Sviluppo di funzionalità di Image Targeting con apps basate su realtà aumentata

Dopo una breve introduzione sulla realtà aumentata (definizione, storia e stato dell’arte) viene effettuata un'analisi delle librerie esistenti per l’implementazione su dispositivi mobile. Considerando compatibilità con i recenti SO, frequenza degli aggiornamenti, costi per le licenze e funzionalità offerte viene scelta la libreria Vuforia, originariamente sviluppata da Qualcomm e poi acquistata da PTC inc. Si conviene poi che le apps basate su realtà aumentata creano il contenuto “aumentato” in due maniere: o tramite riconoscimento di una specifica immagine oppure tramite localizzazione GPS. Di questi due metodi descritti, il primo risulta molto più affidabile e per questo viene sviluppata una app che crea un contenuto in 3D (aumentato) riconoscendo una immagine: funzionalità di Image Targeting. Il progetto considera le seguenti varianti: l’immagine da riconoscere, chiamata “target”, può essere in un database locale oppure cloud mentre il contenuto in 3D aumentato può essere sia statico che animato. Durante la fase di implementazione vengono fornite anche alcuni nozioni di base di Computer Graphic per il rendering del modello 3D. La tesi si conclude con una panoramica di apps presenti sullo store che funzionano secondo questo principio di Image Targeting, i possibili utilizzi in ambito educativo/ludico ed i costi di realizzazione.

Tecniche di riconoscimento del volto in presenza di makeup

Il makeup, come strumento atto a modificare i tratti somatici di un individuo per aumentarne la bellezza, è largamente diffuso e socialmente accettabile al giorno d’oggi. Per la sua facile reperibilità, semplicità di utilizzo e capacità di alterare le caratteristiche principali di un volto, può diventare uno strumento pericoloso per chi volesse sottrarsi a dei controlli. In questo lavoro di tesi sono stati analizzati algoritmi presenti in letteratura che cercano di arginare gli effetti di alterazione di un viso, causati dal makeup, durante un processo di riconoscimento del volto. Inoltre è stato utilizzato un software per verificare la robustezza dei programmi commerciali in merito al problema del makeup e confrontare poi i risultati riscontrati in letteratura con quelli ottenuti dai test.

Rinforzo di pavimentazioni stradali bituminose mediante geogriglie sintetiche

Il termine “sovrastruttura stradale” identifica l’insieme di strati legati e non legati che, partendo dal piano viabile, raggiungono la sommità del rilevato o il piano di posa, nelle sezioni in trincea. Al fine di fornire agli utenti stradali sovrastrutture in grado di sviluppare prestazioni ottimali per lunghi periodi, è necessario che esse siano manutenute utilizzando i metodi via via più consoni al tipo di dissesto che si verifica. Attraverso numerose ricerche è emerso come uno dei fattori di maggiore influenza per il degrado stradale sia da attribuire all’efficacia del collegamento fra i diversi elementi di una sovrastruttura. Gli stati tensionali che si creano all’interfaccia fra due strati adiacenti, se non contrastati adeguatamente, possono provocare effetti dannosi come l’insorgere di fessurazioni ed il distacco fra gli strati. Per contrastare tali fenomeni, si è sviluppata la tecnica di inserire uno strato di rinforzo all’interno della sovrastruttura costituito da materiali metallici o sintetici anche nell’ambito delle costruzioni stradali. La ricerca effettuata in questo elaborato prevede lo studio del collegamento fra gli strati superficiali di una sovrastruttura flessibile rinforzata con geogriglie in fibra di vetro, mediante prove sperimentali condotte con apparecchiatura Leutner. Tale metodologia di prova è utilizzata per valutare la resistenza a taglio all’interfaccia fra i vari strati che compongono la pavimentazione. I campioni di prova sono stati estratti tramite carotatura da una pavimentazione esistente. Come ulteriore indagine, con gli stessi conglomerati sono stati creati nuovi campioni doppio strato mediante compattazione in pressa giratoria. Si è poi ripetuta la prova Leutner, per valutare la possibile variazione dei risultati ottenuti in precedenza e, in tale caso, studiare l’influenza della compattazione sulla resistenza a taglio presente all’interfaccia fra i due strati.

