Solubility and permeability as in vitro predictors for in vivo performance of fenofibrate IR solid dosage forms

This current work focused on the simulation of in vivo dissolution and permeation in order to be able to predict the in vivo performance of orally administered fenofibrate immediate release formulations. Therefore, the effects of the formulation surfactants on in vivo solubility and permeation of fenofibrate under physiologically relevant excipient concentrations were emphasized.rnIt was shown that the surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS) may decrease rather than increase the solubility of fenofibrate in vivo. This was related to the interference of SDS with the vesicular system of the biorelevant medium, FaSSIFmod, and therefore its solubilization capacity. rnMoreover, in vitro permeation studies revealed that SDS concentrations inversely correlated with fenofibrate permeability. Through combination of the observed permeation and solubility data a good in vitro/in vivo correlation regarding Cmax values in humans could be established for five fenofibrate formulations which were based on the same manufacturing technique.rnBesides the experimental part, the major characteristics and their potential implementation in a dissolution/permeation device were discussed based on the promising realization of the in vitro solubility and permeation methods. rn

Microglial involvement in brain physiopathology: in vitro studies using rat primary cultures

Microglial involvement in neurological disorders is well-established, being microglial activation not only associated with neurotoxic consequences, but also with neuroprotective effects. The studies presented here, based on microglia rat primary cell cultures and mainly on microglial conditioned medium (MCM), show insights into the mechanism of Superoxide dismutase 1 (SOD1) and Apolipoprotein E (ApoE) secretion by microglia as well as their neuroprotective effect towards primary cerebellar granule neurons (CGNs) exposed to the dopaminergic toxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA). SOD1 and ApoE are released respectively through non-classical lysosomal or the classical ER/Golgi-mediated secretion pathway. Microglial conditioned medium, in which SOD1 and ApoE accumulated, protected CGNs from degeneration and these effects were replicated when exogenous SOD1 or ApoE was added to a non-conditioned medium. SOD1 neuroprotective action was mediated by increased cell calcium from an external source. ApoE release is negatively affected by microglia activation, both with lipopolysaccharide (LPS) and Benzoylbenzoyl-ATP (Bz-ATP) but is stimulated by neuronal-conditioned medium as well as in microglia-neurons co-culture conditions. This neuronal-stimulated microglial ApoE release is differently regulated by activation states (i.e. LPS vs ATP) and by 6-hydroxydopamine-induced neurodegeneration. In co-culture conditions, microglial ApoE release is essential for neuroprotection, since microglial ApoE silencing through siRNA abrogated protection of cerebellar granule neurons against 6-OHDA toxicity. Therefore, these molecules could represent a target for manipulation aimed at promoting neuroprotection in brain diseases. Considering a pathological context, and the microglial ability to adopt a neuroprotective or neurotoxic profile, we characterize the microglial M1/M2 phenotype in transgenic rats (McGill-R-Thy1-APP) which reproduce extensively the Alzheimer’s-like amyloid pathology. Here, for the first time, cortical, hippocampal and cerebellar microglia of wild type and transgenic adult rats were compared, at both early and advanced stages of the pathology. In view of possible therapeutic translations, these findings are relevant to test microglial neuroprotection, in animal models of neurodegenerative diseases.

Generierung und Charakterisierung von in-vitro- und in- vivo-Modellsystemen zur Untersuchung des Skelettsystems

