L-arginine may mediate the therapeutic effects of low protein diets.

We have previously shown beneficial effects of dietary protein restriction on transforming growth factor beta (TGF-beta) expression and glomerular matrix accumulation in experimental glomerulonephritis. We hypothesized that these effects result from restriction of dietary L-arginine intake. Arginine is a precursor for three pathways, the products of which are involved in tissue injury and repair: nitric oxide, an effector molecule in inflammatory and immunological tissue injury; polyamines, which are required for DNA synthesis and cell growth; and proline, which is required for collagen production. Rats were fed six isocaloric diets differing in L-arginine and/or total protein content, starting immediately after induction of glomerulonephritis by injection of an antibody reactive to glomerular mesangial cells. Mesangial cell lysis and monocyte/macrophage infiltration did not differ with diet. However, restriction of dietary L-arginine intake, even when total protein intake was normal, resulted in decreased proteinuria, decreased expression of TGF-beta 1 mRNA and TGF-beta 1 protein, and decreased production and deposition of matrix components. L-Arginine, but not D-arginine, supplementation to low protein diets reversed these effects. These results implicate arginine as a key component in the beneficial effects of low protein diet.

A conserved family of elav-like genes in vertebrates.

A large family of genes encodes proteins with RNA recognition motifs that are presumed to bind RNA and to function in posttranscriptional regulation. Neural-specific members of this family include elav, a gene required for correct differentiation and maintenance of neurons in Drosophila melanogaster, and a related gene, HuD, which is expressed in human neuronal cells. I have identified genes related to elav and HuD in Xenopus laevis, zebrafish, and mouse that define a family of four closely related vertebrate elav-like genes (elrA, elrB, elrC, and elrD) in fish, frogs, and mammals. In addition to protein sequence conservation, a segment of the 3'-untranslated sequence of elrD is also conserved, implying a functional role in elrD expression. In adult frogs, elrC and elrD are exclusively expressed in the brain, whereas elrB is expressed in brain, testis, and ovary. During Xenopus development, elrC and elrD RNAs are detected by late gastrula and late neurula stages, respectively, whereas a nervous system-specific elrB RNA species is expressed by early tadpole stage. Additional elrB transcripts are detected in the ovary and early embryo, demonstrating a maternal supply of mRNA and possibly of protein. These expression patterns suggest a role for different elav-like genes in early development and neuronal differentiation. Surprisingly, elrA is expressed in all adult tissues tested and at all times during development. Thus, the widely expressed elrA is expected to have a related function in all cells.

Determinação de biomarcadores de aflatoxina B1 e aplicabilidade na avaliação da eficiência de adsorventes em frangos de corte

As aflatoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos toxigênicos das espécies Aspergillus flavus, A. parasiticus e A. nomius. São amplamente encontradas em matérias-primas de rações animais, em especial o milho, e têm a capacidade de levar a quadros clínicos agudos ou crônicos de aflatoxicose, caracterizados por, desde a morte por hepatite aguda até a diminuição do desempenho zootécnico por diminuição de peso ou consumo de ração. A aflatoxina B1 tem sido considerada o metabólito mais perigoso, uma vez que possui alto poder hepatotóxico, além de ser mutagênica e carcinogênica. Atualmente a ciência trabalha rumo à descoberta de substâncias que sejam indicadoras confiáveis de contaminação por componentes tóxicos em homens e em animais, os chamados biomarcadores, que medem uma mudança celular, biológica ou molecular em um meio biológico (tecidos humanos, células ou fluídos) que fornecem informação a respeito de uma doença ou exposição a uma determinada substância. Sua detecção pode auxiliar na identificação, no diagnóstico e no tratamento de indivíduos afetados que podem estar sob risco, mas ainda não exibem os sintomas. Sendo assim, com o auxílio de análises que confirmem a patogenicidade da aflatoxina B1 (determinação da atividade de enzimas hepáticas, da avaliação da função renal, de hematologia, da dosagem de minerais séricos e da avaliação de desempenho zootécnico), o objetivo deste trabalho foi avaliar a aplicabilidade da determinação de resíduos hepáticos de aflatoxinas e do aduto sérico AFB1-lisina na avaliação da eficiência de adsorventes em frangos de corte. Utilizou-se 240 pintos de 1 dia, machos, de linhagem Cobb 500®, distribuídos aleatoriamente em 4 dietas experimentais: Controle Negativo: Ração Basal (RB); RB + 0,5% de adsorvente ((aluminosilicato de cálcio e sódio hidratado/HSCAS); RB + 0,5% de adsorvente + 500 µg de AFB1/kg de ração e; RB + 500 µg de AFB1/kg de ração.Os resultados experimentais mostram que o efeito deletério da AFB1, na concentração utilizada, é mais pronunciado que os efeitos protetores do HSCAS sobre os parâmetros de saúde dos animais. Não houve ação efetiva do adsorvente utilizado sobre quase nenhuma variável estudada, apenas para a redução das lesões histopatológicas em fígado, na redução da concentração de gama-glutamiltransferase (GGT), fósforo e aumento da contagem de hemáceas aos 21 dias de idade. Porém, influenciou positivamente a redução de resíduos hepáticos de aflatoxina G1 aos 21 dias e as concentrações de AFB1-lisina sérica aos 21 e aos 42 dias de idade. Estes dados são importantes porque permite concluir que, embora sintomatologicamente o HSCAS não tenha exercido função efetiva, molecularmente foi capaz de mostrar de eficácia sobre os alguns biomarcadores de aflatoxinas no organismo das aves

Contribuição das células-tronco mesenquimais para as propriedades tumorigênicas de células de glioblastoma humano

Células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam tropismo a tumores, sendo importantes componentes do estroma tumoral. No cérebro, o nicho perivascular é uma importante fonte de CTM, as quais podem contribuir direta e/ou indiretamente para o desenvolvimento de tumores, embora os mecanismos envolvidos sejam pouco conhecidos. No presente trabalho, investigou-se a influência de CTM sobre a proliferação, capacidade invasiva e tumorigenicidade de células de Glioblastoma (GBM) humano. Sabe-se que CTM produzem TGFB1, uma citocina multifuncional envolvida em imunomodulação, proliferação, migração e transição epitelial-mesenquimal de células tumorais. Experimentos in vitro, realizados com meios condicionados de CTM de cordão umbilical humano com silenciamento permanente do gene TGFB1, demonstraram que o TGFB1 secretado por CTM é capaz de aumentar significativamente a proliferação e viabilidade de células de GBM humano da linhagem U87FP635. Esses resultados revelam uma importante ação parácrina dessa citocina regulatória, quando produzida por outros tipos celulares contidos no microambiente tumoral. Entretanto, sob condições experimentais que melhor mimetizam o microambiente tumoral, detectou-se que CTM também afetam o comportamento de células tumorais por um mecanismo alternativo, dependente de contato celular, mas independente dos níveis de TGFB1 secretados pelas CTM. Sob condições de cocultivo celular, envolvendo contato físico entre CTM e células de GBM U87FP635, detectou-se um aumento significativo na quantidade de células tumorais viáveis. Quando cultivadas na forma de esferoides tumorais, o contato com CTM aumentou a capacidade invasiva das células U87FP635. Finalmente, em modelo in vivo ectópico de GBM, células U87FP635 geraram tumores mais desenvolvidos quando coinjetadas com CTM. Esses efeitos pró-tumorigênicos foram observados tanto em contato com CTM controles, quanto com CTM contendo o gene TGFB1 permanentemente silenciado. Assim, esses achados indicam que CTM podem exercer efeitos pró-tumorigênicos por dois mecanismos alternativos e independentes: ação parácrina de TGFB1 secretado por CTM e ação mediada por contato célula-célula. Nas condições experimentais testadas, o mecanismo dependente de contato célula-célula demonstrou ser predominante. O estudo proteômico do secretoma dessas células identificou 126 proteínas diferencialmente expressas além de 10 proteínas exclusivamente detectadas em meios condicionados de cocultivos de CTM com células de GBM U87FP635. Cerca de 80% dessas proteínas exclusivamente secretadas pelo contato célula-célula são componentes de exossomos e estão envolvidas em proliferação celular e desenvolvimento tecidual. Esses resultados apontam uma interação dinâmica de comunicação entre CTM e células tumorais, e revelam algumas proteínas interessantes potencialmente envolvidas em uma ação pró-tumorigênica de CTM mediada por contato celular