Studio e sviluppo di un Framework in ambiente Android per la realizzazione di Interfacce Utente Innovative basate su Smart Glass

La tesi tratta dell'esplorazione di una possibile interfaccia utente per Smart Glass in un contesto di utilizzo hands-free con elementi virtuali appartenenti ad un sistema di riferimento solidale all'utente e non al dispositivo, e la conseguente realizzazione di un Framework per lo sviluppo di applicazioni Andoid rispondenti a tale interfaccia e relativo test.

"Cloudy": un'applicazione di assistenza allo shopping basata sulle API di Marketcloud

In questo lavoro di tesi si è analizzato il problema di creare un sistema di assistenza allo shopping integrabile in applicazioni e-commerce web e mobile sviluppate con le tecnologie messe a disposizione da Marketcloud, ovvero un progetto che punta a fornire strumenti per la realizzazione, la manutenzione, la gestione, la diffusione e la pubblicizzazione di tali applicazioni limitando i costi e le problematiche di sviluppo a carico delle aziende che intendono fornire servizi di e-commerce. Dopo aver discusso gli aspetti principali del progetto Marketcloud, sono state analizzate le necessità delle aziende interessate allo sviluppo del sistema di assistenza in esame, così come le aspettative degli utenti (i clienti) finali, ed è stato discusso perché fosse necessario e preferibile, nel caso in esame, non utilizzare soluzioni già presenti sul mercato. Infine, è stata progettata ed implementata un’applicazione web che includesse tale sistema e che fosse immediatamente integrabile tra i servizi già sviluppati da Marketcloud, testandone risultati, prestazioni, problemi e possibili sviluppi futuri. Al termine del lavoro di implementazione, il sistema e l'applicazione garantiscono all'utente finale l'utilizzo di tre funzioni: ricerca per categoria, ricerca libera, recommendation di prodotti. Per gestire la ricerca libera, è stato implementato un sistema di filtri successivi, ed una rete neurale multi-livello dotata di un opportuno algoritmo di machine learning per poter apprendere dalle scelte degli utenti; per la recommendation di prodotti, è stato utilizzato un sistema di ranking (classificazione). Le prestazioni della rete neurale sono state oggetto di attenta analisi.

Scavi profondi in ambiente urbano: il caso della stazione Dateo di Milano

Il crescente bisogno di infrastrutture di trasporto va inevitabilmente a collidere con la penuria di spazi che caratterizzano le città metropolitane. Per questo motivo ci si orienta sempre più spesso verso soluzioni che riescono a minimizzare lo spazio urbano utilizzato per sopperire ai bisogni legati alla mobilità. Il presente lavoro di tesi è incentrato sul tema del comportamento di scavi a cielo aperto in ambiente urbano, con particolare riferimento agli spostamenti delle strutture perimetrali di sostegno e del terreno a monte, nonché alla caratterizzazione geotecnica dei terreni interessati. In contesti edificati infatti, il controllo degli spostamenti è di fondamentale importanza per ridurre il più possibile il rischio di effetti indesiderati sulle strutture preesistenti. Il lavoro è stato strutturato come segue: Il capitolo 2 è dedicato ai risultati di evidenze sperimentali raccolte da diversi ricercatori con riferimento a un gran numero di casi di studio, che hanno portato alla definizione di correlazioni empiriche tra gli spostamenti, le caratteristiche del terreno e dell'opera di sostegno. Queste costituiscono un primo riferimento per una previsione qualitativa degli spostamenti indotti dagli scavi. Nel capitolo 3 si affronta il caso studio della stazione Dateo della metropolitana M4 di Milano, particolare attenzione viene rivolta alla caratterizzazione tecnologica degli elementi fondamentali, strutturali e geotecnici, che qualificano questo tipo di opere. Nel capitolo 4 vengono sintetizzati i risultati delle campagne geognostiche, ed esposta la caratterizzazione geotecnica dei terreni dell'area in esame. Il capitolo 5 è dedicato alla descrizione di semplici metodi empirici per la stima dei massimi spostamenti indotti dalla realizzazione di scavi profondi. Nel capitolo 6 si presentano le conclusioni del lavoro svolto.

