Role of the extracellular matrix in variations of invasive pathways in lung cancers

Among the most common features of highly invasive tumors, such as lung adenocarcinomas (AD) and squamous cell carcinomas (SqCC), is the massive degradation of the extracellular matrix. The remarkable qualitative and quantitative modifications of hyaluronidases (HAases), hyaluronan synthases (HAS), E-cadherin adhesion molecules, and the transforming growth factor β (TGF-β) may favor invasion, cellular motility, and proliferation. We examined HAase proteins (Hyal), HAS, E-cadherin, and TGF-β profiles in lung AD subtypes and SqCC obtained from smokers and non-smokers. Fifty-six patients, median age 64 years, who underwent lobectomy for AD (N = 31) and SqCC (N = 25) were included in the study. HAS-1, -2 and -3, and Hyal-1 and -3 were significantly more expressed by tumor cells than normal and stroma cells (P < 0.01). When stratified according to histologic types, HAS-3 and Hyal-1 immunoreactivity was significantly increased in tumor cells of AD (P = 0.01) and stroma of SqCC (P = 0.002), respectively. Tobacco history in patients with AD was significantly associated with increased HAS-3 immunoreactivity in tumor cells (P < 0.01). Stroma cells of SqCC from non-smokers presented a significant association with HAS-3 (P < 0.01). Hyal, HAS, E-cadherin, and TGF-β modulate a different tumor-induced invasive pathway in lung AD subgroups and SqCC. HAases in resected AD and SqCC were strongly related to the prognosis. Therefore, our findings suggest that strategies aimed at preventing high HAS-3 and Hyal-1 synthesis, or local responses to low TGF-β and E-cadherin, may have a greater impact in lung cancer prognosis.

In vitro biological screening of the anticholinesterase and antiproliferative activities of medicinal plants belonging to Annonaceae

The aim of this research was to investigate the antiproliferative and anticholinesterase activities of 11 extracts from 5 Annonaceae species in vitro. Antiproliferative activity was assessed using 10 human cancer cell lines. Thin-layer chromatography and a microplate assay were used to screen the extracts for acetylcholinesterase (AchE) inhibitors using Ellman's reagent. The chemical compositions of the active extracts were investigated using high performance liquid chromatography. Eleven extracts obtained from five Annonaceae plant species were active and were particularly effective against the UA251, NCI-470 lung, HT-29, NCI/ADR, and K-562 cell lines with growth inhibition (GI50) values of 0.04-0.06, 0.02-0.50, 0.01-0.12, 0.10-0.27, and 0.02-0.04 µg/mL, respectively. In addition, the Annona crassiflora and A. coriacea seed extracts were the most active among the tested extracts and the most effective against the tumor cell lines, with GI50 values below 8.90 µg/mL. The A. cacans extract displayed the lowest activity. Based on the microplate assay, the percent AchE inhibition of the extracts ranged from 12 to 52%, and the A. coriacea seed extract resulted in the greatest inhibition (52%). Caffeic acid, sinapic acid, and rutin were present at higher concentrations in the A. crassiflora seed samples. The A. coriacea seeds contained ferulic and sinapic acid. Overall, the results indicated that A. crassiflora and A. coriacea extracts have antiproliferative and anticholinesterase properties, which opens up new possibilities for alternative pharmacotherapy drugs.

The investigation of the reduction mechanism of the 5a-reductase enzyme of Penicillium decumbens /

The 5a-reductase of Penicillium decumbens ATCC 10436 was used as a model for the mammalian enzyme to investigate the mechanism of reduction of testosterone to 5adihydrotestosterone . The purpose of this study was to search for specific 5a-reductase inhibitors which antagonize prostate cancer . In a whole-cell biotransformation mode, this organism reduced testosterone (1) to 5a-dihydrosteroids (8) and 5aandrostane- 3, 17-dione (9) in yields of 28% and 37% respectively. Control experiments have shown that 5aandrostane- 3, 17-dione (9) can be produced from the corresponding alcohol (8) in a subsequent reaction separate from that catalysed by the 5a-reductase enzyme . Androst-4- ene-3, 17-dione (2) is reduced to give only (9) with a recovery of 80% The stereochemistry of the reduction was determined by 500 MHz ^H NMR analysis of the products resulting from the deuterium labelled substrates. The results were obtained by an analysis of the NOE difference spectra, double-quantum filtered phase sensitive COSY 2-D spectra, and ^^c-Ir 2-D shift correlation spectra of deuterium labelled products. According to the unambiguous assignment of the signals due to H-4a and H-4Ii in 5a-dihydro steroids, the NMR data show clearly that addition of hydrogen to the 4{5)K bond has occurred in a trans manner at positions 413 and 5a. To Study the reduction mechanism of this enzyme, several substrates were prepared as following; 3-methyleneandrost-4-en- 17fi-ol(3), androst-4-en-17i5-ol(5) , androst-4-en-3ii, 17fi-diol (6) and 4, 5ii-epoxyandrostane-3, 17-dione (7) . Results suggest that this enzyme system requires an oxygen atom at the 3-position of the steroid in order to bind the substrate. Furthermore, the mechanism of this 5a-reductase may proceed via direct addition of hydrogen at the 4,5 position without involvement of a carbonyl group as an intermediate.