Caracterização in vitro do metabolismo e da absorção intestinal da casearina X

As principais propriedades farmacológicas da Casearia sylvestris, uma espécie de árvore cujas folhas são utilizadas na medicina popular, já foram descritas na literatura. Recentemente foi demonstrada a potente atividade citotóxica in vitro da casearina X (CAS X), o diterpeno clerodânico majoritário isolado das folhas de C. sylvestris, contra linhagens de células tumorais humanas. Apesar dos resultados promissores, sua potente atividade citotóxica in vitro não pode ser extrapolada para uma potente atividade in vivo, a menos que possua boa biodisponibilidade e duração desejável do seu efeito. Tendo em vista que o avanço nas pesquisas de produtos naturais requer a avaliação pré-clínica de propriedades farmacocinéticas, no presente trabalho foi realizada a caracterização in vitro do metabolismo e da absorção intestinal da CAS X, com o objetivo de prever sua biodisponibilidade in vivo. Para os estudos de metabolismo in vitro, foi utilizado o modelo microssomal hepático de ratos e de humanos. Foi desenvolvido um método analítico para a quantificação da CAS X em microssomas, empregando a precipitação de proteínas com acetonitrila no preparo das amostras e a cromatografia líquida de alta eficiência para as análises. O método foi validado de acordo com os guias oficiais da Agência Nacional de Vigilância Sanitária e da European Medicine Agency (EMA). A CAS X demonstrou ser substrato para as reações de hidrólise mediada pelas carboxilesterases (CES) e apresentou um perfil cinético de Michaelis-Menten. Foram estimados os parâmetros de Vmax e KM, demonstrando que o clearance intrínseco em microssomas hepático de humanos foi 1,7 vezes maior que o de ratos. O clearance hepático foi estimado por extrapolação in vitro-in vivo, resultando em mais de 90% do fluxo sanguíneo hepático em ambas as espécies. Um estudo qualitativo para a pesquisa de metabólitos foi feito utilizando espectrometria de massas, pelo qual foi possível sugerir a formação da casearina X dialdeído como produto de metabolismo. Nos estudos de absorção intestinal in vitro foi utilizado o modelo de monocamadas de células Caco-2. Um método analítico por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas foi desenvolvido e validado de acordo com o EMA, para as etapas de quantificação da CAS X no sistema de células. Os parâmetros cinéticos de permeabilidade aparente absortiva e secretória da CAS X foram estimados em um sistema celular, no qual a atividade hidrolítica da CES foi inibida. Assim, a CAS X foi capaz de permear a monocamada de células Caco-2, provavelmente por transporte ativo, sem a ocorrência de efluxo, mas com significativa retenção do composto dentro das células. Em conjunto, os ensaios in vitro realizados demonstraram a susceptibilidade da CAS X ao metabolismo de primeira passagem, como substrato para as CES específicas expressas no fígado e intestino.

Lesões em DNA promovidas por produtos de oxidação do β-caroteno: possíveis implicações biológicas