Die Entstehung und Aufrechterhaltung von Knorpel- und Knochengewebe wird durch eine Vielzahl von hemmenden oder fördernden Faktoren hoch komplex reguliert, wobei die dabei involvierten physiologischen Prozesse bisher nur teilweise verstanden werden. Auch die Ursachen sowohl degenerativer Erkrankungen, aber auch durch Mutationen im FGFR3-Gen verursachter Chondrodysplasien sind in ihrer Ätiopathogenese noch nicht vollständig erforscht. In dieser Arbeit wurden verschiedene experimentelle Ansätze verfolgt, die zur weiteren Aufklärung der Pathophysiologie zweier unterschiedlicher Skeletterkrankungen beitragen sollten.rnEin relevantes Charakteristikum der degenerativen Gelenkserkrankung Osteoarthrose ist der Verlust an Aggrekan, hauptverantwortlich verursacht durch die Aggrekanase ADAMTS5. Es wurde ein Tiermodell generiert, bei dem gezielt mittels des Tet-ON-Systems die Aggrekanase mAdamts-5 überexprimiert werden kann. Nach Konstruktherstellung und Generierung als auch Charakterisierung des in vitro-Modells wurde das Tiermodell hergestellt, um die Folgen der Überexpression im Hinblick auf einen verstärkten Aggrekanabbau im Knorpel der Mäuse zu analysieren. Nach initialer Charakterisierung auf Induzierbarkeit zeigte eine Gründerlinie eine induzierbare transgene mAdamts5-Expression. Die Überprüfung auf Knorpelspezifität zeigte, sowohl embryonal als auch im adulten Tier, dass sich der verwendete, zusammengesetzte Kollagen-Typ II Promotor wie der endogene verhielt und somit funktional war. Nach Doxyzyklininduktion wurde bei der optimalen Dosis von 1 mg/ml im Vergleich zum induzierten Wildtyp-Tier eine 15%ige Abnahme des Gesamt-Glykosamino-glykan(GAG)-Gehaltes und eine um 120% erhöhte GAG-Abgabe ins Medium detektiert, was eine verstärkte Spaltung von Aggrekan bedeutete. Die transgene Aggrekanase wurde überexprimiert und spaltete verstärkt Aggrekan. Da aufgrund der histologischen Untersuchungen jedoch keine Knorpelerosionen feststellbar waren, konnte im Umkehrschluss gefolgert werden, dass der Knorpel einen Verlust an Glykosaminoglykanen bis zu einer gewissen Grenze tolerieren kann. Mit dem generierten und charakterisierten Tiermodell konnte mit dem Verlust an GAG eine Osteoarthrose-ähnliche Situation simuliert werden, insbesondere im Hinblick auf frühe Stadien der Erkrankung, bei denen noch keine makroskopisch eindeutig sichtbare Knorpelerosionen vorliegen. rnIm zweiten Teil der Arbeit wurden Zellkulturexperimente zur weiteren Aufklärung FGFR3-regulierter Prozesse durchgeführt. Nach Generierung und Verifizierung der stabilen Zelllinien, die mittels des Tet-ON-Systems das FGFR3-Gen mit jeweils einer Chondrodysplasie-assoziierten Mutation (Achondroplasie-Mutation G380R, Thanatophore Dysplasie Typ II-Mutation K650E) induzierbar überexprimieren, wurden die Auswirkungen der zwei verschiedenen Mutationen anhand bereits beschriebener Signalwege untersucht. Über die Rekrutierung des ERK-Signalweges konnte bei beiden Zelllinien die Funktionalität nachgewiesen werden, wobei die Zelllinie mit der einen schwereren Phänotyp beim Menschen verursachenden TDII-Mutation eine stärkere Aktivierung zeigte. Bei der Aktivierung von STAT1 wies nur die TDII-Zelllinie eine Phosphorylierung auf, nicht jedoch die ACH-Zelllinie; dies deckte sich mit bereits publizierten Untersuchungen. Beide Kaskaden zeigten eine unterschiedliche Signalantwort aufgrund der verschiedenen Mutationen. Des Weiteren konnte eine unterschiedliche MMP13-Zielgenexpression nachgewiesen werden, wobei lediglich die ACH-Zelllinie eine erhöhte MMP13-Expression (6-fach) zeigte. Zur Identifizierung neuer involvierter FGFR3-Zielgene wurde die differentielle Genexpression der TDII-Zelllinie im Vergleich induziert/nicht induziert mittels Microarray-Hybridisierung untersucht. Als interessantes Zielgen fiel STC1 auf, welches ebenfalls eine Rolle in der Chondrogenese spielt und bislang nicht mit FGFR3 in Verbindung gebracht wurde. Es konnte jedoch nur auf RNA-Ebene eine Regulation nachgewiesen werden. Nachfolgend durchgeführte transiente Experimente zeigten, dass die Wildtyp-Variante von FGFR3 möglicherweise eine Funktion in der Sekretion des Proteins STC1 hat und dass durch die beiden eingefügten Mutationen (ACH, TDII) diese aufgehoben ist. Der Einfluss von FGFR3 auf die Sekretion von STC1 stellt ein neues Ergebnis dar, insbesondere auch die Auswirkungen der beiden für die unterschiedlichen Krankheitsbilder stehenden Mutationen. Welche Relevanz allerdings die STC1-Sekretion im Rahmen FGFR3-assoziierter Erkrankungen hat, kann nicht eindeutig beurteilt werden. Weitere Faktoren aus dem hoch komplexen Zusammenspiel während der Knorpel/Knochenentwicklung müssen untersucht werden, um eine definitive Einordnung zu ermöglichen.

The porcine animal model goes through the 3Rs: development of in vitro and ex vivo system to study vascular biology

Since the publication of the book of Russell and Burch in 1959, scientific research has never stopped improving itself with regard to the important issue of animal experimentation. The European Directive 2010/63/EU “On the protection of animals used for scientific purposes” focuses mainly on the animal welfare, fixing the Russell and Burch’s 3Rs principles as the foundations of the document. In particular, the legislator clearly states the responsibility of the scientific community to improve the number of alternative methods to animal experimentation. The swine is considered a species of relevant interest for translational research and medicine due to its biological similarities with humans. The surgical community has, in fact, recognized the swine as an excellent model replicating the human cardiovascular system. There have been several wild-type and transgenic porcine models which were produced for biomedicine and translational research. Among these, the cardiovascular ones are the most represented. The continuous involvement of the porcine animal model in the biomedical research, as the continuous advances achieved using swine in translational medicine, support the need for alternative methods to animal experimentation involving pigs. The main purpose of the present work was to develop and characterize novel porcine alternative methods for cardiovascular translational biology/medicine. The work was mainly based on two different models: the first consisted in an ex vivo culture of porcine aortic cylinders and the second consisted in an in vitro culture of porcine aortic derived progenitor cells. Both the models were properly characterized and results indicated that they could be useful to the study of vascular biology. Nevertheless, both the models aim to reduce the use of experimental animals and to refine animal based-trials. In conclusion, the present research aims to be a small, but significant, contribution to the important and necessary field of study of alternative methods to animal experimentation.

