Systematic studies of the interaction between amyloid beta-protein and lipids

The amyloid peptide (Aß), a normal constituent of neuronal and non-neuronal cells, has been shown to be a major component of the extracellular plaque of Alzheimer’s disease (AD). The interaction of Aß peptides with the lipid matrix of neuronal cell membranes plays an important role in the pathogenesis of AD. In this study, we have developed peptide-tethered artificial lipid membranes by the Langmuir-Blodgett and Langmuir-Schaefer methods. Anti-Aß40-mAb labeled with a fluorophore was used to probe the Aß40 binding to the model membrane system. Systematic studies on the antibody or Aß-membrane interactions were carried out in our model systems by Surface Plasmon Field-Enhanced Fluorescence Spectroscopy (SPFS). Aß adsorption is critically determined by the lipid composition of the membranes. Aß specifically binds with membranes of sphingomyelin, and this preferential adsorption was markedly amplified by the addition of sterols (cholesterol or 25-OH-Chol). Fluorescence microscopy indicated that 25-OH-Chol could also form micro-domains with sphingomyelin as cholesterol does at the conditions used for the built-up of the model membranes. Our findings suggest that micro-domains composed of sphingomyelin and the sterols could be the binding sites of Aß and the role of sphingomyelin in AD should receive much more attention. The artificial membranes provide a novel platform for the study on AD, and SPFS is a potential tool for detecting Aß-membrane interaction. Numerous investigations indicate that the ability of Aß to form fibrils is considerably dependent upon the levels of ß-sheet structure adopted by Aß. Membrane-mediated conformational transition of Aß has been demonstrated. In this study, we focus on the interaction of Aß and the membranes composed of POPC/SM/25-OH-Chol (2:1:1). The artificial membrane system was established by the methods as described above. Immunoassy based on a pair of monoclonal antibodies (mAbs) against different epitopes was employed to detect the orientation of the Aß at the model membranes. Kinetics of antibody-Aß binding was determined by surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS). The attempt has also been made to probe the change in the conformation of Aß using SPFS combined with immunoassay. Melatonin was employed to induce the conformational change of Aß. The orientation and the conformational change of Aß are evaluated by analysing kinetic/affinity parameters. This work provides novel insight into the investigation on the structure of Aß at the membrane surface.

Gen knockdown der Metalloproteasen Meprin alpha 1, alpha 2 und beta im Zebrabärbling Danio rerio