Apesar de diversos estudos in vitro e em populações indicarem um efeito protetor do β-caroteno em sistemas biológicos, estudos epidemiológicos como o \"The Alpha-Tocopherol, Beta-Carotene Cancer Prevention Study\" (ATBC) e o \"The Beta-Carotene and Retinol Efficacy Trial\" (CARET) mostraram um aumento na incidência de câncer pulmonar em indivíduos fumantes suplementados com β-caroteno. Essa ação contraditória tem sido chamada na literatura de \"Paradoxo do β-Caroteno\". Sabe-se que este carotenóide sob altas pressões de oxigênio ou na presença de peróxidos pode sofrer oxidação e levar a formação de compostos como aldeídos, epóxidos, etc, que são capazes de se adicionarem covalentemente ao DNA. Estudos, in vitro e in vivo têm demonstrado a possibilidade de os metabólitos do β-caroteno agirem como agentes pró-carcinogênicos. Estes agentes quando ativados quimicamente podem levar à formação de adutos de DNA. Já se sabe que alguns desses adutos encontramse em níveis aumentados em diversas situações de risco de câncer. Diversos grupos, incluindo o nosso, têm demonstrado a formação de lesões em DNA a partir de aldeídos e epóxidos exógenos ou gerados endogenamente. O presente trabalho mostra que a reação do β-caroteno e dois de seus produtos de oxidação, retinal e β-apo-8\'-carotenal, com 2\'-desoxiguanosina e DNA leva à formação de adutos. Dentre os adutos formados, foi caracterizado o aduto 1,N2eteno-2\'-desoxiguanosina (1 ,N2-εdGuo). Os níveis de outro aduto de DNA, a 8-oxo-7,8-dihidro-2\'-deoxiguanosina (8-oxodGuo), também foram monitoradas para estudo comparativo. A formação dos adutos também foi verificada em fibroblastos normais de pulmão humano (linhagem IMR-90) expostos ao β-caroteno e aos seus produtos de oxidação. Experimentos com ratos suplementados com β-caroteno e expostos à fumaça de cigarro em períodos de 7, 30 e 180 dias, mostraram níveis aumentados de 1,N2-εdGuo nos animais suplementados com o carotenóide comparado ao grupo veículo. Aumento no nível de 8-oxodGuo também foi verificado nos tratamentos de 7 e 180 dias. Um aumento significativo no nível do eteno aduto também foi verificado nos animais suplementados com β-caroteno e expostos à fumaça de cigarro, comparado ao grupo apenas exposto à fumaça após 7 e 180 dias de exposição. Nestes mesmos grupos, o aumento do 8-oxodGuo só foi observado no tratamento por 180 dias. Sabendo que estas lesões são comprovadamente mutagênicas, nossos estudos podem contribuir para o esclarecimento dos mecanismos envolvidos na formação de câncer em fumantes suplementados ou não com β-caroteno.

Dissection moléculaire de la sénescence cellulaire induite par le stress et la thérapie dans le cancer de l’ovaire et son impact sur la réponse des patientes

Le cancer de l’ovaire (COv) est le cancer gynécologique le plus létal chez la femme et les traitements existants, chirurgie et chimiothérapie, ont peu évolué au cours des dernières décennies. Nous proposons que la compréhension des différents destins cellulaires tels que la sénescence que peuvent choisir les cellules du cancer de l’ovaire en réponse à la chimiothérapie pourrait conduire à de nouvelles opportunités thérapeutiques. La sénescence cellulaire a été largement associée à l’activité de la protéine TP53, qui est mutée dans plus de 90% des cas de cancer de l’ovaire séreux de haut grade (COv-SHG), la forme la plus commune de la maladie. Dans nos travaux, à partir d’échantillons dérivés de patientes, nous montrons que les cultures primaires du cancer de l’ovaire séreux de haut grade exposées au stress ou à des drogues utilisées en chimiothérapie entrent en senescence grâce à l’activité d’un isoforme du gène CDKN2A (p16INK4A). Dans ces cellules, nous avons évalué les caractéristiques fondamentales de la sénescence cellulaire tels que les altérations morphologiques, l’activité béta galactosidase associée à la sénescence, les dommages à l’ADN, l’arrêt du cycle cellulaire et le phénotype sécrétoire associé à la sénescence. En utilisant des micromatrices tissulaires construites à partir d’échantillons humains de COv-SHG pré- et post-chimiothérapie, accompagnées de leurs données cliniques, nous avons quantifié des marqueurs de sénescence incluant une diminution de la prolifération cellulaire quelques semaines après chimiothérapie. De façon intéressante, l’expression de p16INK4A dans les échantillons de COv-SHG prétraitement corrèle avec une survie prolongée des patientes suite au traitement. Ceci suggère ainsi pour la première fois un impact biologique bénéfique pour la présence de cellules cancéreuses qui sont capable d’activer la sénescence, particulièrement pour le traitement du cancer de l’ovaire. Dans le but de complémenter les thérapies actuelles avec des approches de manipulation pharmacologique de la sénescence, nos résultats suggèrent qu’il serait important de déterminer l’impact positif ou négatif de la sénescence induite par la thérapie sur la progression de la maladie et la survie, pour chaque type de cancer de façon indépendante.