Servizi di Discovery in IoT: una Soluzione MQTT-based per Gateway Kura

Grazie alla costante evoluzione tecnologica, negli ultimi anni sempre più oggetti di vita quotidiana stanno accedendo ad Internet. Il proliferare dei dispositivi “smart” ha dato il via ad una nuova rivoluzione tecnologica: quella di Internet of Things (IoT), che sta portando nelle mani degli utenti un elevatissimo numero di informazioni in grado di offrire notevoli benefici alla vita di ogni giorno. Per poter accedere ai dati messi a disposizione risulterà necessario realizzare un servizio in grado di consentire la scoperta, l’accesso e l’interazione con i nodi della rete che si occuperanno della gestione delle informazioni. In letteratura sono già disponibili alcuni di questi meccanismi, ma essi presentano dei difetti che verrebbero ancor più accentuati dalle ridotte capacità computazionali dei terminali IoT. In questo progetto di tesi verrà presentato un servizio di discovery per gateway IoT Kura-based, pensato, grazie all’utilizzo del protocollo di messaggistica MQTT, per operare con terminali dalle performance limitate ed in situazioni di scarsa connettività. Il servizio realizzato prevede che degli smartphone Android richiedano a tutti i gateway in una determinata località i parametri per entrare nel loro network. La richiesta verrà inviata mediante un messaggio MQTT pubblicato in un topic location-specific su un broker remoto. I gateway che riceveranno il messaggio, se interessati alle caratteristiche del client, gli risponderanno comunicando i dati di accesso al network in modo che il dispositivo possa auto-configurarsi per accedervi. Ad accesso avvenuto client e gateway comunicheranno in modo diretto attraverso un broker locale. In fase di testing si valuteranno le performance del servizio analizzando i tempi di risposta e l’utilizzo di risorse lato gateway, e l’assorbimento di potenza lato client.

Sviluppo di metodologie per l'interazione tra un sistema di ausilio a ipovedenti e dispositivi iOS

L’oggetto di questa tesi riguarda la predisposizione un sistema di ausilio per non vedenti, basato su visione 3D, alla comunicazione in rete. Si è quindi sviluppata un’applicazione per dispositivi iOS che sia in grado di ricevere e interpretare i dati inviati da tale sistema. In particolare, questo lavoro si inserisce in un lavoro più ampio che ha l’obiettivo di fornire diverse modalità di interfacciamento con il sistema di rilevazione ostacoli per utenti ipovedenti e di sostituire le attuali tecnologie cablate con tecnologie wireless. Il seguente lavoro descrive i problemi emersi e le soluzioni adottate durante lo sviluppo del sistema, al fine di fornire un’adeguata documentazione a coloro che avranno intenzione di proseguire nell’ampliamento delle funzioni realizzabili.

Analisi del flusso in acque sotterranee e principi di progettazione di barriere idrauliche

Le acque sotterranee rappresentano una risorsa fondamentale di acqua potabile; per questo motivo esse devono essere preservate, controllate, e se necessario, trattate e decontaminate. Nella presente tesi è stato analizzato, dal punto di vista idraulico, uno dei metodi di risanamento delle acque sotterranee più efficaci ed ampiamente utilizzati: il sistema Pump & Treat. Esso consiste nella costruzione di una barriera idraulica formata da pozzi che pompano acqua dal sottosuolo per consentirne il trattamento e la conseguente reimmissione nel corpo idrico. In questo contesto, sono stati approfonditi i principali criteri di progettazione ed è stato sviluppato un esempio applicativo utilizzando il codice numerico MODFLOW per la risoluzione delle equazioni di flusso e trasporto in acque sotterranee.

