高山植物唐古特红景天（Rhodiola algida Var.tangutica）抗冻蛋白的研究

抗冻蛋白（AFP）或热滞蛋白（THP）最早是从极区鱼和昆虫中发现的一类特殊蛋白质，其共同特性是能阻止体液内冰核的形成和生长，降低体液的冰点，使其冰点低于熔点（热滞效应）。近几年的研究表明，AFP在某些植物、细菌、真菌中也存在。生长在极端低温环境中的高山植物体内是否也存在AFP，据我们掌握的资料，还未见这方面的报道。为此，我们选择了青海高原海拔4000米高山生长的唐古特红景天为实验材料，并在这种植物中发现了抗冻蛋白。主要实验结果概括如下： 1. 唐古特红景天叶片有很强的抗冻性，可耐受-26.5 ℃的冰冻温胁迫。在北京地区夏季（7月）驯化20天后，半致死温度（LT_(50)）升高为-15.5 ℃。叶片质外体蛋白抽提液有明显的热滞效应（0.2 ℃），在AFP中存在糖基。SDS-PAGE分析表明，质外体AFP为分子量在43-85KD范围内的五条多肽。 2. 光镜组织化学切片显示，在红景天叶片中存在蛋白质量丰富的细胞;电镜细胞化学研究揭示，在细胞壁外层及细胞间隙中分布着明显的经钌红特异染色的糖蛋白，这种糖蛋白因环境温度升高而减少。结合前述的实验结果，确认这种细胞壁外层及细胞间隙中的糖蛋白，即抗冻蛋白。 3. 以唐古特红景天叶片为外植体，在MS+BA_2+NAA_(0.2)固体培养基上可诱导出黄绿色，松脆愈伤组织。愈伤组织细胞在同样成分的液体培养基中培养获得成功。在悬浮培养液中可检测到分泌蛋白的存在。经SDS-PAGE分析表明，经低温锻炼或ABA诱导后，细胞分泌蛋白的多肽谱带数增加。与此相对应的是，细胞的抗冻能力也明显提高。PAS染色揭示，多肽中均含有糖基。 4. 通过测定热滞值，确信细胞分泌蛋白是具有抗冻活性的糖蛋白。