Prostate Cancer and the Search for Novel Biomarkers

The primary objective of this research project was to identify prostate cancer (PCa) -specific biomarkers from urine. This was done using a multi-faceted approach that targeted (1) the genome (DNA); (2) the transcriptome (mRNA and miRNA); and (3) the proteome. Toward this end, urine samples were collected from ten healthy individuals, eight men with PCa and twelve men with enlarged, non-cancerous prostates or with Benign Prostatic Hyperplasia (BPH). Urine samples were also collected from the same patients (PCa and BPH) as part of a two-year follow-up. Initially urinary nucleic acids and proteins were assessed both qualitatively and quantitatively for characteristics either unique or common among the groups. Subsequently macromolecules were pooled within each group and assessed for either protein composition via LC-MS/MS or microRNA (miRNA) expression by microarray. A number of potential candidates including miRNAs were identified as being deregulated in either pooled PCa or BPH with respect to the healthy control group. Candidate biomarkers were then assessed among individual samples to validate their utility in diagnosing PCa and/or differentiating PCa from BPH. A number of potential targets including deregulation of miRNAs 1825 and 484, and mRNAs for Fibronectin and Tumor Protein 53 Inducible Nuclear Protein 2 (TP53INP2) appeared to be indicative of PCa. Furthermore, deregulation of miR-498 appeared to be indicative of BPH. The sensitivities and specificities associated with using deregulation in many of these targets to subsequently predict PCa or BPH were also determined. This research project has identified a number of potential targets, detectable in urine, which merit further investigation towards the accurate identification of PCa and its discrimination from BPH. The significance of this work is amplified by the non-invasive nature of the sample source from which these candidates were derived, urine. Many cancer biomarker discovery studies have tended to focus primarily on blood (plasma or serum) and/or tissue samples. This is one of the first PCa biomarker studies to focus exclusively on urine as a sample source.

Identification and characterization of the transcriptional targets of the WNT/β-catenin signaling pathway in granulosa cells

Les Wnts représentent une famille de glycoprotéines de signalisation qui sont connues pour les nombreux rôles qu'ils jouent durant le développement embryonnaire et dans la cancerogénèse. Plusieurs Wnts, leurs récepteurs (Fzd) et d'autres composants des voies de signalisation des Wnt sont exprimés dans l’ovaire postnatal, et il a été démontré que l’expression de certains de ces gènes est régulée pendant le développement et l'ovulation/luteinization folliculaires. Toutefois, leurs rôles physiologiques dans l’ovaire demeurent mal définis. Pour étudier le rôle de WNT4 dans le développement folliculaire, nous avons entrepris d’identifier ses cibles transcriptionnels dans les cellules de la granulosa. Pour ce faire, nous avons employé la souris Catnbflox(ex3)/flox(ex3), chez laquelle une activation constitutive de la voie de Wnt/β-catenin a lieu suite à l’action de la recombinare Cre. Des cellules de la granulosa de ces souris ont été mises en culture et infectées avec un adenovirus pour causer la surexpression de WNT4 ou l’expression de Cre. L’ARN a alors été extrait de ces cellules et analysé par micro-puce. Les résultats ont démontré qu’une forte proportion des gènes induits par WNT4 étaient des gènes impliqués dans la réponse cellulaire au stress. Presque tous gènes induits par WNT4 ont également été induits par Cre, indiquant que WNT4 signale via la voie Wnt/β-catenin dans ces cellules. Nos résultats suggèrent donc que WNT4 favorise la survie des follicules par l’induction de gènes de réponse au stress dans les cellules de la granulosa, augmentant ainsi la résistance cellulaire à l'apoptose.

Importance of the HSP90 molecular chaperoning pathway for antibody diversification by determining AID stability

