Evaluation of the antioxidant activity and antitumor activity of marine invertebrates extracts

Dissertação de Mestrado, Biologia Marinha, Faculdade de Ciências e Tecnologias, Universidade do Algarve, 2014

Characterization of TRIB2-mediated resistance to anti-cancer drugs

Dissertação de Mestrado, Oncobiologia: Mecanismos Moleculares do Cancro, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016

Inmovilización de lacasas en esferas de SiO₂ para la degradación de rojo congo

Propósito y Método de Estudio: Las lacasas son enzimas extracelulares que tienen la capacidad de oxidar una amplia variedad de sustratos utilizando al oxígeno como aceptor de electrones. Debido a esto, se ha utilizado esta enzima para diversas aplicaciones biotecnológicas dentro de las cuales destaca la degradación de colorantes textiles. En este trabajo se inmovilizaron tres tipos de lacasas, dos a partir de hongos de pudrición blanca (lacasa-HPB y lacasa HTT) y una comercial del género Trametes versicolor (lacasa-EC), en esferas mesoporosas de dióxido de silicio modificado para la degradación del colorante tipo azo rojo congo y azul índigo. Las lacasas HPB y HTT fueron purificadas a partir de la fermentación líquida optimizada de los hongos de pudrición blanca. Posteriormente se inmovilizaron mediante enlace covalente con el soporte (SiO2) y se realizaron las cinéticas de actividad enzimática y de degradación de los colorantes rojo congo y azul índigo. Contribuciones y Conclusiones: Se encontraron las condiciones de máxima producción de lacasa para los hongos seleccionado (HPB) y el hongo de referencia (HTT), observando que la producción de las lacasas se ve favorecida cuando el medio de cultivo contiene materiales ligninocelulósicos. Además se purificaron lacasas a partir de los extractos de los hongos HPB y HTT obteniendo pesos molecuares de aproximadamente 67 kDa lo que concuerda con lo reportado para las lacasas monoméricas. Se inmovilizaron las lacasas-EC, lacasas-HPB y lacasas-HTT en esferas mesoporosas de dióxido de silicio reteniendo un 56.94%, 55.68% y 46.08% de su actividad inicial respectivamente. En la degradación del colorante rojo congo con las enzimas inmovilizadas se obtuvieron porcentajes de decoloración de un 92.2%, 61.9% y 42.2% para la lacasa-EC, lacasa-HPB y lacasa-HTT en un tiempo de 60 minutos. Para el colorante azul índigo los porcentajes de degradación fueron de 89.2%, 62.1% y 50.3% para la lacasa-EC, lacasa-HPB y lacasa-HTT en 90 minutos. Por los resultados anteriores se muestra que la inmovilización enzimática de lacasas en SiO2 mesoporoso modificado con aminas, es una opción recomendable en el tratamiento de efluentes textiles, ya que los porcentajes de degradación se favorecen por el aporte que presenta el soporte en la degradación debido a la adsorción del colorante, disminuyendo por lo tanto los tiempos de proceso de tratamiento de efluentes acuosos con colorantes.

Impacto de la microbiota intestinal de plodia interpunctella en su respuesta inmune y susceptibilidad a bacillus thuringiensis

El aumento en las poblaciones de insectos plaga genera fuertes pérdidas en la producción agrícola. El control de plagas inicialmente se enfocó al empleo de insecticidas químicos; sin embargo, estos han causado un considerable daño al medio ambiente y a la salud humana, por lo que dentro de las alternativas de control se están empleando biopesticidas como la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt). El empleo de esta bacteria se ha dificultado por el potencial desarrollo de insectos resistentes, lo cual está relacionado en general con cambios en la actividad enzimática y en los receptores de toxinas Cry en el intestino. Recientes estudios sugieren que se requiere de la microbiota intestinal para la actividad insecticida de Bt y que la respuesta inmune de los insectos podría verse afectada por el bioinsecticida. Por ello, en este trabajo se analizó el efecto de las bacterias intestinales en la respuesta inmune y en la susceptibilidad a Bt en el lepidóptero Plodia interpunctella, una de las plagas de granos almacenados de mayor importancia a nivel mundial. Así mismo, se realizó una descripción de los géneros bacterianos de dicho ecosistema mediante el análisis de secuencias del ARNr 16S bacteriano del intestino de larvas del insecto. Nuestros resultados demuestran la importancia de las bacterias intestinales de P. interpunctella en la susceptibilidad a Bt, teniendo una mortalidad de un 21% al erradicar la microbiota respecto a un 60% de mortalidad en su estado normal (con microbiota). La ausencia de microorganismos en el intestino modificó la respuesta inmune basal, aumentando el número de hemocitos y disminuyendo la expresión de hemolina, lo cual retardó el proceso de metamorfosis del insecto. Las larvas expuestas a Bt presentaron una disminución en los siguientes factores de inmunidad evaluados: número de hemocitos, actividad fenol oxidasa y expresión de hemolina. En cuanto a la diversidad bacteriana del intestino, los principales géneros de bacterias encontrados fueron Pseudomonas con un 26%, Achromobacter 14%, Methylobacterium 11% y un 9% de Propionibacterium, que al igual que los hábitos alimenticios del insecto, su microbioma fue diferente al reportado para otros lepidópteros. Estos resultados nos permiten concluir que la microbiota de P. interpunctella es fundamental para mantener una respuesta inmune basal y ayuda a modular la expresión de la hemolina, la cual se requiere para la metamorfosis del insecto. Así también, Bt puede disminuir dicha respuesta y matar al insecto sin la presencia de otras bacterias; sin embargo, éstas aumentan su actividad insecticida.

