observ lors de la snescence prmature provoque par lexpression dun oncogne et par lexposition aux radiations ionisantes. De plus, dans des conditions normales de prolifration, la modulation de Necdin par des essais de gain et de perte de fonction naffecte pas la dure de vie des cellules primaires. Toutefois, en condition de stress gnotoxique d lexposition aux irradiations, les cellules surexprimant Necdin prsentent une radiorsistance accrue de la mme faon que lorsque p53 est inactiv directement. Ce rsultat en cellules humaines vient appuyer leffet observ dans les cellules de souris sur limpact quaura le niveau de Necdin sur la rponse de p53 en condition de stress. Un bref survol a t fait pour aborder de quelle faon nos rsultats en culture cellulaire pouvaient se traduire dans des modles de cancer chez lhumain. Nous avons caractris lexpression de Necdin dans deux types diffrents de cancer. Dabord, dans le cancer de lovaire, le niveau lev de Necdin dans les tumeurs faible potentiel de malignit (LMP) en comparaison aux cancers agressifs de lovaire de type sreux suggre que lexpression de Necdin se limite aux cellules de cancer LMP, qui prsente gnralement un p53 de type sauvage. Son expression est aussi retrouve dans deux lignes cellulaires du cancer de lovaire non-tumorigniques en xnogreffe de souris, dont lune possde un p53 fonctionnel. De plus, la caractrisation de Necdin dans les lignes cellulaires du cancer de la prostate suggre une relation entre son expression et la prsence de p53 fonctionnel. Dans le cancer de la prostate, tout comme pour le cancer de lovaire, Necdin semble tre prsent dans les lignes reprsentant un stade moins avanc de la maladie. Lutilisation de loncoprotine virale PyLT nous a permis de rvler des proprits intressantes de Necdin. Nous proposons que dans certains contextes, lexpression constitutive de Necdin pourrait contribuer au cancer en retardant une rponse par p53 approprie et possiblement en participant laugmentation de linstabilit gnomique. La fonction potentiellement oncognique de Necdin quant sa relation avec p53 que nous avons rvle requiert davantage dinvestigation et les cancers caractriss ici pourraient constituer de bons modles cette fin.
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La cardiomyopathie ischmique et linsuffisance cardiaque (IC) sont deux des principales causes de morbidit et de mortalit dans les pays industrialiss. LIC reprsente la condition finale rsultant de plusieurs pathologies affectant le myocarde. Au Canada, plus de 400 000 personnes souffrent dIC. Malgr la grande varit de traitements disponibles pour prendre en charge ces patients haut risque de mortalit, lvolution et le pronostic clinique de cette population demeurent sombres. Les thrapies de rgnration par transplantation cellulaire reprsentent de nouvelles approches pour traiter les patients souffrant dIC. Limpact de cette approche cellulaire et les mcanismes qui sous-tendent lapplication de ce nouveau mode de traitement demeurent obscurs. Les hypothses proposes dans cette thse sont les suivantes : 1) lvolution long terme des patients qui se prsentent en IC grave est nettement dfavorable malgr les techniques actuelles de revascularisation chirurgicale cur battant; 2) la thrapie cellulaire et, plus spcifiquement, linjection intracoronaire prcoce de milieu de culture cellulaire, permet damliorer la rcupration fonctionnelle du ventricule gauche suite un infarctus aigu du myocarde; et 3) la mobilisation de laxe cur-moelle osseuse constitue un mcanisme de rponse important lors de la survenue dun vnement ischmique chronique affectant le myocarde.
