松属植物rRNA基因的变异模式及其进化生物学意义

被子植物的rRNA基因已经得到深入研究。二倍体被子植物一般拥有1-4对18S-5.8S-26S rDNA位点和1-2对5S rDNA位点。作为特殊的多基因家族成员，rDNA会受均一化力 (homogenizing forces) 的作用，通过基因转换、不等交换等机制，形成基因的致同进化 (concerted evolution)。长期以来，我们一直认为动植物rDNA致同进化水平很高，各种拷贝的序列几乎完全一致，因此可以直接应用PCR测序的方法进行分子系统学研究。但是在裸子植物中由于研究资料的匮乏，使我们对裸子植物rDNA的变异模式了解甚少。松属植物作为裸子植物的最大类群，它的rDNA变异和进化有何特点、与被子植物是否相同，是这个重要类群的进化研究中目前尚未解决的问题。本文的研究内容从三个方面进行： (1)rDNA的染色体定位 目前，松属的18S-5.8S-26S rDNA的染色体定位研究只包括5种植物，其中的3种同时涉及到5S rDNA定位。这些研究结果表明，不同种存在相异的rDNA位点数目，甚至不同的个体的rDNA位点均有变化。其共同点是，18S-5.8S-26S rDNA位点数平均较被子植物多，5S rDNA除Pinus radiata外，在其它种里则与被子植物相似。这种现象是松属或裸子植物的共同特征，亦或是特例呢？有限的研究限制了对裸子植物rDNA的了解。本研究的目的之一就是研究松属植物rDNA的染色体空间分布特征，希望借此了解松属植物间的关系，比较裸子植物和被子植物rDNA在染色体组水平的差异。 (2)5S rDNA的分子进化 5S rDNA的序列水平的进化研究在松属中尚属空白。5S rDNA在染色体数目上没有显示裸子植物与被子植物的差异，是否意味着松属乃至裸子植物的5S rDNA也同被子植物一样——致同进化完全，序列高度一致呢？利用克隆测序方法对松属植物5S rDNA的研究无疑是有开创性的工作，可以探讨裸子植物的5S rDNA的进化机制和种间关系。 (3)杂种基因组研究 杂交物种的起源演化是当前生物学研究的热点，通过杂种基因组的研究，可以了解杂种的的基因组构成，组织方式和进化历史，探讨杂交事件对成种过程的影响及意义。这项研究涉及到高山松、云南松和油松。之所以采用这三种植物，因为等位酶、cpDNA和mtDNA证据证明高山松为油松和云南松的自然杂交种。但这些证据不足以反映杂种核基因组的重组特征和构成及其进化规律。我们利用rDNA-FISH、5S rDNA和基因组原位杂交分析三种松树间的基因组关系，为揭示高山松的进化机制和历史提供新的依据。 本项研究得到以下结果： 一. rDNA荧光原位杂交 (FISH) 通过对华山松和白皮松两种单维管束亚属植物及油松、云南松、高山松、马尾松和南亚松等五种双维管束亚属植物的18S rDNA与5S rDNA的荧光原位杂交，结果表明： ⑴ 裸子植物的18S rDNA位点数目明显多于二倍体被子植物。其中主要位点数目，油松有7对，高山松5对，云南松8对，马尾松10对，南亚松6对，白皮松3对，华山松10对，平均在7对;另外，部分松树还存在弱位点。无论强弱位点都有部分存在于染色体的着丝粒区，除了赤松 (Pinus densiflora)，在其它松科植物中并没有发现这种现象。究竟是基因转移的结果或该位点是18S rDNA的原始起源位置还有待确证。 ⑵ 5S rDNA位点相对变异较小，与被子植物相当。除了华山松5S rDNA有4对位点，马尾松只有1对位点外，其它松树的5S rDNA位点数目均为2对，并且在双维管束亚属植物中有一对属于弱位点。 ⑶ 两种rDNA存在不同连锁模式。双维管束亚属植物中，5S与18S rDNA连锁在同一染色体的同一臂或两条臂上。在同一染色体臂时，18S rDNA在臂的远端。单维管束亚属植物的5S与18S rDNA或连锁于同一染色体的同一臂上，或分别处于不同染色体。前一情况，5S rDNA位于臂的远端。据此可以说明两个亚属的rDNA结构在染色体组水平的很大分化。 ⑷ 松属植物的关系及高山松核型特征。由于5S与18S rDNA连锁关系的不同，可以将单维管束亚属和双维管束亚属分开。各亚属的不同物种可以依据杂交位点的多少、位置、信号强弱构成的核型图加以区分，并且构成一定的系统关系。杂交起源的高山松在染色体组上，表现出对油松和云南松两亲本不同染色体特征的分别继承与重组，并产生独有的特征。其II同源染色体之一18S rDNA位点的缺失，可能是染色体重组的痕迹。 二. 5S rDNA的序列变异与分子进化 利用分子克隆和DNA测序分析了油松、云南松、马尾松、白皮松和不同遗传背景的高山松居群的5S rRNA基因序列变异及基因进化规律，得到以下主要结果： ⑴ 5S rDNA的结构特征。双维管束亚属植物长度在658-728 bp，白皮松则为499-521 bp。长度差异体现在基因间隔区，而基因区极端保守，基本为120 bp。基因转录区内部存在着转录控制区，决定了5S rRNA的转录起始与转录效率。5S rRNA基因能够折叠成正常的二级结构，其中，相对于干区来说，环区要保守，但环E却表现出异乎寻常的变异，转换/颠换比值高达7.1，这种突变可能是假基因的产物。基因间隔区存在一定的保守单元，其中一些与转录的起始和终止调控相关，有些是裸子植物未知功能的特异保守区。 ⑵ 松属植物5S rDNA存在着基因组内与种间的异质性。基因组内的各个克隆中有超过80%的特异的，彼此不相同。整个5S rDNA分化距离为0.042 - 0.051，其中，间隔区的分化比基因区高，其速度约是基因区的3-7倍。比较种间5S rDNA序列发现：在122个克隆中，基因区只有50个特异的序列。基因组间的序列变异度与基因组内 (个体内) 没有明显差别。白皮松的间隔区与双维管束亚属松树的5S rDNA间隔区差异极大，几乎不能排序，而四种双维管束亚属植物的5S rDNA间隔区种间种内差异不大。 ⑶ 松属植物5S rDNA进化。PAUP分析建立的5S rRNA基因树显示，5S rRNA基因在基因组内是多系的 (polyphyletic)，表明成种事件以前，祖先种就已经存在序列的分化。观测到的5S rRNA基因序列变异状况，并非完全是致同进化或独立进化的单一因素造成的，而是二者的相互作用的结果。致同进化确实存在，只是速度较慢而已。 ⑷ 高山松5S rDNA 组成。高山松拥有最高的基因组内的序列多样性，高山松的5S rDNA拷贝既有亲本类型，又有重组类型，并且不同地理及遗传来源的高山松显示一定的分化趋势，有更多的拷贝来自母系亲本。 三. 基因组原位杂交 以油松和云南松总DNA作为探针，相互进行基因组原位杂交，结果显示云南松和油松的染色体组可以完全被对方探针标记，在现有基因组原位杂交的分辨率下不能将两个基因组区分开。说明云南松和油松基因组之间存在高比例的同源序列，两种松树的基因组组成十分相似。利用油松和云南松总DNA作为探针，对高山松的染色体组进行双探针基因组原位杂交。结果表明，高山松全部基因组都能与两亲本探针完全杂交，说明三者间有着异乎寻常的亲缘关系。但在PH失调影响下，高山松只有部分基因组被杂交，并且两种探针的杂交信号有轻微差异。这可能是高度重复序列优先杂交的结果。这些情况表明，高山松虽然在基因组构成上与两个亲本基本一致，但基因在染色体组的空间排布上是存在差异的，这一点可以从rDNA-FISH中证明。