Bone-implant interface. Evaluation of osteoblastic cells behavior on nanopatterned titanium surfaces: an in vitro analysis

Protein-adsorption occurs immediately following implantation of biomaterials. It is unknown at which extent protein-adsorption impacts the cellular events at bone-implant interface. To investigate this question, we compared the in-vitro outcome of osteoblastic cells grown onto titanium substrates and glass as control, by modulating the exposure to serum-derived proteins. Substrates consisted of 1) polished titanium disks; 2) polished disks nanotextured with H2SO4/H2O2; 3) glass. In the pre-adsorption phase, substrates were treated for 1h with αMEM alone (M-noFBS) or supplemented with 10%-foetal-bovine-serum (M-FBS). MC3T3-osteoblastic-cells were cultured on the pre-treated substrates for 3h and 24h, in M-noFBS and M-FBS. Subsequently, the culture medium was replaced with M-FBS and cultures maintained for 3 and 7days. Cell-number was evaluated by: Alamar-Blue and MTT assay. Mitotic- and osteogenic-activities were evaluated through fluorescence-optical-microscope by immunolabeling for Ki-67 nuclear-protein and Osteopontin. Cellular morphology was evaluated by SEM-imaging. Data were statistically analyzed using ANOVA-test, (p<0.05). At day3 and day7, the presence or absence of serum-derived proteins during the pre-adsorption phase had not significant effect on cell-number. Only the absence of FBS during 24h of culture significantly affected cell-number (p<0.0001). Titanium surfaces performed better than glass, (p<0.01). The growth rate of cells between day3 and 7 was not affected by the initial absence of FBS. Immunolabeling for Ki-67 and Osteopontin showed that the mitotic- and osteogenic- activity were ongoing at 72h. SEM-analysis revealed that the absence of FBS had no major influence on cell-shape. • Physico-chemical interactions without mediation by proteins are sufficient to sustain the initial phase of culture and guide osteogenic-cells toward differentiation. • The challenge is avoiding adsorption of ‘undesirables’ molecules that negatively impact on the cueing cells receive from surface. This may not be a problem in healthy patients, but may have an important role in medically-compromised-individuals in whom the composition of tissue-fluids is altered.

Untersuchungen zur Wechselbeziehung zwischen Proteom, Energiestoffwechsel, Redoxstatus und Radiosensibilität von Tumorzellen in vitro und in vivo

Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die Erforschung ursächlicher Unterschiede im Energiestoffwechsel von hoch- und niedrig-glykolytischen Tumorzelllinien. Darüber hinaus wurde die Hypothese überprüft, wonach eine hohe glykolytische Aktivität in Tumorzellen zu einer Anreicherung von antioxidativen Metaboliten führt und infolgedessen eine Therapieresistenz gegen Gammabestrahlung hervorruft. Abschließend sollte durch biochemische und gentechnische Manipulationen des Energie- bzw. Glukosestoffwechsels die Strahlenresistenz von Tumorzellen verändert und somit neue therapeutische Interventionen eröffnet werden.rnDie zur Klärung dieser Fragestellung erforderlichen molekularbiologischen Experimente erfolgten an jeweils zwei Ovarialkarzinomzelllinien (OC316 und IGROV-1) und zwei Plattenepithelkarzinomzelllinien der Kopf- und Halsregion (SAS und FaDu) sowie den entsprechenden Experimentaltumoren.rnUnabhängig von der Tumorentität und dem Tumormodell konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression Stoffwechsel-assoziierter Proteine mit einem gesteigerten Energiestoffwechsel einhergeht. Der Transfer der Ovarial- und Plattenepithelkarzinomzelllinien in das Mausmodell führte zu keiner grundsätzlichen Änderung des Tumormikromilieus. So wies die hoch-metabolische Linie OC316 in vitro und in vivo eine stark erhöhte MCT-4 Expression auf, deren gentechnische Inhibition jedoch zu keiner Reduktion der Glykolyserate führte.rnDie Hypothese, dass die Laktatproduktion als prädiktiver Marker für die Strahlenresistenz einer Tumorzelllinie fungiert, konnte nicht bestätigt werden. Jedoch führte die Manipulation der intrazellulären Laktatbildung und des Energiestoffwechsels mit nicht zelltoxischen Konzentrationen von 2-Deoxy-D-glukose (2DG) und Rotenon (ROT) bei den Ovarialkarzinomzelllinien zu einer Erhöhung der intrazellulären O2--Anionen, einer Zunahme der Strahlenempfindlichkeit sowie zur Steigerung der initialen und residualen DNA-Doppelstrangbrüche nach Gammabestrahlung.rnHierbei wirken 2DG und ROT synergistisch durch die Inhibierung antioxidativer Systeme sowie durch die Erhöhung des zellulären Radikal-Status. Die Anwendung von Stoffwechselmanipulatoren zur Optimierung und Unterstützung vorhandener Radikal-erzeugender Therapieformen wird aktuell in klinischen Studien überprüft. Translational könnte die durch 2DG und ROT beschriebene Erhöhung der Strahlenempfindlichkeit bei Ovarialkarzinomzelllinien z. B. in Kombination mit intensitätsmodulierten Strahlentherapien neue Behandlungsmöglichkeiten eröffnen, was in weiterführenden in vivo Studien zu überprüfen ist.rn

Etablierung eines high content imaging-basierten in vitro Testsystems zur Evaluierung genotoxischer Substanzen