水稻抗旱性与光合特征的资源评价及其根系抗旱生理基础的研究

为了挖掘和利用野生资源抗旱和高光效的有益基因性状，本研究针对野生种的抗旱生理性状、光合作用和抗旱关系进行了测定，同时利用野生稻和栽培稻远缘杂交获得不同光合特点的后代材料进行了胁迫反应试验，并以栽培稻（陆稻和水稻）为材料研究了抗旱反应中根系的激素信号变化。旨在明确水分胁迫条件下，水稻不同野生种对干旱反应的差异及其机理，以及进一步鉴定有效的抗旱指标，为今后育种和生产实践提供理论依据和指导。主要结果如下： 1．通过对具有不同抗旱性状的四个野生种O.Granulata、O.Alta、O,Officinalis、O.Latifolia水分胁迫处理的抗旱相关生理性状的变化特点的研究表明：(1)在胁迫早期，野生种间黎明前叶片水势没有明显的差别，随着胁迫加剧，种间差异显示明显。耐旱性弱的野生种（O.Granulata、O.Latifolia）黎明前叶片水势和中午水势下降幅度大于耐旱性强的野生种( O.Alta、O.Officinalis)。这表明在一定的干旱处理程度下，黎明前叶片水势和中午水势可以反映出不同种间植株忍受干旱胁迫的能力。(2)四个野生种的植株在轻微胁迫时，膜稳定性呈现出增强的趋势，这可能与干旱胁迫的适应性相关。随着胁迫时间的延长，胁迫程度的加重，叶片膜稳定性破坏，植株叶片渗漏率增加。(3)在胁迫条件下，不同野生种表现出茎杆中糖分增加，叶片的光合酶和光合速率下降，且抗旱性弱的品种这种变化比抗旱性强的品种更加明显。这可能是由于干旱处理降低了同化物的运转和淀粉合成，导致了糖分积累。(4)在水分胁迫条件下，植株中的ABA浓度增加而IAA浓度下降，其中ABA的浓度增加与种间的抗旱性相关。抗旱性差(O.Granulata、O.Latifolia)的野生种叶片ABA浓度增加幅度高于抗旱性强的野生种（O.Alta、O.Officinalis）。Officinalis和Alta在水分胁迫下，仍比Granulata 和Latifolia具有较高的分蘖，这可能与其在胁迫下具有较高GA3浓度有关。 2．通过对20个野生种叶片膜电解质泄漏率的比较，研究其叶片细胞膜稳定性的特点表明，46℃的温度，水浴时间24小时是较适宜的条件。在适宜的处理条件下，Longistaminata、Punctata渗漏率较低，表明其具有良好的膜稳定性：O. Officinalis、O.Glumaepatula、O.Glaberrima，O.Latifolia、Meridionalis、Rufipogon (105697)、100889、Nivara (80683)、Sativa( IR-36)电解质泄漏率居中在60-80%;O.Alta、Rampur6、Azucena、Rufipogon (105599)、Bartlic、Rufipogon(104640)、105429、Minuta (101099)、HP4的渗漏值均较高，表明其膜稳定性较差，尤其是Minuta。此外，叶片光合速率和叶片膜稳定性的关系并不完全一致，在育种时应选择光合速率较高而叶片膜稳定性好的品种，O.Longistaminata因其具有较高的光合速率和较好的膜稳定性，是一个值得关注的材料。 3．研究了栽培稻（Oryza sativa）和普通野生稻（Oryza rufipogon）的杂种后代F3，即：Azucena×Rampur6杂交得到的Fi植株(25007-10)，通过自交得到其F3代植株，在水分胁迫下不同光合速率类型植株以及相关的抗旱生理特点。结果表明， (1)光合速率高的株系黎明前叶片水势下降较大，而中午叶片水势下降却较小：光合速率低的株系黎明前叶片水势下降幅度较小，而中午叶片水势下降幅度却较大，这表明水分胁迫下，植株中午叶片水势与植株的光合速率密切相关。(2)在轻微水分胁迫下（缓慢干旱0-40天），所有株系经受抗旱锻炼的植株，其叶片渗漏率均下降，膜稳定性增强;随着胁迫时间延长（胁迫后40-80天）其叶片泄漏值上升，这可能是由于：水分胁迫下通过植株的渗透调节能力，使得叶片中累积的有机溶质增加：且干旱胁迫使得叶片的质膜破坏，电解质外渗，相对电导率提高。 (3)水分胁迫下，从不同光合速率类型的植株，其光合速率的变化看：高光合速率类型的植株，在水分胁迫下光合速率的下降幅度，要大于光合速率较低类型的植株。在水分胁迫下，SHPl-2株系后代比SHPl-1株系具有较强的抗旱性，能维持较高的光合速率。 (4)在水分胁迫下，不同光合速率的株系，其气孔阻抗均增加：低光合速率的株系，气孔阻抗上升幅度大于高光合速率类型的株系，并且其气孔阻抗上升的时间要早于高光合速率的株系。 4．研究了两个陆稻品种Azucena、IRAT104和两个水稻品种IR64、Salumpikit，在干旱胁迫下根系木质部汁液中内源激素的变化。(1)干旱复水后不同时间进程中，各品种木质部汁液内源激素的变化看，IRAT104和Salumpikit木质部汁液中ABA含量迅速降低，其下降幅度较大。说明ABA作为胁迫信号，通过木质部汁液传递干旱信息;在干旱胁迫解除后，ABA的浓度亦发生相应的变化。(2)在对根系施加不同压力后，测定其木质部汁液内源激素变化，结果表明：在不同的根系压力下，不同品种间（IR64、Salumpikit、IRAT104和Azucena） 木质部汁液中GA3含量变化较大，其中两个陆稻品种IRAT104和Azucena均较高，两个水稻品种IR64和Salumpikit均较低。这表明，在不同的压力下，陆稻品种（Azucena和IRAT104）比水稻品种（IR64和Salumpikit）具有较高的GA3含量;在胁迫条件下，维持较高的GA3含量，这有利于其维持正常的生长发育。(3)在干旱胁迫及复水过程中，根据木质部汁液中ABA和GA3含量变化的结果表明，虽然Azucena和IRAT104均属于陆稻品种，但二者的抗旱性不同。(4)水稻品种木质部汁液的pH值高于陆稻品种。木质部汁液中pH在干旱胁迫下升高，复水后又降低，其可作为干旱胁迫的一个信号，它与木质部汁液中ABA联合调节植株对干旱的生理生化反应。 上述结果表明，叶片水势与水分胁迫密切相关，可作为植株抗旱性的鉴定指标;抗旱性强的品种，叶片水势下降幅度小，有利于维持较高的水势，保证植株生长发育的需要。严重干旱使得所有品种的质膜稳定性降低，电解质外渗，相对电导率提高;抗旱性强的品种的质膜伤害程度小，电导率上升幅度小，表明其质膜稳定性好，对干旱的忍耐能力强。质膜稳定性的变化实际上反映了品种的耐旱性，所以是一种综合而又比较准确的抗旱鉴定指标。对于酶和激素的测定方法，由于操作比较烦琐，且数据分析和产量比较复杂等原因，不太适合于常规的大田选育工作中。水稻的抗旱性是多种生理生化变化综合作用的结果，因此进行水稻抗旱性鉴定时，不能使用单一的生理生化指标，而应对多个指标进行综合分析，依据综合值对水稻品种的抗旱性进行评价较为科学。