Strumenti di monitoraggio di dati web non strutturati

Negli ultimi anni i documenti web hanno attratto molta attenzione, poiché vengono visti come un nuovo mezzo che porta quello che sono le esperienze ed opinioni di un individuo da una parte all'altra del mondo, raggiungendo quindi persone che mai si incontreranno. Ed è proprio con la proliferazione del Web 2.0 che l’attenzione è stata incentrata sul contenuto generato dagli utenti della rete, i quali hanno a disposizione diverse piattaforme sulle quali condividere i loro pensieri, opinioni o andare a cercarne di altrui, magari per valutare l’acquisto di uno smartphone piuttosto che un altro o se valutare l’opzione di cambiare operatore telefonico, ponderando quali potrebbero essere gli svantaggi o i vantaggi che otterrebbe modificando la sia situazione attuale. Questa grande disponibilità di informazioni è molto preziosa per i singoli individui e le organizzazioni, che devono però scontrarsi con la grande difficoltà di trovare le fonti di tali opinioni, estrapolarle ed esprimerle in un formato standard. Queste operazioni risulterebbero quasi impossibili da eseguire a mano, per questo è nato il bisogno di automatizzare tali procedimenti, e la Sentiment Analysis è la risposta a questi bisogni. Sentiment analysis (o Opinion Mining, come è chiamata a volte) è uno dei tanti campi di studio computazionali che affronta il tema dell’elaborazione del linguaggio naturale orientato all'estrapolazione delle opinioni. Negli ultimi anni si è rilevato essere uno dei nuovi campi di tendenza nel settore dei social media, con una serie di applicazioni nel campo economico, politico e sociale. Questa tesi ha come obiettivo quello di fornire uno sguardo su quello che è lo stato di questo campo di studio, con presentazione di metodi e tecniche e di applicazioni di esse in alcuni studi eseguiti in questi anni.

Mobile CSCW e sincronizzazione dati per il soccorso in emergenza: un caso di studio

L'obiettivo principale di questa tesi è quello di approfondire il tema della comunicazione e sincronizzazione dati nel contesto di uno specifico caso di studio di sistema informatico a supporto del lavoro cooperativo per il soccorso in emergenza: a partire dai requisiti del caso applicativo, secondo cui agli operatori deve essere possibile utilizzare il sistema anche a fronte di disconnessioni dei propri dispositivi mobili, emerge infatti la necessità di un middleware a cui il livello applicativo demandi le funzionalità di sincronizzare le informazioni prodotte durante le operazioni, in modo da promuovere uno scambio di informazioni che migliori e supporti l'azione del singolo e conseguentemente del team. Quindi, dopo aver introdotto la tematica ed analizzato il caso di studio da affrontare, viene descritta l'esplorazione del panorama tecnologico volta alla ricerca di strumenti o approcci che possano mitigare la complessità nella realizzazione di questa funzionalità. Nel panorama tecnologico considerato, comprendente framework per servizi web, MOM e database, uno strumento di particolare interesse è stato individuato in CouchDB, un database NoSQL, grazie alle sue funzionalità di replica e sincronizzazione e alla presenza di una libreria per lo sviluppo su dispositivi mobili: su di esso è stata effettuata una breve fase di sperimentazione volta a saggiarne in maniera più concreta le potenzialità anche in relazione alla valutazione di fattibilità per il caso applicativo considerato.