Design and synthesis of constrained azacyclic pyrrolidine analogues of FTY720 as anticancer agents & metal coordination-controlled and bifunctional catalysis toward tertiary β-Ketols

Cette thèse se compose en deux parties: Première Partie: La conception et la synthèse d’analogues pyrrolidiniques, utilisés comme agents anticancéreux, dérivés du FTY720. FTY720 est actuellement commercialisé comme médicament (GilenyaTM) pour le traitement de la sclérose en plaques rémittente-récurrente. Il agit comme immunosuppresseur en raison de son effet sur les récepteurs de la sphingosine-1-phosphate. A fortes doses, FTY720 présente un effet antinéoplasique. Cependant, à de telles doses, un des effets secondaires observé est la bradycardie dû à l’activation des récepteurs S1P1 et S1P3. Ceci limite son potentiel d’utilisation lors de chimiothérapie. Nos précédentes études ont montré que des analogues pyrrolidiniques dérivés du FTY720 présentaient une activité anticancéreuse mais aucune sur les récepteurs S1P1 et S1P3. Nous avons soumis l’idée qu’une étude relation structure-activité (SARs) pourrait nous conduire à la découverte de nouveaux agents anti tumoraux. Ainsi, deux séries de composés pyrrolidiniques (O-arylmethyl substitué et C-arylmethyl substitué) ont pu être envisagés et synthétisés (Chapitre 1). Ces analogues ont montré d’excellentes activités cytotoxiques contre diverses cellules cancéreuses humaines (prostate, colon, sein, pancréas et leucémie), plus particulièrement les analogues actifs qui ne peuvent pas être phosphorylés par SphK, présentent un plus grand potentiel pour le traitement du cancer sans effet secondaire comme la bradycardie. Les études mécanistiques suggèrent que ces analogues de déclencheurs de régulation négative sur les transporteurs de nutriments induisent une crise bioénergétique en affamant les cellules cancéreuses. Afin d’approfondir nos connaissances sur les récepteurs cibles, nous avons conçu et synthétisé des sondes diazirine basées sur le marquage d’affinité aux photons (méthode PAL: Photo-Affinity Labeling) (Chapitre 2). En s’appuyant sur la méthode PAL, il est possible de récolter des informations sur les récepteurs cibles à travers l’analyse LC/MS/MS de la protéine. Ces tests sont en cours et les résultats sont prometteurs. Deuxième partie: Coordination métallique et catalyse di fonctionnelle de dérivés β-hydroxy cétones tertiaires. Les réactions de Barbier et de Grignard sont des méthodes classiques pour former des liaisons carbone-carbone, et généralement utilisées pour la préparation d’alcools secondaires et tertiaires. En vue d’améliorer la réaction de Grignard avec le 1-iodobutane dans les conditions « one-pot » de Barbier, nous avons obtenu comme produit majoritaire la β-hydroxy cétone provenant de l’auto aldolisation de la 5-hexen-2-one, plutôt que le produit attendu d’addition de l’alcool (Chapitre 3). La formation inattendue de la β-hydroxy cétone a également été observée en utilisant d’autres dérivés méthyl cétone. Étonnement dans la réaction intramoléculaire d’une tricétone, connue pour former la cétone Hajos-Parrish, le produit majoritaire est rarement la β-hydroxy cétone présentant la fonction alcool en position axiale. Intrigué par ces résultats et après l’étude systématique des conditions de réaction, nous avons développé deux nouvelles méthodes à travers la synthèse sélective et catalytique de β-hydroxy cétones spécifiques par cyclisation intramoléculaire avec des rendements élevés (Chapitre 4). La réaction peut être catalysée soit par une base adaptée et du bromure de lithium comme additif en passant par un état de transition coordonné au lithium, ou bien soit à l’aide d’un catalyseur TBD di fonctionnel, via un état de transition médiée par une coordination bidenté au TBD. Les mécanismes proposés ont été corroborés par calcul DFT. Ces réactions catalytiques ont également été appliquées à d’autres substrats comme les tricétones et les dicétones. Bien que les efforts préliminaires afin d’obtenir une enantioselectivité se sont révélés sans succès, la synthèse et la recherche de nouveaux catalyseurs chiraux sont en cours.