绣球族的系统学研究

绣球科绣球族包含9属：草绣球属、叉叶蓝属、Broussaisia、常山属、绣球属、蛛网萼属、赤壁木属、冠盖藤属和钻地风属。到目前为止，绣球族内的属间关系还不清楚，族内的系统发育关系还有争论。本研究的目的是在前人研究的基础上，进一步发现新的系统学性状，为绣球族乃至绣球科补充新的证据;并综合多学科的研究结果进行分析，探讨绣球族的系统学关系。 本文研究了绣球族的外部形态学、花发育形态学、解剖学、分子系统学和分支系统学。 主要内容包括： 1. 形态学 通过标本室研究和野外观察，对绣球族植物的形态分化进行了分析。发现习性、地上茎的生存期限、花冠卷叠式、花瓣联合与否、花柱的联合程度、雄蕊的数目及排列具有系统学价值;放射花和果实是很好的分类性状，但并非可靠的系统学性状。 2. 花发育形态学 在扫描电子显微镜下，研究了绣球族常山属、绣球属、冠盖藤属、蛛网萼属共4种植物花器官发生和发育的全过程。发现它们的花萼均为螺旋式相继发生，花瓣的发生近乎同时。冠盖藤、马桑绣球及常山具两轮雄蕊，第一轮雄蕊发生于花瓣内轮正对萼片中部的位置，随后第二轮雄蕊发生于正对花瓣中部的位置。在第一轮雄蕊略靠内的位置形成第二轮雄蕊的时候，多数情况下，相邻的对萼雄蕊之间只形成1个对瓣雄蕊，但有时却形成2个对瓣雄蕊，使雄蕊群的数目略多于花被的数目。对萼雄蕊与对瓣雄蕊的分化方式基本一致，但它们在花芽中空间取向不同。 蛛网萼雄蕊数目极多，雄蕊群的发生式样较为独特，并不始于对萼三联体。最早的雄蕊于杯状体近基部发生，之后雄蕊的发生大致沿杯状体壁向上，具离心趋势。在雄蕊发生过程中杯状体继续伸长，为众多雄蕊的发生提供了空间。蛛网萼雌蕊的发生明显早于雄蕊，其它3种植物雌蕊的发生晚于雄蕊。4种植物的雌蕊在发生上较为相似，发育却不同。在常山、马桑绣球和蛛网萼中，花柱从开始到发育成熟始终分离，柱头在每个花柱的顶端形成;而冠盖藤属的花柱裂片从开始就是联合的，最终形成单一的花柱，柱头从合生花柱顶端远轴面分化形成。 3. 解剖学 在光学显微镜和扫描电子显微镜下，观察了绣球族9属42种1变种及近缘8属11种共53种1变种的叶表皮特征。发现气孔的分布、气孔器的类型、表皮细胞的形状及其垂周壁式样、毛被等具有一定的系统学意义和分类价值。绣球族各属的气孔仅散生于下表皮;而在绣球族的几个近缘属中，上下表皮均有气孔分布。气孔器在多数类群中为无规则型，仅常山属和绣球属离瓣组的成员为平列型。气孔多为椭圆形，稀近圆形;外拱盖表面通常光滑，仅在钻地风属中具条状纹饰;外拱盖内缘具环状加厚，近全缘、不规则波状或浅波状。表皮细胞在多数种中为不规则形，垂周壁波状、浅波状或深波状;在有些种中为（近）多边形，垂周壁平直或弓形。叶表皮细胞形状、垂周壁式样在绣球族寡种属属级水平比较稳定，但在绣球属中变化较大。表皮角质膜纹饰形态多样，有网纹、粗网纹、浅波状条纹、波状条纹、条纹、粗条纹及丝状条纹;在钻地风属及绣球属的少数种中，角质膜条纹有时汇集呈球形或玫瑰型。表皮毛状附属物有单细胞2分枝毛（黄山梅属）、多细胞星状毛（星毛冠盖藤）、单细胞星状毛（溲疏属）和单细胞不分枝毛四种。对钻地风属所有种的观察结果表明，仅在椭圆钻地风的下表皮细胞中央观察到乳突状结构，而在白背钻地风和圆叶钻地风中并未观察到前人描述的附属物。 4. 叶绿体DNA trnL-F序列的分析 首次对绣球族9属23种及近缘类群3属3种的trnL-F序列进行了测定。序列长度在860 bp~970 bp范围内变化。在以山梅花属、溲疏属和黄山梅属为外类群，基于trnL-F序列构建的系统树上，绣球族作为一个单系群得到很高的支持率。绣球属的种出现在不同的分支上，表明该属不是一个单系群。绣球族被分为两大支：第一支由绣球属离瓣组的中国绣球、绣球、以及常山和Broussaisia arguta组成;第二支由绣球属另外的9个种与草绣球属、叉叶蓝属、蛛网萼属、赤壁木属、冠盖藤属以及钻地风属组成。在第二支中，下列类群的近缘关系得到支持：① 草绣球与叉叶蓝属;② 绣球属挂苦子组的东陵绣球、圆锥绣球和挂苦绣球。③ 钻地风属、赤壁木属和冠盖藤属;④ 蜡莲绣球、莼兰绣球、马桑绣球、粗枝绣球。 5. 分支分析 以山梅花属为外类群，基于形态、解剖、花发育、孢粉等32个性状（或性状状态）对绣球族9属的系统发育关系进行了分支分析。结果表明：草绣球属和叉叶蓝属为基出类群，这两个属有多个共同特征;绣球族其余的成员聚成一支，该支又有5个分支。其中蛛网萼属和绣球属冠盖组各为单独的分支，它们有多个自衍征，可能有各自独立的演化线;绣球属离瓣组与常山属聚成一分支，二者的密切关系得到解剖学证据的支持;绣球属绣球组和星毛组聚成一分支，这两个组包含了绣球属的多数种类;钻地风属、赤壁木属、冠盖藤属、Broussaisia和绣球属挂苦子组聚成一分支。其中钻地风属、赤壁木属与冠盖藤属具多个近裔衍征，表明它们是绣球族的晚出类群。 通过对绣球族植物外部形态、花器官发生、叶表皮微形态特征、叶绿体DNA trnL-F区的研究以及基于形态性状的分支分析，并综合已有的研究结果，我们认为： 1. 绣球族是一个单系群;绣球属不是一个单系群。 2. 在绣球族中，草绣球属和叉叶蓝属关系密切，它们可能是绣球族其余成员的姐妹群。 3. 绣球组和星毛组可能是绣球属的核心成员;离瓣组和常山属关系密切;冠盖组有单独的演化线。 4. 赤壁木属、冠盖藤属和钻地风属为单系群，它们在绣球族处于较高的演化位置。 5. 绣球属需重新界定。