Die Metalloproteasen Meprin α und β übernehmen Schlüsselfunktionen in vielen (patho-) physiologischenrnProzessen. So sind sie beteiligt an der Umstrukturierung der extrazellulären Matrix, an immunologischenrnReaktionen oder an entzündlichen Gewebserkrankungen. Die beiden Enzyme kommenrnhauptsächlich in den Bürstensaummembranen von Niere und Darm sowie in der Haut von Vertebratenrnvor. Für die Erforschung der biologischen Aktivität der Meprine wurde in dieser Arbeit der ModellorganismusrnDanio rerio verwendet, der vor allem durch die Möglichkeit der gentechnischen Manipulationrnprädestiniert ist. Im Fisch konnten drei homologe Enzyme (Meprin α1, α2 und β) nachgewiesenrnwerden. Während mRNA-Analysen eine nahezu ubiquitäre Verteilung der Meprine offenbarten,rnkonnte ich mittels spezifischer Antikörper die Expression auf Proteinebene nachweisen. WährendrnMeprin α1 und β verstärkt im Darmepithel und in der Epidermis lokalisiert sind, konnte Meprinrnα2 ausschließlich in der Lamina propria des Darms identifiziert werden.rnDer Hauptteil der vorliegenden Arbeit zielt auf die spezifische Reduzierung des Expressionslevels derrnMeprine in Embryonen des Zebrabärblings. Dies wurde durch die Mikroinjektion von sogenanntenrnMorpholinos in die Zygote erzielt. Morpholinos sind RNA-Moleküle, die spezifisch an die mRNA desrnZielproteins binden können und die Translation verhindern. Die auftretenden Effekte durch das Fehlenrnder Meprine lassen so Rückschlüsse auf ihre physiologische Funktion zu. Nach der Injektion vonrnMorpholinos gegen Meprin α1 zeigten sich lediglich leichte epidermale Deformationen. Bei Meprin βrnhingegen kam es zu einer massiven Fehlbildung von Organen im Rumpf- und Schwanzbereich. Diesesrnführte zu erheblichen Defekten; die Embryonen starben innerhalb der ersten 24 Stunden nach derrnBefruchtung. Demzufolge müssen Meprin α1 und Meprin β insbesondere an der Gewebsdifferenzierungrnbeteiligt sein. Dies korreliert mit verschiedenen Experimenten, u.a. an knockout Mäusen, ausrndenen hervorgeht, dass die Prozessierung und Aktivierung der Cytokine Interleukin-1β oder Interleukin-rn18 durch Meprin β erfolgen kann.rnDie Injektion von Meprin α2-Morpholinos erbrachte ein weiteres, eindrucksvolles Ergebnis: Das Blutgefäßsystemrnvon injizierten Embryonen war vollständig unterbrochen und es sammelten sich Erythrozytenrnim Bereich der Caudalvene an. Diese Phänotypen gleichen den knockdown-Experimenten mitrndem vascular endothelial growth factor VEGF-A, dem entscheidenden Wachstumsfaktor in der Angiogenesern(Blutgefäßbildung). Eine Inkubation des humanen VEGF-A mit (humanem) rekombinantemrnMeprin α bzw. β führte zu einer differenzierten Prozessierung des Moleküls. Diese Ergebnisse legenrnnahe, dass Meprin α pro-angiogenetisch wirkt, indem es VEGF-A prozessiert und damit die Gefäßbildungrnaktiviert. Aus den Daten dieser Arbeit wird die hohe Signifikanz der Meprine für die Proliferationrnund Differenzierung spezieller Gewebe deutlich, welche somit eine wichtige Grundlage für Studienrnan höheren Vertebraten darstellt.

Funktionelle Charakterisierung der Metalloendopeptidasen Meprin alpha und Meprin beta unter besonderer Berücksichtigung pathologischer Umstände in der menschlichen Dermis

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei neuentdeckte Astacin-ähnliche-Proteasen LAST undrnLAST_MAM aus dem Pfeilschwanzkrebs Limulus polyphemus funktionell charakterisiert.rnInsbesondere LAST_MAM, eignet sich zur phylogenetischen Untersuchung, hinsichtlich derrnEvolution von Astacin-ähnlichen-Proteasen mit MAM-Domäne, zu denen auch die Meprinernzählen. Es wurde deutlich, dass LAST_MAM nicht unmittelbar mit anderen Astacinen, diernüber eine MAM-Domäne verfügen, verwandt ist, und dass von einer divergenten Entwicklungrndieser Proteasen und der MAM-Domäne selbst ausgegangen werden muss.rnMeprin Metalloendopeptidasen werden in membrangebundener und sezernierter Form,rnvorwiegend in Epithelien aber auch in intestinalen Leukozyten und bestimmten Krebszellenrnexprimiert. Meprin

Molecular interaction of the human metalloprotease meprin beta with the amyloid precursor protein, ADAM10, and ADAM17 based on proteomics