Polo-like kinase 4 controls centriole duplication but does not directly regulate cytokinesis

Centrioles organize the centrosome, and accurate control of their number is critical for the maintenance of genomic integrity. Centrioles duplicate once per cell cycle, and duplication is coordinated by Polo-like kinase 4 (Plk4). We previously demonstrated that Plk4 accumulation is autoregulated by its own kinase activity. However, loss of heterozygosity of Plk4 in mouse embryonic fibroblasts has been proposed to cause cytokinesis failure as a primary event, leading to centrosome amplification and gross chromosomal abnormalities. Using targeted gene disruption, we show that human epithelial cells with one inactivated Plk4 allele undergo neither cytokinesis failure nor increase in centrosome amplification. Plk4 is shown to localize exclusively at the centrosome, with none in the spindle midbody. Substantial depletion of Plk4 by small interfering RNA leads to loss of centrioles and subsequent spindle defects that lead to a modest increase in the rate of cytokinesis failure. Therefore, Plk4 is a centriole-localized kinase that does not directly regulate cytokinesis.

Highly dynamic host actin reorganization around developing Plasmodium inside hepatocytes

Plasmodium sporozoites are transmitted by Anopheles mosquitoes and infect hepatocytes, where a single sporozoite replicates into thousands of merozoites inside a parasitophorous vacuole. The nature of the Plasmodium-host cell interface, as well as the interactions occurring between these two organisms, remains largely unknown. Here we show that highly dynamic hepatocyte actin reorganization events occur around developing Plasmodium berghei parasites inside human hepatoma cells. Actin reorganization is most prominent between 10 to 16 hours post infection and depends on the actin severing and capping protein, gelsolin. Live cell imaging studies also suggest that the hepatocyte cytoskeleton may contribute to parasite elimination during Plasmodium development in the liver.

Sildenafil Potentiates a cGMP-Dependent Pathway to Promote Melanoma Growth.

Sildenafil, an inhibitor of the cGMP-degrading phosphodiesterase 5 that is used to treat erectile dysfunction, has been linked to an increased risk of melanoma. Here, we have examined the potential connection between cGMP-dependent signaling cascades and melanoma growth. Using a combination of biochemical assays and real-time monitoring of melanoma cells, we report a cGMP-dependent growth-promoting pathway in murine and human melanoma cells. We document that C-type natriuretic peptide (CNP), a ligand of the membrane-bound guanylate cyclase B, enhances the activity of cGMP-dependent protein kinase I (cGKI) in melanoma cells by increasing the intracellular levels of cGMP. Activation of this cGMP pathway promotes melanoma cell growth and migration in a p44/42 MAPK-dependent manner. Sildenafil treatment further increases intracellular cGMP concentrations, potentiating activation of this pathway. Collectively, our data identify this cGMP-cGKI pathway as the link between sildenafil usage and increased melanoma risk.