Zur Registrierung von Pharmazeutika ist eine umfassende Analyse ihres genotoxischen Potentials von Nöten. Aufgrund der Vielzahl genotoxischer Mechanismen und deren resultierenden Schäden wird ein gestaffeltes Testdesign durch die ICH-Richtlinie S2(R1) „Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use S2(R1)“ definiert, um alle genotoxischen Substanzen zu identifizieren. Die Standardtestbatterie ist in der frühen Phase der Arzneimittelentwicklung aufgrund des geringen Durchsatzes und des Mangels an verfügbarer Substanzmenge vermindert anwendbar. Darüber hinaus verfügen in vitro Genotoxizitätstests in Säugerzellen über eine relativ geringe Spezifität. Für eine vollständige Sicherheitsbeurteilung wird eine in vivo Testung auf Kanzerogenität benötigt. Allerdings sind diese Testsysteme kosten- und zeitintensiv. Aufgrund dessen zielen neue Forschungsansätze auf die Verbesserung der Prädiktivität und die Erfassung des genotoxischen Potentials bereits in der frühen Phase der Arzneimittelentwicklung ab. Die high content imaging (HCI)-Technologie offeriert einen Ansatz zur Verbesserung des Durchsatzes verglichen mit der Standardtestbatterie. Zusätzlich hat ein Zell-basiertes Modell den Vorteil Daten relativ schnell bei gleichzeitig geringem Bedarf an Substanzmenge zu generieren. Demzufolge ermöglichen HCI-basierte Testsysteme eine Prüfung in der frühen Phase der pharmazeutischen Arzneimittelentwicklung. Das Ziel dieser Studie ist die Entwicklung eines neuen, spezifischen und sensitiven HCI-basierten Testsytems für Genotoxine und Progenotoxine in vitro unter Verwendung von HepG2-Zellen gewesen. Aufgrund ihrer begrenzten metabolischen Kapazität wurde ein kombiniertes System bestehend aus HepG2-Zellen und einem metabolischen Aktivierungssystem zur Testung progenotoxischer Substanzen etabliert. Basierend auf einer vorherigen Genomexpressionsprofilierung (Boehme et al., 2011) und einer Literaturrecherche wurden die folgenden neun unterschiedlichen Proteine der DNA-Schadensantwort als putative Marker der Substanz-induzierten Genotoxizität ausgewählt: p-p53 (Ser15), p21, p-H2AX (Ser139), p-Chk1 (Ser345) p-ATM (Ser1981), p-ATR (Ser428), p-CDC2 (Thr14/Tyr15), GADD45A und p-Chk2 (Thr68). Die Expression bzw. Aktivierung dieser Proteine wurde 48 h nach Behandlung mit den (pro-) genotoxischen Substanzen (Cyclophosphamid, 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen, Aflatoxin B1, 2-Acetylaminofluoren, Methylmethansulfonat, Actinomycin D, Etoposid) und den nicht-genotoxischen Substanzen (D-Mannitol, Phenforminhydrochlorid, Progesteron) unter Verwendung der HCI-Technologie ermittelt. Die beste Klassifizierung wurde bei Verwendung der folgenden fünf der ursprünglichen neun putativen Markerproteine erreicht: p-p53 (Ser15), p21, p-H2AX (Ser139), p-Chk1 (Ser345) und p-ATM (Ser1981). In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurden die fünf ausgewählten Proteine mit Substanzen, welche von dem European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) zur Beurteilung der Leistung neuer oder modifizierter in vitro Genotoxizitätstests empfohlen sind, getestet. Dieses neue Testsystem erzielte eine Sensitivität von 80 % und eine Spezifität von 86 %, was in einer Prädiktivität von 84 % resultierte. Der synergetische Effekt dieser fünf Proteine ermöglicht die Identifizierung von genotoxischen Substanzen, welche DNA-Schädigungen durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Mechanismen induzieren, mit einem hohen Erfolg. Zusammenfassend konnte ein hochprädiktives Prüfungssystem mit metabolischer Aktivierung für ein breites Spektrum potenziell genotoxischer Substanzen generiert werden, welches sich aufgrund des hohen Durchsatzes, des geringen Zeitaufwandes und der geringen Menge benötigter Substanz zur Substanzpriorisierung und -selektion in der Phase der Leitstrukturoptimierung eignet und darüber hinaus mechanistische Hinweise auf die genotoxische Wirkung der Testsubstanz liefert.

Analyse der T-Zellkreuzreaktivität bei Birkenpollenallergikern mit assoziierter Nahrungsmittelallergie