红松种子休眠的研究

对影响红松种子休眠的因素进行了系统和深入的研究，主要结果如下： 1：自然成熟的种子，蕴包在雌配子体中的胚胎在形态上已发育成熟，但未充分成长。胚体的后生长与贮藏条件有关，主要取决于胚体吸水的程度，与温度关系不大，而胚体颜色由乳白色转变为乳黄色与温度关系密切，可能是生理后熟的标志。 2：夹破中种皮后，种子萌发率很低，说明红松种子坚硬中种皮的机械阻力不是导致休眠的重要因素。 3：在离体胚培养中外加ABA及种子经ABA溶液浸泡后的发芽试验证明，红松种子所含的ABA对种子萌发没有明显的抑制作用。ABA不是导致休眠的主要因素。 4：用未经预先浸种吸胀的种子直接进行各种快速催芽效果不佳，凡种皮破烂者极易霉烂，发芽率很低。 5：冷、热砂藏和流水贮藏比较试验表明，红松种子至少需要3个月以上的低温层积处理以完成其生理后熟。 6：红松种子有透气性障碍，剥除种皮或低温砂藏后，种皮对氧气的阻碍作用明显减弱。 7：未经低温砂藏的种子几乎不含还原糖，仅有少量的低聚糖和淀粉，缺少直接作用为种子萌发初始的呼吸代谢原料，低温砂藏后，脂酶及异柠檬酸裂解酶的活性增强，脂肪水解后，经乙醛酸循环生成糖，低温砂藏30天后，胚的还原糖含量从0.05%增加到0.97%。因此脂肪的代谢直接或间接关系到种子生理后熟，还原糖含量的升高是生理后熟的重要生化标志。离体胚在无外源糖份补给的情况下不能生长及干种子必须预先浸泡3～4天才能萌发，都说明了红松种子的萌发与否关键在于能源“启动”。 8：H2O2处理能提高种子发芽率表明，红松种子的萌发初期可能与PP途径运转有关。 9：光照、黑暗及光、暗交替条件下发芽试验表明，红松种子萌发与光照无关。 本文还就种子脂肪酸的组成及生态环境因子等其它可能导致红松种子休眠的原因进行探讨。 根据系列实验研究结果确认，红松种子休眠的实质在于种子后熟及其生理，生化过程，尤其是种子贮藏物质的分解、转化和利用。

