Analysen zur Expression proinflammatorischer Mediatoren in humanen Zellkulturmodellen und murinen Tiermodellen chronisch-inflammatorischer Erkrankungen

Die humane induzierbare NO-Synthase (iNOS) spielt bei zahlreichen Erkrankungen wie Asthma, Krebs und der rheumatoiden Arthritis eine entscheidende Rolle. Durch Fehlregulation der iNOS-Expression kommt es h��ufig zu massiven Gewebesch��digungen. Aus diesem Grund ist es wichtig die Mechanismen der Genregulation der iNOS-Expression zu verstehen. Bei Affinit��tschromatographie-Analysen wurde das zytosolische PolyA-bindende Protein (PABP) als direkter Interaktionspartner der 3��UTR der humanen iNOS identifiziert. Weitere Bindungsanalysen konnten eine spezifische Bindestelle f��r PABP in der 5��UTR und zwei Bindestellen im AU-reichen Bereich der 3��UTR der humanen iNOS nachweisen. Eine siRNA-mediierte Herabregulation von PABP mit Hilfe der stabilen Expression spezifischer siRNAs in DLD-1 Zellen (siPABP Zellen) zeigte eine signifikant verringerte Expression der humanen iNOS und damit einhergehend eine verringerte NO-Produktion nach Zytokinstimulation. Promotoranalysen zeigten keine Ver��nderung der Induzierbarkeit des humanen 16 kb iNOS-Promotors in siPABP Zellen. RNA-Stabilit��tsanalysen zeigten einen verst��rkten Abbau der iNOS-mRNA in diesen Zellen, so dass davon auszugehen ist, dass die Regulation der humanen iNOS ��ber die mRNA-Stabilit��t erfolgt. Reportergen-Analysen mit Plasmiden, welche die 5��� und/oder 3���UTR Sequenzen der humanen iNOS mit den identifizierten PABP-Bindestellen oder Mutationen in diesen Bindestellen enthielten, zeigten, dass PABP die iNOS-mRNA ��ber die 5��UTR stabilisiert und anscheinend ��ber die 3��UTR einen destabilisierenden Effekt auf die mRNA aus��bt. Ebenfalls scheint PABP ��ber die 3���UTR dieTranslation der iNOS mRNA zu hemmen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass PABP, ��ber seine allgemeinen Funktionen hinaus, eine spezifische Rolle in der Regulation der Expression der humanen iNOS einnimmt.rnDie rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch entz��ndliche Autoimmunerkrankung, welche ��berwiegend die peripheren Gelenke der H��nde und F����e betrifft. Die aktuellen Therapiem��glichkeiten sind immer noch mit einer Vielzahl von Nebenwirkungen behaftet und f��hren nicht zur vollst��ndigen Remission der Erkrankung, so dass die Entwicklung neuer Medikamente unerl��sslich ist. In dieser Arbeit wurden die antiinflammatorischen Substanzen Gallielalacton (Gal) und Oxacyclododecindion (Oxa) im Mausmodell der kollagen-induzierten Arthritis (CIA) getestet. Leider waren beide Substanzen nicht in der Lage die Symptome der CIA zu vermindern, obwohl beide im Modell der LPS-induzierten akuten Entz��ndung die Expression proinflammatorischer Mediatoren senken konnten. Die Substanz S-Curvularin (SC) hat sich im CIA-Modell bereits bew��hrt und wurde in dieser Arbeit weiter untersucht. SC war in der Lage die Expression knorpel- und knochendestruktiver Markergene signifikant zu verrindern. rnIn der vorliegenden Arbeit wurden neue microRNAs identifiziert, die in der Pathogenese der CIA eine Dysregulation zeigen. Die Expression dieser microRNAs wurde von SC wieder auf das Normalniveau gebracht, so dass SC eine vielversprechende Substanz in der Therapie chronisch inflammatorische Erkrangungen sein k��nnte. Die neu identifizierten CIA-relevanten microRNAs k��nnten als neueRA-Marker oder als Zielstrukturen f��r neue Medikamente dienen.rn