La protéine AID (déaminase induite par l’activation) joue un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative. En désaminant des désoxycytidines en désoxyuridines au niveau des gènes immunoglobulines, elle initie l’hypermutation somatique (SHM), la conversion génique (iGC) et la commutation isotypique (CSR). Elle est essentielle à une réponse humorale efficace en contribuant à la maturation de l’affinité des anticorps et au changement de classe isotypique. Cependant, son activité mutagénique peut être oncogénique et causer une instabilité génomique propice au développement de cancers et de maladies autoimmunes. Il est donc critique de réguler AID, en particulier ses niveaux protéiques, pour générer une réponse immunitaire efficace tout en minimisant les risques de cancer et d’autoimmunité. Un élément de régulation est le fait qu’AID transite du cytoplasme vers le noyau mais reste majoritairement cytoplasmique à l’équilibre. AID est par ailleurs plus stable dans le cytoplasme que dans le noyau, ce qui contribue à réduire sa présence à proximité de l’ADN. Le but de cette thèse était d’identifier de nouveaux partenaires et déterminants d’AID régulant sa stabilité et ses fonctions biologiques. Dans un premier temps, nous avons identifié AID comme une nouvelle protéine cliente d’HSP90. Nous avons montré qu’HSP90 interagit avec AID dans le cytoplasme, ce qui empêche la poly-ubiquitination d’AID et sa dégradation par le protéasome. En conséquence, l’inhibition d’HSP90 résulte en une diminution significative des niveaux endogènes d’AID et corrèle avec une réduction proportionnelle de ses fonctions biologiques dans la diversification des anticorps mais aussi dans l’introduction de mutations aberrantes. Dans un second temps, nous avons montré que l’étape initiale dans la stabilisation d’AID par la voie de chaperonnage d’HSP90 dépend d’HSP40 et d’HSP70. En particulier, la protéine DnaJa1, qui fait partie de la famille des protéines HSP40s, limite la stabilisation d’AID dans le cytoplasme. La farnésylation de DnaJa1 est importante pour l’interaction entre DnaJa1 et AID et moduler les niveaux de DnaJa1 ou son état de farnésylation impacte à la fois les niveaux endogènes d’AID mais aussi la diversification des anticorps. Les souris DNAJA1-/- présentent une réponse immunitaire compromise en cas d’immunisation, qui est dûe à des niveaux réduits d’AID et un défaut de commutation de classe. Dans un troisième temps, nous avons montré que la protéine AID est intrinsèquement plus instable que sesprotéines paralogues APOBEC. Nous avons identifié l’acide aspartique en seconde position d’AID ainsi qu’un motif semblable au PEST comme des modulateurs de la stabilité d’AID. La modification de ces motifs augmente la stabilité d’AID et résulte en une diversification des anticorps plus efficace. En conclusion, l’instabilité intrinsèque d’AID est un élément de régulation de la diversification des anticorps. Cette instabilité est en partie compensée dans le cytoplasme par l’action protective de la voie de chaperonnage DnaJa1-HSP90. Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs d’HSP90 ou de farnésyltransférases pourrait être un outil intéressant pour la modulation indirecte des niveaux d’AID et le traitement de lymphomes/leucémies et de maladies auto-immunes causés par AID.

The overexpression of the efflux pump Tpo1 leads to the bleomycin resistance in Saccharomyces cerevisiae.

La bléomycine est un antibiotique cytotoxique, son potentiel génotoxique est plus important quand elle est utilisée en combinaison avec des agents antinéoplasiques sur le cancer testiculaire, que sur les autres types qui développent souvent une résistance envers la drogue. Notre but consiste alors de mettre en évidence ce mécanisme de résistance en utilisant l’organisme modèle Saccharomyces cerevisiae. Nous avons démontré au sein de notre laboratoire, que les levures délétées au niveau de leur coactivateur transcriptionnel Imp2, présentent une hypersensibilité à la bléomycine, en raison de son accumulation toxique dans la cellule. Ceci suggère que Imp2 pourrait réguler l’expression d’une ou de plusieurs pompes à efflux, capables d’expulser la bléomycine à l’extérieur de la cellule. Pour tester notre hypothèse, nous avons recherché des suppresseurs multicopies capables de restaurer la résistance à la bléomycine chez le mutant imp2, et c’est ainsi que nous avons identifié l'activateur transcriptionnel Yap1. Ce dernier se lie à une région spécifique localisée au niveau du promoteur et permet d’activer l'expression d'un sous-ensemble de gènes, codant pour des pompes à efflux, impliquées dans la résistance aux drogues. Selon la littérature, au moins 27 pompes à efflux ont été identifiées chez la levure Saccharomyces cerevisiae, certaines d’entre elles disposent du site de liaison pour Yap1, tels que Qdr3, Tpo2 et Tpo1. Afin de déterminer si une de ces pompes expulse la bléomycine, nous avons créé des mutations simples et doubles en combinaison avec IMP2, aussi nous avons verifié si les mutants étaient sensibles à la drogue et enfin, nous avons testé si la surexpression de Yap1 pouvait restaurer le phénotype sauvage chez ces mutants, via l’activation de pompes à efflux.