Strategie di offerta di servizi streaming in Internet: Studio di caso "Amazon-Twitch"

Internet è la rete globale a cui si può avere accesso in modo estremamente facile, consentendo praticamente a chiunque di inserire i propri contenuti in tempi rapidi, a costi quasi nulli e senza limitazioni geografiche. Il progresso tecnologico e la maggiore disponibilità della banda larga, uniti alle nuove modalità di fruizione ed ai nuovi format, hanno portato ben il 70% degli web users a vedere video online regolarmente. La popolarità dei servizi di streaming video è cresciuta rapidamente, tanto da registrare dei dati di traffico impressionanti negli ultimi due anni. Il campo applicativo della tesi è Twitch, il più celebre servizio di streaming che è riuscito ad imporsi come quarto sito negli Stati Uniti per traffico Internet: un dato sorprendente se pensiamo che si occupa solo di videogiochi. Il fenomeno Twitch è destinato a durare, lo dimostrano i 970 milioni di dollari investiti da Amazon nel 2014 per acquistare la piattaforma, diventata così una sussidiaria di Amazon. L'obiettivo della tesi è stato lo studio di mercato della piattaforma, attraverso il recupero e l'analisi delle informazioni reperibili in letteratura, nonché attraverso estrapolazione di dati originari mediante le API del sito. Si è proceduto all’analisi delle caratteristiche del mercato servito, in termini di segmentazione effettiva, rivolta alla messa in evidenza della possibile dipendenza dai comportamenti dei player, con particolare attenzione alla possibile vulnerabilità.

Design di interfacce e usabilità del Web in ambiente mobile: la Programmazione della Cineteca di Bologna

Il presente progetto è stato svolto in collaborazione con la Cineteca di Bologna e verte sulla riprogettazione dell'odierna interfaccia Web, in funzione della sua visualizzazione mobile non considerata nella progettazione del 2008, in particolare nella sua parte che concerne la programmazione degli spettacoli in ambito cinematografico. Raccolti i suggerimenti degli utenti e approfondite le richieste della Cineteca, affrontando con i responsabili IT della Fondazione le criticità emerse, la ristrutturazione delle sezioni presenti e l'aggiunta di nuove funzionalità, si è impostato il lavoro come segue. In primis, si è eseguita una ricerca, avvalendosi di fonti autorevoli nella letteratura di settore, con un focus incentrato sull’Usabilità. Questa ha portato a presentare una panoramica di tale tematica, per concentrarsi poi sulle peculiarità dei dispositivi mobili, toccando vari aspetti: da un approfondimento dalle caratteristiche dell’uso fino una collocazione anche storica alla realtà mobile. Successivamente, si è proseguito analizzando nel dettaglio tutti i vari elementi da includere, sia dal punto di vista concettuale che posizionale, in riferimento a varie soluzioni proposte dalla letteratura di settore. Ciò preferendo i modelli principalmente utilizzati, dunque maggiormente familiari agli utenti, e i metodi normalizzati per la risoluzione di singole problematiche frequenti nella presentazione delle informazioni. Il risultato è un progetto di interfaccia più vicina all'esperienza quotidiana dell'utente, concretizzatosi con la realizzazione di un prototipo per mezzo di applicativi che simulano un device e mostrano anteprime grafiche dell'interfaccia medesima, nella fattispecie della natura e della collocazione dei singoli componenti sullo schermo. Il lavoro, pertanto, si pone l’obiettivo di rispondere a comuni e debite aspettative dell'utenza in fatto di comodità, efficienza e immediatezza di consultazione della Programmazione anche in mobilità.

App Ibrida per l’apprendimento della matematica attraverso esercizi di logica

Nell’ambito di questo lavoro di tesi è stata progettata e realizzata un'applicazione di edutainment, pensata per essere fruita attraverso dispositivi mobili, da parte di studenti delle scuole medie, con l’obiettivo di esercitare e migliorare le capacità logiche e di problem solving. La tesi descrive il contesto educativo e scolastico in relazione alla presenza delle tecnologie dell'informazione e della comunicazione, ed infine mostra come una componente di intrattenimento possa essere utile nei processi di apprendimento. Lo sviluppo dell’applicazione è basato sulla progettazione di applicazioni ibride, usando come framework di sviluppo Apache Cordova, quindi attraverso tecnologie web-based, con un’architettura client-server, in cui la parte client gestisce l’interfaccia grafica e le interazioni logiche mentre la parte server viene sfruttata esclusivamente come contenitore di informazioni.

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.