文昌鱼发育相关基因GDF8/11、ACTIVIN和NM23-Bbt2的克隆、表达及分子进化分析

文昌鱼是头索动物，被认为是现存的与脊椎动物最接近的无脊椎动物，经常被看作是分析从无脊椎动物到脊椎动物进化过程的一种重要的模式动物。在本研究中，我们克隆了青岛文昌鱼的GDF8/11、ACTIVIN和NM23-Bbt2基因，并对这些基因在不同胚胎发育时期和不同成体组织中的表达情况进行了分析，同时分析了这些基因的进化情况。 文昌鱼GDF8/11的基因组全长为9.9 kb，包括五个外显子和四个内含子，比其他物种多出两个外显子和两个内含子。在多出的第三个内含子中，我们分离出一个可能的转座因子，这表明这个内含子可能来源于转座子。文昌鱼GDF8/11 cDNA编码一个419个氨基酸的前体多肽，这个前体多肽与软体动物、硬骨鱼类、鸟类和哺乳动物的MSTN以及哺乳动物和斑马鱼的GDF11具有高同源性。系统分析表明文昌鱼GDF8/11位于脊椎动物MSTN和GDF11的根部，这个结果证实MSTN/GDF11来源于同一个祖先基因，并且文昌鱼GDF8/11可能就是他们的共同祖先，产生MSTN和GDF11的基因复制事件发生在脊椎动物分离之前和文昌鱼与脊椎动物分离之后或者分离时。RT-PCR结果表明GDF8/11基因在新受精的细胞、早原肠胚和刀形胚胎中表达，这与哺乳动物中的情况不同。这表明GDF8/11在文昌鱼中除了调节肌肉生长外还可能拥有其他的功能。 文昌鱼ACTIVIN的基因组序列长为6.1 kb，启动子大约长为447 bp，其基因组包括两个外显子和一个内含子，外显子/内含子边界严格遵守GT…AG的原则。文昌鱼ACTIVIN基因编码一个410个氨基酸的前体蛋白，前体蛋白包括信号肽、N-末端结构域和C-末端结构域。文昌鱼ACTIVIN基因演绎的氨基酸序列与脊椎动物比较发现ACTIVIN基因比较保守，特别是C-末端生物活性区。系统进化分析表明脊椎动物和无脊椎动物的ACTIVIN基因分别聚在一起，文昌鱼的ACTIVIN则位于脊椎动物ACTIVIN分支的根部，这表明文昌鱼ACTIVIN基因可能是脊椎动物ACTIVIN同源基因的祖先基因。 文昌鱼NM23-Bbt2 cDNA包括一个编码171个氨基酸的开放阅读框，序列分析表明文昌鱼NM23-Bbt2与其他物种高度保守，他们都包含高度保守的基元，并且这些基元在NM23的功能中扮演着重要的角色。RT-PCR分析表明文昌鱼NM23-Bbt2在所检测的组织和胚胎发育时期中的非特异性的表达模式。系统分析表明脊椎动物和无脊椎动物NM23-H2分别聚在一起，而文昌鱼NM23-Bbt2位于脊椎动物NM23-H2分支的根部，这表明文昌鱼NM23-Bbt2可能是脊椎动物NM23-H2同源基因的祖先基因。从无脊椎动物到脊椎动物的基因组结构比较表明五个外显子和四个内含子的基因组结构可能产生在文昌鱼与脊椎动物分离之前。

黄海葵神经毒素基因和牙鲆孵化酶基因分子克隆及相关生物技术研究

聚合酶链反应（PCR）是体外 DNA 扩增技术，用于扩增确定长度的特异 DNA 片段或从少量复合性模板中扩增目的的 DNA 序列。随着聚合酶链式反应技术的不断革新和仪器设备的优化，聚合酶链式反应已经成为分子生物学领域中广泛应用的技术，并对以分子生物学为基础的相关领域产生重要影响。本文研究了利用聚合酶链式反应分别克隆黄海葵神经毒素基因和牙鲆孵化酶基因。海葵神经毒素是一类海洋多肽毒素，它们能广泛作用于可激动细胞的电压门控的钠离子通道，并且有心肌刺激活性。在所有已知海葵毒素中，来源于黄海葵的 Anthopleurin-B 拥有最强的心肌刺激活性，因此 Anthopleurin-B 被广泛认为是未来设计强心药物的理想分子模型。孵化酶是特异存在于鱼类胚胎孵化腺中的一种金属蛋白酶。由于孵化酶存在时空特异性，它被认为是从细胞水平和分子水平研究胚胎分化的良好探针，克隆其基因将促进胚胎发育与分化的系统研究。海葵组织存在大量的粘我糖物质，目前采用的许多标准方法提取海葵组织中核酸的效果均不理想。在已有的核酸提取方法的基础上，西文设计了一种新方案用于分离总 RNA 和基因组 DNA ，其要点为：用强变性剂异硫氰酸胍匀浆海葵组织，在一定离子强度下，用表面活性剂溴化十六烷基三甲基胺（CTAB）处理匀浆液，并有氯仿抽提，可将粘多糖从核酸溶液中分离；或在一定离子强度下，通过二乙胺乙基（DEAE）纤维素层析柱，将多糖和其它杂质分离。结果表明这种新组合的方法效果良好，获得的总 RNA 和基因组 DNA 在 260nm 和 280nm 紫外吸光度的比值分别为 1.96－1.97 和 1.73－1.75。同时总 RNA 的完整性良好，基因组 DNA 为大片段。根据黄海葵神经毒素 Anthopleurin-B C 末端氨基酸序列密码子简并度低的特点，本文设计了四种方案，用聚合酶链式反应扩增 Anthopleurin-B 的 cDNA 序列。其中用连接锚定聚合酶链式反应，即末端 DNA 快速扩增技术（RACE）成功扩增了 Anthopleurin-B 的全长 cDNA 序列，表明末端 DNA 快速扩增技术适合于较小的多肽或蛋白基因序列的扩增。本研究还修改了胚胎细胞总 RNA 标准提取和纯化方法，删除了胚胎细胞匀浆步骤，改为在缓冲溶液中，于 55℃ 用高浓度蛋白酶 K 裂解胚胎细胞，从而减少细胞核的破损，用苯酚／氯仿抽提将细胞核除去。获得的总 RNA 不受基因组 DNA 的污染，RNA 在 260nm 和 280nm 紫外吸光度的比值为 1.93－1.99 之间。用反转录聚合酶链式反应获得了目的基因序列，证明该方法切实可行。通过反转录聚合酶链式反应获得了牙鲆孵化酶部分 cDNA 克隆，经过 DNA 测序并且与青鳉孵化酶（HCE）比较，两者之间的以应 cDNA 序列的同源性分别为 86.0%, 推演氨基酸序列的同源性为 80.7%，由此可知，两者之间的同源性确实很高，因此，我们推测在硬骨鱼纲中，孵化酶基因可能是一类保守性很强的 DNA 序列。