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PHEX est une protine importante dans le processus de minralisation osseuse. Des mutations ou la dltion dune partie de ce gne causent lhypophosphatmie lie au chromosome X (XLH). Cette maladie est caractrise par une hypophosphatmie, accompagne de dfauts de minralisation, de rachitisme et de lsions ostomalaciques. Avec lhypophosphatmie, les taux circulants de vitamine D devraient tre augments, ce qui nest pas le cas do une rgulation anormale de la production de vitamine D a lieu. Cependant, malgr le fait que cette protine soit une peptidase, aucun substrat physiologique na encore t rpertori pour PHEX. PHEX est une protine membranaire de type II de la famille M13 des mtalloendopeptidases zinc possdant un court domaine N-terminal cytosolique, un segment transmembrannaire denviron 20 acides amins et une large portion C-terminale extracellulaire o se trouve le site actif de lenzyme. PHEX est exprime de faon majoritaire dans les os et dans les dents et elle apparat linitiation de la minralisation. Les patients souffrant de XLH et la souris Hyp, qui est un modle animal de la maladie humaine, montrent des quantits importantes de la protine FGF23. De plus, FGF23 est impliqu dans une autre maladie relie au mtabolisme du phosphate, lhypophosphatmie rachitique autosomale dominante (ADHR) o des mutations de FGF23 causent sensiblement les mmes symptmes que XLH. FGF23 est produit principalement par les ostoblastes et les ostocytes. FGF23 cause une hypophosphatmie par la diminution de lexpression du cotransporteur NaPi de type II, responsable de la rabsorption du phosphate rnal. Lhypothse propose dans la littrature serait que PHEX activerait ou inactiverait des peptides importants pour la minralisation osseuse. Plus spcifiquement, lactivation ou linactivation de ces peptides aurait pour rle de rguler les quantits de FGF23. Selon lhypothse mentionne prcdemment, la rgulation de PHEX pourrait donc avoir un effet sur la minralisation. Une quantit croissante de donnes sur la rgulation de PHEX sont maintenant disponibles. Par exemple, la vitamine D diminue lexpression de PHEX tandis que les glucocorticodes et lhormone de croissance augmentent son expression. Dans une premire tude, nous avons voulu dterminer si un peptide reli la minralisation osseuse, le PTHrP1-34, pouvait rguler lexpression de PHEX. Nous avons dtermin que le PTHrP1-34 peut rguler de faon ngative lexpression de PHEX dans les cellules UMR-106, une ligne cellulaire ostoblastique. Cette rgulation passe par la voie de lAMPc/protine kinase A. De plus, cette diminution dexpression est galement observe au jour 7 dans des cultures primaires dostoblastes de rat en minralisation. Par la suite, nous avons tudi un mutant de PHEX, le mutant E4Q retrouv chez un patient souffrant de XLH, o la mutation se retrouve dans le domaine cytosolique de PHEX. Cette mutation ninterfre pas avec le site catalytique de lenzyme puisque ce mutant de PHEX peut tout aussi bien cliver un substrat synthtique que la protine sauvage. Il a t dtermin que cette mutation annule un motif di-acide. Nous avons dmontr que ce motif di-acide est responsable de la liaison de PHEX COPII, responsable de la formation de vsicules de scrtion. De plus, il semblerait que ce motif soit important, probablement par son interaction avec COPII, lincorporation de PHEX dans des vsicules de calcification, lesdites vsicules tant importantes dans le processus de minralisation. Finalement, des essais de comptitions ont dmontr que la minralisation pouvait tre perturbe lorsque lon surexprimait la queue cytosolique sauvage de PHEX, contrairement la queue mute. Ceci suggre possiblement que linteraction avec COPII menant lincorporation de PHEX dans les vsicules de calcification ou dautres protines comprenant de tels motifs pourrait tre importante pour la minralisation. Finalement, la dernire tude porte sur la protine FGF23. Nous avons dmontr, par la surexpression de FGF23 dans la ligne MC3T3 dostoblastes de souris, que cette surexpression a un effet sur la snescence de ces cellules. En effet, des essais de snescence ont montr laugmentation de celle-ci lorsque FGF23 est surexprim. Par contre, la prolifration nest pas altre. De plus, il semblerait que la diffrenciation soit plus rapide, tel quobserv par une minralisation survenant plus tt, mais ntant pas plus importante. Bref, la surexpression de FGF23 semblerait faire en sorte que les ostoblastes se diffrencient plus rapidement et passent donc un tat de snescence prmatur comparativement aux cellules sauvages. Ceci est en accord avec la littrature o KLOTHO, un cofacteur de FGF23 permettant sa liaison avec une plus grande affinit sur son rcepteur, lorsquinactiv dmontre un phnotype similaire au vieillissement incluant un phnotype de snescence.