濒危植物大花黄牡丹种子休眠与萌发特性研究

本文以中国极危种大花黄牡丹种子为研究材料，对其种子生物学、休眠与萌发特性进行研究，采用变温层积和激素处理解除种子休眠，并通过生物抑制物测试、胚培养、激素含量动态变化的测定，研究种子休眠的原因，从根本上解决了大花黄牡丹迁地保护过程中种子繁殖的技术难题，并初步探讨了大花黄牡丹致濒因素与种子休眠及萌发特性的关系，结果表明： 1.大花黄牡丹种子饱实度高，活力强，种皮较坚硬，但不存在吸水障碍，干燥条件下易因失水而丧失活力。迁地保护冷室中盆播18个月方可出苗，出苗率约4%;变温层积实验表明该种具有典型的下胚轴休眠和上胚轴生长抑制。 2.胚组织培养表明：带胚乳和种皮的胚不能萌发，剥除种皮和胚乳后，胚根可萌发，胚芽不生长，GA3处理上胚轴可促进生长，说明种皮和胚乳是导致大花黄牡丹种子下胚轴休眠的关键因素，而上胚轴生长抑制与胚本身关系更密切。 3.抑制物质提取实验表明：大花黄牡丹种子胚乳、种皮、胚等各部位的浸提液均存在抑制小白菜种子萌发的物质，且抑制作用依次增强，说明胚乳和胚是其下胚轴休眠的主要原因。经过暖层积（15 ℃/90 d）种子（未解除上胚轴生长抑制）的胚根、子叶、胚轴浸提液对小白菜和已解除休眠的大花黄牡丹种子的萌发均有不同程度的抑制作用，并依次减弱，说明种胚本身的抑制物质是导致生理休眠的主要原因。 4.变温层积处理和外源激素实验表明：新鲜种子采收后15 ℃暖层积3个月生根率可达85%，下胚轴休眠解除对温度要求严格，高于或低于15 ℃及变温条件均不利于下胚轴萌发;暖层积90d、根长大于6 cm种子再经过60～80 d/ 5 ℃冷层积，即可有效解除大花黄牡丹种子上胚轴的生长抑制，出芽率达80%，最终出苗率68%。不同浓度GA3及不同处理时间促进上胚轴伸长实验结果显示，GA3　400 mg/L浸种根长大于1.5 cm的种子2 h，出芽率可达100%，可以完全解除上胚轴的生长抑制作用。 5.休眠萌发过程中种子各部位内源激素含量动态变化分析结果说明，初始状态脱落酸含量高是导致大花黄牡丹种子下胚轴休眠、上胚轴生长抑制的主要原因之一，且上胚轴抑制与子叶、下胚轴和根的脱落酸含量密切相关;同时认为种子各部位初始生长素含量水平低是导致其休眠的另一个主要原因;变温层积过程中胚各部位脱落酸含量的急剧下降和生长素的迅速升高是解除休眠的关键;同时发现赤霉素在解除休眠和促进萌发过程中起着重要的促进作用，外源GA3能够有效地打破上胚轴的深度休眠。玉米素核苷在休眠与萌发进程中变化趋势与生长素和赤霉素相似，说明其对种子胚根和上胚轴的萌发和生长具有一定的促进作用。