The role of dendritic cells (DC) in Friend retrovirus-induced immunosuppression and immunotherapeutic applications of functionalized nanoparticles

Friend murine leukemia Virus (FV) infection of immunocompetent mice is a well- established model to acquire further knowledge about viral immune suppression mechanisms, with the aim to develop therapeutics against retrovirus-induced diseases. Interestingly, BALB/c mice are infected by low doses of FV and die from FV-induced erythroleukemia, while C57/BL6 mice are infected by FV only at high viral dose, and remain persistently infected for their whole life. Due to the central role of dendritic cells (DC) in the induction of anti-viral responses, we asked for their functional role in the genotype-dependent sensitivity towards FV infection. In my PhD study I showed that bone marrow (BM)-derived DC differentiated from FV-infected BM cells obtained from FV-inoculated BALB/c (FV susceptible) and C57BL/6 (FV resistant) mice showed an increased endocytotic activity and lowered expression of MHCII and of costimulatory receptors as compared with non-infected control BMDC. FV-infected BMDC from either mouse strain were partially resistant towards stimulation-induced upregulation of MHCII and costimulators, and accordingly were poor T cell stimulators in vitro and in vivo. In addition, FV-infected BMDC displayed an altered expression profile of proinflammator cytokines and favoured Th2 polarization. Ongoing work is focussed on elucidating the functional role of proteins identified as differentially expressed in FV-infected DC in a genotype-dependent manner, which therefore may contribute to the differential course of FV infection in vivo in BALB/c versus C57BL/6 mice. So far, more than 300 proteins have been identified which are differently regulated in FV-infected vs. uninfected DC from both mouse strains. One of these proteins, S100A9, was strongly upregulated specifically in BMDC derived from FV-infected C57BL/6 BM cells. S100A9-/- mice were more sensitive towards inoculation with FV than corresponding wild type (WT) mice (both C57BL/6 background), which suggests a decisive role of this factor for anti-viral defense. In addition, FV-infected S100A9-/- BMDC showed lower motility than WT DC. The future work is aimed to further elucidate the functional importance of S100A9 for DC functions. To exploit the potential of DC for immunotherapeutic applications, in another project of this PhD study the usability of different types of functionalized nanoparticles

Regulatory T cell-mediated suppression of Th9 cell development and effector function

T helper (Th) 9 cells are an important subpopulation of the CD4+ T helper cells. Due to their ability to secrete Interleukin-(IL-)9, Th9 cells essentially contribute to the expulsion of parasitic helminths from the intestinal tract but they play also an immunopathological role in the course of asthma. Recently, a beneficial function of Th9 cells in anti-tumor immune responses was published. In a murine melanoma tumor model Th9 cells were shown to enhance the anti-melanoma immune response via the recruitment of CD8+ T cells, dendritic cells and mast cells. In contrast to Th9 effector cells regulatory T cells (Tregs) are able to control an immune response with the aid of different suppressive mechanisms. Based on their ability to suppress an immune response Tregs are believed to be beneficial in asthma by diminishing excessive allergic reactions. However, concerning cancer they can have a detrimental function because Tregs inhibit an effective anti-tumor immune reaction. Thus, the analysis of Th9 suppression by Tregs is of central importance concerning the development of therapeutic strategies for the treatment of cancer and allergic diseases and was therefore the main objective of this PhD thesis.rnIn general it could be demonstrated that the development of Th9 cells can be inhibited by Tregs in vitro. The production of the lineage-specific cytokine IL-9 by developing Th9 cells was completely suppressed at a Treg/Th9 ratio of 1:1 on the transcriptional (qRT-PCR) as well as on the translational level (ELISA). In contrast, the expression of IRF4 that was found to strongly promote Th9 development was not reduced in the presence of Tregs, suggesting that IRF4 requires additional transcription factors to induce the differentiation of Th9 cells. In order to identify such factors, which regulate Th9 development and therefore represent potential targets for Treg-mediated suppressive mechanisms, a transcriptome analysis using ���next-generation sequencing��� was performed. The expression of some genes which were found to be up- or downregulated in Th9 cells in the presence of Tregs was validated with qRT-PCR. Time limitations prevented a detailed functional analysis of these candidate genes. Nevertheless, the analysis of the suppressive mechanisms revealed that Tregs probably suppress Th9 cells via the increase of the intracellular cAMP concentration. In contrast, IL-9 production by differentiated Th9 cells was only marginally affected by Tregs in vitro and in vivo analysis (asthma, melanoma model). Hence, Tregs represent very effective inhibitors of Th9 development whereas they have only a minimal suppressive influence on differentiated Th9 cells.rn