Identificação de alvos moleculares para o diagnóstico quantitativo da resistência a pesticidas organofosforados em populações do carrapato-dos-bovinos.

Os programas de controle direcionados aos parasitas ainda exigem a utilização de produtos químicos para maior estabilidade operacional das ações de controle e o uso de carrapaticidas químicos é a principal ferramenta de controle para as infestações do carrapato-dos-bovinos. A utilização de técnicas fenotípicas de avaliação in vitro da suscetibilidade de carrapatos às bases pesticidas são ainda o método mais prático e mais utilizados para o diagnóstico e mensuração do fator de resistência às bases carrapaticidas. Na atualidade, o desenvolvimento e o aprimoramento de provas diagnósticas moleculares de resistência aos diferentes grupos pesticidas devem ser consideradas como ações prioritárias de pesquisa e desenvolvimento dada a necessidade de disponibilização ao setor produtivo de ferramentas acuradas e de rápida execução que a médio prazo venham a substituir os bioensaios, os quais necessitam de aproximadamente 45 dias para obtenção dos resultados. A partir de uma população de Rhipicephalus microplus reconhecidamente resistente a pesticidas foram realizados os estudos que demonstram a atividade enzimática das estares no processo de detoxicação de organofosforados. Observou-se que na cepa de R. microplus resistente a organofosforados ocorreu o aumento na transcrição dos genes que codificam enzimas metabolizantes, possibilitando identificar os alvos moleculares aptos para serem utilizadas no desenvolvimento do ensaio diagnóstico molecular quantitativo para a resistência aos pesticidas organofosforados em populações do carrapato-dos-bovinos.

Relación de la enzima alfa-amilasa salivar con la presencia de sintomatología psicopatologica internalizada auto- y hetero-observada en una muestra de niños y niñas de entre 7 y 12 años de edad: un estudio piloto.

Introducción: La medición de la actividad enzimática (AAAs) y del flujo de secreción (FSAAs) de la enzima alfa-amilasa salivar han sido propuestos por diversos grupos de investigación como posibles marcadores biológicos indirectos, no invasivos, y de bajo coste, del nivel de actividad noradrenérgica periférica/central. Dicha actividad noradrenérgica se sustenta, esencialmente, gracias a la actividad preponderante del denominado Sistema Locus Coeruleus-Noradrenalina (LC-NA), un sistema básico en la modulación de diversas funciones atencionales, cognitivas ejecutivas, así como en la regulación de los estados de ánimo. Material y Método: En nuestro estudio piloto (N = 13; 9 niños, 4 niñas; Edad media ± DT = 10,23 ± 1,53) se analizó la relación entre ambos marcadores salivares junto al parámetro flujo de secreción salivar total (registrados a lo largo de un proceso de evaluación neuropsicológica escolar) y diversas medidas auto (CDI; ansiedad, depresión y depresión total) y hetero-reportadas (escalas de psicopatología internalizada del TRF: ansiedad- depresión, depresión-aislamiento, alteraciones psicosomáticas y psicopatología internalizante total). Resultados: Los análisis estadísticos basados en el cálculo de coeficientes de correlación producto-momento de Pearson (de tipo parcial al controlar el efecto de la variable IMC), revelaron correlaciones estadísticamente significativas y directas entre el FSAAs y las puntuaciones en la escala ansiedad-depresión (p < 0,039) y psicopatología internalizante total del TRF (p < 0,012), así como una tendencia a la significación en el caso de las puntuaciones para la escala de alteraciones psicosomáticas (p = 0,054) de esa misma prueba. Del mismo modo, se observaron tendencias a la significación en la asociación directa entre las subescalas ansiedad-depresión (p = 0.065) y psicopatología internalizante total (p = 0.083) y la medida del flujo salivar total. Por otro lado, se observaron asociaciones inversas estadísticamente significativas entre la variable flujo salivar total y las puntuaciones de ansiedad (p < 0.01) y depresión total (p < 0.01) obtenidas a través del CDI. Discusión: Estos resultados preliminares de este estudio piloto abren una interesante línea de trabajo en nuestro laboratorio acerca de la utilidad de la medición de la AAAs, FSAAs y FST como posibles marcadores biológicos, no invasivos, y de bajo coste, aptos para su empleo con poblaciones pediátricas. Dichos marcadores, están relacionados con el grado de actividad noradrenérgica periférica/central desarrollada por el sistema LC y con la actividad del SNV, que a su vez están implicados en la regulación de los estados afectivos. Estudios recientes han mostrado bajos niveles basales de alfa-amilasa salivar en el caso de pacientes jóvenes diagnosticados de su primer episodio depresivo (Cubala y Landoski, 2014) y en participantes infantiles con mayor sintomatología depresiva heteroobservada (Vigil et al., 2006; Maldonado et al., 2014; Maldonado, enviado). Estos resultados complementan las observaciones realizadas anteriormente por nuestra laboratorio (Maldonado et al., 2014; Maldonado, enviado).