银杏种胚脱水敏感性及其生理研究

银杏（Ginkgo. Biloba.L），又俗称白果，是起源于中国的特有珍贵树种。本实验选用银杏种子和种胚为材料，研究其脱水过程中存活率、抗氧化酶活性、ABA等生理变化，并通过外源处理方式提高种胚脱水耐性，探讨银杏种胚脱水敏感性与抗氧化系统、ABA的关系，为银杏种质资源的长期保存提供一定依据。研究结果显示： 银杏种子和离体胚对脱水均较敏感，快速脱水后完整种子临界含水量40.3%，半致死含水量约为32%左右，离体种胚分别为28.2%和22%左右，初步认为银杏属顽拗型种子。经比较银杏整粒种子、离体胚快速脱水时含水量变化情况，发现离体种胚比整粒种子更耐脱水，完整种子脱水对内部种胚是一种慢速脱水。 种胚脱水过程中，含水量高于24.5% 时，丙二醛（MDA）含量基本不变，抗氧化酶活性增加，抗氧化酶防御机制起作用；当含水量低于24.5%时，MDA含量显著增加，抗氧化酶活性大幅度降低，防御机制无法消除过氧化产物的大量积累，造成细胞损伤，种胚存活率下降。因此银杏种胚脱水过程中，特别是脱水后期，抗氧化酶活性的迅速下降和脂质过氧化作用的加强与积累是造成存活率快速丧失、对脱水敏感的主要原因之一。 银杏属典型后熟种子，脱落后种胚需经历形态和生理发育过程，这一阶段脱水耐性在后熟7个月达到最大，ABA含量也不断积累，并在最耐脱水时期达到峰值，继续后熟脱水耐性减弱，ABA含量也迅速降低，可能与银杏种胚完成后熟转而进入萌发阶段有关。在种胚快速脱水过程中，ABA含量不断降低，与存活率显著正相关。银杏种胚在后熟过程中ABA的含量较低以及脱水过程中的不断降低，可能是造成种胚不耐脱水的另一部分原因。 通过外源ABA处理种胚后可明显提高其脱水耐性。ABA处理的种胚SOD活性升高，脱水后抗氧化酶活性（GR除外）被进一步激发，从而减少脂质过氧化伤害，降低细胞膜结构的破坏。这也更进一步证实了ABA和抗氧化系统在银杏种胚脱水过程中的重要作用。