Morbidity characteristics related to cardiovascular outcomes in French Canadian Families of the Saguenay-Lac-Saint-Jean region of Quebec

PROBLÉMATIQUE: L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) considère les maladies cardiovasculaires (MCVs) comme l'hypertension, la maladie coronarienne (par exemple, infarctus du myocarde), l'insuffisance cardiaque ainsi que les accidents cérébrovasculaires, parmi les principales causes de mortalité dans le monde. Les MCVs sont des maladies multifactorielles caractérisées par des interactions complexes entre le génome et l'environnement et dont la prévalence augmente rapidement dans toutes les populations du globe, ce qui vient compliquer d'autant l'étude de leurs bases héréditaires. Nos études précédentes sur la population fondatrice des familles Canadiennes-françaises de la région du Saguenay-Lac-Saint-Jean (SLSJ) au Québec ont permis d’obtenir une carte des loci significativement liés à des déterminants qualitatifs et quantitatifs de l’hypertension et ses déterminants métaboliques [1, 2]. HYPOTHÈSE ET OBJECTIF: Puisque nos données préliminaires nous suggèrent que la mort prématurée consécutive aux MCVs possède des composantes génétique et environnementale, notre hypothèse de départ est que les maladies avec occurrences fatales et non fatales (OF et ONF, respectivement) ont des caractéristiques distinctes, surtout lorsqu’en lien avec le système CV. Pour réaliser ce projet, nos objectifs sont d’analyser les causes de morbidité/mortalité d’hypertendus avec ou sans obésité chez des familles de la région du SLSJ. Nous accomplirons ceci en interrogeant les registres des hôpitaux et de l'état civil de même que les données généalogiques de 1950 jusqu'à maintenant. Nous voulons décrire et étudier les OF pour les comparer aux NFO. RÉSULTATS: Nous avons identifié un total de 3,654 diagnostiques appartenant aux OF et ONF chez les 343 sujets étudiés. Pour les OF, nous avons trouvé que: (1) un grand total de 1,103 diagnostiques du système circulatoire ont affecté 299 sujets avec 555 occurrences et 247 premières occurrences; (2) 333 des sujets participants ont reçu 1,536 diagnostiques non-CV avec 195 occurrences et 107 premières occurrences; (3) 62 diagnostiques de toutes autres causes chez 62 des sujets participants avec 81 occurrences et 11 premières occurrences. Pour les ONF: (1) 156 diagnostiques du système circulatoire ont affecté 105 sujets; (2) 60 diagnostiques de causes non-CV chez 53 des sujets; (3) et 718 diagnostiques de toutes autres causes chez 252 des sujets. Pour les OF, 109 des 333 sujets affectés par les maladies non-CV et 58 des 62 par toutes autres maladies étaient atteints simultanément par des MCV. Nous avons décrit les caractéristiques des maladies avec occurrences fatales et non fatales. Les MCVs prédominaient dans les résultats des premières occurrences et occurrences totales tandis que les maladies non-CV étaient les plus élevées pour les diagnostiques. De plus, les OF CV ont affecté 67.1% de notre échantillon de population, incluant les sujets co-affectés par les maladies non-CV ou de toutes autres causes. En fait, nos sujets ont un risque trois fois plus élevé de développer des MCVs (p<0.0001; χ2=1,575.348), tandis qu’il diminue de moitié pour les maladies non-CV comparativement au reste de la population du SLSJ (p=0.0006; χ2=11.834). Enfin, le risque de développer des tumeurs malignes est diminué de moitié dans notre échantillon comparativement à l’incidence régionale. CONCLUSION: Cette étude a apporté une nouvelle perspective sur les OF et ONF chez nos sujets de la région SLSJ du Québec après 11 ans. Quand on observe ces résultats en conjonction avec les MCVs, ce risque double.

Characterization of the Sterile20 kinase Slik : A regulator of growth in Drosophila

La prolifération cellulaire et la croissance tissulaire sont étroitement contrôlées au cours du développement. Chez la Drosophila melanogaster, ces processus sont régulés en partie par la kinase stérile-20 Slik (SLK et LOK chez les mammifères) et le suppresseur de tumeur Hippo (Hpo, MST1/2 chez les mammifères) dans les cellules épithéliales. La surexpression de la kinase Slik augmente la taille des tissus chez les mouches adultes. Cependant, les mutants slik-/- meurent avant d'avoir terminé leur développement. Lorsqu’elle est surexprimée dans les cellules épithéliales des ailes en voie de développement, cette protéine favorise la prolifération cellulaire. En outre, l'expression de Slik dans une population de cellules conduit à une surprolifération des cellules voisines, même quand elles sont physiquement séparées. Ceci est probablement dû à la sécrétion de facteurs de croissance qui stimulent la prolifération de manière paracrine. En utilisant des méthodes génétiques et transcriptomiques, nous essayons de déterminer les molécules et les mécanismes impliqués. Contrairement à ce qui a été publié, nous avons constaté que Slik ne transmet pas de signal prolifératif en inhibant le suppresseur de tumeur Merlin (Mer, NF2 chez les mammifères), un composant en amont de la voie Hippo. Plutôt, elle favorise la prolifération non-autonome et la croissance des tissus en signalisation par la kinase dRaf (la seule kinase de la famille Raf chez la drosophile). Nous prouvons que dRaf est nécessaire chez les cellules voisines pour conduire la prolifération chez ces cellules. De plus, nous avons utilisé le séquençage du transcriptome pour identifier de nouveaux effecteurs en aval de Slik. Ce qui permettra de mieux comprendre les effets de SLK et LOK chez les humains.