Eine Pollenallergie geht häufig mit einer sekundären Nahrungsmittelallergie einher, die durch die Kreuzreaktivität zwischen dem Pollen- und dem Nahrungsmittelallergen verursacht wird. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Kohorte von 20 Allergikern mit einer Typ I-Allergie gegen Birkenpollen und einer assoziierten Nahrungsmittelallergie gegen Haselnüsse und/oder Karotten in Bezug auf eine allergenspezifische IgE-Antwort, T-Zellantwort und vor allen Dingen hinsichtlich der T-Zellkreuzreaktivität zwischen den rekombinanten Allergenen Bet v 1, Cor a 1 und Dau c 1 charakterisiert. Verwendet wurde hierzu ein Zellkultursystem mit primären CD4+ T-Zellen ohne die Zugabe von exogenem IL-2 oder wiederholten Stimulationen. Zur Analyse der T-Zellkreuzreaktivität kamen zwei unterschiedliche Analyseverfahren zum Einsatz: zum einen der bewährte 3H-Thymidinassay und zum anderen eine neue durchflusszytometrische Methode, die auf der Verwendung von zwei unterschiedlichen Proliferationsfarbstoffen basiert.rnBei der Charakterisierung der T-Zellantwort konnte festgestellt werden, dass eine robuste Th2-Antwort vorliegt, die stark von dem Zytokin IL-5 dominiert wird, begleitet von einer signifikanten Produktion von IL-9 und IL-13, allerdings ohne die Beteiligung von IL-4.rnDes Weiteren konnte zum ersten Mal mit Hilfe eines dosisabhängigen Inhibitions-ELISA eine B-Zellkreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Cor a 1 gezeigt werden, wobei das Cor a 1-reaktive IgE prädominant ist und eine Subpopulation des Bet v 1-reaktiven IgE darstellt.rnMittels 3H-Thymidinassay konnte eine T-Zellkreuzreaktivität zwischen Bet v 1, Cor a 1 und in einem geringeren Maße zu Dau c 1 bei primären T-Zellen von Allergikern gezeigt werden. Ebenso konnte die Kreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Cor a 1 durch die neue durchflusszytometrische Methode bewiesen werden. Zusätzlich ist es mit Hilfe dieser neuen Methode nun möglich, zwischen den einzelnen T-Zellsubpopulationen zu unterscheiden, die sowohl nach primärer und sekundärer oder ausschließlich nach sekundärer Stimulation proliferieren. Es konnte festgestellt werden, dass die kreuzreaktiven T-Zellen aus der T-Zellsubpopulation hervorgehen, die bereits nach der primären Stimulations stark proliferiert haben. Somit kann also innerhalb des T-Zellrepertoires der allergischen Spender eine Prädominanz der kreuzreaktiven T-Zellsubpopulationen festgestellt werden. Eine monospezifische T-Zellsubpopulation konnte unter Verwendung der neuen Methode nicht detektiert werden.rnDas Ausmaß von Qualität und Quantität einer Kreuzreaktivität kann nun visualisiert werden, was dazu beitragen kann, das Protokoll einer SIT zu verbessern und optimal an den individuellen Patienten anzupassen, um möglicherweise eine größere Chance auf eine erfolgreiche Therapie in Aussicht zu stellen.

Synthese und Charakterisierung von HPMA-stabilisierten Kolloiden sowie deren Evaluierung in vitro und in vivo

Nanodimensionale Wirkstoff-Trägersysteme sind in der Lage, sowohl die Bioverfügbarkeit als auch das pharmakokinetische Profil von Wirkstoffen drastisch zu verbessern. Hauptgründe dafür sind eine erhöhte Plasma-Halbwertszeit durch die größenbedingte verminderte renale Ausscheidung und eine gesteigerte Anreicherung im Tumorgewebe durch den EPR-Effekt. Diese Arbeit beschreibt die Synthese und Entwicklung neuer kolloidaler Wirkstoff-Trägersysteme, welche biokompatibel, teilweise bioabbaubar und funktionalisierbar sind. Ein Fluoreszenzfarbstoff wurde als hydrophobes Wirkstoffmodell eingekapselt. Wohldefinierte, eng verteilte und funktionalisierbare HPMA-basierte Block- und statistische Copolymere unterschiedlicher Molekulargewichte (10-25 kDa) und hydrophiler/hydrophober Zusammensetzung (10-50 mol%) wurden mittels RAFT- Polymerisation in Kombination mit dem Reaktivesteransatz hergestellt und in Miniemulsionsprozesse eingesetzt, um ihre Stabilisierungseffizienz zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass die kleineren Copolymere (10 kDa) mit einem Einbau von 10 mol% LMA, sowohl im Modellsystem Polystyrol, als auch im bioabbaubaren PDLLA-System, besonders geeignet sind und ergaben monodisperse Kolloide im Größenbereich von 100 bis 300 nm. Die kolloidalen Systeme zeigten keine Wirkung auf die Zellviabilität. In Folge dessen wurde das Aggregationsverhalten in humanem Blutserum mittels DLS untersucht, wobei keine Interaktion mit Blutbestandteilen festgestellt werden konnte. Zellaufnahmestudien wurden an HeLa-Zellen durchgeführt, um das Schicksal der Kolloide in vitro zu untersuchen. Dabei wurden Kernmaterial, Hülle und das hydrophobe Wirkstoffmodell durch unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung getrennt betrachtet. Das hydrophobe Wirkstoffmodell wurde allein durch Interaktion der Kolloide mit den Zellen übertragen, was für eine diffusionsbedingte, initiale, aber unspezifische Freisetzung spricht. Eine solche Freisetzungskinetik kann durch Verwendung von Nitroglycerin, als vasodilatierender Wirkstoff mit geringer unspezifischer Wirkung, ausgenutzt werden, um den EPR-Effekt zu unterstützen. Die Aufnahme des Partikels hingegen geschieht zeitverzögert. Das Schicksal der Kolloide (sowohl des Kern- und desrnHüllmaterials) wurde durch doppelte Fluoreszenzmarkierung untersucht. Dabei kam es zu einer intrazellulären Ablösung der stabilisierenden Block-Copolymere zwischen 8 und 24 h. Nach Aufklärung der Aufnahme- und Freisetzungskinetiken wurde nun die Körperverteilung der PS- und PDLLA-Kolloide nach 18F-Markierung mittels PET und ex vivo-Biodistributiosstudien untersucht. Dabei hatte das Kernmaterial einen Einfluss auf die Körperverteilung. PET-Studien in Mäusen zeigten, dass die stabilisierenden Block-Copolymere beider Kolloide ein starkes Signal in der Niere geben, wobei das der PS-Kolloide weiter ausgeprägt war. Darüber hinaus war eine Anreicherung dieser in Lunge, Leber und Milz festzustellen. Die Verdrängung der stabilisierenden Polymere durch die Interaktion mit Blutbestandteilen erklärt dabei das erhöhte Nieren- und Blasensignal der PS- Kolloide. Das Anreicherungsmuster der PDLLA-Kolloide hingegen zeigte neben der Nierenakkumulation eine erhöhte Blutaktivität und somit die gewünschten langzirkulierenden Eigenschaften. Diese Ergebnisse konnten auch mittels ex vivo- Biodistributionsstudien bestätigt werden. Um die Tumoranreicherung weiter zu verbessern wurde die Verwendung von Folat als Erkennungsstruktur am einfachen HPMA-Polymer untersucht. Die Konjugate zeigten eine erhöhte Anreicherung im Vergleich zu den Polymeren ohne Erkennungsstrukturen. Blockadestudien bestätigten die Selektivität der Anreicherung. Diese Daten zeigen das Potential der Folat-Erkennungsstruktur in vivo innerhalb kurzer Zeitfenster, welche nun auf kolloidale Systeme übertragen werden kann.