微藻脂肪酸去饱和酶基因的比较基因组学分析及重要基因功能的验证

不饱和脂肪酸是机体生物膜的重要组成成分，对生物膜结构、机能、相转变、通透性的调节及相关过程的调控有重要作用。并且，它参与细胞生物化学反应、转运过程和细胞应激反应，影响脂肪代谢、寻靶作用、免疫反应、耐寒、抗氧化等生理过程。此外，不饱和脂肪酸还是哺乳动物体内生成前列腺素、凝血哑烷和白三烯等激素的前体，具有提高人体免疫力、预防心血管疾病和癌症等重要的生理功能。本文对微藻中脂肪酸去饱和酶基因进行了比较基因组学分析；分离并验证了模式绿藻莱茵衣藻中Δ12去饱和酶基因的功能；克隆了南极小球藻NJ-7不饱和脂肪酸合成途径中的内质网型Δ12、Δ15去饱和酶基因和叶绿体型Δ12基因，并对内质网型Δ12基因的功能进行了研究。 1、对已测序的37株蓝藻的脂肪酸去饱和酶基因进行比较基因组学分析，发现，丝状或固氮蓝藻中具有的脂肪酸去饱和酶的种类一般多于单细胞蓝藻；海洋来源的聚球藻和原绿球藻的酰基-脂去饱和途径明显不同于其他来源的蓝藻，这两属的蓝藻与其他蓝藻可能具有不同的系统发育史；与嗜温蓝藻相比，三个嗜热蓝藻藻株，Thermosynechococcus elongatus BP-1， Synechococcus sp. JA-2-3B'a(2-13)，sp. JA-3-3Ab只含有Δ9去饱和酶基因，这可能与它们的生长环境（温泉）有关。 2、对已测序的7株真核微藻的脂肪酸去饱和酶基因进行比较基因组学分析，发现，真核微藻不饱和脂肪酸合成途径具有多样性。绿藻衣藻和团藻，O. tauri和O. lucimarinus，硅藻三角褐指藻和伪矮海链藻中均存在两条不饱和脂肪酸合成途径，原核途径和真核途径。原核途径位于叶绿体，真核途径位于内质网，但合成的脂肪酸产物有所不同。原始红藻C. merolae只含有3个去饱和酶基因，2个Δ9基因和1个Δ12基因。不饱和脂肪酸合成缺失了一条原核途径，明显不同于其他蓝藻、绿藻、硅藻和高等植物，这可能是由于它们的特定的生长环境（酸性火山温泉）导致的。 3、通过比较基因组学分析，从模式绿藻莱茵衣藻中发现了一个可能的内质网型Δ12去饱和酶基因（135825），以酿酒酵母作为表达系统，验证了该基因的功能，为明确该模式藻的脂肪酸合成途径提供了依据。 4、从南极小球藻NJ-7中克隆了参与不饱和脂肪酸合成途径的内质网型Δ12、Δ15去饱和酶基因和叶绿体型Δ12基因的部分cDNA序列，并利用RACE方法获得了内质网型Δ12基因的全长，以酿酒酵母作为表达系统，对该基因的功能进行了研究。 本研究首次利用比较基因组学的方法分析了37株蓝藻和7株真核微藻中的不饱和脂肪酸合成途径，在此基础上研究了莱茵衣藻135825基因的功能。并从南极绿藻小球藻中克隆了参与不饱和脂肪酸合成途径的内质网型Δ12、Δ15去饱和酶基因和叶绿体型Δ12基因，为进一步研究温度调节去饱和酶表达的模式，明确微藻低温适应的分子机理奠定了基础。

文蛤（Meretrix meretrix）幼虫生长发育相关基因的克隆和功能分析

贝类养殖是我国海水养殖业中最重要的组成部分之一。贝类人工大规模养殖中的关键环节是种苗的人工繁育，早期幼虫能否正常生长发育，对幼虫变态和变态后生长率及成活率有很大的影响，直接关系到生产产量和经济效益，所以，了解幼虫发育机制对于生产实践具有重要的指导意义。 文蛤（Meretrix meretrix）是一种在东亚各国沿海和滩涂地区广泛分布的双壳贝类，是我国一种重要的经济品种。本论文以文蛤幼虫为研究对象，分别对文蛤幼虫发育过程中贝壳形成相关的铁蛋白（MmeFer）、营养及变态相关的组织蛋白酶B（MmeCB）及变态过程中细胞凋亡相关的caspase三个基因进行了克隆，分析了基因及编码蛋白在担轮幼虫期（L1）、D形幼虫期（L2）、壳顶幼虫期（L3）和稚贝期（L4）的时空表达特征，解析了其可能的功能，并研究了相应酶类的特异性抑制剂作用对幼虫发育过程的影响，进行了目标蛋白的功能验证，详述如下： 研究结果显示，在文蛤胚胎发育到原肠胚时放入不含铁离子的人工海水中培养，发育成无壳的畸形，随着人工海水中铁离子添加浓度的升高，幼虫长出壳状组织接近正常状态；而发育到L1期幼虫放入不含铁离子的人工海水中培养却可以发育出正常的壳，推测铁和铁代谢相关蛋白在幼虫贝壳初始形成有重要的作用。根据构建的文蛤幼虫cDNA文库中提供的序列信息，从文蛤中克隆了与铁离子代谢密切相关的铁蛋白（MmeFer）的全长cDNA 序列；通过Real time PCR发现，MmeFer mRNA的表达量在贝壳形成前后有明显改变；整体原位杂交结果显示MmeFer mRNA在L1期的表达部位刚好是贝壳生成的起始部位，推断文蛤铁蛋白与文蛤幼虫贝壳初始形成密切相关。 利用文蛤幼虫cDNA文库中的EST信息在幼虫中克隆到文蛤组织蛋白酶B（MmeCB）全长cDNA序列；通过整体原位杂交分析发现MmeCB mRNA在L2至L4期幼虫的消化腺部位表达，而且在L2期的幼虫表皮也有表达，说明MmeCB可能和幼虫消化相关，而且可能参与幼虫从表皮摄取营养的过程。利用MmeCB特异性抑制剂（CA074Me）处理饥饿幼虫，发现其生长受到明显抑制，验证了MmeCB参与幼虫表皮营养代谢的推论。利用免疫组织化学技术，研究了MmeCB蛋白在文蛤幼虫中的时空分布，发现其在L2期幼虫表面和胃部有阳性信号，而在L3期，MmeCB在幼虫面盘基部有强烈的表达，提示MmeCB在文蛤幼虫中不仅起到营养的作用，而且可能和幼虫附着变态有关。利用CA074Me分别处理文蛤胚胎和变态期幼虫，发现抑制MmeCB的活性对胚胎发育和幼虫变态都有显著影响。研究结果提示MmeCB在幼虫发育各阶段均具有重要的生物学功能。 根据caspase在不同物种中的保守区域设计简并引物，在文蛤幼虫中扩增到cDNA序列片段；检测有活性的caspase在文蛤幼虫各发育时期的分布部位，发现其在L1至L3期幼虫中都有分布，说明整个幼虫形态变化过程中都有caspase的参与；细胞凋亡检测结果显示，幼虫主要发生细胞凋亡的部位在L3期幼虫的面盘，即变态过程中要退化的器官，说明细胞凋亡可能是文蛤幼虫变态过程中面盘退化的主要机制；用caspase特异性抑制剂处理变态前幼虫，发现幼虫变态率下降，初步验证了caspase在文蛤幼虫变态过程中的作用。 通过对上述三种基因的研究，分别探讨了文蛤幼虫发育阶段中的几个主要事件（L1期到L2期的贝壳形成、L2到L3期的幼虫营养摄食及L3到L4期的附着变态）相关的基因及其功能，为研究贝类生长发育调控的分子机理提供了新的线索。