Investigation of the structure and dynamics of the centromeric epigenetic mark

Le centromère est le site chromosomal où le kinetochore se forme, afin d’assurer une ségrégation fidèles des chromosomes et ainsi maintenir la ploïdie appropriée lors de la mitose. L’identité du centromere est héritée par un mécanisme épigénétique impliquant une variante de l’histone H3 nommée centromere protein-A (CENP-A), qui remplace l’histone H3 au niveau de la chromatine du centromère. Des erreurs de propagation de la chromatine du centromère peuvent mener à des problèmes de ségrégation des chromosomes, pouvant entraîner l’aneuploïdie, un phénomène fréquemment observé dans le cancer. De plus, une expression non-régulée de CENP-A a aussi été rapportée dans différentes tumeurs humaines. Ainsi, plusieurs études ont cherchées à élucider la structure et le rôle de la chromatine contenant CENP-A dans des cellules en prolifération. Toutefois, la nature moléculaire de CENP-A en tant que marqueur épigénétique ainsi que ces dynamiques à l'extérieur du cycle cellulaire demeurent des sujets débat. Dans cette thèse, une nouvelle méthode de comptage de molécules uniques à l'aide de la microscopie à réflexion totale interne de la fluorescence (TIRF) sera décrite, puis exploitée afin d'élucider la composition moléculaire des nucléosomes contenant CENP-A, extraits de cellules en prolifération. Nous démontrons que les nucléosomes contenant CENP-A marquent les centromères humains de façon épigénétique à travers le cycle cellulaire. De plus, nos données démontrent que la forme prénucléosomale de CENP-A, en association avec la protéine chaperon HJURP existe sous forme de monomère et de dimère, ce qui reflète une étape intermédiaire de l'assemblage de nucléosomes contenant CENP-A. Ensuite, des analyses quantitatives de centromères lors de différenciation myogénique, et dans différents tissus adultes révèlent des changements globaux qui maintiennent la marque épigénétique dans une forme inactive suite à la différentiation terminale. Ces changements incluent une réduction du nombre de points focaux de CENP-A, un réarrangement des points dans le noyau, ainsi qu'une réduction importante de la quantité de CENP-A. De plus, nous démontrons que lorsqu'une dédifférenciation cellulaire est induite puis le cycle cellulaire ré-entamé, le phénotype "différencié" décrit ci-haut est récupéré, et les centromères reprennent leur phénotype "prolifératif". En somme, cet oeuvre décrit la composition structurale sous-jacente à l'identité épigénétique des centromères de cellules humaines lors du cycle cellulaire, et met en lumière le rôle de CENP-A à l'extérieur du cycle cellulaire.

Molecular characterization of the contribution of autophagy to antigen presentation using quantitative proteomics