兰科槽舌兰属的系统学研究

槽舌兰属为兰科树兰亚科万代兰族指甲兰亚族植物，大部分种类为中国特有种，部分种类分布到越南、泰国、缅甸等国家和地区。长期以来，本属植物由于与近缘属间的界线模糊不清，而属内性状变异大，是兰科植物系统学研究的疑难属之一。本文通过对槽舌兰属及部分近缘属植物的形态地理学、细胞学、传粉生物学、分子系统学等研究，重新界定了槽舌兰属，确认该属植物的种类，提出一个新的属下分类系统，讨论了槽舌兰属属内和近缘属间的系统学关系，同时对槽舌兰属高山组植物的演化进行了探讨。 1．槽舌兰属及近缘属形态学性状 　　我们通过标本研究和野外观察，对槽舌兰属和近缘属植物的形态学性状及其变异式样进行了详细比较分析，重新评价各性状的分类学价值，认为蕊喙、蕊柱翅、花粉块类型等对于槽舌兰属与近缘属的划分具有重要意义;胼胝体类型、粘盘柄形状、距的类型、唇瓣中裂片边缘状况等对属下分类具有重要的意义;而中裂片、侧裂片和距的形态对槽舌兰属的种的划分具有重要的意义。传统上作为划分种依据的胼胝体的数目、花序上花的数目、茎的长短等在种内变异较大，不宜用作种划分的依据。 2. 槽舌兰属植物核型研究 　　我们报道了8种槽舌兰属植物的体细胞的染色体数目，其中6种为首次报道，并对其中7个种的核型进行初步分析。目前已进行研究的槽舌兰属植物的染色体数为2n=38，体细胞分裂中期的染色体长小于2 um, 染色体类型以中部和近中部着丝粒染色体为主，部分染色体成点状。槽舌兰属不同染色体数目相等、染色体形态和大小相似，从一个方面反映了槽舌兰属植物是一个单系类群。 3. 滇西槽舌兰（Holcoglossum rupestre）的传粉生物学研究 　　我们选择滇西槽舌兰的进行传粉生物学研究以探讨本属植物系统学和进化，发现滇西槽舌兰的传粉系统为兰科植物中少见的甲虫专化传粉系统，而且滇西槽舌兰的传粉系统处于一种不稳定的状态。弯腿金龟（Hybovalus bioculatus）是滇西槽舌兰唯一的传粉者，以两个不同的部位携带花粉团，即前腿和臀部，并存在着两种不同的传粉机制。滇西槽舌兰这种不稳定的传粉系统似乎表明该系统可能正处于转变阶段。繁殖系统的实验表明自然状况下滇西槽舌兰结实率由传粉率决定，而自然状况下低的结实率可能由两方面的原因导致：很低的传粉效率和有效的防止自花传粉机制。 4. 槽舌兰属植物的分子系统学研究 　　我们对9种槽舌兰属植物和2种万代兰属植物的叶绿体基因组trnL-F序列进行了测定，并从基因库下载了14种万代兰族植物和2种用作外类群的美洲附生兰亚科植物的trnL-F序列。测序结果发现槽舌兰属的trnL-F序列存在着很大的差异：H. lingulatum的trnL-F存在大片段的缺失，而H. kimballianum的trnL-F存在许多小片段的插入。分子系统学分析表明槽舌兰属为一单系类群，支持将Vanda subulifolia和V. amesiana转置入槽舌兰属中，强烈支持由H. sinicum、H. flavescens、H. rupestre和 H. weixiense构成槽舌兰属属内分支。 5．槽舌兰属的分类学修订 　　在广泛查阅国内外馆藏标本和开展多次野外调查的基础上，并结合细胞学和分子系统学研究结果，我们重新界定了槽舌兰属。该属植物的主要特征：茎短;叶肉质，细长半圆柱形，部分种叶略扁而成“V”形，其近轴面具一纵槽，先端渐尖，不裂;总状花序侧生，花疏生;花苞片比花梗和子房短;侧萼片或多或少呈镰形;花瓣通常具爪，与中萼片相似;唇瓣3裂;侧裂片直立;中裂片较大，基部常有附属物;蕊柱粗短，具翅，无蕊柱足或具很短的足;蕊喙2裂;花粉团蜡质，2个，球形，具裂隙。确定槽舌兰属目前包括11种（包括2个新种）：H. subulifolium、H. amesianum、H. kimballianum、H. lingulatum、H. omeiense、H. quasipinifolium、H. sinicum、H. rupestre、H. flavescens、H. wangii和H. weixiense。 H. tangii和Vanda saprophytica被分别处理为H. lingulatum与H. kimballianum的异名，而H. tsii的分类学地位尚有待进一步研究。同时在我们研究的基础上，提出槽舌兰属一个新属下的分类系统： 槽舌兰属 Holcoglossum 　　短距亚属 Holcoglossum subgen. Amesianum 　　H. subulifolium，H. amesianum; 槽舌兰亚属Holcoglossum subgen. Holcoglossum 　槽舌兰组Holcoglossum sect. Holcoglossum 　　H. kimballianum，H. lingulatum，H. wangii，H. omeiense，H. quasipinfolium; 高山组Holcoglossum sect. Sinicum 　H. sinicum，H. rupestre，H. flavescens，H. weixiense。 6．槽舌兰属属内和近缘属间系统学关系探讨 　　通过广泛的形态地理研究并结合传粉生物学和分子系统学研究结果，我们对槽舌兰属属内和属间关系进行的探讨。槽舌兰属短距亚属与万代兰属和指甲兰属比较接近，是槽舌兰属中比较原始的类群; 槽舌兰组植物的分布中心介于短距亚属和高山组分布中心之间，而该组植物的许多性状也表现出过渡性质。在‘Aerides-Vanda alliance’中，我们认为钻喙兰属和万代兰属是该类群中比较原始的属，而鸟舌兰属（Ascocentrum）可能是介于指甲兰属和举喙兰属（Seidenfadenia）之间，支持传统的观点认为Papilionanthe位于Vanda和Aerides之间但更接近于Aerides，但同时我们认为举喙兰属可能是‘Aerides-Vanda alliance’中最为特化的类群。 7． 高山组所属物种形成探讨 　　槽舌兰属高山组的四个种均为中国特有植物，主要分布云南西北部地区，其中H. weixiense、 H. rupestre、H. sinicum3个种只局限分布在云南的西北部地区。尽管高山组各个种比较相似，但形态上已经分化，生境也不同而且存在着对应关系。细胞学实验结果发现槽舌兰属高山组的四种植物均为二倍体（2n=38），与槽舌兰属的其他种类一致，这表明该组植物在横断山区的分化时染色体的数目并没有变化，高山组植物的三种横断地区特有植物可能为裂生特有。高山组4个种的1300bp的trnL-F总共只有10个碱基的差异，在trnL-F分支图中，高山组分支作为单系类群得到强有力的支持（BP=94%）。高山组植物trnL-F序列微小的差别反映了该组植物可能是在近期通过快速物种形成进行分化的。这些资料说明槽舌兰属高山组植物是近期通过适应辐射进行分化以适应不同生境，而且可能是生境和传粉系统共同驱动下形成的。

羽叶铁线莲杂交起源的初步研究

通过野外观察，发现羽叶铁线莲Clematis pinnata Maxim.在形态上相似于短尾铁线莲C. brevicaudata DC.及大叶铁线莲C. heracleifolia DC.，推测羽叶铁线莲为后二者杂交产生。本文从形态学、解剖学、孢粉学、分子生物学等方面寻找证据，为这一推测寻找证据： 1． 形态学 通过野外观察结合标本馆工作，对这三个种的外部形态性状及其变异进行全面的分析，以探讨羽叶铁线莲C. pinnata在形态上与二假定亲本的异同及其产生原因。发现花、叶、习性等性状，在二假定亲本种种内稳定，但种间差异很大，在羽叶铁线莲中，性状变异的幅度正是处于二假定亲本差异之间。 2．解剖学 在光学显微镜及扫描电镜下，观察了这三种铁线莲的叶表皮特征，结果表明：叶片上表皮均不具有气孔器，下表皮气孔器类型均为无规则型;表皮细胞多为不规则形，仅在短尾铁线莲C. brevicaudata的上表皮中为近多边形;上表皮角质膜均具细条纹，下表皮角质膜均具环状或放射状波状嵴。 在扫描电镜下对瘦果形态及宿存花柱进行观察，结果表明：瘦果均密被长柔毛，并有蜡质颗粒状附属物。 在三个种植物之间叶表皮和瘦果的特征均无明显差别，对解释所讨论的问题意义不大。 3．孢粉学 在扫描电镜下对这三种铁线莲的花粉粒进行观察，结果表明：短尾铁线莲的花粉粒具三沟;大叶铁线莲的杂性株中花粉高度败育，说明其杂性株其实即为雌株;羽叶铁线莲的花粉也高度败育，但本种均为两性株，支持本种为杂交种的推测。 4．等位酶研究 利用莽草酸脱氢酶SKD和苹果酸脱氢酶MDH对采自3个居群的羽叶铁线莲大叶铁线莲和短尾铁线莲进行等位酶试验，结果显示在短尾铁线莲与大叶铁线莲中分别出现种内一致的谱带，而羽叶铁线莲则显示出二者杂合的带型。这一结果有力的支持了羽叶铁线莲是由短尾铁线莲和大叶铁线莲杂交产生的推测。 5．居群遗传结构分析 利用随机扩增多态性DNA标记（RAPD）分别检测三个种的遗传多样性和居群遗传结构。15个随机引物对这三个种共160个个体 （短尾铁线莲C. brevicaudata 五个居群73个个体;大叶铁线莲Clematis heracleifolia五个居群75个个体;羽叶铁线莲Clematis pinnata三个居群12个个体。）进行分析，总共得到123个用于分析的条带。我们对这三个种扩增出的条带按照居群进行了聚类分析，结果表明这三个种在聚类树上能够很好的区分开，但是种内居群间没有表现出地理分布式样方面的信息;个体水平上聚类结果表明，百花山采到的7株无法确定的铁线莲幼苗有6株是短尾铁线莲C. brevicaudata另外一株是羽叶铁线莲Clematis pinnata，这说明在幼苗形态上二者差别不大;我们对这三个种分别进行了居群遗传结构的分析，结果表明：短尾铁线莲C. brevicaudata的多态条带比率为90.65％，遗传变异主要分布在居群内，居群间分化较小，而大叶铁线莲Clematis heracleifolia的多态条带比率为90.76％，居群间遗传变异占30.52％，居群间有明显分化。羽叶铁线莲Clematis pinnata的遗传多样性很低，有可能是由于营养繁殖造成的。 6．DNA序列分析 选取叶绿体基因组的trn L－F序列和核基因组的ITS序列进行了测序分析。发现从三个种十个个体得到的trn L－F序列之间几乎没有差异，在640 bp中只得到了3个信息位点。对ITS测序过程中发现短尾铁线莲可直接用PCR产物测序，而对大叶铁线莲和羽叶铁线莲必须进行克隆测序，由于时间关系，我们得到的序列不足以进行进一步分析。 基于以上研究结果，我们初步认为羽叶铁线莲是通过短尾铁线莲和大叶铁线莲的杂交而起源，并根据我们观察到的变异式样对羽叶铁线莲系的一些种类进行了分类学处理。