栉孔扇贝抗氧化酶基因的克隆与表达分析

扇贝是我国海水养殖的重要品种，但自1994年以来，养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡，不但造成了巨大的经济损失，而且直接威胁到现有产业的生存和发展。扇贝病害的不断爆发以及病因的多样性迫切要求制定新的疾病防治措施和开发新型的抗菌物质。因此，深入研究扇贝免疫防御机制，探讨提高机体抗病力的有效途径和方法，改良种质和培育抗病品系，无疑是解决目前困扰扇贝养殖业健康可持续发展的必经之路。 抗氧化酶可以清除活性氧，是维持机体内氧环境平衡，抵抗外界环境影响的重要免疫因子。本研究采用大规模 EST 测序方法和同源克隆的方法，结合 cDNA 末端快速扩增（RACE）技术，从栉孔扇贝中克隆到了超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）等抗氧化酶基因的全长 cDNA序列，并对其基因结构进行了分析。同时，用实时定量PCR方法对这三个基因在健康扇贝血淋巴细胞、肾、鳃、肌肉、性腺等组织和在分别用鳗弧菌，溶壁微球菌和假丝酵母处理扇贝后不同时间段的表达差异情况进行了研究。 超氧化物歧化酶基因CfSOD的cDNA 全长为1022 bp，其中开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）含有 459 bp，编码 153个氨基酸残基，无信号肽，为胞内蛋白。经BLASTP分析发现，CfSOD与其它动物具有较高的同源性。CfSOD中存在两个Cu/Zn-SOD的签名序列；另外Cu结合必须氨基酸(His-45，-47，-62 和-119)和Zn结合必须氨基酸(His-62，-70，-79和Asp-82)在CfSOD中保守。实时定量PCR 检测发现，CfSOD在鳃、血细胞和肾中有较高的表达。在鳗弧菌和溶壁微球菌刺激后，CfSOD的相对表达量逐渐下降，然后分别在32小时和16小时的时候恢复到刺激前的表达水平。在假丝酵母刺激后，CfSOD的mRNA表达没有显著差异。 栉孔扇贝过氧化氢酶基因CfCAT的cDNA全长为3146 bp，其中开放阅读框含有1521bp，编码507个氨基酸残基，无信号肽，为胞内蛋白。经BLASTP分析发现，CfCAT与其它动物具有较高的同源性。 CfCAT中存在过氧化氢酶近端活性位点和过氧化氢酶近端血红素配体签名序列，另外存在两个糖基化位点 NFS和 NFT，同时在CfCAT 的C末端存在过氧化物酶体定位信号AQL，为典型过氧化氢酶。实时定量PCR 检测发现，健康的扇贝中CfCAT在鳃和性腺中有较高的表达。CfCAT基因在鳗弧菌刺后表达升高，在4小时达到最高，约是刺激前表达量的6.8倍（P<0.05），后随着时间的变化而逐渐下降。在8小时表达量达到为刺激前表达量的1.3倍（P<0.05），在16和32小时略高于刺激前的水平。在溶壁微球菌刺激后CfCAT基因表达量也呈上升趋势，在刺激后4小时达到刺激前表达量的约2倍，然后有所下降，在16 小时又上升到刺激前表达量的2.9倍。CfCAT基因在假丝酵母刺激后的表达略有升高，4小时约是刺激前的1.2倍（P<0.05），在其他时间段变化不明显。 栉孔扇贝谷胱甘肽过氧化物酶基因CfGPX的cDNA 全长为1290 bp，其中开放阅读框含有705bp，编码235个氨基酸残基，有一个24核苷酸的信号肽序列。经BLASTP 分析发现，CfSOD与其它动物具有较高的同源性。CfGPX中发现谷胱甘肽过氧化物酶活性位点的签名序列， 另外发现硒半胱氨酸和硒半胱氨酸插入序列，为含硒型谷胱甘肽过氧化物酶。实时定量PCR 检测发现，未经处理的扇贝中CfGPX在性腺、肌肉、血和肾中有较高的表达。CfGPX基因在鳗弧菌刺后表达量快速上升，在6 小时的时候表达量达到最高，为刺激前的4.0倍（P>0.05），后随着时间的变化而逐渐下降。在溶壁微球菌刺激后CfGPX在前6小时表达略有降低，在6小时的时候表达量为刺激前的0.5倍（P<0.05），后随着时间的变化而逐渐升高。在16小时的时候表达量为刺激前的2.1倍（P<0.05）。在假丝酵母刺激后， CfGPX的表达量略有下降在8小时的时候表达量为刺激前的0.8倍（P<0.05）。 实验证明栉孔扇贝的超氧化物歧化酶基因CfSOD，过氧化氢酶基因CfCAT，谷胱甘肽过氧化物酶基因CfGPX基因在机体抵抗外界微生物刺激中起到了重要的作用。