Genexpressionsanalyse boviner mesenchymaler Stammzellen und deren in-vitro-differenzierten Folgelinien

Mesenchymale Stamzellen (MSC) sind Vertreter der adulten Stammzellen. Sie bergen durch ihre große Plastizität ein immenses Potential für die klinische Nutzung in Form von Stammzelltherapien. Zellen dieses Typs kommen vornehmlich im Knochenmark der großen Röhrenknochen vor und können zu Knochen, Knorpel und Fettzellen differenzieren. MSC leisten einen wichtigen Beitrag im Rahmen regenerativer Prozesse, beispielsweise zur Heilung von Frakturen. Breite Studien demonstrieren bereits jetzt auch bei komplexeren Erkrankungen (z.B. Osteoporose) therapeutisch vielversprechende Einsatzmöglichkeiten. Oft kommen hierbei aus MSC gezielt differenzierte Folgelinien aus Zellkulturen zum Einsatz. Dies bedingt eine kontrollierte Steuerung der Differenzierungsprozesse in vitro. Der Differenzierung einer Stammzelle liegt eine komplexe Veränderung ihrer Genexpression zugrunde. Genexpressionsmuster zur Erhaltung und Proliferation der Stammzellen müssen durch solche, die der linienspezifischen Differenzierung dienen, ersetzt werden. Die mit der Differenzierung einhergehende, transkriptomische Neuausrichtung ist für das Verständnis der Prozesse grundlegend und wurde bislang nur unzureichend untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine transkriptomweite und vergleichende Genexpressionsanalyse Mesenchymaler Stammzellen und deren in vitro differenzierten Folgelinien mittels Plasmid - DNA Microarrays und Sequenziertechniken der nächsten Generation (RNA-Seq, Illumina Plattform). In dieser Arbeit diente das Hausrind (Bos taurus) als Modellorganismus, da es genetisch betrachtet eine hohe Ähnlichkeit zum Menschen aufweist und Knochenmark als Quelle von MSC gut verfügbar ist. Primärkulturen Mesenchymaler Stammzellen konnten aus dem Knochenmark von Rindern erfolgreich isoliert werden. Es wurden in vitro Zellkultur - Versuche durchgeführt, um die Zellen zu Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozyten zu differenzieren. Zur Genexpressionsanalyse wurde RNA aus jungen MSC und einer MSC Langzeitkultur („alte MSC“), sowie aus den differenzierten Zelllinien isoliert und für nachfolgende Experimente wo nötig amplifiziert. Der Erfolg der Differenzierungen konnte anhand der Genexpression von spezifischen Markergenen und mittels histologischer Färbungen belegt werden. Hierbei zeigte sich die Differenzierung zu Osteoblasten und Adipozyten erfolgreich, während die Differenzierung zu Chondrozyten trotz diverser Modifikationen am Protokoll nicht erfolgreich durchgeführt werden konnte. Eine vergleichende Hybridisierung zur Bestimmung differentieller Genexpression (MSC vs. Differenzierung) mittels selbst hergestellter Plasmid - DNA Microarrays ergab für die Osteogenese mit Genen wie destrin und enpp1, für die undifferenzierten MSC mit dem Gen sema3c neue Kandidatengene, deren biologische Funktion aufzuklären in zukünftigen Experimenten vielversprechende Ergebnisse liefern sollte. Die Analyse der transkriptomweiten Genexpression mittels NGS lieferte einen noch umfangreicheren Einblick ins Differenzierungsgeschehen. Es zeigte sich eine hohe Ähnlichkeit im Expressionsprofil von jungen MSC und Adipozyten, sowie zwischen den Profilen der alten MSC (eine Langzeitkultur) und Osteoblasten. Die alten MSC wiesen deutliche Anzeichen für eine spontane Differenzierung in die osteogene Richtung auf. Durch Analyse der 100 am stärksten exprimierten Gene jeder Zelllinie ließen sich für junge MSC und Adipozyten besonders Gene der extrazellulären Matrix (z.B col1a1,6 ; fn1 uvm.) auffinden. Sowohl Osteoblasten, als auch die alten MSC exprimieren hingegen verstärkt Gene mit Bezug zur oxidativen Phosphorylierung, sowie ribosomale Proteine. Eine Betrachtung der differentiellen Genexpression (junge MSC vs. Differenzierung) mit anschließender Pathway Analyse und Genontologie Anreicherungsstatistik unterstützt diese Ergebnisse vor allem bei Osteoblasten, wo nun jedoch zusätzlich auch Gene zur Regulation der Knochenentwicklung und Mineralisierung in den Vordergrund treten. Für Adipozyten konnte mit Genen des „Jak-STAT signaling pathway“, der Fokalen Adhäsion, sowie Genen des „Cytokine-cytokine receptor interaction pathway“ sehr spannende Einsichten in die Biologie dieses Zelltyps erlangt werden, die sicher weiterer Untersuchungen bedürfen. In undifferenzierten MSC konnte durch differentielle Genexpressionsanalyse die Rolle des nicht kanonischen Teils des WNT Signalweges als für die Aufrechterhaltung des Stammzellstatus potentiell äußerst einflussreich ermittelt werden. Die hier diskutierten Ergebnisse zeigen beispielhaft, dass besonders mittels Genexpressionsanalyse im Hochdurchsatzverfahren wertvolle Einblicke in die komplexe Biologie der Stammzelldifferenzierung möglich sind. Als Grundlage für nachfolgende Arbeiten konnten interessante Gene ermittelt und Hypothesen zu deren Einfluss auf Stammzelleigenschaften und Differenzierungsprozesse aufgestellt werden. Um einen besseren Einblick in den Differenzierungsverlauf zu ermöglichen, könnten künftig NGS Analysen zu unterschiedlichen Differenzierungszeitpunkten durchgeführt werden. Zudem wären weitere Anstrengungen zur erfolgreichen Etablierung der chondrogenen Differenzierung zur vollständigen Analyse der Genexpression des trilinearen Differenzierungspotentials von MSC wünschenswert.