独花兰和扇脉杓兰的传粉生态学

兰科植物精巧的花部结构及其独特的传粉机制为自然选择理论和异花受粉优势学说提供了强有力的证据。开展兰科植物的传粉生态学研究对进一步探讨植物进化中的一些关键问题（如生殖隔离、物种形成、适应和繁育系统进化等）具有重要意义。本文通过对独花兰 (Changnienia amoena) 和扇脉杓兰 (Cypripedium japonicum) 两种兰科植物进行植物与传粉者之间关系、种内形态变异、花粉散布等方面的研究，探讨其适应进化方式、传粉系统的进化趋势，同时为开发适用的分子标记，在独花兰中初步摸索和探讨了微卫星标记的分离。主要研究结果如下： 1. 濒危植物独花兰的传粉生态学 在神农架2个地点进行了连续2年的野外观测和实验。结果表明，独花兰是一种自交亲和、需要昆虫传粉的欺骗性植物。在2个地点独花兰的传粉者种类不同，在龙门河三条熊蜂 (Bombus (Diversobombus) trifasciatus) 是主要传粉者，在关门山仿熊蜂 (B. (Tricornibombus) imitator) 是唯一的传粉者。尽管它们出现的丰度和觅食行为不同，但其传粉行为和携粉部位非常相同，因此，可以看作是一个功能群（functional group）。从种群水平上看，开花个体的分布式样不是显著的偏斜曲线图，传粉者的有效访问主要集中在开花的前、中期。由于没有花蜜，传粉者在花内停留的时间很短，花粉块输出和传粉发生在熊蜂劳而无获的访问、退出花时。自然条件下，独花兰的结实率很低，只有6%-12%，并呈现明显的年份和地点变化。传粉者限制是结实率低的主要原因。与同亚族近缘种布袋兰相比，分布于中国中部的独花兰受冰期的影响很小，其传粉环境相对稳定，在进化历史中，形成了一种稳定的传粉系统。本研究结果纠正了前人对独花兰繁殖方式的错误认识，并为其保护策略的制订提供了重要资料。 2. 独花兰种群大小、传粉者访问和花粉流 为了检验独花兰种群大小、空间格局与传粉者访问之间的关系，连续2年对10个独花兰种群的花粉块输出和输入进行了统计分析，同时对花粉块进行标记研究其散布式样。结果显示，花粉块输出比例与种群大小之间关系在2003年呈显著负相关，但在2004年这种负相关关系不显著。尽管独花兰的空间分布格局在不同种群不同，但传粉者的访问除了在有蜂巢的种群为聚集式访问外，其余种群内均为随机访问式样。花粉块的散布式样呈尖峰态分布，多数花粉块散布很短的距离，少数散布较远。花粉块的平均散布距离在龙门河为7.3 m，在关门山为10.6 m。由于各种群之间相隔很远，种群之间花粉块交流受到限制，很少有种群外的花粉块输入。花粉块传递只在种群内近缘个体中进行，有可能导致种内遗传或形态分化。 3. 独花兰种内形态变异及其适应意义 对庐山、新宁和神农架3个地点15个独花兰自然种群的形态变异进行了研究，探讨了形态多样性水平和地理变异式样及其可能的适应机制。结果表明，在物种水平上独花兰形态性状存在丰富的变异。单因素方差分析显示3个地区间多个形态性状存在极显著差异（P<0.01），UPGMA聚类分析也表明这3个地区分别形成明显不同的分支，说明3个地区种群植物形态已经出现分化。在神农架地区，龙门河和关门山两个地点间出现明显的形态分化，而这两个地点的传粉者在形体大小表现出显著差异。适合度与形态性状之间的相关性分析显示，独花兰种内形态分化是以传粉者为媒介的自然选择作用的结果。移栽实验显示，本地传粉者对本地和移栽种群花的访问表现出一定的选择性。 4. 扇脉杓兰的传粉生态学研究 与独花兰同域分布、花期不遇的扇脉杓兰是杓兰属的一个特殊类群，具有典型“Japonicum”型唇瓣类型。对神农架6个种群连续两年野外观测和实验结果表明，扇脉杓兰是一种自交亲和、需要昆虫传粉的欺骗性植物。在种群水平上开花个体的分布式样呈显著的偏斜曲线图，在短时间内迅速到达盛花期。扇脉杓兰的传粉者是三种熊蜂，其访问频次很低，访问时间很短，有效访问主要集中在开花的前、中期。自然结实率只有4.3％－8.5％，人工授粉实验证明，传粉者限制是结实率低的主要原因，且传粉者限制程度在花期不同阶段和不同地点存在差异。对欺骗性植物聚集生长、开花有利于吸引传粉者这一假说进行检验，结果显示，克隆群丛大小与传粉者有效访问（花粉块输出比例）呈弱负相关关系。聚集生长的结实率与分散生长的没有显著差异，说明繁殖成功与开花个体的密度无关。扇脉杓兰的花粉集结为未蜡质化的花粉块，是杓兰属中粘质花粉和蜡质花粉块的中间进化类型。传粉生态学和形态学证据显示C. acaule和扇脉杓兰是东亚-北美间断分布的姐妹种对。 5. 独花兰微卫星位点的分离 为了深入研究独花兰种群的基因流和交配系统，用Dynabeads和选择性杂交法分离微卫星位点、筛选引物。首先将基因组DNA用合适的内切酶消化为400-1000 bp大小的片段，然后用生物素标记的简单重复寡核苷酸序列做探针与其杂交，杂交复合物用抗生链霉素蛋白包裹的磁珠吸附，经过一系列洗脱、沉淀，得到富含重复片段的DNA，然后在进行克隆、测序，利用SSR两侧翼区设计引物，经过多态性分析可得到微卫星标记。结果显示，35个克隆序列中18个（51.4％）含有重复片段（SSRs），说明用Dynabeads富集效率明显高于传统方法。到目前为止所得引物共4对。这一实验方法的探索为以后分离杓兰属等兰科植物微卫星位点、进而进行群体遗传学研究奠定了一定的基础。