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Les oligonuclotides (ONs) antisens prsentent un fort potentiel en tant quagents thrapeutiques. Toutefois, leurs proprits physicochimiques limitent leur utilisation en thrapie gnique. Pour pallier aux divers obstacles, des systmes de vectorisation, tels que les micelles polyioniques (PICMs), ont t dvelopps. Grce leur structure unique, les micelles protgent lON contre une dgradation prmature et le couplage dun ligand leur surface augmente leur spcificit et leur internalisation. Dans dautres systmes, un polymre adjuvant aux proprits pH-sensibles peut tre ajout pour faciliter la sortie de lendosome et augmenter lefficacit de lON. Lobjectif gnral de ce mmoire tait de mettre au point des PICMs ternaires cibles pour ladministration dONs. Ces micelles assureraient la fois linternalisation cellulaire de leur cargaison en interagissant avec des rcepteurs cellulaires et sa fuite de lendosome grce un mcanisme de dstabilisation de la membrane endosomale. Pour cela, des PICMs composes dun copolymre cationique de type poly(thylne glycol)-bloc-poly(mthacrylate d(alkylamino)thyle) et dun copolymre dacide mthacrylique ont t prpares. Les proprits physicochimiques de ces vecteurs ont dmontr quils permettaient une condensation efficace de lacide nuclique et ce, indpendamment de la nature du polymre cationique et de lacide nuclique. Finalement, une approche de couplage par pont disulfure a t dveloppe afin de greffer au copolymre un fragment danticorps dirig contre les rcepteurs de la transferrine. En conclusion, ces travaux dmontrent la versatilit et le potentiel des PICMs ternaires en tant que vecteurs dacide nuclique, et proposent une mthodologie de couplage dun ligand afin de formuler des PICMs cibles.
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Le long bio-polymre d'ADN est condens lintrieur du noyau des cellules eukaryotes l'aide de petites protines appeles histones. En plus de leurs fonctions condensatrices,ces histones sont galement la cible de nombreuses modifications post-traductionnelles(MPT), particulirement au niveau de leur section N-terminale. Ces modifications rversibles font partie dun code dhistones pi-gntique transmissible qui orchestre et module dynamiquement certains vnements impliquant la chromatine, tels lactivation et la dsactivation de gnes ainsi que la duplication et la rparation dADN. Ces modifications sont impliques subsquemment dans la signalisation et la progression de cancers, tels que la leucmie. En consquence, l'lucidation des modifications dhistones est importante pour comprendre leurs fonctions biologiques. Une mthodologie analytique a t mise au point en laboratoire pour isoler, dtecter, et quantifier les MPT dhistones en utilisant une approche rapide deux volets laide doutils bioinformatiques spcialiss. La mthodologie dveloppe en laboratoire a t valide en utilisant des histones de souche sauvage ainsi que deux types dhistones mutants dficients en enzymes actyltransferase. Des trois sources dhistones utilises, la seule MPT qui a dmontr un changement significatif est lactylation de lhistone H3 lysine 56 (H3K56ac). Lexpression et la stoechiomtrie de cette MPT, issue de cellules de souche sauvage et de cellules mutantes, ont t dtermines avec prcision et compares. Les fonctions de balayage polyvalentes d'un instrument trappe ionique quadruple linaire hybride ont t utilises pour amliorer la dtection de protines intactes. Le mode de balayage enhanced multiply charged (EMC) a t modifi pour contenir et dtecter les ions de protines intactes situes dans la trappe ionique linaire. Ce mode de balayage nomm targeted EMC (tEMC) a permis de quadrupler le niveau de sensibilit (signal/interfrence), et quintupler la rsolution du mode de balayage conventionnel. De plus, la capacit de sparation des charges du tEMC a rduit de faon significative les effets de space charge dans la trappe ionique linaire. La rsolution suprieure du mode tEMC a permis de diffrencier plusieurs isoformes modifies, particulirement pour lhistone H3. Lanalyse des peptides dhistones trypsiques laide du mode de balayage MRM a permis le squenage et la quantification de MPT avec un haut degr de prcision. La seule MPT qui tait sous-exprime entre lhistone de souche sauvage et le mutant DOT1L fut la mthylation de lhistone H3 lysine 79(H3K79me1). Les effets de deux inhibiteurs denzymes HDAC (HDACi) sur lexpression de MPT dhistone ont t valus en utilisant la mthodologie analytique mentionne. Les histones extraites de cellules normales et cancreuses ont t exposes du Vorinostat(SAHA) ou du Entinostat (MS-275) pour une priode de 24 72 heures. Deux histones furent principalement affectes, soit H3 et H4. tonnamment, les mmes effets n'ont pas t dtects lorsque les cellules normales ont t traites avec le HDACi pour une priode de 48 72 heures. Une mthode absolue de quantification avec une courbe dtalonnage a t dveloppe pour le peptide H3K56ac. Contrairement certaines publications, nos rsultats dmontrent que cette MPT est prsente dans les cellules mammifres avec une stoechiomtrie trs basse (< 0,1%) et n'est pas surexprime de faon significative aprs le traitement au HDACi.
