Characterization of TRIB2-mediated resistance to anti-cancer drugs

Dissertação de Mestrado, Oncobiologia: Mecanismos Moleculares do Cancro, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016

Cancer results from the accumulation of multiple mutations and is characterized by deregulated cell mechanisms including cell growth, tissue invasion, angiogenesis and metastasis, being responsible for a large number of worldwide deaths. Malignant melanoma is the most aggressive type of human skin cancer, being just 5% of all skin cancer cases but accounting for over 80% of all skin deaths. This is primarily the result of melanoma being highly resistant to conventional chemotherapy. The PI3K/AKT signaling pathway is involved in many cell processes like survival, proliferation, growth and is one of the most mutated pathways in all human cancers, particularly in melanomas. FOXO3a, a transcriptional factor, is a crucial component of the PI3K/AKT pathway regulating the transcription of genes that promote apoptosis and cell cycle arrest. Following its activation, AKT negatively regulates FOXO3a, via phosphorylation, leading to FOXO3a export from the nucleus into the cytoplasm where it is ubiquitinated and is degraded. Consequently, if AKT is constitutively active, this enables a cancer cell to avoid apoptosis and to keep proliferating. The TRIB2 protein was discovered to be a FOXO3a repressor and is over expressed in many cancers although how TRIB2 mediates this effect is unknown. This project evaluates TRIB2 drug resistance to a dual PI3K/mTOR inhibitor BEZ235 in a clinically representative in vivo BEZ235 treatment model to confirm if our in vitro data (published and unpublished) correlates in a 3D in vivo model and demonstrates that AKT and TRIB2 interact in both in vitro cell models and in ex vivo clinical samples.