中国明对虾重要分子伴侣蛋白基因的克隆及表达研究

对虾养殖业的可持续发展面临着种质退化、病害严重和养殖环境恶化等问题的严重挑战。养殖环境恶化造成的环境胁迫，不但影响对虾的生长性状，而且导致对虾的抵抗力下降，更容易引发病害的发生。养殖环境恶化已经严重影响了对虾养殖业的健康可持续发展。本论文针对环境恶化造成的环境胁迫对对虾影响的分子机理进行了研究。 克隆了中国明对虾对环境胁迫应答的重要伴侣蛋白基因，包括钙网蛋白（FcCRT）、葡萄糖调节蛋白78 （FcGrp78）、热休克蛋白70（FcHsp70）和热休克蛋白90（FcHsp90）的全长cDNA，研究了这些基因的组织表达特征，并对这些基因在不同胁迫条件下的转录表达特征进行了分析。 钙网蛋白是一种多功能的内质网钙结合蛋白，负责蛋白折叠和糖蛋白修饰。本论文首次在中国明对虾报道了钙网蛋白FcCRT基因的全长cDNA序列，编码406个氨基酸，具有保守的N-，P-和C-功能域，以及信号肽和保守的HDEL内质网回收标签。FcCRT基因与其它物种的钙网蛋白具有高度的相似性，系统进化分析表明，FcCRT在亲缘关系上更接近昆虫的钙网蛋白。Northern blot和原位杂交结果显示，FcCRT基因在中国明对虾各组织中均有表达，且在卵巢中发育早起的卵母细胞中表达量最高，说明FcCRT很可能参与了卵母细胞的成熟。FcCRT基因在不同胁迫条件下，其转录表达均呈现明显的变化。在WSSV感染实验中，中国明对虾肝胰脏和淋巴器官中FcCRT转录表达均明显上调；热休克、重金属处理均可引起FcCRT基因转录表达的变化，但不同重金属处理引起FcCRT转录表达变化的模式不同。铜离子处理6小时，会引起FcCRT基因的下调表达，但在12小时之后出现明显上调；镉离子处理12小时后引起FcCRT基因的下调表达，但在24小时又出现明显的上调表达。 葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是内质网重要的伴侣蛋白。中国明对虾的Grp78基因（FcGrp78）的cDNA全长为2325bp，编码665个氨基酸。FcGrp78具有三个Hsp70蛋白家族标签，并含有KDEL内质网回收标签。FcGrp78基因与中国明对虾已有的Hsc70和Hsp70具有高度相似性。Northern blot杂交结果显示FcGrp78基因在中国明对虾各组织中均有表达。FcGrp78基因在WSSV感染的中国明对虾肝胰脏中呈上调表达，在血细胞中下调表达，说明FcGrp78可能与对虾的免疫应答有关。热休克处理会诱导FcGrp78基因转录的上调。不同重金属离子胁迫引起的FcGrp78转录表达有所不同：铜离子处理可以诱导FcGrp78基因在处理后24小时的上调表达；镉离子的处理导致FcGrp78基因处理后12小时的下调以及处理后24小时的上调表达变化。短期低氧胁迫则抑制对虾FcGrp78基因的转录表达。 本论文报道的中国明对虾FcHsp90基因 cDNA全长2552bp，编码726个氨基酸，具有保守的N端功能域、中间功能域和C端功能域，具有五个保守的Hsp90蛋白家族标签，序列上与其他物种Hsp90相似性高。Real-time RT-PCR结果显示FcHsp90基因在发育的卵巢中表达量较高，说明Hsp90可能参与了对虾卵母细胞成熟过程中的蛋白合成和卵黄蛋白原的分泌。WSSV感染引起中国明对虾肝胰脏的FcHsp90的转录表达明显上调，说明FcHsp90很可能与对虾的免疫相关。热休克处理诱导FcHsp90基因转录表达的迅速上调。铜离子处理也可诱导FcHsp90基因转录的上调表达，而镉离子处理首先引起FcHsp90基因的下调表达，24小时后开始上调。低氧胁迫也会抑制FcHsp90基因在对虾体内的转录表达。 诱导型FcHsp70基因cDNA全长2511bp，编码629个氨基酸，具有三个保守的Hsp70蛋白家族标签和C末端EEVD序列。与其他物种的Hsp70蛋白具有高度的相似性。FcHsp70基因转录表达对于热休克处理和铜离子的处理非常敏感：热休克处理2小时后FcHsp70基因的转录水平是对照组的80倍；铜离子处理12小时FcHsp70基因转录表达达到对照组的15倍。而镉离子处理后没有诱导FcHsp70显著的上调表达。 以上研究结果为阐明对虾对环境胁迫应答的机制奠定了重要基础，并可为抗逆对虾的培育提供依据。

栉孔扇贝凝集素家族基因研究

栉孔扇贝是我国北方重要的贝类养殖品种。自1997年以来爆发的栉孔扇贝大规模死亡，给地区经济造成了重大损失并且已经严重威胁扇贝养殖业的健康发展。然而，到目前为止，对扇贝免疫防御的分子机理了解还很少，深入研究扇贝免疫应答的分子机制是认识和了解病害发生和实现病害控制的关键问题之一。本研究采用了EST大规模测序结合cDNA锚定扩增的方法，从栉孔扇贝cDNA文库中克隆到五个C－型凝集素基因，并对其中部分基因进行了深入研究。 C－型凝集素CFLec－1的基因全长1785bp，其中含有5’非翻译区66bp，随后是666bp的开放阅读框；最后一条非常长的3’非翻译区1040bp，其中包含多个多聚腺甘酸加尾信号和polyA尾巴。栉孔扇贝CFLec－1编码221个氨基酸的蛋白，其N末端为15个氨基酸的信号肽。CFLec－1的成熟肽为206个氨基酸，其等电点为5.12，计算分子量为23.49kDa。SMART程序分析显示，C末端130氨基酸是一个标准的长型C－型凝集素结构域，其中四个半光胺酸（Cys104，Cys177，Cys193，Cys202）形成的两对二硫键维持了C－型凝集素的空间结构，而位于N末端的两个二硫键（Cys74，Cys85）构成了长型C－型凝集素结构域特有的一对额外二硫键。同源性分析表明，CFLec－1的C－型凝集素结构域与红原鸡的甘露糖受体中的C－型凝集素结构域有47％的相似度，与大西洋鲑的C－型凝集素受体C有31％的相似度。通过与其他同源的C－型凝集素结构域序列比对，发现了可能的糖结合位点EPD基域（Glu169-Pro170-Asp171）。通过RT－PCR研究CFLec－1在扇贝不同组织中的分布后发现，在健康扇贝中，CFLec－1在性腺中有中等程度的表达，在腮中有少量表达，在血淋巴和外套膜中有微量表达。经热处死的鳗弧菌刺激后，CFLec－1在几乎所有检测组织中的表达量都有明显的提高，其中，血淋巴中的表达量变化最为显著。这些结果说明CFLec－1是组成/诱导型基因，并且可能参与了黏膜防御。通过RT－PCR分析了CFLec－1在血淋巴中的表达特征后发现，在革兰氏阳性菌溶壁微球菌和革兰氏阴性菌鳗弧菌刺激后，CFLec－1的表达均显著高于对照组，并且成明显的随时间变化趋势。在大肠杆菌中表达的重组CFLec－1可以凝集革兰氏阴性菌大肠杆菌JM109，且凝集过程需要钙离子的参与。重组CFLec－1对大肠杆菌JM109有较弱的抑菌活性，对溶壁微球菌有明显的抑菌活性，对鳗弧菌没有抑菌活性。这一结果说明，CFLec－1可能不仅参与对入侵微生物的识别过程，而且可能作为效应分子起到了直接杀灭入侵微生物的作用。 CFLec-2的cDNA全长为708bp，其5’UTR为59bp。3’UTR为217bp。 CFLec-2的开放阅读框为432bp，编码160个氨基酸残基,其中包含5’信号肽17个残基。CFLec-2的编码区中含有一个C-型凝集素结构域。利用本研究中构建的原核表达载体，CFLec-2的成熟肽在大肠杆菌中被成功表达。 mCFLec-1的cDNA全长为2257bp，5’UTR17bp，3’UTR为713bp。mCFLec-1的开放阅读框为1527bp，编码508个氨基酸残基，其中包含17个氨基酸残基的信号肽序列。mCFLec-1的编码区含有三个串联的C-型凝集素结构域。利用本研究中构建的原核表达载体，mCFLec-2的成熟肽在大肠杆菌中被成功表达。 mCFLec-2的cDNA全长2086bp。其5’UTR长为18bp，3’UTR长为238bp。开放阅读框均为1776bp，编码609个氨基酸残基，其中包含N末端由18个氨基酸构成的信号肽。mCFLec-2的编码区包含四个C-型凝集素结构域。mCFlec-3的cDNA全长1897bp，其5’UTR和编码区与mCFLec-2几乎完全相同，只有个别碱基的差异。mCFlec-3的3’UTR为49bp。 本研究从扇贝机体本身的免疫机制入手，深入探讨其免疫机理，为进一步研究信号传导，了解扇贝先天性免疫的机制，为制定合理的研制策略提供坚实的理论基础；丰富和发展海水无脊椎动物免疫学的内容，为控制养殖生物疾病提供了新的思路；进一步通过高低等生物之间功能类似分子的同源性比对，为解释和阐明先天免疫这种已经存在数十亿年，从低等生物开始到人类仍旧保留且更加完善的免疫系统的奥秘和本质提供证据。