大豆种子低温吸胀相关基因的分离与蛋白变化的研究

大豆 (Glycine max (L.) Meer.)是人们日常生活中不可缺少的食品，也是一种非常重要的油质、蛋白资源。目前根据大豆种子吸胀阶段对低温敏感性的不同，可将其划分成3种生态型：低温非敏感型、低温敏感型及中间型。对于低温非敏感型的种子来讲，4℃下吸胀24小时对其发芽率影响很小，而敏感型种子萌发率不超过5%。我国属于温带大陆性气候，大豆播种后由于温度波动而造成一部分种子不能萌发，最终导致减产甚至绝产的现象普遍存在。高产是育种工作的主要目标，提高逆境胁迫的适应能力是高产的前提和基础，所以从分子角度研究种子吸胀非常必要，一方面能够挖掘新的基因资源，另一方面为今后育种工作提供必要的理论依据。 本试验以此为立足点，低温吸胀非敏感型大豆品种 (Z22)为材料，利用cDNA-AFLP方法及蛋白质技术分离与低温吸胀相关的基因及蛋白，得到结果如下： 第一，本试验成功的分离出4个受低温诱导的基因，半定量RT-PCR方法进一步验证了这4个基因在种子吸胀24小时内受低温诱导。 第二，利用RACE方法成功的得到2个完整的全长基因，在NCBI数据库中查找后发现其中1个基因为新基因，命名为SCHI基因 (SCHI：Soybean chilling-induced gene)。SCHI全长为390bp，编码分子量大约为14.2KD的蛋白；另外一个基因是已知基因，其同源序列已经在其他的物种中得到分离。由于此基因与核糖体蛋白L34高度同源，所以把把这个基因命名为SOL34 (Soybean L34)。 第三，利用半定量RT-PCR方法对基因表达模型进行分析，结果表明：SCHI在种子低温吸胀18～24小时期间诱导表达量最高，而当种子低温吸胀24小时后转入常温下，其表达量在常温下18小时左右迅速下降；ABA (100μM)、PEG (30%，10000)及NaCl (250mM)能够诱导SCHI的表达，在诱导表达量上，ABA和PEG诱导效果最明显，而NaCl能够微弱的诱导此基因表达；对不同生态型的大豆品种而言，低温吸胀过程中，SCHI在非敏感型种子中的表达量高于敏感型种子，但非敏感型和中间型之间没有差别；另外，SCHI在大豆胚轴中是诱导型表达，在叶片和根尖中则是组成型表达。SOL34的表达在萌发前24小时内被低温诱导，但在不同生态型之间没有差别。SOL34在胚轴和根尖中受低温诱导，在叶片中是组成型表达。 第四，SCHI能够在原核生物中表达出相应蛋白，诱导表达蛋白的分子量在26-29KD，大约为理论值的2倍，说明在大肠杆菌中被表达的蛋白以2聚体形式存在。另外低温试验结果表明SCHI能够提高菌落忍耐短时间-20℃低温的能力。 第五，利用双元表达载体把SCHI转入拟南芥植株，经过低温、干旱和盐胁迫后，转基因植株的成活率均高于野生型植株。超表达SOL34的拟南芥植株降低了对低温的耐性；而抑制拟南芥中L34的表达反而提高了植株对低温的抗性。 第六，本试验利用蛋白质等有关试验检测了大豆种子低温吸胀时蛋白质发生的变化。从吸胀 (4℃和22℃下24h)后的大豆胚轴中成功鉴定出上调蛋白点25个，下调蛋白点15个。其中有参与能量代谢反应 (占10%，例如柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶等)、细胞生长与分裂相关反应 (20%，例如LEA蛋白和种子成熟蛋白PM26)、胁迫反应 (10%，如乙醇脱氢酶)、种子宿命和贮藏蛋白 (20%，大豆球蛋白)等蛋白在此过程中发生了变化，暗示种子萌发前期低温吸胀过程中多种代谢发生变化。细胞生长变缓、能量代谢增强、胁迫代谢蛋白的高表达以及贮藏蛋白降解速度减慢等变化都有利于种子在吸胀过程中度过低温环境，为以后的生长作好准备。

干旱胁迫下草莓水分调控及光合特性研究

以盆栽草莓(Fragaria×ananassa)为材料研究了水分胁迫下克隆植物草莓母株和子株间的水分调控机制及其与碳同化、光系统II激发能分配的关系。实验材料分为匍匐茎连接和剪断两个大组，进行两步实验。第一步实验，对连接组和剪断组的所有母株控水，子株充分供水；4天后进入第二步实验，把连接组分为两小组，对其中一组充分供水子株开始控水，另一组保持不变。结果表明，土壤干旱引起母株叶片失水，并使其净光合速率和气孔导度显著降低。但是连接组中供水良好的子株能有效缓解缺水母株的水分胁迫。当供水良好的子株也开始受到干旱处理的时候，则会加剧与之相连母株的水分胁迫。受胁迫母株可以通过加强渗透调节能力和降低水势从相连子株获取水分。虽然土壤干旱会造成受胁迫母株叶片脱落酸（abscisic acid, ABA）含量的大幅度增加，但是与之相连子株的叶片ABA含量并没有增加；并且气孔导度与ABA变化趋势一致。因此，我们认为：(1)草莓母株和子株间的水分运输是由二者的水势差驱动的；（2）ABA不会通过匍匐茎在母株和子株间传递并影响相邻子株气孔导度；（3）在水分异质性较大情况下，生理整合可明显提高克隆系统的碳同化能力和光系统II激发能利用效率。 同时研究了水分胁迫对草莓叶片叶绿素荧光诱导动力学参数Fm的影响。结果表明，在水分胁迫初期, 活体草莓叶片失水萎缩、叶面积和叶片厚度减小，单位叶面积的叶绿素含量升高，此时叶绿素荧光动力学参数Fm上升；当水分胁迫进一步加剧，单位叶面积的叶绿素含量开始下降，但Fm没有随之下降。离体叶片测定则没有出现Fm上升这一过程，Fm随着单位叶面积叶绿素含量的下降而下降。叶片叠加实验证明，增加叶片厚度也可以使Fm上升。综上我们认为在干旱胁迫进程中，活体草莓叶片的荧光动力学参数Fm出现上升是由单位面积叶绿素含量和叶片结构的变化共同决定的。