Evaluation zellul��rer Mechanismen der allergen-spezifischen Immuntherapie in einem chronischen Modell der allergischen Atemwegsentz��ndung

Klinische Studien haben gezeigt, dass die allergenspezifische Immuntherapie (SIT) eine effektive Therapieoption f��r allergische Erkrankungen ist. Obwohl dieses Therapieverfahren seit ��ber 100 Jahren existiert, sind die zugrunde liegenden Suppressionsmechanismen jedoch nicht vollst��ndig verstanden. Bisher wird angenommen, dass der Behandlungserfolg der SIT auf einer Blockade durch allergenspezifische Antik��rper, einer Verschiebung des Th1-Th2-Gleichgewichtes und/oder auf einer Suppression durch regulatorische T-Zellen (Tregs) basiert. Um die Effekte der SIT in einer chronischen Erkrankung in vivo untersuchen zu k��nnen, wurde in dieser Doktorarbeit ein Mausmodell f��r chronisches Asthma entwickelt, das die Situation im Menschen nach einer SIT nachahmt. rnDurch eine SIT war es m��glich, allergeninduzierte Asthmasymptome wie Atemwegshyperreagibilit��t (AHR), Eosinophilie in der Lunge, IgE-Produktion und Atemwegsentz��ndung im Modell zu unterdr��cken. Bemerkenswert ist, dass durch OVA-spezifische Immuntherapie (OVA-IT) ebenfalls eine Verringerung der strukturellen Ver��nderungen im Lungengewebe im chronischen Krankheitsverlauf erreicht wurde.rnDes Weiteren wurde in diesem Modell nach den Prozessen gesucht, die f��r die toleranzinduzierende Wirkung der SIT verantwortlich sein k��nnen. Dabei wurde im Vergleich zur Placebo-behandelten Gruppe eine erh��hte Antwort spezifischer IgG1-Antik��rper, eine verst��rkte Th1-Antwort, sowie eine erh��hte Frequenz von FoxP3+ Tregs und von IL-10-produzierenden T-Zellen (Tr1-Zellen) nach OVA-IT festge-stellt. Zur weiteren Untersuchung der von SIT-induzierten T-Zellantworten wurden Mausmodelle des allergischen Asthmas mit einem akuten Verlauf gew��hlt.rnDie Bedeutung der Th1-Zellen f��r die SIT wurde in T-bet-/- M��usen untersucht, welche aufgrund des Fehlens des Transkriptionsfaktors T-bet keine stabile Th1-Antwort induzieren k��nnen. Durch SIT war es m��glich, allergeninduzierte Asthmasymptome wie AHR, eosinophile Granulozyten in der Lunge, IgE-Produktion und Atemwegsentz��ndung in den T-bet-/- Tieren im gleichen Ma��e wie in den Wildtyptieren zu unterdr��cken. Diese Untersuchung zeigte, dass die SIT auch ohne funktionelle Th1-Zellen die allergische Entz��ndung unterdr��cken kann. rnDie Rolle der Tregs f��r die SIT wurde in DO11.10 M��usen und DO11.10 RAG-/- M��usen untersucht. In beiden St��mmen konnte nach SIT eine Induktion OVA-spezifischer Tregs nachgewiesen werden. In DO11.10 RAG-/- M��usen k��nnen durch den Knockout im rag2-Gen keine nat��rlichen, d.h. im Thymus gereiften, Tregs entstehen. Im Blut von DO11.10 RAG-/- M��usen war direkt nach Durchf��hrung der OVA-IT eine FoxP3+ Treg-Population detektierbar. Demnach wird durch die OVA-IT eine de-novo-Induktion von FoxP3+ Tregs in Gang gesetzt. In Abwesenheit der nat��rlichen Tregs zeigte sich weiterhin, dass diese Zellen zur Produktion von IL-10 in T-Zellen und somit zum Erfolg der SIT beitragen.rnDie Rolle der FoxP3+ Tregs bei der SIT wurde in DEREG M��usen untersucht. Eine Depletion der FoxP3+ Tregs in DEREG M��usen w��hrend der Durchf��hrung der OVA-IT hob die protektiven Effekte der Therapie jedoch nur teilweise auf. rnUm die Rolle des regulatorischen Zytokins IL-10 bei der SIT zu untersuchen, wurde ein blockierender Antik��rper gegen den IL-10-Rezeptor (anti-IL-10R) im chronischen Modell des allergischen Asthmas mit SIT angewendet. Anti-IL-10R hob die protektive Wirkung der SIT auf die AHR, die Atemwegsentz��ndung und die strukturellen Ver��nderungen im Lungengewebe auf. Somit ist die protektive Wirkung der SIT abh��ngig vom IL-10-Signalweg.rnZusammenfassend stellt diese Arbeit die Bedeutung der SIT f��r allergische Erkrankungen heraus. SIT kann durch die positive Beeinflussung der allergiebedingten, strukturellen Ver��nderungen in der Lunge auch f��r Asthmapatienten gro��e Vorteile bringen. Die aus Studien bekannten Mechanismen konnten im Modell best��tigt werden und wurden im weiteren Verlauf untersucht. Die Arbeit stellt im Besonderen die Bedeutung der IL-10-produzierenden und FoxP3+ Tregs f��r die Effektivit��t der SIT in den Vordergrund. Zudem ist durch die Etablierung eines neuen Mausmodells der SIT f��r chronisches allergisches Asthma ein Mittel zur weiteren Erforschung der zugrunde liegenden Prozesse dieser erfolgreichen Therapie geschaffen worden. rn