In vivo and in vitro effects of genistein as obesogenic/anti-obesogenic compound in the lipid metabolism of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)

Nowadays, soy is one of the most used ingredients in the formulation of fish feed, due to the ample market supply, lower market price, high protein concentration and favorable amino acid composition. Nevertheless, soybean meal products are rich and primary diet source of phytoestrogens, as genistein, which may have a potential negative impact on growth, hormonal regulation and lipid metabolism in fish. The principal aim of this study was to better understand in vivo and in vitro genistein’s effects on lipid metabolism of rainbow trout. In adipose tissue it was showed an unclear role of genistein on lipid metabolism in rainbow trout, and in liver an anti-obesogenic effect, with an up-regulation of autophagy-related genes LC3b (in adipose tissue) and ATG4b (in liver and adipose tissue), a down-regulation of apoptosis-related genes CASP3 (in adipose tissue) and CASP8 (in liver). An increase of VTG mRNA levels in liver was also observed. Genistein partially exerted these effects via estrogen- receptor dependent mechanism. In white muscle, genistein seemed to promote lipid turnover, up-regulating lipogenic (FAS and LXR) and lipolytic (HSL, PPARα and PPARβ) genes. It seemed that genistein could exert its lipolytic role via autophagic way (up-regulation of ATG4b and ATG12l), not through an apoptotic pathway (down-regulation of CASP3). The effects of genistein on lipid-metabolism and apoptosis-related genes in trout muscle were not dose-dependent, only on autophagy-related genes ATG4B and ATG12l. Moreover, a partial estrogenic activity of this phytoestrogen was also seen. Through in vitro analysis (MTT and ORO assay), instead, it was observed an anti-obesogenic effect of genistein on rainbow trout adipocytes, and this effect was not mediated by ERs. Both in vivo and in vitro, genistein exerted its effects in a dose-dependent manner.

In vivo and in vitro effects of antioxidant compounds and PPAR γ modulators on rainbow trout oxidative stress and lipid metabolism.

The aquafeed use of raw plant materials, as protein and lipid sources, has been considered and approved as a sustainable alternative to fish products (fish meal and oils) because the current trend to use high-lipid diets has been shown to induce undesirable increase in fat depots or further physiological alterations, such as induction of oxidative stress. In the aquaculture perspective, the addition of natural substances with antioxidant properties is an emerging strategy for protecting biological systems and foodstuffs from oxidative damage. Among natural substances, hydroxytyrosol (HT) and caffeic acid (CA) have attracted considerable attention as food antioxidant additives and modulators of physiological and molecular pathways involved in energy metabolism and adiposity. The aim of this study was to evaluate the effects of CA and HT on lipid metabolism and oxidative stress of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). In vitro results showed the potential anti-obesogenic effects of the compounds CA and HT on the adipose tissue of the rainbow trout. To support these data, in vitro assays performed (MTT, ORO, immunofluorescence) resulted in accordance among them; only results from proliferating cell nuclear antigen (PCNA) assay were not significant. In vivo results showed a possible anti-obesogenic effect of CA in liver and HT in adipose tissue. Regarding oxidative stress, we could hypothesize a possible anti-oxidant role of CA in liver.