Small but influential: the role of microRNAs on gene regulatory network and 3 ' UTR evolution

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous similar to 22 nucleotide noncoding RNAs that regulate the expression of complementary messenger RNAs (mRNAs). Thousands of miRNA genes have been found in diverse species, and many of them are highly conserved. With the mi

Antihemostatic molecules from saliva of blood-feeding arthropods

The ability to feed on vertebrate blood has evolved many times in various arthropod clades. Consequently, saliva of blood-feeding arthropods has proven to be a rich source of antihemostatic molecules. A variety of platelet aggregation inhibitors antagonize platelet responses to wound-generated signals, including ADP, thrombin, and collagen. Anticoagulants disrupt elements of both the intrinsic and extrinsic pathways. Vasodilators include nitrophorins (nitric oxide storage and transport heme proteins), a variety of peptides that mimic endogenous vasodilatory neuropeptides, and proteins that catabolize or sequester endogenous vasoconstrictors. Multiple salivary proteins may be directed against each component of hemostasis, resulting in both redundancy and in some cases cooperative interactions between antihemostatic proteins. The complexity and redundancy of saliva ensures an efficient blood meal for the arthropod, but it also provides a diverse array of novel antihemostatic molecules for the pharmacologist.

Activation mechanism of pre-phenoloxidase in lobster and shrimp

Phenoloxidase in shrimp and lobster is shown to exist in latent form which could be activated by trypsin and by an endogenous enzyme with tryptic activity. On Sephadex G-100 gel, three isoenzymes, differing in molecular weights, were isolated from naturally activated lobster shell extracts. Mechanism of activation of ptephenoloxidase involving limited proteolysis by the activating enzyme to form isoenzymes has been proposed.

Control of Arabidopsis flowering: the chill before the bloom.

The timing of the floral transition has significant consequences for reproductive success in plants. Plants gauge both environmental and endogenous signals before switching to reproductive development. Many temperate species only flower after they have experienced a prolonged period of cold, a process known as vernalization, which aligns flowering with the favourable conditions of spring. Considerable progress has been made in understanding the molecular basis of vernalization in Arabidopsis. A central player in this process is FLC, which blocks flowering by inhibiting genes required to switch the meristem from vegetative to floral development. Recent data shows that many regulators of FLC alter chromatin structure or are involved in RNA processing.

Dissecting Arabidopsis thaliana DICER function in small RNA processing, gene silencing and DNA methylation patterning.

Small RNAs have several important biological functions. MicroRNAs (miRNAs) and trans-acting small interfering RNAs (tasiRNAs) regulate mRNA stability and translation, and siRNAs cause post-transcriptional gene silencing of transposons, viruses and transgenes and are important in both the establishment and maintenance of cytosine DNA methylation. Here, we study the role of the four Arabidopsis thaliana DICER-LIKE genes (DCL1-DCL4) in these processes. Sequencing of small RNAs from a dcl2 dcl3 dcl4 triple mutant showed markedly reduced tasiRNA and siRNA production and indicated that DCL1, in addition to its role as the major enzyme for processing miRNAs, has a previously unknown role in the production of small RNAs from endogenous inverted repeats. DCL2, DCL3 and DCL4 showed functional redundancy in siRNA and tasiRNA production and in the establishment and maintenance of DNA methylation. Our studies also suggest that asymmetric DNA methylation can be maintained by pathways that do not require siRNAs.