吉林哈尼湖钻孔5000年来的植被演替与气候变化

重建古气候、古环境已成为当今全球变化研究的热点。5000以来是人类有文字记录的历史时期，其气候与植被变化与人类活动十分密切，对这一时期的气候变化的研究，具有重要的理论意义。 植被的状况可以在相当大的程度上反映气候的状况。孢子和花粉由于其个体小、产量高和易于保存而成为植被演替和古气候、古环境研究的重要手段之一。 孢粉组合的变化可以很好地反映植被的演替，吉林地区地层沉积比较稳定，本文选取哈尼湖钻孔360-0cm（5112－0aBP）的沉积物进行孢粉分析，共采取样品85个，平均时间分辨率约为60年。样品中花粉含量非常丰富，种类以乔木为主，其百分含量多在80%以上，最高可达96%，根据花粉组成在钻孔上的变化，结合花粉沉积率进行样品的分析，自下而上可分为4个花粉组合带，进而得出5000年以来该区气候演化大致可分为4个阶段：阶段1（5112－3784aBP），阔叶类乔木占优势，湿生及水生草本比较丰富，气候温暖湿润;阶段2（ 3784 －1380aBP）针叶类乔木占优势，湿生及水生草本消失，气候变凉干;阶段3（ 1380 －994aBP），以松为主的针叶类仍占绝对优势，喜温湿的灌木草本含量持续下降，说明气候继续变冷变干;阶段 4（ 994－0aBP），植物种类比较丰富，湿生植物的沉积率明显增高，气候变的更加湿润。

黄杉属的分子系统发育与生物地理学

松科植物的叶绿体和线粒体基因分别为父系和母系遗传，二者的联合分析为系统发育重建，特别是揭示网状进化过程提供了便利条件。此外，松科中的多个属（如黄杉属、铁杉属等）呈洲际间断分布，是研究生物地理学问题的良好试材。 本文选择来自于叶绿体和线粒体基因组的5个DNA片段，通过序列分析对黄杉属的所有8个种进行了系统发育重建;同时结合已有的对黄杉属的各方面研究，讨论了该属典型的东亚-北美间断分布式样的形成过程。主要结果如下： (1) 叶绿体DNA片段trnfM-trnS、rpl20和trnP的序列分析 无论叶绿体基因两两组合分析还是3个叶绿体片段的联合分析均强烈支持东亚的6种黄杉属植物聚为一支（支持率>96%），其中日本黄杉位于最基部，其他分布于中国的5个种聚在一起。 (2) 线粒体基因nad5和cox1的序列分析 线粒体基因序列的进化速率较慢，信息位点相对较少，因此分辨率较低。本文中线粒体DNA序列在黄杉属的东亚物种间几乎没有分辨率，但是仍以>60%的Bootstrap支持率将该属分为东亚与北美两个姐妹支。 (3) 5个DNA片段的联合分析 5个细胞质DNA片段(trnfM-trnS, rpl20, trnP, nad5, cox1)的联合数据矩阵长4351 bp，其中含变异位点129个（3.0%），信息位点109个（2.5%）。利用最大简约法进行的系统发育分析表明：黄杉属分成北美和东亚两支，与地理分布相吻合，并分别得到了66%和100%的支持;中国的5个物种形成一个单系分支，该分支与日本黄杉为姐妹群关系。 根据上述叶绿体和线粒体DNA片段的序列分析结果，并结合前人的研究资料，我们认为黄杉属通过白令陆桥扩散后，在北美和东亚独立进化，但该属的起源地尚需要进一步研究。

苔藓植物一些东亚特有属的分子系统学研究

苔藓是高等植物（有胚植物或陆地植物）中最原始的一类，但种类却丰富多样，其形态和生长环境的多样化程度高于蕨类和裸子植物，且对极端环境的忍耐力更强，分布范围也更广。“特有”是一个地理概念，它是相对广布而言，当一个类群的分布范围有一定的限制时即为特有现象。“东亚特有”是指分布范围主要局限于中国，朝鲜，日本和蒙古等，向北可及俄罗斯远东地区，少数可分布至中国南部相邻地区的植物类群。东亚地区主要以温带植物区系为主，但也包含一些热带植物区系成分，还因为第四纪以来受冰川活动影响较少，因此植物种类非常丰富。东亚地区也是苔藓植物的多样性中心之一，这里有较多的特有成分。在我国总共分布有苔藓植物东亚特有属35属，其中苔类5属，藓类30属。长期以来，特有成分始终引起人们的极大关注，不仅是因为其在植物地理学上的重要性，还因为特有类群中包含了孓遗类群，往往系统位置比较关键，此外，大部分特有类群对人为干扰比较敏感，对其保护就愈加重要，因为它在这个地区的消失就意味着一个类群的灭绝。 我国对苔藓植物东亚特有类群已有较好的认识，在前人知识积累的基础之上，我们期望通过分子系统学的方法，开展对东亚特有苔藓属的研究，逐步揭开特有属植物的神秘面纱，最终在系统树上找到它们各自应该属于自己的位置。 在本次研究中，我们总共得到十一个苔藓植物东亚特有属的新鲜材料。在实验室中我们对这十一个特有属叶绿体和核的六个基因（叶绿体atpB, rbcL, cp-SSU, cp-LSU 和核18S，26S rDNA）进行了测序，并在此基础之上，构建了来自苔藓植物106个属上述六个基因的联合矩阵，并对它们进行了系统学分析。本文所选十一个特有属中除三个苔类属和一个线齿藓类的属之外，其它七个特有属都属于侧蒴藓类。根据近几年的研究结果，侧蒴藓类中灰藓目被认为是起源自一次快速辐射演化，灰藓目各科之间的关系以及各科的范围都很难确定。即便本实验测序一万多bp，这一支之内的关系仍不能解决。 在以上结果的基础上，本文对线齿藓类的树发藓属（Microdendron）进行了较为详细的研究，我们用最大简约法分析了金发藓目15属，33种的18S, rbcL和trnL-F序列的联合矩阵。对树发藓属的微形态进行了电镜扫描。形态和分子数据的分析结果表明，这个特有属在属级水平是不成立的，它仅是小金发藓属的一个种。此结果支持将这个东亚特有属降为种的等级。此外，本文还对囊绒苔属（Trichocoleopsis）和新绒苔属（Neotrichocolea）的系统位置做了比较详细的研究。我们分别分析了一个苔类植物57属的四基因（cp-SSU, cp-LSU, atpB and rbcL）矩阵和一个苔类植物24属的九基因（cp-SSU, cp-LSU, atpB, psbA, rps4, rbcL, 18S, 26S and nad5）联合矩阵，结果显示囊绒苔属和新绒苔属互为姐妹群关系，而毛叶苔属（Ptilidium）又是它们二者的姐妹群。研究结果支持了囊绒苔属和新绒苔属组成新绒苔科（Neotrichocoleaceae），而不同于前人的观点：将上述两属放置于毛叶苔科（Ptilidiaceae）、绒苔科（Trichocoleaceae）或多囊苔科（Lepidolaenaceae）。另外值得注意的是这两个特有属和毛叶苔属组成的一支位于叶苔类（Leafy liverwort）中“Leafy I”和“Leafy II”两大支之间，但这一支确切的系统位置没有解决，仍有待于进一步研究。 除此之外，本文还利用GenBank中的数据对东亚特有属日鳞苔属（Nipponolejeunea）和耳坠苔属（Ascidiota）（未获得实验材料）进行了初步的系统学分析。结果表明传统上放在细鳞苔科的日鳞苔属与毛耳苔科的毛耳苔属（Jubula）为姐妹群关系，建议将日鳞苔属置于毛耳苔科;耳坠苔属是光萼苔科的成员，属的分类等级是合理的。 最后本文利用罚分似然法，选取多个化石作为标定点，对来自苔藓植物主要类群及其它陆地植物共115个类群5个基因（atpB, rbcL, cp-SSU, cp-LSU, 18S）的矩阵进行了分子钟的分析，初步估算11个东亚特有属的分化时间。