O cancro é a nível mundial, uma das principais causas de morte. É o resultado da acumulação de várias mutações ao longo do tempo, e caracteriza-se pela desregulação dos mecanismos celulares. Há várias características que uma célula normal necessita para que se tornar cancerígena, sendo designadas como as “hallmarks of cancer” e neste momento são conhecidas dez: resistência à morte celular (apoptose), serem capazes de proliferar, serem capazes de escapar à vigilância e destruição por parte do sistema imune, serem imortais através da sua contínua replicação, serem genomicamente instáveis, serem capazes de induzirem a angiogénese (produção de novos vasos sanguíneos), desregularem os mecanismos de produção de energia celular, terem a capacidade de invadir outros tecidos, e por fim serem capazes de metastizar. Melanoma maligno, é um tipo de cancro da pele que embora não sendo o mais comum, contemplando apenas 5% dos casos totais de cancro da pele, é o tipo mais agressivo, visto que é responsável por 80% das mortes por cancro da pele e a idade média de aparecimento é aos 50 anos, tendo maior incidência em indivíduos caucasianos. Este tipo de cancro é causado pela transformação maligna das células produtoras de melanina, os melanócitos que se encontram situados na epiderme. É também caracterizado por ser dos cancros no ser humano com pior prognóstico, e este facto deve-se à sua rápida metastização e invasão de outros tecidos e ao facto de atualmente não existirem drogas eficazes para o seu tratamento, havendo muitos casos verificados de resistência a quimioterapêuticos convencionais por parte destes pacientes. Este tipo de cancro é inicialmente designado por melanoma in situ sendo que nesta primeira fase, o seu desenvolvimento ocorre horizontalmente, dentro da epiderme. Ao longo do tempo, o seu crescimento é em profundidade, penetrando a derme e neste caso passa a ser designado por melanoma invasivo. Caso a doença seja detetada até esta fase, o prognóstico do paciente será bom uma vez que através de intervenção cirúrgica a fim de remover o tumor confere cerca de 95% de taxa de sobrevivência de 5 anos aos pacientes. A via de sinalização PI3K/AKT está envolvida em múltiplos processos celulares, desde mecanismos relacionados com sobrevivência, crescimento e proliferação celular, e é uma das vias metabólicas mais mutadas em cancros humanos. PI3Ks são enzimas que desencadeiam a cascata de ativação de várias proteínas. A desregulação da via PI3K/AKT está associada a um elevado número de pacientes com melanoma, pelo que é necessário que se encontrem novas drogas de forma a melhorar o prognóstico dos pacientes, através da compreensão desta via de sinalização e dos seus componentes. Sendo o AKT uma quinase, identificada como estando constantemente ativa nesta via, e estando descrito que esta ativação por parte do PIP3 (um dos substratos das PI3Ks), vai fazer com que o fator de transcrição FOXO3a, responsável pela transcrição de genes que promovem a paragem do ciclo celular (para que sejam remendados erros através dos checkpoints), e a apoptose (necessária para que as células cancerígenas morram) seja exportado do núcleo (onde está ativo), para o citoplasma onde através da fosforilação por parte do AKT, vai ser ubiquitinado e marcado para destruição proteossomal, impedindo assim que os genes com características anticancerígenas sejam transcritos. Por ser uma das vias mais mutadas, e por não haver terapias eficazes, a via PI3K/AKT está a ser alvo de vários estudos e há várias drogas a ser testadas em ensaios clínicos, sendo BEZ235 principal foco no meu projeto de investigação, tendo já sido descrito por vários autores como tendo um potencial terapêutico anticancerígeno, visto que é um inibidor das PI3Ks. Atualmente, sabe-se que a grande maioria dos pacientes com melanoma, adquire ao longo do tempo resistência aos tratamentos, pelo que se tem tentado compreender os mecanismos envolvidos nessa resistência, de forma a saber como reverter este problema. É também conhecido na literatura que o TRIB2 é um gene cuja sobrexpressão está associada a vários tipos de cancro, entre os quais melanomas, estando este gene também associado a mecanismos de resistência a quimioterapêuticos, bem como está descrito o seu envolvimento na regulação negativa do FOXO3a. Não é ainda evidente de que forma é feita esta regulação, pelo que é crucial que haja mais investigação acerca destes mecanismos, uma vez que sabendo de que forma FOXO3a é inativado através do TRIB2, será possível encontrar uma forma de inverter esta situação. A principal hipótese colocada pelo nosso grupo de investigação com base em estudos feitos anteriormente, é a de que embora os inibidores das PI3Ks estejam a atuar, e que estas sejam de facto inibidas, se o TRIB2 estiver constantemente a ativar o AKT hipoteticamente através da fosforilação deste, o inibidor não estará a sortir o efeito desejado, pelo facto de o AKT estar constantemente ativo, visto que consequentemente vai inativar o FOXO3a, impedindo a transcrição dos genes com propriedades anticancerígenas, como por exemplo BIM, FasLG, p27, entre outros. Neste projeto de investigação, é feita a avaliação do inibidor das PI3Ks BEZ235, de forma a compreender se a inativação do FOXO3a tem ou não relação com a interação entre o AKT e o TRIB2. Para isso fizeram-se vários estudos para não só verificar se há uma co-localização do TRIB2 e do AKT, através de CO-IP e de microscopia de fluorescência, bem como para compreender se realmente se verifica esta resistência a drogas por parte das células tumorais dos melanoma, e se a sobreexpressão de TRIB2 está em concordância um aumento do de AKT no seu estado ativo, ou seja fosforilado (pAKT/PO4-AKT) através de estudos in vitro, in vivo e ex vivo (com amostras clínicas de pacientes). Atualmente está aprovado apenas um biomarcador para melanoma, LDH. Assim, o ideal seria que o TRIB2 fosse igualmente aprovado como biomarcador para a doença, para que desta forma fosse possível que através de um “screening” a pacientes com melanoma, verificar se há sobreexpressão de TRIB2. Verificando ser o caso, evitar-se-ia a administração de inibidores das PI3Ks tal como BEZ235, uma vez que esta droga não terá um efeito benéfico para o paciente e este estará apenas a sofrer efeitos citotóxicos desnecessários. Devem ser feitos mais estudos de forma a elucidar os mecanismos que levam a que haja esta resistência, para que se descubram alternativas terapêuticas eficazes de forma a melhorar o prognóstico destes pacientes, já que este é dos menos promissores para a sobrevivência destes doentes.