L’autophagie est une voie hautement conservée de dégradation lysosomale des constituants cellulaires qui est essentiel à l’homéostasie cellulaire et contribue à l’apprêtement et à la présentation des antigènes. Les rôles relativement récents de l'autophagie dans l'immunité innée et acquise sous-tendent de nouveaux paradigmes immunologiques pouvant faciliter le développement de nouvelles thérapies où la dérégulation de l’autophagie est associée à des maladies auto-immunes. Cependant, l'étude in vivo de la réponse autophagique est difficile en raison du nombre limité de méthodes d'analyse pouvant fournir une définition dynamique des protéines clés impliquées dans cette voie. En conséquence, nous avons développé un programme de recherche en protéomique intégrée afin d’identifier et de quantifier les proteines associées à l'autophagie et de déterminer les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l’autophagosome dans la présentation antigénique en utilisant une approche de biologie des systèmes. Pour étudier comment l'autophagie et la présentation antigénique sont activement régulés dans les macrophages, nous avons d'abord procédé à une étude protéomique à grande échelle sous différentes conditions connues pour stimuler l'autophagie, tels l’activation par les cytokines et l’infection virale. La cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) est l'une des principales cytokines pro-inflammatoires qui intervient dans les réactions locales et systémiques afin de développer une réponse immune adaptative. La protéomique quantitative d'extraits membranaires de macrophages contrôles et stimulés avec le TNF-alpha a révélé que l'activation des macrophages a entrainé la dégradation de protéines mitochondriales et des changements d’abondance de plusieurs protéines impliquées dans le trafic vésiculaire et la réponse immunitaire. Nous avons constaté que la dégradation des protéines mitochondriales était sous le contrôle de la voie ATG5, et était spécifique au TNF-alpha. En outre, l’utilisation d’un nouveau système de présentation antigènique, nous a permi de constater que l'induction de la mitophagie par le TNF-alpha a entrainée l’apprêtement et la présentation d’antigènes mitochondriaux par des molécules du CMH de classe I, contribuant ainsi la variation du répertoire immunopeptidomique à la surface cellulaire. Ces résultats mettent en évidence un rôle insoupçonné du TNF-alpha dans la mitophagie et permet une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la présentation d’auto-antigènes par les molécules du CMH de classe I. Une interaction complexe existe également entre infection virale et l'autophagie. Récemment, notre laboratoire a fourni une première preuve suggérant que la macroautophagie peut contribuer à la présentation de protéines virales par les molécules du CMH de classe I lors de l’infection virale par l'herpès simplex virus de type 1 (HSV-1). Le virus HSV1 fait parti des virus humains les plus complexes et les plus répandues. Bien que la composition des particules virales a été étudiée précédemment, on connaît moins bien l'expression de l'ensemble du protéome viral lors de l’infection des cellules hôtes. Afin de caractériser les changements dynamiques de l’expression des protéines virales lors de l’infection, nous avons analysé par LC-MS/MS le protéome du HSV1 dans les macrophages infectés. Ces analyses nous ont permis d’identifier un total de 67 protéines virales structurales et non structurales (82% du protéome HSV1) en utilisant le spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Nous avons également identifié 90 nouveaux sites de phosphorylation et de dix nouveaux sites d’ubiquitylation sur différentes protéines virales. Suite à l’ubiquitylation, les protéines virales peuvent se localiser au noyau ou participer à des événements de fusion avec la membrane nucléaire, suggérant ainsi que cette modification pourrait influer le trafic vésiculaire des protéines virales. Le traitement avec des inhibiteurs de la réplication de l'ADN induit des changements sur l'abondance et la modification des protéines virales, mettant en évidence l'interdépendance des protéines virales au cours du cycle de vie du virus. Compte tenu de l'importance de la dynamique d'expression, de l’ubiquitylation et la phosphorylation sur la fonction des proteines virales, ces résultats ouvriront la voie vers de nouvelles études sur la biologie des virus de l'herpès. Fait intéressant, l'infection HSV1 dans les macrophages déclenche une nouvelle forme d'autophagie qui diffère remarquablement de la macroautophagie. Ce processus, appelé autophagie associée à l’enveloppe nucléaire (nuclear envelope derived autophagy, NEDA), conduit à la formation de vésicules membranaires contenant 4 couches lipidiques provenant de l'enveloppe nucléaire où on retrouve une grande proportion de certaines protéines virales, telle la glycoprotéine B. Les mécanismes régissant NEDA et leur importance lors de l’infection virale sont encore méconnus. En utilisant un essai de présentation antigénique, nous avons pu montrer que la voie NEDA est indépendante d’ATG5 et participe à l’apprêtement et la présentation d’antigènes viraux par le CMH de classe I. Pour comprendre l'implication de NEDA dans la présentation des antigènes, il est essentiel de caractériser le protéome des autophagosomes isolés à partir de macrophages infectés par HSV1. Aussi, nous avons développé une nouvelle approche de fractionnement basé sur l’isolation de lysosomes chargés de billes de latex, nous permettant ainsi d’obtenir des extraits cellulaires enrichis en autophagosomes. Le transfert des antigènes HSV1 dans les autophagosomes a été determine par protéomique quantitative. Les protéines provenant de l’enveloppe nucléaire ont été préférentiellement transférées dans les autophagosome lors de l'infection des macrophages par le HSV1. Les analyses protéomiques d’autophagosomes impliquant NEDA ou la macroautophagie ont permis de decouvrir des mécanismes jouant un rôle clé dans l’immunodominance de la glycoprotéine B lors de l'infection HSV1. Ces analyses ont également révélées que diverses voies autophagiques peuvent être induites pour favoriser la capture sélective de protéines virales, façonnant de façon dynamique la nature de la réponse immunitaire lors d'une infection. En conclusion, l'application des méthodes de protéomique quantitative a joué un rôle clé dans l'identification et la quantification des protéines ayant des rôles importants dans la régulation de l'autophagie chez les macrophages, et nous a permis d'identifier les changements qui se produisent lors de la formation des autophagosomes lors de maladies inflammatoires ou d’infection virale. En outre, notre approche de biologie des systèmes, qui combine la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse avec des essais fonctionnels tels la présentation antigénique, nous a permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l'autophagie lors de la présentation antigénique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra de réduire les effets nuisibles de l'immunodominance suite à l'infection virale ou lors du développement du cancer en mettant en place une réponse immunitaire appropriée.