Molekulare Charakterisierung der Il-9-Genexpression in T-Helfer-Typ-9-Zellen

CD4+ T-Zellen k��nnen in verschiedene T-Helferzellsubpopulationen differenzieren. Dabei h��ngt es von verschiedensten Milieubedingungen ab, welche Subpopulation sich auspr��gt, damit die CD4+ T-Zelle durch die Sekretion verschiedenster Zytokine ihre Funktion im Immunsystem wahrnehmen kann.rnBei der Th9-Subpopulation handelt es sich um einen IL-9-produzierenden Ph��notyp, welcher sich in der Anwesenheit von TGF-�� und IL-4 entwickelt39. Als treibender Transkriptionsfaktor f��r diese Subpopulation wurde das Protein IRF4 beschrieben45. Da dieser Transkriptionsfaktor auch f��r die Differenzierung weiterer Subpopulationen, wie Th2- und Th17-Zellen von Bedeutung ist30,121, stellte sich die Frage, welcher Interaktionspartner von IRF4 dar��ber entscheidet, welcher Subtyp sich entwickelt. Deshalb wurde in dieser Arbeit der Transkriptionsfaktor NFATc2 als m��glicher Interaktionspartner f��r IRF4 am murinen Il9 Promotor untersucht. Allerdings zeigten Reportergen��analysen, dass NFATc2 die IL-9-Produktion in Th9-Zellen inhibiert anstatt sie zu f��rdern. Th9-Zellen aus NFATc2-defizienten Tieren zeigen folglich im Vergleich zu wildtypischen Th9-Zellen sowohl nach Prim��r- als auch nach Restimulation eine verst��rkte IL-9-Produktion. Der Faktor NFATc2 kann somit als transkriptioneller Aktivator f��r die IL-9-Expression in Th9-Zellen ausgeschlossen werden. In vivo wurden diese Beobachtungen dadurch untermauert, dass NFATc2-defiziente Tiere im Rahmen des Asthma bronchiale zu einer verst��rkten pulmonalen Inflammation neigen und auch einen erh��hten Atemwegswiderstand nach Methacholin-Provokation aufweisen. Diese asthmatischen Symptome konnten durch Applikation eines neutralisierenden Antik��rpers f��r IL-9 wesentlich gemildert werden. In einem B16F10-Melanommodell konnten NFATc2-defiziente Tiere gegen��ber dem Wildtyp eine verbesserte anti-Tumorantwort auspr��gen. Nach Gabe eines IL-9-neutralisierenden Antik��rpers, wurde dieser Effekt wiederum gemildert.rnZusammenfassend l��sst sich sagen, dass IRF4 nicht mit NFATc2 am murinen Il9 Promotor interagiert, um die IL-9-Expression in Th9-Zellen zu f��rdern. Eine NFATc2-Defizienz resultiert sogar in einer gesteigerten IL-9-Produktion, womit ein inhibitorischer Einfluss von NFATc2 in Bezug auf die IL-9-Expression in Th9-Zellen nachgewiesen werden konnte.rn