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Le cancer pithlial de lovaire (EOC) est le plus mortel des cancers gyncologiques. Cette maladie complexe progresse rapidement de faon difficilement dcelable aux stades prcoces. De plus, malgr une chirurgie cytorductive et des traitements de chimiothrapie le taux de survie des patientes diagnostiques aux stades avances demeurt faible. Dans le but dtudier lEOC dans un contexte ex vivo, lutilisation de modles cellulaires est indispensable. Les lignes cellulaires dEOC sont un outil pratique pour la recherche cependant, la faon dont l'expression des gnes est affecte en culture par comparaison la tumeur d'origine n'est pas encore bien lucide. Notre objectif tait donc de dvelopper et de caractriser de nouveaux modles de culture in vitro qui rflteront plus fidlement la maladie in vivo. Nous avons tout dabord utiliser des lignes cellulaires disponibles au laboratoire afin de mettre au point un modle 3D de culture in vitro dEOC. Des sphrodes ont t gnrs laide de la mthode des gouttelettes inverses, une mthode pionnire pour la culture des cellules tumorales. Nous avons ensuite procd une analyse des profils dexpression afin de comparer le modle sphrode au modle de culture en monocouche et le modle xnogreffe in vivo. Ainsi, nous avons identifi des gnes stratifiant les modles tridimensionnels, tant in vivo quin vitro, du modle 2D monocouche. Parmi les meilleurs candidats, nous avons slectionn S100A6 pour une caractrisation ultrieure. Lexpression de ce gne ft module afin dtudier limpact de son inhibition sur les paramtres de croissance des sphrodes. Linhibition de ce gne a comme effet de rduire la motilit cellulaire mais seulement au niveau du modle sphrode. Finalement, toujours dans loptique de dvelopper des modles dEOC les plus reprsentatifs de la maladie in vivo, nous avons russi dvelopper des lignes cellulaires uniques drives de patientes atteintes dEOC du type sreux, soit le plus commun des EOC. Jusque l, trs peu de lignes cellulaires provenant de ce type de cancer et de patientes nayant pas reu de chimiothrapie ont t produites. De plus, nous avons pour la premire fois caractrise des lignes dEOC de type sreux provenant la fois de lascite et de la tumeur solide de la mme patiente.
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Lacide rtinoque (AR) est le ligand des rcepteurs nuclaires RAR et RXR qui agissent comme facteurs de transcription ligand-inductibles et mdient ses effets biologiques. Il est connu que lAR a des proprits prodiffrenciatrices et antiprolifratives, notamment sur les cellules de lpithlium mammaire. Une perte de sensibilit de lAR a toutefois t mise en vidence dans plusieurs lignes cellulaires mammaires cancreuses, ce qui pourrait faciliter la croissance des tumeurs. Or jusquici cette perte de sensibilit avait t attribue des dfauts de la voie de signalisation de lAR, cause par la perte de lexpression des rcepteurs lAR dans la tumeur, bien que plusieurs lignes de cellules cancreuses y soient tout de mme trs sensibles. Peu dtudes se sont intresses au rle de la voie de synthse de lAR dans la transformation des cellules mammaires. En effet, lAR est synthtis partir de la vitamine A, ou rtinol, son prcurseur sanguin provenant de la dite. Les cellules de lpithlium mammaire normales ont la capacit de synthtiser lAR partir du rtinol. Nos rapportons pour la premire fois que lpithlium mammaire est probablement le sige de la synthse et de la signalisation de lAR. Cela est d, au moins en partie, lexpression dune enzyme de synthse de lAR, RALDH3, dans lpithlium mammaire normal. Dans cette tude, nous dmontrons que les cellules cancreuses de type luminal, qui ont sensibles lAR (et qui expriment le rcepteur des estrognes ER, catgorie qui regroupe 75 % des tumeurs diagnostiques) nont au contraire pas la capacit de sythtiser lAR, probablement en raison dune faible expression de RALDH3 dans les tumeurs, sous leffet des estrognes. Cela pourrait reprsenter un nouveau mcanisme favorisant la croissance des tumeurs luminales dont les cellules prolifrent en prsence du rtinol sanguin. RALDH1, une autre enzyme de la voie de synthse de lAR, et qui partage 70 % didentit de squence avec RALDH3, est un marqueur de tumeurs plus agressives et de la formation de mtastase. Nous montrons au contraire, que RALDH3 est un marqueur dune moindre probabilit de dvelopper des mtastases chez les patientes atteintes dune tumeur luminale. Cela suggre des rles different pour ces deux enzymes dans la glande mammaire. Nos rsultats indiquent que RALDH1 et 3 ont des proprits enzymatiques trs diffrentes, ce qui est en accord avec cette dernire hypothse. Nos donnes suggrent aussi que RALDH1 et 3 pourraient tre des marqueurs de populations distinctes de cellules dans la glande mammaire normale. Nous proposons dexploiter les diffrences entre RALDH1 et 3 afin de mettre au point des mthodes de sparation des diffrentes population de cellules de lpithlium mammaire ce qui pourrait aider comprendre le rle de la synthse dAR dans ce tissu.