Biochemical and functional characterization of the tumor suppressors BRCA1 and BAP1

L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle majeur dans la régulation d’une multitude de processus cellulaires. Dans cette thèse, je discuterai de la caractérisation de deux protéines, BRCA1 et BAP1, soit deux suppresseurs de tumeurs fonctionnellement reliés. BRCA1, une ubiquitine ligase qui catalyse la liaison de l’ubiquitine à une protéine cible, est mutée dans les cancers du sein et de l'ovaire. Il est bien établi que cette protéine aide à maintenir la stabilité génomique suite à un bris double brin de l’ADN (BDB), et ce, à l’aide d’un mécanisme de réparation bien caractérisé appelé recombinaison homologue. Cependant, les mécanismes de régulation de BRCA1 suite à des stresses génotoxiques n’impliquant pas directement un BDB ne sont pas pleinement élucidés. Nous avons démontré que BRCA1 est régulée par dégradation protéasomale suite à une exposition des cellules à deux agents génotoxiques reconnus pour ne pas directement générer des BDBs, soit les rayons UV, qui provoquent la distorsion de l’hélice d’ADN, et le méthyle méthanesulfonate (MMS), qui entraîne l’alkylation de l’ADN. La dégradation de BRCA1 est réversible et indépendante des kinases associées à la voie des PI3 kinase, soit ATM, ATR et DNA-PK, protéines qui sont rapidement activées par les dommages à l’ADN. Nous proposons que la dégradation de BRCA1 prévienne son recrutement intempestif, ainsi que celui des facteurs qui lui sont associés, à des sites de dommages d’ADN qui ne sont pas des BDBs, et que cette régulation coordonne la réparation de l’ADN. L’enzyme de déubiquitination BAP1 a initialement été identifiée comme une protéine capable d’interagir avec BRCA1 et de réguler sa fonction. Elle est également connue pour sa capacité à se lier avec les protéines du groupe Polycomb, ASXL1 et ASXL2. Cependant, l’importance de ces interactions n’a toujours pas été établie. Nous avons démontré que BAP1 forme deux complexes protéiques mutuellement exclusifs avec ASXL1 et ASXL2. Ces interactions sont critiques pour la liaison de BAP1 à l’ubiquitine ainsi que pour la stimulation de son activité enzymatique envers l’histone H2A. Nous avons également identifié des mutations de BAP1 dérivées de cancers qui empêchent à la fois son interaction avec ASXL1 et AXSL2, et son activité de déubiquitinase, ce qui fournit un lien mécanistique direct entre la déubiquitination de H2A et la tumorigenèse. Élucider les mécanismes de régulation de BRCA1 et BAP1 menera à une meilleure compréhension de leurs rôles de suppresseurs de tumeurs, permettant ainsi d’établir de nouvelles stratégies de diagnostic et traitement du cancer.

Biochemical & Pharmacological evaluation of liver oils of selected deep sea sharks and chimaeras of the Indian EEZ

With a seacoast of 8,1 18 km, an exclusive economic zone (EEZ) of 2 million square km, and with an area of about 30,000 square km under aquaculture, lndia produces close to six million tonnes of fish, over 4 per cent of the world fish production. While the marine waters upto 50m depth have been fully exploited, those beyond, remain unexplored. There is an ever increasing demand for fishery resources as food. The coastal fishery resources of the country are dwindling at a rapid pace and it becomes highly imperative that we search for alternate fishery resources for food. The option we have is to hunt for marine fishery resources. Studies pertaining to proximate composition, amino acid and fatty acid composition are essential to understand the nutraceutical values of these deep sea fishery resources. The present study was aimed to carry out proximate composition of deep sea fishery resources obtained during cruises onboard the FORV Sarise Sampada, to identify fishery resources which have appreciable lipid content and thereby analyse the bioactive potentials of marine lipids, to study the amino acid profile of these fishery resources, to understand the contents of SPA, MUFA and PUFA and to calculate the n3/n6 fatty acid contents. Though the presence of nutraceuticals was identified in the marine fishery resources their use as potential food resources deserve further investigation. So the study were carried out to calculate the hepatosomatic indices of sharks & chimaeras and conduct biochemical characterisation of liver oils of Apristurus indicus, Cenlrophorus scalprams, Centroselachus crepidater, Neoharriotta raleighana, and Harriotta pinnata obtained during cruises onboard the FORV Sugar Sampada.Therapeutic use of shark liver oil is evident from its use for centuries as a remedy to heal wounds and fight flu (Neil er al. 2006). Japanese seamen called it 'samedava' or "cure all". Shark liver oil is being promoted worldwide as a dietary supplement to boost the immune system, fight infections, to treat cancer and to lessen the side effects of conventional cancer treatment. These days more emphasis is laid on the nutritive benefits of shark liver oils especially on the omega 3 polyunsaturated fatty acids ( PUFAs) (Anandan er al. 2007) and alkylglycerols (AKGs) (Pugliese er al. I998) contained in them due to the high rise of inflammatory disorders such as arthritis, asthma and neurodegenerative diseases like Alzheimer’s, Parkinson’s and Schizophrenia. So the present study also evaluate the pharmacological properties with respect to analgesic, anti-inflammatory, anti pyretic and anti-ulcer effects of four different liver oils of sharks belonging to the Indian EEZ and to identify the components of oil responsible for these activities.The analgesic and anti-inflammatory activities of liver oils from Neoharriotra raleighana (NR), Centrosymnus crepidater (CC), Apristurus indicus (AI), and Centrophorus sculpratus (CS) sharks caught from the Arabian Sea and the Indian Ocean were compared. The main objectives also include determination of the cholesterol lowering effects of liver oils of Neoharriotra raleighana (NR) and Centrophorus sculpratus (CS) on the high fat diet induced dyslipidemia and to compare the impact of four isolipidemic diets, on levels of serum diagnostic marker enzymes, on lipid profile of blood and liver and antioxidant status of heart in male Albino rats. And also to study the efficacy of Centrophorus sculpratus (CS) liver oil against Complete Freund’s Adjuvant-induced arthritis and to compare the anti-inflammatory activity of this oil with a traditionally used anti-inflammatory substance gingerol (oleoresin extracted from ginger.). The results of the present study indicated that both (Centrophorus sculpratus liver oils as well as gingerol extracts proved to be effective natural remedies against CFA-induced arthritis in Albino rats.