Development of in vitro methods to test acetabular prosthetic reconstructions (messa a punto di metodi in vitro per la caratterizzazione biomeccanica di ricostruzioni acetabolari)

The revision hip arthroplasty is a surgical procedure, consisting in the reconstruction of the hip joint through the replacement of the damaged hip prosthesis. Several factors may give raise to the failure of the artificial device: aseptic loosening, infection and dislocation represent the principal causes of failure worldwide. The main effect is the raise of bone defects in the region closest to the prosthesis that weaken the bone structure for the biological fixation of the new artificial hip. For this reason bone reconstruction is necessary before the surgical revision operation. This work is born by the necessity to test the effects of bone reconstruction due to particular bone defects in the acetabulum, after the hip prosthesis revision. In order to perform biomechanical in vitro tests on hip prosthesis implanted in human pelvis or hemipelvis a practical definition of a reference frame for these kind of bone specimens is required. The aim of the current study is to create a repeatable protocol to align hemipelvic samples in the testing machine, that relies on a reference system based on anatomical landmarks on the human pelvis. In chapter 1 a general overview of the human pelvic bone is presented: anatomy, bone structure, loads and the principal devices for hip joint replacement. The purpose of chapters 2 is to identify the most common causes of the revision hip arthroplasty, analysing data from the most reliable orthopaedic registries in the world. Chapter 3 presents an overview of the most used classifications for acetabular bone defects and fractures and the most common techniques for acetabular and bone reconstruction. After a critical review of the scientific literature about reference frames for human pelvis, in chapter 4, the definition of a new reference frame is proposed. Based on this reference frame, the alignment protocol for the human hemipelvis is presented as well as the statistical analysis that confirm the good repeatability of the method.

Population doublings and percentage of S100-positive cells as predictors of in vitro chondrogenicity of expanded human articular chondrocytes

The aim of this study was to investigate the interconnection between the processes of proliferation, dedifferentiation, and intrinsic redifferentiation (chondrogenic) capacities of human articular chondrocyte (HAC), and to identify markers linking HAC dedifferentiation status with their chondrogenic potential. Cumulative population doublings (PD) of HAC expanded in monolayer culture were determined, and a threshold range of 3.57-4.19 PD was identified as indicative of HAC loss of intrinsic chondrogenic capacity in pellets incubated without added chondrogenic factors. While several specific gene and surface markers defined early HAC dedifferentiation process, no clear correlation with the loss of intrinsic chondrogenic potential could be established. CD90 expression during HAC monolayer culture revealed two subpopulations, with sorted CD90-negative cells showing lower proliferative capacity and higher chondrogenic potential compared to CD90-positive cells. Although these data further validated PD as critical for in vitro chondrogenesis, due to the early shift in expression, CD90 could not be considered for predicting chondrogenic potential of HAC expanded for several weeks. In contrast, an excellent mathematically modeled correlation was established between PD and the decline of HAC expressing the intracellular marker S100, providing a direct link between the number of cell divisions and dedifferentiation/loss of intrinsic chondrogenic capacity. Based on the dynamics of S100-positive HAC during expansion, we propose asymmetric cell division as a potential mechanism of HAC dedifferentiation, and S100 as a marker to assess chondrogenicity of HAC during expansion, of potential value for cell-based cartilage repair treatments.

Preclinical in vitro and in vivo characterization of the fully human monoclonal IgM antibody KBPA101 specific for Pseudomonas aeruginosa serotype IATS-O11

Pseudomonas aeruginosa infection in ventilator-associated pneumonia is a serious and often life-threatening complication in intensive care unit patients, and new treatment options are needed. We used B-cell-enriched peripheral blood lymphocytes from a volunteer immunized with a P. aeruginosa O-polysaccharide-toxin A conjugate vaccine to generate human hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies specific for individual P. aeruginosa lipopolysaccharide serotypes. The fully human monoclonal antibody secreted by one of these lines, KBPA101, is an IgM/kappa antibody that binds P. aeruginosa of International Antigenic Typing System (IATS) serotype O11 with high avidity (5.81 x 10(7) M(-1) +/- 2.8 x 10(7) M(-1)) without cross-reacting with other serotypes. KBPA101 specifically opsonized the P. aeruginosa of IATS O11 serotype and mediated complement-dependent phagocytosis in vitro by the human monocyte-like cell line HL-60 at a very low concentration (half-maximal phagocytosis at 0.16 ng/ml). In vivo evaluation of KBPA101 demonstrated a dose-response relationship for protection against systemic infections in a murine burn wound sepsis model, where 70 to 100% of animals were protected against lethal challenges with P. aeruginosa at doses as low as 5 microg/animal. Furthermore, a high efficacy of KBPA101 in protection from local respiratory infections in an acute lung infection model in mice was demonstrated. Preclinical toxicology evaluation on human tissue, in rabbits, and in mice did not indicate any toxicity of KBPA101. Based on these preclinical findings, the first human clinical trials have been initiated.