青岛文昌鱼肌肉生化分析及其功能基因的研究

本论文主要对青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)肌肉组织进行了酶组织化学实验和电镜观察，分离了青岛文昌鱼肌球蛋白重链基因异构体并将其重组表达；克隆了青岛文昌鱼新生肽链相关复合体α亚基基因，并检测了其时空表达情况。 根据NADH酶组化实验可以将文昌鱼的肌细胞分成两类，即蓝紫色、有氧代谢型的浅层肌和基本不着色、无氧代谢型的深层肌。电镜观察进一步验证了酶组化的结果，并首次发现浅层肌和中间肌细胞肌丝密度明显大于深层肌。而mATPase组化实验没能对肌纤维进行分类，这也许是由于实验的pH条件不是文昌鱼的肌纤维ATP酶活的pH；或者其很容易失活；或者该酶的活化需要不同于其它动物的金属离子的缘故。 克隆到三条对应于肌球蛋白重链尾部保守区的异构体，其中两条是首次报道。这三条异构体都属于II类肌球蛋白并和脊椎、无脊椎动物的多种类型的肌球蛋白分子有较高的同源性；利用原核表达系统对异构体进行重组表达，获得了可溶性的表达蛋白，为制备文昌鱼肌球蛋白特异性抗体打下了基础。 从青岛文昌鱼成体中分离到了新生肽链相关复合体α亚基的全长cDNA，并检测了其时空表达情况。对其cDNA 5’端的基因组序列进行预测和比较分析，没有发现肌肉特异性外显子的存在。

中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）几种免疫相关因子的分离纯化、基因克隆及相互关系研究

中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）是我国重要的海水养殖动物，但是近年来在其养殖过程中深受病害的影响，细菌性和病毒性疾病给对虾养殖业造成了巨大的经济损失，因此对中国明对虾免疫机理的研究对于对虾的疾病控制以及海水养殖业的持续发展具有重要意义。甲壳动物只具有天然免疫系统。天然免疫系统对于异己物质的识别是通过有限数量的模式识别蛋白（PRPs）来实现的。C型凝集素（C-type lectin）作为宿主防御系统中的一种模式识别受体，在病原识别和细胞间的相互作用上具有重要作用，此外它们还参与止血、凝固、物质运输和创伤修复等一系列作用；酚氧化酶（phenoloxidase）又称为酪氨酸酶(tyrosinase,EC1.14.18.1)。它是一种含铜的酶,能够催化单酚羟化成二酚(如多巴)，把二酚氧化成醌；醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素。血蓝蛋白(hemocyanins，Hc)是在软体动物和节肢动物血淋巴中发现的存在于细胞外、负责运输氧的一类巨大蛋白质。本论文从中国明对虾血清中纯化了利用亲和层析纯化了一种凝集素FC-L，并对FC-L的理化性质、多糖结合和细菌结合特性进行了研究。从中国明对虾血细胞中克隆了一种酚氧化酶原(prophenoloxidase,proPO)基因FCproPO，从肝胰腺中克隆了一种血蓝蛋白基因FCHc，分析了它们的分子结构特征，预测了其可能的作用，并对它们的组织分布、应答不同病原感染的表达变化模式以及相互关系进行了研究。

扇贝、对虾基因组BAC文库构建及其重要功能基因的初步筛选和分析

基因组大片段BAC文库是进行生物遗传学和基因组学研究必不可少的基础工具。为了深入开展栉孔扇贝（Chlamys farreri）和凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）基因组学研究、阐明其基因组的结构与功能、图位克隆重要功能基因、构建高密度物理图谱并最终实现与已有遗传连锁图的整合，本研究在植物基因组BAC文库构建技术的基础上，针对海洋生物的特点进行了大胆的改革与尝试，最终成功构建了C. ferrari和L. vannamei两种重要海水养殖动物的基因组BAC文库。 本文构建的栉孔扇贝基因组BAC文库，由BamHI文库和MboI文库构成。其中BamHI文库含有73,728个BAC克隆，空载率约为1%，平均插入片段约为110 kb，覆盖栉孔扇贝单倍体基因组约8倍；MboI文库共有7,680个克隆组成，平均插入片段大小约为145 kb，插入率为100%，覆盖栉孔扇贝单倍体基因组约1.1倍。两个栉孔扇贝基因组BAC文库共由81,408个克隆组成，平均插入片段约为113 kb，覆盖率约为栉孔扇贝单倍体基因组大小的9.1倍。 将栉孔扇贝基因组BAC文库的192个384微孔培养板中的73,728个BAC克隆以4 x 4点阵形式制备了高密度DNA薄膜，用于对感兴趣的基因及DNA序列的筛选。高密度DNA薄膜的覆盖率约为栉孔扇贝单倍体基因组的8.3倍。针对栉孔扇贝先天免疫系统通路的6个重要功能基因，根据栉孔扇贝cDNA序列以及异缘物种DNA序列设计了Overgo探针。利用Overgo探针对高密度DNA薄膜杂交筛选的结果显示，平均每个基因检测到7.3个潜在阳性克隆。 本研究所构建的凡纳滨对虾基因组HindIII酶切BAC文库共有102,528个BAC克隆，存放于267个384微孔培养板中，平均插入片段大小约为101 kb，空载率约为5%，覆盖L. vannamei单倍体基因组约5倍。将其中240个384微孔培养板中的92,160个BAC克隆以4 x 4的矩阵排列形式制作了5张高密度凡纳滨对虾DNA薄膜，约覆盖整个对虾单倍体基因组的4.5倍。针对6个与对虾免疫、生殖生理有关的重要功能基因设计了Overgo探针，杂交筛选出20个阳性克隆，平均每个基因有3.3个潜在阳性克隆。 以上筛选结果不仅为进一步研究这些功能基因的结构与功能、表达与调控，揭示它们在扇贝和对虾以及其他近缘种的免疫系统、抗逆和生殖生理过程中的作用机理打下了基础，同时也间接验证了栉孔扇贝和凡纳滨对虾基因组BAC文库将成为基因筛选、基因的结构与功能分析、基因图位克隆、物理图谱构建以及大规模全基因组测序等方面的有力工具。

扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CfKZSPI及Aikunitz的克隆与重组表达

扇贝养殖是我国重要的海水养殖产业，然而自1997 年以来，养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡，不但造成了巨大的经济损失，而且严重影响了该产业的健康发展。丝氨酸蛋白酶抑制因子及丝氨酸蛋白酶在无脊椎动物的免疫应答中起着核心作用，它们的协同作用直接导致外界病源入侵的信号转导和级联放大，并进一步激活一系列防御体系，如黑化反应、血液凝结和抗菌肽的合成等。因此，克隆扇贝参与免疫防御的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因并对其功能进行研究，将有助于进一步研究扇贝的免疫防御机制，丰富和发展无脊椎动物免疫学的内容。 运用大规模EST技术和RACE技术从栉孔扇贝中克隆出一个Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，定名为CfKZSPI。该基因cDNA序列全长1788bp，其中5' 非编码区（Untranslated Region, UTR）为97 bp，3' UTR161 bp，有一个典型的多聚腺苷酸信号序列（AATAAA）和一个ploy A 尾巴，开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）含有1530 bp，编码509 个氨基酸残基。对其推测氨基酸序列进行分析，发现其中包括22个氨基酸残基组成的信号肽序列和12个Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域。采用QRT-PCR（quantitative real time PCR）对鳗弧菌浸泡刺激后栉孔扇贝血淋巴中CfKZSPI 的 mRNA表达量进行了检测，发现其mRNA 的表达量在鳗弧菌刺激后3h明显上升，达到空白组的43.6倍；然后在6h时有所下降，为空白组的15.0倍；随着菌刺激时间的增长，CfKZSPI基因的 mRNA 表达量急剧增加，在刺激后8h，12h，24h分别达到空白组的174.1，207.8，675.4倍。统计分析发现3h（P=0.019<0.05）和12h（P=0.020<0.05）时，CfKZSPI基因mRNA表达量与空白组差异均显著。为了研究栉孔扇贝CfKZSPI的蛋白活性，将其第十二个结构域克隆到pET-32a（+）载体中，转化大肠杆菌Rosetta-gami（DE3）表达菌株，获得可溶性表达的蛋白rCfKZSPI-12，对其进行抑制蛋白酶活性的分析，发现其对胰蛋白酶有很强的抑制活性，而对凝血酶没有抑制活性。当rCfKZSPI-12与胰蛋白酶分子比率为1：1时，约90%的蛋白酶活性被抑制。运用狄更斯作图法研究rCfKZSPI-12对胰蛋白酶的抑制能力，结果发现其对胰蛋白酶的抑制常数为173 nmol L-1。 采用同样方法从海湾扇贝cDNA文库中克隆出一个Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，定名为Aikunitz。该基因全长632 bp，其中5' UTR 为105 bp，3' UTR 为 245 bp，有一个典型的多聚腺苷酸信号序列（AATAAA）和一个ploy A 尾巴，ORF 含有282 bp，编码93 个氨基酸残基。推测的氨基酸序列N末端有一个20个氨基酸残基组成的信号肽序列，成熟蛋白包括一个Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域。采用QRT-PCR对鳗弧菌和藤黄微球菌感染后海湾扇贝血淋巴中Aikunitz 的mRNA的表达量进行了检测，结果发现其在鳗弧菌刺激后3h到9h持续上升，9h时表达量为PBS对照组的4.49倍（P=0.008<0.05），然后开始下降，在72h时表达量为对照组的0.24倍（P=0.021<0.05）；而在藤黄微球菌刺激后3h到12h其表达量上升，其中6h时为空白组的5.95倍（P=0.0004<0.01）；12h以后迅速下降，其中24h的表达量为对照组的0.38倍（P=0.028<0.05）。将Aikunitz基因编码的成熟蛋白按照重组CfKZSPI-12的方法进行重组表达，并对重组蛋白进行抑制蛋白酶和抑菌活性分析。结果发现其对胰蛋白酶和弹性蛋白酶两种丝氨酸蛋白酶都没有抑制作用。抑菌实验同样发现，重组Aikunitz 对供试的革兰氏阳性菌藤黄微球菌和革兰氏阴性菌鳗弧菌和大肠杆菌都不显示明显抑菌活性。