Análisis de los cambios epigenéticos en la metilación del DNA inducidos por la diabetes y sus posibles mecanismos

Los cambios epigenéticos son responsables de la aparición de muchas patologías humanas y sus causas son debido a factores ambientales como genéticos. Se ha descrito en enfermedades crónicas como la Diabetes Mellitus tipo 2 (T2DM) que se caracteriza por los estados de hiperglucemia y el incremento en el estrés oxidativo que conlleva a complicaciones micro y macro vasculares, asociado a una desmetilación global del genoma. Nuestra hipótesis corresponde a que los órganos diana son afectados por las alteraciones como la metilación e hidroximetilación como consecuencia del estrés oxidativo que luego repercuten en la persistencia de la enfermedad. Métodos: A partir de sangre periférica se analizaron los cambios globales en la metilación del DNA que son afectados por el estado metabólico de 60 individuos (40 pacientes, 20 controles sanos). Por técnicas de cuantificación se compararon los resultados obtenidos con los de la expresión de las enzimas involucradas. Por último, se realizó un estudio de microarreglos de metilación del DNA y de expresión obtenidos de la base de datos GEO para así comparar los resultados con nuestros datos experimentales. Resultados: Los pacientes diabéticos con pobre control metabólico presentaron mayores niveles de metilación que el grupo control y no se encontró alteración en las enzimas involucradas en este proceso. Los resultados fueron concordantes con el estudio de microarreglos. Conclusión: Los estudios experimentales y de microarreglos demostraron que la metilación es tejido específico y que existe una mayor oxidación en pacientes. Por ello proponemos una vía alterna de desmetilación no enzimática, basada en la oxidación directa de los grupos metilos generados por los estados oxidativos característicos de esta enfermedad.