松科nrDNA 的进化研究Evolution of nuclear ribosomal DNA in Pinaceae

核核糖体DNA（nrDNA）已被作为一个重要的标记，用于推断很多分类等级上的系统发育关系。相对于在被子植物中的快速致同进化，nrDNA在裸子植物中的致同进化速率低，且ITS和5S-NTS区有着较大的长度变异，这种现象在松科植物中尤为明显。在本研究中，我们克隆并测定了银杉属的5S rDNA以及冷杉属、银杉属、雪松属、油杉属、长苞铁杉属、金钱松属与铁杉属的ITS序列。基于获得的新数据，再结合前人报导的其它属的数据，我们探讨了如下四个问题： （1）松科 nrDNA ITS1 亚重复单位的组成、分布及进化;（2）ITS1区的长度变异与亚重复单位数目的关系以及它们的系统学意义;（3）松科ITS1的二级结构特征;（4）银杉5S rDNA编码区及非转录间隔区的结构特征。主要研究结果如下： 1. ITS区的序列分析ITS区的克隆及序列分析发现：（1） 松科ITS1的长度变异范围为 944-3271 bp, 这是目前已报导的真核生物中属间ITS变异最大的类群之一;（2） 所有松科植物的ITS区域都包含亚重复单位，亚重复单位的数目从2到9，并且这些亚重复单位可分为两种类型，即不含保守核心序列（5’-GGCCACCCTAGTC ） 的长亚重复单位（LSR）和含上述保守核心序列的短亚重复单位（SSR）;（3） ITS1区的巨大长度变异主要归因于亚重复单位的数量变异; （4） ITS1区的GC含量与 它的序列长度和亚重复单位的数目有一定关系，并能够提供一些系统发育信息，特别是支持云杉属、松属和银杉属三者具有很近的亲缘关系。 2. ITS1亚重复单位的系统发育分析为了研究亚重复单位的进化关系，我们用最大似然法和最大简约法构建了松科ITS1亚重复单位的系统发育树。结果表明：（1）在ML和MP树中可发现有共同的五个分支; （2） 银杉比松科其它属拥有更多的SSR，且该属的所有9个SSR在系统树中构成一个单系支，表明它们是在银杉属内发生重复的;（3）一些SSR在属间和种间具有同源性，可为nrDNA ITS 的进化历史以及松科的系统发育 研究提供重要信息;（4）亚重复单位的多次重复以及伴随的重组可能是导致LSR 和SSR在松科不同属中分布式样不同的原因。 3. 松科ITS1的二级结构 用 Mfold 3.2 软件对松科所有11个属的ITS1区进行了二级结构预测，共获得了563个最低自由能折叠。结合以前关于松科二级结构的报导，我们分析的结果表明：（1） 松科ITS1的二级结构主要由几个延展的发夹结构组成;（2） 构象的复杂性与亚重复的数目呈正相关;（3）配对的亚重复单位通常在保守核心区（5’-GGCCACCCTAGTC ） 处有部分重叠，并且构成一个长茎，而其它的亚重复单位通常会自身折叠，且保守核心区的部分出现在发夹结构的环中。 4. 银杉5S rDNA 序列分析 我们对来自银杉不同群体的3个个体的5S rDNA进行了克隆，共获得 45 条序列，分析结果表明：（1） 绝大多数银杉5S rDNA编码区长度为120 bp, 以GGG 开头，以CTC结尾，编码区出现的碱基替代主要为转换;（2） 银杉与其它裸子植物相比，5S rDNA基因编码区具很高的相似性（90-99%）; （3）间隔区含有一个poly-C和一个poly-T结构、两个TC丰富区以及五个GC丰富区。根据长度和序列特征，银杉的5S rDNA间隔区可分为三种类型：Type A 长751-764 bp，Type B 长770-807 bp （含一个32 bp的插入），Type C 长581-594 bp; （5）长间隔区（Type A，Type B ）中含有两个148-175 bp的串联亚重复单位，该亚重复单位与短间隔区（Type C ）中的一段143 bp的序列具有较高的相似性（56.0-66.8%）。 5. 银杉5S rRNA的二级结构 Mfold 3.2 预测结果表明：（1）银杉5S rRNA二级结构包括5个双螺旋区（干区）（Ⅰ-Ⅴ）、2个发夹结构环区（C和D）、3个中间环区（B1、B2 和 E）和1个铰链区（A）, 铰链区为三个双螺旋的结合处;（2） 二级结构中的环区通常比双螺旋区更加保守;（3）在5个双螺旋中，I 和 IV 区有较高的碱基替代率。

菰的分子谱系地理研究及茭白的起源

近几十年来，栽培作物及其野生近缘（祖先）种的群体遗传结构和进化历史的研究日益受到关注，因为此类研究不仅能加深人们对作物起源和驯化的认识，而且有助于作物野生资源的开发以及作物的遗传改良。分子谱系地理分析（Molecular phylogeography）是此类研究中的重要手段之一，能够有效地了解近缘群体的进化历程以及重建作物的驯化历史。菰（Zizania latifolia Turcz.）是东亚广泛分布、具有重要价值的水生草本植物，其栽培型—茭白是中国第二大水生蔬菜。尽管已有不少涉及此类群的研究，但迄今我们对菰的群体遗传结构和进化历史以及茭白的起源几乎一无所知。本研究从29个基因片段中筛选了2个在菰种内水平上具有显著变异量的核基因片段，进行了分子谱系地理研究，揭示了菰的遗传多样性水平及其地理分布格局，探讨了菰的群体演化历史，并初步探讨了茭白的起源和驯化历史。主要结果如下： 1）基因片段筛选 开展分子谱系地理学研究，需要采用具有显著种内变异的分子标记，为此我们通过预实验对一批备选基因片段进行了筛选。在18个叶绿体和2个线粒体片段中，测序的总长度达17100 bp，但没有发现任何变异位点。在9个核基因片段中，7个片段具有变异位点，但只有2个片段的变异量在1%以上，分别是Adh1a（2.70%）和GPATb（1.25%）基因。所以，本研究最后确定了采用这2个核基因片段来进行菰的分子谱系地理的研究。 2）Adh1a基因谱系地理分析 对来自21个天然群体126个个体，通过Adh1a基因的直接PCR和克隆测序共得到了252条序列，中性检测表明，Adh1a基因符合中性进化模型、没有重组并且有足够的变异量，适合用于进行菰的谱系地理研究和进化历史的推断。在物种水平上，菰的核苷酸多态性水平为θsil = 0.0089，跟一些作物近缘类群相比处于中等偏低的水平;不同群体的核苷酸多态性水平相差明显，多态性最高的群体出现在东北地区，并有从北向南递减的趋势。群体间存在着显著的遗传分化（FST = 0.481）表明群体之间的基因流有限。群体间的遗传距离与地理距离没有相关性，地理邻近的群体并没有共享关系相近的单倍型，整个群体缺乏明显的谱系地理结构。目前的遗传多样性分布格局可能是由于近几十年来的生境退化和丧失造成过去群体的片段化所致。根据群体遗传多样性水平的差异和基因谱系的地理分布格局以及分子钟估算的与北美近缘种的分化时间，我们推断菰的群体经历了从东北向华南逐步扩散的过程。 3）GPATb基因谱系地理分析 为更可靠地推断菰的谱系地理格局，我们选择了GPATb基因作为标记开展了进一步的分析。对相同的采样群体和个体共252条序列的分析表明，在物种水平上，GPATb的核苷酸多态性只相当于Adh1a基因的1/4。综合2个基因的结果，可以认为菰的核苷酸多态性水平是维持在较低的水平上。该位点体现的群体遗传分化也没有Adh1a基因明显。群体之间相近的遗传多样性水平和较低分化程度可能意味着该基因位点受到平衡选择作用的影响，这一推论也得到了中性检测结果的支持。因此，GPATb基因可能受到选择作用的影响，不能用来支持或推翻Adh1a基因的结果。 4）茭白的起源和驯化 对来自13个省份的65个茭白品种的Adh1a和GPATb基因片段进行测序，结果发现，所有的品种在这2个基因上都具有相同的基因型，Adh1a位点上表现为杂合体，而GPATb位点上则是纯合体。这说明在茭白的起源过程中发生了严重的驯化瓶颈效应，也即茭白是单次起源的，是从菰的少数几个甚至单个个体驯化而来。虽然文献考据表明，茭白最早的栽培地区为太湖流域，但我们的分子证据却并不支持其为茭白的驯化起源地点，而可能是在太湖流域以北地区起源的。鉴于采样的局限性，这一结论还有待于进一步的验证。同时2个基因的数据表明来自陕西、四川、云南、湖南和福建的6个菰群体可能是从人为引种的茭白逃逸成为野生的。因此，在以后野生菰群体的采集中，特别是在茭白种植地区，要在详细调查的基础上设计采集方案。