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La technique de clonage par transfert nuclaire de cellules somatiques (SCNT) prsente une page importante dans les annales scientifiques, mais son application pratique demeure incertaine d son faible taux de succs. Les anomalies placentaires et de dveloppement ftal se traduisent par des pertes importantes de gestation et des mortalits nonatales. Dans un premier temps, la prsente tude a caractris les changements morphologiques des membranes ftales durant la gestation clone en les comparant des gestations contrles obtenues partir de linsmination artificielle. Les diffrentes anomalies morphologiques des placentomes telles que ldme chorioallantoique, la prsence de zones hyperchoiques et irrgulires dans la membrane amniotique et la prsence de cellules inflammatoires dgnres compromettent le dveloppement ftal normal de la gestation clone. Lexamen ultrasonographique reprsente une technique diagnostique importante pour faire le suivi dune gestation et de caractriser les changements placentaires dans le cadre dvaluation globale du bien-tre ftal. Le profil hormonal de trois strodes (progestrone (P4), estrone sulfate (E1S), et stradiol (E2)) et de la protine B spcifique de gestation (PSPB) dans le srum des vaches porteuses de clones SCNT a t dtermin et associ aux anomalies de gestations clones. Une diminution de la P4 srique au jour 80, une lvation du niveau de la concentration de la PSPB au jour 150, et une augmentation de la concentration dE2 srique durant le deuxime et troisime tiers de la gestation clone concident avec les anomalies de gestation dj reportes. Ces changements du profil hormonal associs aux anomalies phnotypiques du placenta compromettent le droulement normal de la gestation clone et gnent le dveloppement et le bien-tre ftal. Sur la base des observations faites sur le placenta de gestation clone, le mcanisme molculaire pouvant expliquer la disparition de lpithlium du placenta (linterface entre le tissue maternel et le placenta) a t tudi. Ltude a identifi des changements dans lexpression de deux protines dadhrence (E-cadhrin et -catenin) de cellules pithliales pouvant tre associes aux anomalies du placenta chez les gestations clones. Le tissu de cotyldons provenant de gestations clones et contrles a t analys par Western blot, RT-PCR quantitatif, et par immunohistochimie. Les rsultats prsentaient une diminution significative (p<0.05) de lexpression des dites protines dans les cellules trophoblastiques chez les gestations clones. Le RT-PCR quantitatif dmontrait que les gnes CCND1, CLDN1 et MSX1 cibls par la voie de signalisation de la Wnt/-catenin taient significativement sous exprims. La diminution de lexpression des protines E-cadherin et -catenin avec une rduction de lactivation de la protine -catenin durant le priode dattachement de lembryon peut potentiellement expliquer labsence totale ou partielle de lattachement des membranes ftales au tissu maternel et ventuellement, linsuffisance placentaire caractristique des gestations clones chez la vache. La caractrisation morphologique et fonctionnelle du placenta durant les gestations clones haut risque est essentielle pour valuer le statut de la gestation. Les rsultats de la prsente tude permettront de prdire le dveloppement et le bien-tre ftal de faon critique travers un protocole standardis et permettre des interventions mdicales pour amliorer le taux de succs des gestations clones chez les bovins.