Funktionelle Charakterisierung der Protein-Kinase CK2 in der Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch regulatorische T-Zellen

Regulatorische T-Zellen (Tregs) leisten durch ihre suppressiven Eigenschaften einen essenziellen Beitrag zur Aufrechterhaltung der immunologischen Toleranz. Sie verhindern sch��dliche Immunreaktionen gegen Autoantigene, kommensale Bakterien, sowie harmlose Nahrungsmittel-bestandteile. Gleichzeitig gew��hrleisten sie die Entwicklung effektiver Immunantworten gegen eindringende Pathogene, wie z.B. Parasiten, Bakterien und Viren. Damit haben Tregs direkten Einfluss auf das Gleichgewicht zwischen Immunit��t und Toleranz. Fehler in der suppressiven Funktionsweise von Tregs beg��nstigen daher auf der einen Seite die Entstehung zahlreicher autoimmuner Erkrankungen und Allergien. Auf der anderen Seite k��nnen Tregs Immunreaktionen bei chronischen Infektionen reduzieren, sowie die Entstehung effektiver Immunantworten gegen Tumore hemmen. Ihre Beteiligung an der ��tiologie all dieser Krankheiten macht Tregs zu einem bedeutenden potenziellen Zielobjekt, um diese Krankheiten effektiv zu therapieren. Die Erweiterung des Grundwissens um die molekularen Mechanismen der Treg-vermittelten Suppression ist daher ein notwendiger Schritt bei der Entwicklung Treg-basierter Theraphieans��tze. 2003 konnte mit Foxp3 ein Transkriptionsfaktor identifiziert werden, der ma��geblich die suppressiven Funktionen von Tregs steuert. Um weiteren Einblick in die der Suppression zugrundeliegenden Signalwege zu erhalten, wurde im Institut f��r Immunologie ein komparativer Kinomarray durchgef��hrt, anhand dessen die Casein Kinase 2 (CK2) als eine der aktivsten Kinasen in Tregs identifiziert wurde (Daten freundlicherweise von Prof. Dr. Tobias Bopp bereitgestellt). rnBasierend auf den Ergebnissen des Kinomarrays wurde in dieser Arbeit die Funktion der CK2 in Tregs untersucht. Dabei konnte in in vitro Experimenten die Treg-vermittelte Suppression durch den pharmakologische CK2 Inhibitor DMAT aufgehoben werden. Weil derartige Inhibitoren jedoch nicht absolut spezifisch die Aktivit��t nur einer Kinase supprimieren, wurden au��erdem M��use mit konditionalem ���knockout��� der CK2�� Untereinheit spezifisch in Tregs gekreuzt (CK2��Treg-/- M��use). Die Analyse dieser Tiere offenbarte eine essenzielle Beteiligung der CK2 an den suppressiven Funktionen von Tregs. So entwickeln CK2��Treg-/- M��use mit zunehmendem Alter Splenomegalien und Lymphadenopathien, von denen in besonderem Ma��e die Mukosa-assoziierten Lymphknoten betroffen sind. Eine Analyse des Aktivierungsstatus der T-Zellen in den Tieren konnte zudem einen erh��hten Anteil sogenannter Effektor-Ged��chtnis T-Zellen aufdecken, die charakteristische Merkmale eines Th2 Ph��notyps zeigten. Erh��hte Titer des Antik��rperisotyps IgE in den Seren von CK2��Treg-/- M��usen suggerieren zus��tzlich eine fehlerhafte Suppression speziell Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2��-defiziente Tregs. In