Fitoextracção de cádmio de solos contaminados, com plantas seleccionadas

A remediação de locais contaminados com metais pesados usando plantas hiperacumuladoras aparenta ser uma alternativa bastante viável. Neste trabalho comparou-se a acumulação e tolerância ao cádmio (Cd), ambas baseadas nas respostas ao stress oxidativo em três espécies de plantas diferentes: Brassica juncea (L.) Czem., Nicotiana tabacum L. e Solanum nigrum L., descritas na literatura como plantas bastante tolerantes ou até com características híper acumuladoras. As plantas cresceram num solo contaminado com diferentes concentrações de Cd (O- 35 mg kg-1) durante um período de 90 dias. O factor de translocação (FT), utilizado para medir a translocação efectiva do Cd da raiz para a parte aérea, variou consideravelmente entre as espécies desenvolvidas. A N. tabacum foi a planta que apresentou os maiores valores de FT. Neste trabalho foi a única planta que preencheu todas as condições para ser considerada hiperacumuladora para todos os níveis de contaminação do solo. Por outro lado, a S. nigrum apresentou os maiores valores de concentração de Cd nos tecidos, com um FT > 1, na presença de 5 mg Cd kg·1 de solo. Apesar da B. juncea ter apresentado um resultado de FT inferior às restantes, foi a única planta com valores crescentes de FT com o aumento da contaminação de Cd. O stress oxidativo nas plantas desenvolvidas foi avaliado pela peroxidação lipídica e pelas actividades da catalase (CAT), ascorbato peroxidase (APX), guaiacol peroxidase (GPX) e superóxido dismutase (SOO), quer na raiz quer na parte aérea. Foi observado um aumento significativo (versus controlo) na peroxidação lipídica e actividade enzimática da CATe APX na parte aérea da B. juncea, N. tabacum e S. nigrum para os níveis de contaminação mais elevados, 15 e/ou 35 mg Cd kg-1 A B. juncea apresentou maior sensibilidade na resposta da GPX, para todas as concentrações de Cd no solo. A peroxidação lipídica e a actividade da CAT foram superiores na parte aérea em relação à raiz para todas as plantas em todas as contaminações de Cd presentes no solo. A actividade da SOO não apresentou respostas consistentes para nenhuma das plantas. ABSTRACT: Remediation of sites contaminated with heavy metals using hyper accumulators seems a promising alternative to engineering approaches. ln this work, we compared cadmium (Cd) accumulation and tolerance (based on responses to oxidative stress) in three different species, Brassica juncea (L) Czem., Nicotiana tabacum L. and Solanum nigrum L., described in the literature as very tolerant or even as hyper accumulators. The plants were grown in soil spiked with different Cd concentrations (O- 35 mg kg- 1) over a period of 90 days. The translocation factor (TF), used to measure the effectiveness of translocating Cd from roots to shoots, depended greatly on the species. N. tabacum was the plant which exhibited the highest TF values. lt was the only plant under study that fulfilled the conditions of a hyper accumulator for all levels of soil contamination. On the other hand, S. nigrum presented the highest Cd concentration in plant tissues, with TF > 1 in the presence of 5 mg Cd kg-1 of soil. Although B. juncea had presented the lowest TF and Cd concentrations, it was the only plant with TF values increasing with the level of cadmium. Oxidative stress in plants was evaluated by lipid peroxidation and activities of catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX), guaiacol peroxidase (GPX) and superoxide dismutase (SOO), both in roots and shoots. A significant enhancement (versus control) on lipid peroxidation and enzymatic activity of CAT and APX in shoots of B. juncea, N. tabacum and S. nigrum was observed for the highest levels of Cd in soil, 15 and/or 35 mg Cd kg-1. B. juncea presented the most sensitive response of GPX, for all levels of Cd in soil. Lipid peroxidation and CAT activity were greater in shoots than in roots for all plants and soil Cd concentrations. SOO activity did not present consistent trends for any plant.

Impacto da contaminação de sedimento de mangue com óleo na atividade de microrganismos.

Sedimentos de mangue contaminados ou não com produtos derivados do petróleo foram avaliados quanto à atividade microbiana e enzimática. Os maiores valores de C na biomassa microbiana foram obtidos nas áreas de transição e restinga, independentemente da contaminação. No mangue contaminado,a biomassa microbiana encontrada na área de transição significativamente menor que as outras áreas. Os maiores valores de qCO2 foram encontrados no mangue contaminado, indicando que a população microbiana gasta mais energia para a manutenção da sua biomassa. Os maiores resultados das atividades enzimáticas, principalmente arilsulfatase, B-glucosidase e fosfatase, foram obtidos na área de transição no mangue contaminado.

Avaliação da citotoxidade do Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) em leite e colostro de cabra com Artrite Encefalite Caprina (CAE).

2015

Caracterização genética da pimenta-do-reino e do cupuaçu através de isoenzimas.

O objetivo da pesquisa foi analisar a variação isoenzimática presente em híbridos e cultivares de pimenta-do-reino (Piper nigrum) e acessos de cupuaçu (Theobroma grandiflorum). O material utilizado foi proveniente dos bancos de germoplasma da Embrapa Amazônia Oriental. As metodologias para a extração das enzimas, formulação de tampões do gel e da cuba e para os procedimentos de coloração foram os descritos por Tsumura, 1990, modificado. Foram testados dezoito sistemas enzimáticos: FUM, ACP; PGI; SKDH; ACO; GOT; G6PD ; 6PGD; DIA; MNR; ME; MDH; GDH; PGM; TZO; ADH; LAP e SoDH. As interpretações genéticas foram feitas de acordo com o método descrito por Alfenas et al., 1991. Concluiu-se, através dos padrões eletroforéticos encontrados, que seis sistemas empregados apresentaram polimorfismo enzimático para a pimenta-do-reino e quatro para o cupuaçu. A presença de heterozigosidade nos materiais estudados significa variabilidade a ser explorada no programa de melhoramento genetic° destas espécies. A resolução obtida nestes sistemas com bandas bem nítidas indica a presença de atividade enzimática em folhas jovens de pimenta-do-reino e cupuaçu.