Design and synthesis of constrained azacyclic pyrrolidine analogues of FTY720 as anticancer agents & metal coordination-controlled and bifunctional catalysis toward tertiary β-Ketols

Cette thèse se compose en deux parties: Première Partie: La conception et la synthèse d’analogues pyrrolidiniques, utilisés comme agents anticancéreux, dérivés du FTY720. FTY720 est actuellement commercialisé comme médicament (GilenyaTM) pour le traitement de la sclérose en plaques rémittente-récurrente. Il agit comme immunosuppresseur en raison de son effet sur les récepteurs de la sphingosine-1-phosphate. A fortes doses, FTY720 présente un effet antinéoplasique. Cependant, à de telles doses, un des effets secondaires observé est la bradycardie dû à l’activation des récepteurs S1P1 et S1P3. Ceci limite son potentiel d’utilisation lors de chimiothérapie. Nos précédentes études ont montré que des analogues pyrrolidiniques dérivés du FTY720 présentaient une activité anticancéreuse mais aucune sur les récepteurs S1P1 et S1P3. Nous avons soumis l’idée qu’une étude relation structure-activité (SARs) pourrait nous conduire à la découverte de nouveaux agents anti tumoraux. Ainsi, deux séries de composés pyrrolidiniques (O-arylmethyl substitué et C-arylmethyl substitué) ont pu être envisagés et synthétisés (Chapitre 1). Ces analogues ont montré d’excellentes activités cytotoxiques contre diverses cellules cancéreuses humaines (prostate, colon, sein, pancréas et leucémie), plus particulièrement les analogues actifs qui ne peuvent pas être phosphorylés par SphK, présentent un plus grand potentiel pour le traitement du cancer sans effet secondaire comme la bradycardie. Les études mécanistiques suggèrent que ces analogues de déclencheurs de régulation négative sur les transporteurs de nutriments induisent une crise bioénergétique en affamant les cellules cancéreuses. Afin d’approfondir nos connaissances sur les récepteurs cibles, nous avons conçu et synthétisé des sondes diazirine basées sur le marquage d’affinité aux photons (méthode PAL: Photo-Affinity Labeling) (Chapitre 2). En s’appuyant sur la méthode PAL, il est possible de récolter des informations sur les récepteurs cibles à travers l’analyse LC/MS/MS de la protéine. Ces tests sont en cours et les résultats sont prometteurs. Deuxième partie: Coordination métallique et catalyse di fonctionnelle de dérivés β-hydroxy cétones tertiaires. Les réactions de Barbier et de Grignard sont des méthodes classiques pour former des liaisons carbone-carbone, et généralement utilisées pour la préparation d’alcools secondaires et tertiaires. En vue d’améliorer la réaction de Grignard avec le 1-iodobutane dans les conditions « one-pot » de Barbier, nous avons obtenu comme produit majoritaire la β-hydroxy cétone provenant de l’auto aldolisation de la 5-hexen-2-one, plutôt que le produit attendu d’addition de l’alcool (Chapitre 3). La formation inattendue de la β-hydroxy cétone a également été observée en utilisant d’autres dérivés méthyl cétone. Étonnement dans la réaction intramoléculaire d’une tricétone, connue pour former la cétone Hajos-Parrish, le produit majoritaire est rarement la β-hydroxy cétone présentant la fonction alcool en position axiale. Intrigué par ces résultats et après l’étude systématique des conditions de réaction, nous avons développé deux nouvelles méthodes à travers la synthèse sélective et catalytique de β-hydroxy cétones spécifiques par cyclisation intramoléculaire avec des rendements élevés (Chapitre 4). La réaction peut être catalysée soit par une base adaptée et du bromure de lithium comme additif en passant par un état de transition coordonné au lithium, ou bien soit à l’aide d’un catalyseur TBD di fonctionnel, via un état de transition médiée par une coordination bidenté au TBD. Les mécanismes proposés ont été corroborés par calcul DFT. Ces réactions catalytiques ont également été appliquées à d’autres substrats comme les tricétones et les dicétones. Bien que les efforts préliminaires afin d’obtenir une enantioselectivité se sont révélés sans succès, la synthèse et la recherche de nouveaux catalyseurs chiraux sont en cours.