海湾扇贝超氧化物歧化酶家族基因结构、表达和多态性分析

海湾扇贝Argopecten irradian Lamarck于1982年从美国引种到中国，由于具有较快的生长速度和很高的经济效益，海湾扇贝成为中国最主要的养殖贝类之一。近年来海湾扇贝养殖遇到了死亡率高等问题，深入开展海湾扇贝功能基因的研究，尤其是免疫相关基因及其机制研究并在此基础上寻找扇贝疾病防治的有效方法对海湾扇贝的健康养殖十分重要。 对于贝类免疫系统来说，其血细胞在先天性免疫防御中起着重要的作用。当受到外界病原侵染时，贝类血细胞的一个重要免疫反应就是吞噬作用。在吞噬病原过程中，受到病原侵染的贝类还会产生其他多种免疫反应，这些免疫反应将消耗大量的能量（ATP），产能的呼吸链会加速运转，由此也会引发与呼吸链相耦联的活性氧（ROS）的大量产生。这些活性氧具有极强的反应特性，能破坏病原微生物的结构和功能分子，实现对入侵病原的杀灭。利用活性氧对被吞噬的病原进行杀灭，这是吞噬作用消除病原抵御侵染的重要机制。但由于活性氧分子反应的非特异性，它们也会破坏宿主机体细胞内的功能蛋白分子、不饱和脂肪酸分子和核酸等，对细胞造成严重的伤害，进而导致机体生理机能的损伤和免疫系统的破坏。所以，及时消除病原感染机体内过量产生的ROS，维持相关细胞的正常代谢，对提高机体抵抗力和免疫力具有重要的作用。O2-是生物体内产生的第一种活性氧分子，其他的活性氧分子也是由它衍生而来，消除过量O2-是消除过量活性氧危害的第一步也是关键一步。生物体内，超氧化物歧化酶（SOD）是催化O2-发生歧化反应，消除O2-的关键酶。 首先，本文通过RACE方法获得了海湾扇贝SOD家族全部三种基因的cDNA全长并对其进行了序列的生物信息学分析，海湾扇贝AiCuZnSOD全长cDNA为1047个碱基，其中开放阅读框为459个碱基，编码152个氨基酸，与栉孔扇贝Chlamys farreri的CuZnSOD相似度为77.5%，与长牡蛎Crassostrea gigas的相似度为75%，与人的相似度为74.7%。AiMnSOD全长cDNA为1207个碱基，其中开放阅读框为678个碱基，编码226个氨基酸，序列比对结果发现AiMnSOD的氨基酸序列与虾夷扇贝Mizuhopecten yessoensis和皱纹盘鲍Haliotis discus hannai的相似度分别为85%和78.4%，与哺乳动物相似度也在68%~72%之间。AiECSOD全长cDNA为893个碱基，其中开放阅读框为657个碱基，编码218个氨基酸。AiECSOD与其它物种ECSOD相似度比较低。与线虫Brugia pahangi的相似度为27.9%，与疟蚊Anopheles gambiae的相似度为31.4%，与斑马鱼Danio rerio的相似度为27.8%，与人的相似度也只有28.6%，与同是贝类的长牡蛎ECSOD也只有28.1%的相似性。主要原因是AiECSOD的信号肽和肝磷脂结合区域在各物种中无同源性。 其次，采用qRT-PCR（quantitative real time PCR）方法分析三种SOD基因在不同组织中的表达情况，结果表明三种SOD基因的组织表达有所差异。AiCuZnSOD基因在鳃中表达水平最高，其次是血细胞和性腺，在外套膜、闭壳肌和肝胰脏表达水平较低。AiMnSOD基因在鳃中表达水平最高，其次是外套膜，在血细胞、性腺，而在肝胰脏和闭壳肌表达较弱。AiECSOD基因在血细胞中表达水平最高，其次是肝胰脏，在鳃、闭壳肌表达水平较低，而性腺和外套膜没有检测到。同时，采用qRT-PCR对鳗弧菌Vibrio angullarum感染后海湾扇贝血细胞中三种SOD基因mRNA表达变化进行了检测。AiCuZnSOD表达量在各个时间段没有显著差异(P > 0.05)。AiMnSOD的表达量在1.5 h时略有下降，在3 h时达到最高表达量，是空白组（0h）的3倍(P < 0.01)，从6 h到24 h表达量逐渐下降，24 h时表达量是空白组的1.6倍，24 h到48 h又稍有升高。AiECSOD的表达量在1.5 h时有所下降，是空白组的0.3倍（P < 0.05)，随后逐渐升高，在12 h时达到最高表达量，是空白组（0h）的4.5倍（P < 0.01），从24 h到48 h表达量逐渐下降并恢复到空白组的水平。在对照组，各个时间点没有显著差异（P > 0.05）。在鳗弧菌感染后，海湾扇贝三种SOD的表达并不一致，且差异比较显著。AiCuZnSOD被认为是构成性表达基因，其受外界刺激的影响最小，AiMnSOD和AiECSOD受刺激后表达上调比较明显。 第三，采用Genome-walking的方法得到了海湾扇贝三种SOD基因的基因组全长和近端启动子序列并对其进行了相关分析。AiCuZnSOD的基因组序列全长为4279bp，包含有4个外显子和3个内含子。AiMnSOD的基因组序列全长为10692bp，包含有4个外显子和3个内含子。AiECSOD的基因组序列全长为5276bp，包含有5个外显子和4个内含子。三种基因外显子和内含子的结合处序列遵循-AT/GT-原则。我们把海湾扇贝SOD家族的三个基因的近端启动子进行了比较分析。发现三种SOD在靠近起始密码子的位置都有Oct-1结合位点。三种SOD共有的转录位点有：Oct-1、C/EBPalp、Oct2.1、Sp-1和GATA-1。AiCuZnSOD和AiMnSOD共有的转录位点有：ICSBP、Ftz、TATA-box、C/EBPbeta和Antp。AiCuZnSOD和AiECSOD共有的转录位点有：AP-1和NFκB。AiMnSOD和AiECSOD共有的转录位点有：GR和ER。AiCuZnSOD独有的位点有：SRF、YY-1和NF-1。AiMnSOD独有的位点有：HNF-1、Hb、MEB、NF-muE1、Pit-1a和Eve。AiECSOD独有的位点有：CREB、RATA-alph、Kruppel-like和AP-3。 此外，通过构建原核表达载体，本研究对AiCuZnSOD和AiECSOD基因进行了体外重组表达，并对纯化的重组蛋白进行了酶活分析。酶活分析表明，重组AiCuZnSOD蛋白有较高的酶活和稳定性。 最后，我们对海湾扇贝三种SOD基因的部分区域，包括启动子、编码区，部分内含子区域进行了SNP检测，并对SOD基因部分SNP位点多态性和鳗弧菌敏感性进行了相关分析。三种SOD基因中，我们共发现了59个SNP位点，其中AiECSOD的SNP位点最多，特别是在启动子区，AiCuZnSOD和AiMnSOD多态性较低。其中AiCuZnSOD启动子区的-1739 T-C 位点的基因型和等位基因，AiECSOD启动子区的-498 A-T和-267 G-A等位基因频率，AiECSOD的第一个外显子38 Thr-Lys的多态性在敏感和抗菌群体中存在显著差异（P < 0.05）。

牙鲆免疫系统和抗病力的研究

本文主要以一龄牙鲆为研究对象，研究了牙鲆免疫系统的组成，以初步探讨牙鲆的抗病机制，并为牙鲆生理状况的诊断建立快捷的方法；研究了牙鲆主要消化酶的活性，为牙鲆的营养强化进行基础性的研究；研究了含有大麻哈鱼生长激素基因的重组酵母菌对牙鲆的生长和非特异性免疫能力的影响；同时对牙鲆热激蛋白hsp70的cDNA进行了合成和扩增。本论文共包括四个部分，由十个实验组成，每个实验的研究内容介绍如下：实验1 利用姬姆萨染色技术观察了牙鲆血细胞的显微结构。结果表明，牙鲆的血细胞由红细胞和白细胞组成，两类细胞的显微结构具有明显的差异；红细胞有细胞核，在血细胞的组成中占较高比例；不同种类的白细胞其结构不同，实验中发现了血栓细胞、淋巴细胞、单核细胞；但是只凭借光学显微形态的差异难以对白细胞进行更确切的分类。实验2 利用透射电镜技术对牙鲆外周血细胞的超显微结构进行了观察。牙鲆的血细胞可以分为红细胞和白细胞；白细胞包括淋巴细胞、血栓细胞、单核细胞、粒细胞；粒细胞包含两种类型；实验中还发现了类似巨噬细胞的一类细胞，但未发现浆细胞的存在。实验3 利用区带毛细管电泳技术对牙鲆血清蛋白的组成进行了分析。实验条件下，牙鲆的血清蛋白主要包含三种类型，即P2.59, P1.60, P0.77。三种蛋白的分子量和稳定性各不相同，初步判断这三种蛋白主要为白蛋白、α球蛋白和β球蛋白。实验4和实验5 对溶菌酶和抗蛋白酶物质在假雄牙鲆体内的分布以及不同在组织和器官中的比活性进行了研究。溶菌酶广泛分布于牙鲆的体表粘液、鳃、血清、消化组织和脾、肾等组织中；抗蛋白酶物质广泛分布于体表粘液、鳃、血清、肌肉中。在不同的组织和器官中，这种酶的比活性不完全相同。体表粘液、血清、肝脏、前肠、肾、鳃中溶菌酶的比活性较高；胃、中肠、后肠、脾中溶菌酶的比活性较低；胆汁中溶菌酶的比活性最低。血清和体表粘液中抗蛋白酶物质的比活性较高，鳃和肌肉中抗蛋白酶物质的比活性较低。由实验结果可知，鳃和消化道在牙鲆抵抗病原微生物侵袭的过程中发挥着重要的作用。实验6 对碱性磷酸酶在牙鲆体内不同消化器官中的分布进行了研究。碱性磷酸酶在牙鲆的胃、肝脏、肠中广泛分布。在前肠和中肠部位酶的比活性较其它部位的高。胃中碱性磷酸酶的比活性随季节的不同没有显著变化，而肠和肝脏中酶的比活性随季节的不同具有较显著的变化。实验 7 对牙鲆体内消化酶的比活性进行了研究。在牙鲆的胃、前肠、中肠、后肠中可以检测出蛋白酶、脂肪酶、酶、纤维素酶的活性。胃中的蛋白酶主要为酸性蛋白酶，肠中的蛋白酶主要为碱性蛋白酶。肠中蛋白酶的比活性由前肠向后肠递减，前肠与中肠酶的比活性没有显著差异；牙鲆肠中脂肪酶的比活性较胃中的高，在肠的不同部位脂肪酶的比活性无显著差异；牙鲆前肠中酶的比活性最高，胃中的次之，中肠、后肠中淀粉酶的比活性较低；牙鲆的胃及肠道不同部位处的纤维素酶的比活性没有显著差异。随着牙鲆的生长，蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶的比活性增强，酶的比活性减弱；其中胃和中肠内纤维素酶的比活性增强得较显著。实验8和实验9 研究了重组酵母菌对牙鲆的生长、血清中某些激素的含量、血清蛋白的含量，以及血清中溶菌酶和抗蛋白酶物质的比活性等生理指标的影响。通过投喂重组酵母菌，可以提高牙鲆血清中生长激素的含量，影响牙鲆血清中甲状腺激素和三碘甲状腺原氨酸的含量，促进牙鲆的生长，同时能够增加牙血清蛋白的含量，增强牙鲆血清中溶菌酶和抗蛋白酶物质的比活性。牙鲆体内生长激素含量的增加以及酵母菌细胞壁中的多糖成分都能够增强牙鲆的非特异性免疫能力。实验 10 对牙鲆肝脏中热激蛋白hsp70的cDNA序列进行了合成和PCR扩增。在实验条件下能够合成750bp左右的核酸序列，为进一步利用热激蛋白hsp70作为生理指标来诊断牙鲆的生理状态，以及研究热激蛋白在牙鲆抵抗外界胁迫中所发挥的作用提供了基础。