Th2-vermittelten Asthma Experimenten in vivo konnte der Verdacht der fehlerhaften Kontrolle von Th2-Antwort best��tigt werden, wobei zus��tzlich aufgedeckt wurde, dass bereits unbehandelte CK2��Treg-/- M��use Zeichen einer Entz��ndungsreaktion in der Lunge aufweisen. Bei der Suche nach den molekularen Ursachen der fehlerhaften Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2��-defiziente Tregs konnten zwei m��gliche Erkl��rungsans��tze gefunden werden. Zum einen zeigen CK2��-defiziente Tregs eine verringerte Expression von Foxp3, was, in Analogie zu Ergebnissen der Gruppe von R. Flavell (Wang Y.Y. Nature. 445, 766-770 (2007)), zu einer Konversion von Tregs zu Th2 Zellen und damit zur Entstehung eines Th2-basierten, autoimmunen Ph��notyps f��hrt. Des Weiteren weisen CK2��-defiziente Tregs eine reduzierte Expression des Transkriptionsfaktors IRF4 auf, der in Tregs entscheidend f��r die Kontrolle Th2-basierter Immunreaktionen ist (Zheng Y. Nature. 19; 351-356 (2009)). Die dargelegten Ergebnisse identifizieren die CK2 damit als Kinase, die entscheidend an der Treg-vermittelten Suppression speziell Th2-basierter Immunantworten beteiligt ist. Demnach k��nnten pharmakologische CK2 Inhibitoren beispielsweise dazu eingesetzt werden, um die Treg-vermittelte Suppression im Rahmen chronischer Parasiten-Infektionen aufzuheben. Die in CK2��Treg-/- M��usen beobachtete Pr��valenz der Funktion der CK2 f��r Mukosa-assoziierte Organe stellt dabei einen zus��tzlichen Vorteil dar, weil systemische Nebenwirkungen, die durch die Blockade der Treg-vermittelte Suppression entstehen, zumindest in nicht-Mukosa-assoziierten Geweben nicht zu erwarten sind.rn

Anti-inflammatory and immunosuppressive effects of the enaminone E121

Asthma is a chronic inflammatory disease of the airways. The treatment of asthma is far from optimal and hence the need for novel therapeutic agents exists. The purpose of this study was to assess the anti-asthma effects of an enaminone, E121, and also its effects on human peripheral blood mononuclear cell proliferation and cytokine release. The effects of E121 were assessed in an ovalbumin-induced model of airway inflammation and airway hyperresponsiveness. In addition, the effects of E121 on phytohemagglutinin (PHA), anti-CD3 monoclonal antibody and lipopolysaccharide (LPS)-induced human peripheral blood mononuclear cell proliferation and cytokine release, respectively, were assessed. Treatment of mice with E121 significantly decreased the ovalbumin-induced increase in airway total cell influx and eosinophil infiltration and this was associated with an inhibition of ovalbumin-induced airway hyperresponsiveness. Moreover, E121 reduced PHA and anti-CD3-induced human peripheral blood mononuclear cell proliferation in vitro. E121 also inhibited PHA, anti-CD3 monoclonal antibody and LPS-induced cytokine release from human peripheral blood mononuclear cell cultures. These findings indicate that E121 exhibits anti-inflammatory and immunosuppressive activities.