全缘叶绿绒蒿的谱系生物地理学研究

青藏高原是我国植物多样性和特有性最高的地区，其中横断山区由于复杂的地质变迁历史和独特的地貌已成为研究物种多样性的一个热点。全缘叶绿绒蒿是分布于青藏高原及其周边地区的高山植物，该物种的谱系生物地理学研究不仅有助于揭示横断山区的物种分化机制及地理分布格局的形成过程，而且有助于探讨青藏高原隆升及新生代晚期气候变化对横断山区物种遗传结构的影响。 本研究对全缘叶绿绒蒿的12 个群体、153 个个体的叶绿体DNA trnS-trnfM片段进行了序列测定，比对校正后该片段的长度为877－962 bp，其中含6 个突变位点和5 个插入缺失（两个7 bp，两个39 bp，一个6 bp）。根据这些变异，可分为12 种叶绿体单倍型（H1-H12）。全缘叶绿绒蒿在物种水平上的核苷酸多态性分别为π = 0.00152 和θ = 0.00122，单倍型多样性为HE 为0.791，群体之间的遗传分化系数FST 为0.46579。中性检测结果显示无论在物种水平还是在群体水平，都没有显著偏离中性模式，说明该物种近期没有经历明显的瓶颈效应或奠基者效应等历史事件。我们从地理上将全缘叶绿绒蒿的群体分为四个地区，即云南、川西、川北和青海地区。AMOVA 分析显示群体间的遗传分化系数FST为0.46579，大多数的核苷酸多态性来自群体内（53.42%），其次来自于地区内的群体间（40.44%），而四个地区之间的分化非常小，仅占6.14%。失配分析显示在整个物种的分布范围内呈现单峰式样（r = 0.0475, P = 0.07924），这种分布虽然是不显著的，但P 值接近显著的临界，说明可能存在不明显的扩散，但在各个地区内的群体都没有扩散的迹象。 比较单倍型的地理分布和单倍型之间的进化关系，发现川西和川北地区存在明显差异，这两个地区都拥有比较古老的单倍型，也具有地区特异的稀有单倍型，因此很可能是全缘叶绿绒蒿在冰期时的避难所。云南地区只具有一个古老单倍型H1，这种分布可能是由川西和川北避难所的南迁造成的，也可能该地区自身就是古老单倍型H1 的发源地。青海地区只有两种古老的单倍型，由于冰期后物种有往高纬度迁移的趋势，因此这个地区的单倍型可能是在冰期后由川西和川北迁移过去的。全缘叶绿绒蒿在横断山区单倍型的片段化分布及多个避难所的存在可能与该地区独特的高山低谷相间地貌以及受多次冰期影响有密切关系。

沙冬青抗冻组份的分离纯化和afp基因克隆的尝试

本文用三种方法分离纯化沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）叶片抗冻蛋白质。从70%硫酸铵沉淀后的上清液中得到了一种碱性的小分子物质，UiS，具有较高的溶解度( 260 mg/ml)和较强的降低溶液冰点的能力（200 mg/ml，冰点小于-20℃）：从10%硫酸铵和26%氯化铵共沉淀物中分离到一种抗冻蛋白-B3，B3分子量为39.8 kDa，热滞活性为0.45℃(10 mg/ml)：从沙冬青叶片热稳定蛋白质中用双向电泳一电泳回收法分离到afp,其分子量为40 kDa,pl为9.0。热滞活性为0.9℃(20 mg/ml)，和其他抗冻蛋白质进行比较，没有发现相同的类型。afp和uis在叶片含量都很高，可能是沙冬青抗冻生理过程中两种主要物质，它们对于沙冬青抵御-20℃左右的冷冻温度具有重要的意义。afp N端序列为SDDL SFTF NKFV PCQT DILF，据此合成了六段5’引物和一段3’引物，用RT - PCR方法从叶片中扩增出一段200 bp左右的片段。

水稻颖花开裂突变体的鉴定及颖花开裂基因srs-1的定位

　　水稻(Oryza sativa L.) 颖花开裂 (split rice spikelet，SRS) 突变体是从水稻品系 8902s 花药培养得到的双单倍体群体中筛选出的同源异型突变体。以窄叶青8号为母本，SRS突变体为父本配制杂交组合，其F2群体中正常植株和突变植株的分离比例符合3:1，说明颖花突变性状是由单隐性基因决定的。 利用扫描电镜观察 SRS突变体花器官形态发生过程。其性状表现为内外稃变软变长，不抱合，在外稃基部又着生一朵花，两浆片基部融合，质地呈稃片状，雄蕊和雌蕊形态正常，且可育。该突变体的突变性状与拟南芥APETALA1的突变表现相似，说明两者在形态建成方面具有相似之处。由于 SRS 突变体第一轮和第二轮花器官发生了变化，根据 ABC 模型，srs-l基因应属于同源异型 A 组基因。 采用BSA法在F2群体中建立DNA正常池和突变池，利用RAPD技术筛选与突变基因srs-l连锁的分子标记。从520条随机引物中筛选出了引物S465能在两池间扩增出分子量为900 bp的差异片段，并证明其在F2群体中表现共分离。将此DNA片段克隆后作为RFLP探针pS465A，该探针与srs-l基因紧密连锁，在DH群体的RFLP分子连锁图谱上成功地将它们定位于第三染色体上。 本研究是利用水稻同源异型突变体为材料，研究水稻花器官发育基因的首例报道。