Pré-tratamento enzimático de resíduos lignocelulósicos para sacarificação.

No Brasil são gerados anualmente toneladas de resíduos agroindustriais de composição lignocelulósica, os quais podem ser utilizados como biomassa para produção de etanol de segunda geração (2G). Nesse trabalho avaliou-se a aplicação de uma rota biológica para a remoção da lignina de materiais lignocelulósicos e posterior sacarificação por celulases. Extratos brutos enzimáticos ricos em lacase foram produzidos em cultivo líquido estático pelo fungo Pleurotus ostreatus e utilizados na presença e ausência de mediadores químicos para o pré-tratamento de casca de arroz e serragem de eucalipto urofila. O pré-tratamento da casca de arroz com lacases possibilitou um aumento de 2,6 vezes na concentração de açúcares após a sacarificação em comparação com a biomassa não pré-tratada. Não foram obtidos resultados significativos na sacarificação com o prétratamento da serragem de eucalipto pelas lacases, no entanto, modificações em picos correspondentes a lignina e a celulose foram observadas em análises realizadas por FTIR.

Influence of nitrogen sources on the enzymatic activity and grown by Lentinula edodes in biomass Eucalyptus benthamii.

Lignocelulose é o componente mais abundante do meio ambiente e recurso orgânico renovável no solo. Alguns fungos filamentosos têm desenvolvido a habilidade de degradar e utilizar celulose, hemicelulose e lignina como fonte de energia. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito de três fontes de nitrogênio (sulfato de amônio, nitrato de potássio e farelo de soja) na atividade enzimática de Lentinula edodes EF 50 utilizando como substrato serragem de E. benthamii. Foi aplicado um planejamento experimental de mistura com três repetições no ponto central constituído de sete tratamentos (T) de iguais concentrações em nitrogênio de sulfato de amônia, nitrato de potássio e farinha de soja cozida. Foram determinadas a atividade enzimática da avicelase, carboximetilcelulase, β-glicosidase, xilanases e manganês peroxidase. Foram avaliados o teor de umidade, pH, atividade de água (aw) e análise qualitativa do crescimento micelial em 8 tempos de cultivo. Os resultados mostraram efeito negativo na produção das enzimas nos tratamentos com máxima concentração de sulfato de amônia e nitrato de potássio. Os tratamentos com farinha de soja cozida expressaram maiores atividades enzimáticas, nos tempos de 3, 6 e 9 dias de cultivo exceto na atividade do manganês peroxidase. A maior produção foi observada no tratamento com sulfato de amônia e farinha de soja cozida (83.86 UI.L?1) em 20 dias de cultivo.

Comparação da produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas por linhagens mutantes e parental do Aspergillus niger 3T5B8.

Diversos trabalhos têm procurado aumentar a eficiência da hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica. Nesse contexto, o melhoramento de cepas produtoras de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas pode resultar em misturas enzimáticas mais eficientes. A linhagem parental de Aspergillus niger 3T5B8, referenciada como produtora de poligalacturonase, foi utilizada para o melhoramento genético visando aumentar a produção de celulases e hemicelulases. A produção das enzimas CMCase, xilanase, beta-glicosidase e poligalacturonase por fermentação submersa usando duas linhagens mutantes P49 e P83 foi avaliada e comparada com a linhagem parental. Os resultados mostraram um destaque para a cepa P83 com um aumento na produção de 56% de CMCase, 76% de beta-glicosidase, 23% de xilanase e 216% na poligalacturonase.

Caracterização das lipases obtidas por duas cepas de Aspergillus niger.

As lipases são enzimas que catalisam a hidrólise parcial ou total de triacilglicerois produzindo ácidos graxos livres, diacilglicerol, monoacilglicerol e glicerol. Este trabalho caracterizou a especificidade, a temperatura ótima e o pH ótimo das lipases obtidas por duas cepas de Aspergillus niger, sendo uma selvagem C e outra mutante 11T53A14. Os resultados mostram que os extratos enzimáticos apresentam especificidade diferentes, sendo a cepa selvagem mais específica para ácidos graxos de 8 carbonos e a cepa mutante inespecífica em relação ao tamanho do ácido graxo. As duas cepas apresentaram atividade em uma ampla faixa de pH, porém observou-se uma redução da atividade de mais de 50% em pH acima de 9,0. Em relação à temperatura, as lipases das duas cepas se mostraram mais ativas a 35°C.