Type IV delayed-type hypersensitivity of the respiratory tract due to budesonide use: report of two cases and a literature review

Respiratory type-IV hypersensitivity reactions due to corticosteroids is a rare phenomenon. We describe two such cases. The first is a 37- year-old atopic woman who developed labial angioedema and nasal itching after the use of budesonide nasal spray. A month later, after the first puffs of a formoterol/budesonide spray prescribed for asthma, she noticed symptoms of tongue and oropharyngeal itching and redness with subsequent dysphagia, labial and tongue angioedema, and facial oedema. The second is a 15-year-old non-atopic woman who reported pruritic eruptions around the nostrils after using a budesonide nasal spray. A year later she presented with nasal pruritus with intense congestion and labial and facial oedema after using the same spray. Both patients were evaluated with patch-tests using the commercial T.R.U.E. test, a budesonide solution, and corticosteroid creams. Test evaluation was performed at 48 and 96 hours. In both patients, patch tests were positive to budesonide (++) on the second day. The first patient also had a positive (+) reaction to tixocortol-21-pivalate. All the other patch tests were negative. Clinicians should be aware that hypersensitivity reactions may occur during the use of nasal or inhaled corticosteroids.

Expression, regulation and clinical significance of soluble and membrane CD14 receptors in pediatric inflammatory lung diseases

BACKGROUND: Inflammatory lung diseases are a major morbidity factor in children. Therefore, novel strategies for early detection of inflammatory lung diseases are of high interest. Bacterial lipopolysaccharide (LPS) is recognized via Toll-like receptors and CD14. CD14 exists as a soluble (sCD14) and membrane-associated (mCD14) protein, present on the surface of leukocytes. Previous studies suggest sCD14 as potential marker for inflammatory diseases, but their potential role in pediatric lung diseases remained elusive. Therefore, we examined the expression, regulation and significance of sCD14 and mCD14 in pediatric lung diseases. METHODS: sCD14 levels were quantified in serum and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of children with infective (pneumonia, cystic fibrosis, CF) and non-infective (asthma) inflammatory lung diseases and healthy control subjects by ELISA. Membrane CD14 expression levels on monocytes in peripheral blood and on alveolar macrophages in BALF were quantified by flow cytometry. In vitro studies were performed to investigate which factors regulate sCD14 release and mCD14 expression. RESULTS: sCD14 serum levels were specifically increased in serum of children with pneumonia compared to CF, asthma and control subjects. In vitro, CpG induced the release of sCD14 levels in a protease-independent manner, whereas LPS-mediated mCD14 shedding was prevented by serine protease inhibition. CONCLUSIONS: This study demonstrates for the first time the expression, regulation and clinical significance of soluble and membrane CD14 receptors in pediatric inflammatory lung diseases and suggests sCD14 as potential marker for pneumonia in children.

2010 International consensus algorithm for the diagnosis, therapy and management of hereditary angioedema

ABSTRACT:

Paediatrics in Vienna

The aim of this article is to describe the paediatric highlights from the 2009 European Respiratory Society Annual Congress in Vienna, Austria. The best abstracts from the seven groups of the Paediatric Assembly (asthma and allergy, respiratory epidemiology, cystic fibrosis, respiratory physiology, respiratory infections and immunology, neonatology and paediatric intensive care, and bronchology) are presented alongside findings from the current literature.