H-OLE1基因的克隆与功能鉴定及维管组织分化的激素调节

脂肪酸是生物体内普遍存在、具重要生理功能的物质，亦是重要的化工原料。研究脂肪酸生物合成及其调控，既是揭示生命活动基本规律的需要，又具巨大的经济价值。多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)是一种甲基嗜热酵母，能合成多聚不饱和脂肪酸，是研究脂肪酸生物合成的理想材料之一。为阐明多形汉逊氏酵母细胞中脂肪酸生物合成途径、关键步骤、调节机理，并利用此系统生产有用脂肪酸，我们开展了不饱和脂肪酸生物合成关键酶基因--△9-脂肪酸去饱和酶基因研究。 以P. angusta IFO 1475的P-OLE1基因为探针，Southern杂交分析，发现在亲缘关系很近的不同种类的甲基嗜热酵母如H. pofymorpha、Pichia angusta、P. pastoris、P. methanolica和Candida boMinii中Δ9-脂肪酸去饱和酶基因的结构多形性。 构建了H. polymorpha CBS 1976染色体Δ9-脂肪酸去饱和酶基因座位的限制性酶切图谱，进而分离了3.4 kb BamHI-XhoI基因片段并进行全序列分析，结果表明这个片段含1个与已克隆的酵母Δ59-脂肪酸去饱和酶基因高度同源的、由1353 bp组成的ORF。推导的H-OLE1多肽具脂肪酸去饱和酶的一些基本特征，如含2个结构域：1个位于N一端、含3个保守的组氨酸簇、具催化功能，另1个位于C-端、参与脱饱和反应中电子传递、类似细胞色素b5。将这个序列申报DDBJ，获得Accession number为：AB024576，推导的蛋白的氨基酸序列的Accession number为：BAA75902。 为验证H-OLE1基因的功能，建立了多形汉逊氏酵母DNA电穿孔实验系统，进行了遗传互补测验。发现完整的H-OLE1基因可互补缺乏Δ59-脂肪酸去饱和酶活性的多形汉逊氏酵母营养缺陷型fadl突变体，却不能互补相应的酿酒酵母olel突变体，而由酿酒酵母GAP表达框架和H-OLE1 ORF组成的嵌合基因可互补上述olel突变体。说明H-OLE1基因编码Δ9-脂肪酸去饱和酶，多形汉逊氏酵母的Δ9-脂肪酸去饱和酶和酿酒酵母的脂肪酸脱饱和系统相亲和，而H-OLE1基因的启动子在异源细胞中没有活性。 为研究H-OLE1基因的转录及其调节规律，通过一系列实验，首次找到了可在研究多形汉逊氏酵母基因表达时用作内标的GAP基因。Northern杂交发现，H-OLE1基因在细胞中以较低水平表达，产生1.5 kb的转录子;基因表达略受不饱和脂肪酸的抑制;在多形汉逊氏酵母HOLE1基因的转录调节中，Choi等在酿酒酵母OLE1基因中发现的脂肪酸调节元件FAR可能不是关键的。 利用基因敲除技术，通过转化H-OLE1∷S-LEU2线性DNA到多形汉逊氏酵母二倍体细胞(fadl／FADl)中，首次构建了多形汉逊氏酵母H-OLE1基因的破坏株。遗传学和分子生物学研究表明，破坏株细胞中线性DNA定位串联多拷贝整合到染色体中并置换了fadl突变部位。利用气相色谱分析了ΔH-OLE1破坏株、fadl-2突变株、野生型菌株及含H-OLE1基因转化子的细胞总脂肪酸，发现多形汉逊氏酵母细胞中除18:0→18:1(Δ9)→18:2(Δ9,12)→18:3(Δ9,12,15)这个脂肪酸去饱和主路外，还可能存在其它几个脱饱和反应与延长反应，如16:1(Δ9)→16:2(Δ9,12)→18:2(Δ11,14);16:1(Δ9)→18:1(Δ11)→18:2(Δ11,15)等。 近年维管组织分化研究进展迅速，取得大量可喜结果，也存在许多不足，如细胞分化调节机理，特别是激素诱导的分子机理研究比较薄弱。为建立研究维管组织分化的理想系统，研究嫁接体发育的激素调节机制，在Parkinson和Yeoman发明的离体茎段嫁接系统的基础上，研究了激素对嫁接体发育特别是维管组织分化的影响。 采用不同的嫁接方法，用试管苗对黄瓜离体茎段自体嫁接、亲和性的黄瓜／黑籽南瓜与不亲和性的黄瓜／绿豆离体茎段嫁接组合进行研究，建立了嫁接过程简单、污染率低的试管苗离体茎段嫁接系统。利用往培养基中添加或不加植物激素研究嫁接体发育，发现通过改变培养基中的植物激素，可使亲和的嫁接体难以形成贯通砧木和接穗的维管束桥，也可诱导非亲和性的嫁接体产生维管束桥。初步研究证明利用植物激素可以克服嫁接不亲和性，这一结果是嫁接基础理论研究的一个重要进展，对揭示嫁接亲和性机制具重要意义。由于黄瓜绿豆嫁接组合中，砧木绿豆是可以固氮的豆科植物，研究结果具有潜在的应用前景。 详细地研究了外源IAA和玉米素(ZT)对黄瓜自体嫁接系统中维管束桥形成时间和数目特别是贯通砧木和接穗的管状分子数的影响。当砧木和接穗培养基中都没有添加植物激素时，嫁接接合部难以产生维管束桥，也难以产生贯通的管状分子。当培养基中添加植物激素时，维管束桥数和贯通的管状分子数随激素浓度和种类的不同而不同。本实验的最佳激素条件是：在接穗培养基中加IAA 1.0 mg／L和ZT 0.25 mg／L，在砧木培养基中加ZT 0.25 mg／L。研究表明在试管苗离体茎段自体嫁接系统中，外源激素是嫁接成功的必要条件。试管苗离体茎段嫁接系统是一个理想的研究植物维管组织分化的新系统。 通过对嫁接体发育期接合部及嫁接体各部分IAA、玉米素及玉米素核苷(Z+ZR)的ELISA分析，发现嫁接接合部维管束的再生受IAA和Z+ZR含量的共同调节;连接接穗和砧木维管束桥的分化比维管束的网联要求更高的IAA水平及LAA(Z+ZR)比率。 上述结果为利用嫁接系统研究维管组织分化机理奠定了基础，使进一步研究嫁接体发育的激素调节机理成为可能。

小麦春化相关基因的克隆及其功能分析

一． 小麦相关基因ver203F cDNA全序列克隆与功能分析 　　根据本实验室通过差异筛选技术克隆到的与春化相关的基因cDNA verc203的序列，设计PCR 5’端PCR引物，利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）克隆策略，得到春化相关基因ver203基因的同源基因ver203F cDNA的3’端序列，长度为1,197bp。Northern分析表明ver203F全长约为1.5 kb，且其表达具有春化处理的特异性。根据3’RACE克隆的ver203F 3 ’端核苷酸序列设计了3’端PCR引物，利用5’RACE克隆到该基因的5’端片段，经DNASIS核酸分析软件分析将5’45RACE和3’RACE DNA序列拼接合并，得到ver203F全长cDNA，从TdT加尾5’末端到poly A全长为1,561 bp，5’端起始密码子ATG上游非编码区－1～－192共了192bp，终止密码子TGA到poly A的非编码区有253bp，cDNA编码区全长1,119 bp，推测编码373氨基酸残基。国际基因序列数据库检索表明该基因序列（GenBank/EMBL/DDBJ：AB012013）与大麦茉莉酸诱导基因有部分同源性。因上推测该基因在调控开花过程中可能参与茉莉酸介导的信号传导途径，ver203F作用的发挥可能需要其它蛋白的参与，或ver203F本身就是一个受体蛋白。 　　为了研究ver203F基因的功能，将通过3’RACE克隆到的ver203F 3’端序到分别构建正义和反义植物表达载体，通过花粉管通道法、农杆菌介导的叶圆片法以及农杆菌介导的真空转化法分别转化小麦、烟草和拟南芥菜。获得转基因植株后，PCR、DNA Dob Blot、Southern Blot分析以及GUS活性检测证明外源基因已整合到转基因植株中，并得到表达。在获得的小麦、烟草和拟南芥菜转基因植株中，它们开花时间都相应地推迟，表明正常植物体内该基因在控制营养生长向生殖生长的转变中起作用。ver203F可以影响小麦和拟南茶菜花序的发育，首先无论正义还是反义都使得花序的发育受到抑制，在小麦中表现为顶部小穗退化，在拟南芥菜中表现为顶花。其次在转化正义基因的转基因拟南芥菜中，观察到产生的顶花为对称的两朵或以对称的两朵顶花基部为生长点长出丛生花，这种对称花的麦型小麦小穗中小花的表型相类似，说明ver203F基因可能在小麦小花的发育过程中也起着重要作用。 二． 春化相关基因ver17在开花过程中功能的分析 以春化处理冬小麦（京冬1号）幼苗cDNA为材料，通过减法杂交与差异筛选得到春化相关cDNA克隆verc17。为了研究该基因的功能，以包含CaMV 35S启动子的pBI221为载体，将ver17cDNA片段分别从两个方向插入pBI221的BamH I－Sma I, Xba I－BamH I间，构建正义和反义表达质粒：p17S和p17X，通过花粉管通道法转化小麦。对T0和T1两代转基因小麦的观察发现，在转化反义基因p17X的转基因小麦首先表现为抽穗推迟，其次穗的顶部和基部小穗严重退化，另外还发现转化反义基因的小麦败育现象严重（主要是花粉败育），因此推测ver17基困能可具有以下几方面的特点：a．春化诱导型表达;b．促进植物开花;c．促进穗顶端和基部花的发育，减少其退化;d．影响雄蕊的发育。