Follistatin 基因在牙鲆胚胎中的表达及其在肌肉发育中作用的研究

卵泡抑素(Follistatin)是1987年由Robertson和Ueno分别从牛和猪的卵泡液中分离出的一种富含半胱氨酸的糖基化单链多肽。FS对不同类型的细胞有广泛的调节作用，具有多方面的生物学作用。本研究克隆到牙鲆Follistatin基因，并利用RT-PCR和原位杂交对其在胚胎及成体中的表达进行了分析，并对其启动子进行了组织特异性分析。 1． Follistatin基因组全长4.3 kb左右，其中启动子区长约1 kb。与cDNA序列的比较显示该基因含有5个外显子和4个内含子，内含子和外显子的交界处严格遵守GT…AG规则。Follistatin基因编码了一个含有323个氨基酸的蛋白质前体，该蛋白质前体含有信号肽区域、N-端结构域、Follistatin结构域Ⅰ、Follistatin结构域Ⅱ、Follistatin结构域Ⅲ和C-端结构域。蛋白比较分析表明Follistatin与其他物种的Follistatin的同源性较高，其结构域保守性更高。 三级预测结果显示：在空间构型上，牙鲆Follistatin基因与斑马鱼Follistatin基因完全一致。在序列上高度保守的半胱氨酸在空间上两两相对，它们可能对维持Follistatin蛋白的空间结构起着重要的作用 2. RT-PCR方法和原位杂交方法研究Follistatin基因在牙鲆胚胎中的表达情况结果显示：Follistatin基因在受精后26 hrs开始在中胚层细胞处表达，其后在受精后28、30、32、34、36、38、40、42 hrs等时期Follistatin基因持续表达，并在体节腹部部位、头部，背部体节等部位表达。以MyoD为对照而进行的双色原位杂交结果显示：Follistatin与MyoD在胚胎的体节处表达有重叠区域，对双色原位杂交样品进行的冰冻切片实验结果显示：两个基因的表达区域交叉，互相混合，表明Follistatin基因也在肌肉前体细胞中表达，但并不在所有的前体细胞中表达，Follistatin可能在肌肉发育早期起一定的作用。成体组织中，Follitatin基因在体肾、肠、心脏、头肾、脾中有表达，而在肌肉中没有表达。 3．启动子序列分析结果表明：牙鲆启动子存在AP-1、C/EBP、SP1、USF、E47、MyoD等转录因子的潜在结合位点。显微注射结果显示：该基因启动子能够使绿色荧光蛋白表达在斑马鱼的胚胎肌肉组织中。

中国明对虾Toll样受体基因的克隆与表达分析

对虾病害在世界范围内的广泛传播，给水产养殖和沿海农村经济造成了重大损失。自1993 年对虾白斑病暴发以来，中国明对虾的养殖一直一蹶不振。引起对虾大规模死亡的原因是多方面的，其主要原因是养殖环境恶化、对虾种质退化和抗病力下降。因此，深入开展对虾免疫机制研究，并在此基础上寻找对虾疾病防治的有效方法，改良种质和培育抗病品系，已成为对虾养殖业走可持续发展之路的当务之急。 Toll 样受体（Toll-like receptors, TLRs）家族是进化保守的哺乳动物模式识别蛋白（pattern recognition receptors, PRR），在先天免疫系统中起着非常重要的作用。本研究采用同源克隆和RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术从中国明对虾中克隆到Toll 样受体同源基因，并将其命名为FcToll。它全长4115 bp，3’UTR 包含16 个poly A 尾巴，开放阅读框编码931 个氨基酸的多肽。预测的该多肽包含典型的Toll 样受体结构，分为胞外区、跨膜区和胞内区。其中胞外区有信号肽，有16 个富含亮氨酸的重复序列eucine-rich repeats, LRR），并含有2个LRR-C 末端基序和2 个LRR-N 末端基序；跨膜区是23 个氨基酸的一次跨膜结构域；胞内区是含有139 个氨基酸的TIR 结构域（Toll/Interleukin-1R）。克隆 发现FcToll 的基因组结构包含5 个外显子和4 个内含子。系统发生分析揭示FcToll归属于“昆虫型”的无脊椎动物Toll 样受体家族。组织分布研究发现FcToll 在中国明对虾中是组成型表达的，在淋巴器官中表达量较显著。分别利用不同病原体刺激健康的中国明对虾，Real-time PCR 发现该基因在刺激后表达水平呈现不同的表达谱：灭活鳗弧菌（Vibrio anguillarum）注射后5 小时，该基因表达显著 上调；而WSSV（white spot syndrome virus）注射后该基因表达则迅速下调，感染后23 小时内其表达水平均低于对应时间点的对照组。这就表明FcToll 可能参与中国明对虾的先天免疫防御，尤其可能参与入侵弧菌的免疫应答。