Genome-wide high-resolution mapping and functional analysis of DNA methylation in arabidopsis.

Cytosine methylation is important for transposon silencing and epigenetic regulation of endogenous genes, although the extent to which this DNA modification functions to regulate the genome is still unknown. Here we report the first comprehensive DNA methylation map of an entire genome, at 35 base pair resolution, using the flowering plant Arabidopsis thaliana as a model. We find that pericentromeric heterochromatin, repetitive sequences, and regions producing small interfering RNAs are heavily methylated. Unexpectedly, over one-third of expressed genes contain methylation within transcribed regions, whereas only approximately 5% of genes show methylation within promoter regions. Interestingly, genes methylated in transcribed regions are highly expressed and constitutively active, whereas promoter-methylated genes show a greater degree of tissue-specific expression. Whole-genome tiling-array transcriptional profiling of DNA methyltransferase null mutants identified hundreds of genes and intergenic noncoding RNAs with altered expression levels, many of which may be epigenetically controlled by DNA methylation.

MicroRNAs and other small RNAs enriched in the Arabidopsis RNA-dependent RNA polymerase-2 mutant.

The Arabidopsis genome contains a highly complex and abundant population of small RNAs, and many of the endogenous siRNAs are dependent on RNA-Dependent RNA Polymerase 2 (RDR2) for their biogenesis. By analyzing an rdr2 loss-of-function mutant using two different parallel sequencing technologies, MPSS and 454, we characterized the complement of miRNAs expressed in Arabidopsis inflorescence to considerable depth. Nearly all known miRNAs were enriched in this mutant and we identified 13 new miRNAs, all of which were relatively low abundance and constitute new families. Trans-acting siRNAs (ta-siRNAs) were even more highly enriched. Computational and gel blot analyses suggested that the minimal number of miRNAs in Arabidopsis is approximately 155. The size profile of small RNAs in rdr2 reflected enrichment of 21-nt miRNAs and other classes of siRNAs like ta-siRNAs, and a significant reduction in 24-nt heterochromatic siRNAs. Other classes of small RNAs were found to be RDR2-independent, particularly those derived from long inverted repeats and a subset of tandem repeats. The small RNA populations in other Arabidopsis small RNA biogenesis mutants were also examined; a dcl2/3/4 triple mutant showed a similar pattern to rdr2, whereas dcl1-7 and rdr6 showed reductions in miRNAs and ta-siRNAs consistent with their activities in the biogenesis of these types of small RNAs. Deep sequencing of mutants provides a genetic approach for the dissection and characterization of diverse small RNA populations and the identification of low abundance miRNAs.

Role of RNA polymerase IV in plant small RNA metabolism.

In addition to the three RNA polymerases (RNAP I-III) shared by all eukaryotic organisms, plant genomes encode a fourth RNAP (RNAP IV) that appears to be specialized in the production of siRNAs. Available data support a model in which dsRNAs are generated by RNAP IV and RNA-dependent RNAP 2 (RDR2) and processed by DICER (DCL) enzymes into 21- to 24-nt siRNAs, which are associated with different ARGONAUTE (AGO) proteins for transcriptional or posttranscriptional gene silencing. However, it is not yet clear what fraction of genomic siRNA production is RNAP IV-dependent, and to what extent these siRNAs are preferentially processed by certain DCL(s) or associated with specific AGOs for distinct downstream functions. To address these questions on a genome-wide scale, we sequenced approximately 335,000 siRNAs from wild-type and RNAP IV mutant Arabidopsis plants by using 454 technology. The results show that RNAP IV is required for the production of >90% of all siRNAs, which are faithfully produced from a discrete set of genomic loci. Comparisons of these siRNAs with those accumulated in rdr2 and dcl2 dcl3 dcl4 and those associated with AGO1 and AGO4 provide important information regarding the processing, channeling, and functions of plant siRNAs. We also describe a class of RNAP IV-independent siRNAs produced from endogenous single-stranded hairpin RNA precursors.