DARPins against a functional IgE epitope

The monoclonal anti-IgE antibody omalizumab (Xolair is mostly used for the treatment of severe allergic asthma. However, the requirement of high doses and suboptimal cost-effectiveness limits the use of the treatment. Here we propose to use a new drug format based on non-immunoglobulin structures, potentially offering increased clinical efficacy while being more cost-effective. For this purpose, DARPins (designed ankyrin repeat proteins) against the constant heavy chain region of IgE have been isolated. DARPins were binding to IgE with high specificity and affinities in the low nanomolar range. Selected DARPins antagonized the interaction between IgE and its high-affinity receptor in inhibition assays. Furthermore, anti-IgE DARPins were shown to inhibit proinflammatory mediator release from rat basophilic leukemia cells expressing human high-affinity IgE receptors with higher efficacy than the monoclonal anti-IgE antibody omalizumab. DARPins may thus represent promising future drug candidates for the treatment of allergy.

Normative data for lung function and exhaled nitric oxide in unsedated healthy infants

Despite association with lung growth and long-term respiratory morbidity, there is a lack of normative lung function data for unsedated infants conforming to latest European Respiratory Society/American Thoracic Society standards. Lung function was measured using an ultrasonic flow meter in 342 unsedated, healthy, term-born infants at a mean �� sd age of 5.1 �� 0.8 weeks during natural sleep according to the latest standards. Tidal breathing flow-volume loops (TBFVL) and exhaled nitric oxide (eNO) measurements were obtained from 100 regular breaths. We aimed for three acceptable measurements for multiple-breath washout and 5-10 acceptable interruption resistance (R(int)) measurements. Acceptable measurements were obtained in ��� 285 infants with high variability. Mean values were 7.48 mL��kg����� (95% limits of agreement 4.95-10.0 mL��kg�����) for tidal volume, 14.3 ppb (2.6-26.1 ppb) for eNO, 23.9 mL��kg����� (16.0-31.8 mL��kg�����) for functional residual capacity, 6.75 (5.63-7.87) for lung clearance index and 3.78 kPa��s��L����� (1.14-6.42 kPa��s��L�����) for R(int). In males, TBFVL outcomes were associated with anthropometric parameters and in females, with maternal smoking during pregnancy, maternal asthma and Caesarean section. This large normative data set in unsedated infants offers reference values for future research and particularly for studies where sedation may put infants at risk. Furthermore, it highlights the impact of maternal and environmental risk factors on neonatal lung function.

Glycomic analysis of human mast cells, eosinophils and basophils

In allergic diseases such as asthma, eosinophils, basophils and mast cells, through release of preformed and newly generated mediators, granule proteins and cytokines, are recognized as key effector cells. While their surface protein phenotypes, mediator release profiles, ontogeny, cell trafficking and genomes have been generally explored and compared, there has yet to be any thorough analysis and comparison of their glycomes. Such studies are critical to understand the contribution of carbohydrates to the induction and regulation of allergic inflammatory responses and are now possible using improved technologies for detecting and characterizing cell-derived glycans. We thus report here the application of high-sensitivity mass spectrometric-based glycomics methodologies to the analysis of N-linked glycans derived from isolated populations of human mast cells, eosinophils and basophils. The samples were subjected to matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) time-of-flight (TOF) screening analyses and MALDI-TOF/TOF sequencing studies. Results reveal substantive quantities of terminal N-acetylglucosamine containing structures in both the eosinophil and the basophil samples, whereas mast cells display greater relative quantities of sialylated terminal epitopes. For the first time, we characterize the cell surface glycan structures of principal allergic effector cells, which by interaction with glycan-binding proteins (e.g. lectins) have the possibility to dictate cellular functions, and might thus have important implications for the pathogenesis of inflammatory and allergic diseases.

Eosinophil and neutrophil extracellular DNA traps in human allergic asthmatic airways

Asthma is a heterogeneous inflammatory airway disorder that involves eosinophilic and noneosinophilic phenotypes. Unlike in healthy lungs, eosinophils are often present in atopic asthmatic airways, although a subpopulation of asthmatic subjects predominantly experience neutrophilic inflammation. Recently, it has been demonstrated that eosinophils and neutrophils generate bactericidal extracellular traps consisting of DNA and cytotoxic granule proteins.