Functional studies of the deubiquitinating enzymes USP19, USP4 and UCH-L1

El marcaje de proteínas con ubiquitina, conocido como ubiquitinación, cumple diferentes funciones que incluyen la regulación de varios procesos celulares, tales como: la degradación de proteínas por medio del proteosoma, la reparación del ADN, la señalización mediada por receptores de membrana, y la endocitosis, entre otras (1). Las moléculas de ubiquitina pueden ser removidas de sus sustratos gracias a la acción de un gran grupo de proteasas, llamadas enzimas deubiquitinizantes (DUBs) (2). Las DUBs son esenciales para la manutención de la homeostasis de la ubiquitina y para la regulación del estado de ubiquitinación de diferentes sustratos. El gran número y la diversidad de DUBs descritas refleja tanto su especificidad como su utilización para regular un amplio espectro de sustratos y vías celulares. Aunque muchas DUBs han sido estudiadas a profundidad, actualmente se desconocen los sustratos y las funciones biológicas de la mayoría de ellas. En este trabajo se investigaron las funciones de las DUBs: USP19, USP4 y UCH-L1. Utilizando varias técnicas de biología molecular y celular se encontró que: i) USP19 es regulada por las ubiquitin ligasas SIAH1 y SIAH2 ii) USP19 es importante para regular HIF-1α, un factor de transcripción clave en la respuesta celular a hipoxia, iii) USP4 interactúa con el proteosoma, iv) La quimera mCherry-UCH-L1 reproduce parcialmente los fenotipos que nuestro grupo ha descrito previamente al usar otros constructos de la misma enzima, y v) UCH-L1 promueve la internalización de la bacteria Yersinia pseudotuberculosis.

Survival of European patients diagnosed with lymphoid neoplasms in 2000-2002: results of the HAEMACARE project

The European Cancer Registry-based project on hematologic malignancies (HAEMACARE), set up to improve the availability and standardization of data on hematologic malignancies in Europe, used the European Cancer Registry-based project on survival and care of cancer patients (EUROCARE-4) database to produce a new grouping of hematologic neoplasma(defined by the International Classification of Diseases for Oncology, Third Edition and the 2001/2008 World Health Organization classifications) for epidemiological and public health purposes. We analyzed survival for lymphoid neoplasms in Europe by disease group, comparing survival between different European regions by age and sex. Design and Methods Incident neoplasms recorded between 1995 to 2002 in 48 population-based cancer registries in 20 countries participating in EUROCARE-4 were analyzed. The period approach was used to estimate 5-year relative survival rates for patients diagnosed in 2000-2002, who did not have 5 years of follow up. Results: The 5-year relative survival rate was 57% overall but varied markedly between the defined groups. Variation in survival within the groups was relatively limited across European regions and less than in previous years. Survival differences between men and women were small. The relative survival for patients with all lymphoid neoplasms decreased substantially after the age of 50. The proportion of ‘not otherwise specified’ diagnoses increased with advancing age.Conclusions: This is the first study to analyze survival of patients with lymphoid neoplasms, divided into groups characterized by similar epidemiological and clinical characteristics, providing a benchmark for more detailed analyses. This Europe-wide study suggests that previously noted differences in survival between regions have tended to decrease. The survival of patients with all neoplasms decreased markedly with age, while the proportion of ‘not otherwise specified’ diagnoses increased with advancing age. Thus the quality of diagnostic work-up and care decreased with age, suggesting that older patients may not be receiving optimal treatment