The CD1d natural killer T-cell antigen presentation pathway is highly conserved between humans and rhesus macaques

Natural killer T (NKT) cells play an important role in controlling cancers, infectious diseases and autoimmune diseases. Although the rhesus macaque is a useful primate model for many human diseases such as infectious and autoimmune diseases, little is known about their NKT cells. We analyzed Valpha24TCR+ T cells from rhesus macaque peripheral blood mononuclear cells stimulated with aalpha-galactosylceramide (a-GalCer) and interleukin-2. We found that rhesus macaques possess Va24TCR+ T cells, suggesting that recognition of alpha-GalCer is highly conserved between rhesus macaques and humans. The amino acid sequences of the V-J junction for the Valpha24TCR of rhesus macaque and human NKT cells are highly conserved (93% similarity), and the CD1d alpha1-alpha2 domains of both species are highly homologous (95.6%). These findings indicate that the rhesus macaque is a useful primate model for understanding the contribution of NKT cells to the control of human diseases.

Endothelial cell serine proteases expressed during vascular morphogenesis and angiogenesis

Many serine proteases play important regulatory roles in complex biological systems, but only a few have been linked directly with capillary morphogenesis and angiogenesis. Here we provide evidence that serine protease activities, independent of the plasminogen activation cascade, are required for microvascular endothelial cell reorganization and capillary morphogenesis in vitro. A homology cloning approach targeting conserved motifs present in all serine proteases, was used to identify candidate serine proteases involved in these processes, and revealed 5 genes (acrosin, testisin, neurosin, PSP and neurotrypsin), none of which had been associated previously with expression in endothelial cells. A subsequent gene-specific RT-PCR screen for 22 serine proteases confirmed expression of these 5 genes and identified 7 additional serine protease genes expressed by human endothelial cells, urokinase-type plasminogen activator, protein C,TMPRSS2, hepsin, matriptase/ MT-SPI, dipepticlylpepticlase IV, and seprase. Differences in serine protease gene expression between microvascular and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were identified and several serine protease genes were found to be regulated by the nature of the substratum, ie. artificial basement membrane or fibrillar type I collagen. mRNA transcripts of several serine protease genes were associated with blood vessels in vivo by in situ hybridization of human tissue specimens. These data suggest a potential role for serine proteases, not previously associated with endothelium, in vascular function and angiogenesis.

High glucose-mediated effects on endothelial cell proliferation occur via p38 MAP kinase

The mitogen-activated protein ( MAP) kinases contribute to altered cell growth and function in a variety of disease states. However, their role in the endothelial complications of diabetes mellitus remains unclear. Human endothelial cells were exposed for 72 h to 5 mM ( control) or 25 mM ( high) glucose or 5 mM glucose plus 20 mM mannitol ( osmotic control). The roles of p38 and p42/44 MAP kinases in the high glucose-induced growth effects were determined by assessment of phosphorylated MAP kinases and their downstream activators by Western blot and by pharmacological inhibition of these MAP kinases. Results were expressed as a percentage ( means +/- SE) of control. High glucose increased the activity of total and phosphorylated p38 MAP kinase ( P < 0.001) and p42/44 MAP kinase ( P < 0.001). Coexposure of p38 MAP kinase blocker with high glucose reversed the antiproliferative but not the hypertrophic effects associated with high-glucose conditions. Transforming growth factor (TGF)-beta1 increased the levels of phosphorylated p38 MAP kinase, and p38 MAP kinase blockade reversed the antiproliferative effects of this cytokine. The high glucose-induced increase in phosphorylated p38 MAP kinase was reversed in the presence of TGF-beta1 neutralizing antibody. Although hyperosmolarity also induced antiproliferation (P < 0.0001) and cell hypertrophy (P < 0.05), there was no change in p38 activity, and therefore inhibition of p38 MAP kinase had no influence on these growth responses. Blockade of p42/44 MAP kinase had no effect on the changes in endothelial cell growth induced by either high glucose or hyperosmolarity. High glucose increased p42/44 and p38 MAP kinase activity in human endothelial cells, but only p38 MAP kinase mediated the antiproliferative growth response through the effects of autocrine TGF-beta1. High glucose-induced endothelial cell hypertrophy was independent of activation of the MAP kinases studied. In addition, these effects were independent of any increase in osmolarity associated with high-glucose exposure.