Die Zinkendopeptidasen Meprin α und β sind Schlüsselkomponenten in patho(physiologischen) Prozessen wie Entzündung, Kollagenassemblierung und Angiogenese. Nach ihrer Entdeckung in murinen Bürstensaummembranen und humanen Darmepithelien, wurden weitere Expressionsorte identifiziert, z.B. Leukozyten, Krebszellen und die humane Haut. Tiermodelle, Zellkulturen und biochemische Analysen weisen auf Funktionen der Meprine in der Epithelialdifferenzierung, Zellmigration, Matrixmodellierung, Angiogenese, Bindegewebsausbildung und immunologische Prozesse hin. Dennoch sind ihre physiologischen Substrate weitgehend noch unbekannt. Massenspektrometrisch basierte Proteomics-Analysen enthüllten eine einzigartige Spaltspezifität für saure Aminosäurereste in der P1´ Position und identifizierten neue biologische Substratkandidaten. Unter den 269 extrazellulären Proteinen, die in einem Substratscreen identifiziert wurden, stellten sich das amyloid precursor protein (APP) and ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease 10) als sehr vielversprechende Kandidaten heraus. Mehrere Schnittstellen innerhalb des APP Proteins, hervorgerufen durch verschiedenen Proteasen, haben unterschiedlichen Auswirkungen zur Folge. Die β-Sekretase BACE (β-site APP cleaving enzyme) prozessiert APP an einer Schnittstelle, welche als initialer Schritt in der Entwicklung der Alzheimer Erkrankung gilt. Toxische Aβ (Amyloid β)-Peptide werden in den extrazellulären Raum freigesetzt und aggregieren dort zu senilen Plaques. Membran verankertes Meprin β hat eine β-Sekretase Aktivität, die in einem Zellkultur-basierten System bestätigt werden konnte. Die proteolytische Effizienz von Meprin β wurde in FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-Analysen bestimmt und war um den Faktor 104 höher als die von BACE1. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Meprin β die ersten zwei Aminosäuren prozessiert und somit aminoterminal einen Glutamatrest freisetzt, welcher nachfolgend durch die Glutaminylzyklase in ein Pyroglutamat zykliert werden kann. Trunkierte Aβ-Peptide werden nur in Alzheimer Patienten generiert. Aufgrund einer erhöhten Hydrophobie weisen diese Peptide eine höhere Tendenz zur Aggregation auf und somit eine erhöhte Toxizität. Bis heute wurde keine Protease identifiziert, welche diese Schnittstelle prozessiert. Die Bildung der Meprin vermittelten N-terminalen APP Fragmenten wurde in vitro und in vivo detektiert. Diese N-APP Peptide hatten keine cytotoxischen Auswirkungen auf murine und humane Gehirnzellen, obwohl zuvor N-APP als Ligand für den death receptor (DR) 6 identifiziert wurde, der für axonale Degenerationsprozesse verantwortlich ist. rnIm nicht-amyloidogenen Weg prozessiert ADAM10 APP und entlässt die Ektodomäne von der Zellmembran. Wir konnten das ADAM10 Propeptid als Substrat von Meprin β identifizieren und in FRET Analysen, in vitro und in vivo zeigen, dass die Meprin vermittelte Prozessierung zu einer erhöhten ADAM10 Aktivität führt. Darüber hinaus wurde ADAM10 als Sheddase für Meprin β identifiziert. Shedding konnte durch Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) oder durch das Ionophor A23187 hervorgerufen werden, sowie durch ADAM10 Inhibitoren blockiert werden. rnDiese Arbeit konnte somit ein komplexes proteolytisches Netwerk innerhalb der Neurophysiologie aufdecken, welches für die Entwicklung der Alzheimer Demenz wichtig sein kann.rn

Der Einfluss der löslichen Spaltprodukte des Amyloid-beta-Vorläuferproteins auf die Proteinhomöostase

Die Alzheimer’sche Erkrankung (AD) ist die am häufigsten vorkommende Form der Demenz. Die Spaltung des APP scheint eine große Rolle in der Pathologie der Erkrankung zu spielen. APP kann auf zwei Wegen prozessiert werden. Dem amyloidogenen Weg, bei dem neben einem löslichen extrazellulären Fragment (sAPPβ) und der APP Intrazellulären Domäne (AICD) auch Aβ entsteht. Auf dem nicht-amyloidogenen Weg entsteht sAPPα, p3 und die AICD. Dem sAPPα werden neuroprotektiv Eigenschaften zugeschrieben. rnEs konnte gezeigt werden, dass sAPPα in jungen IMR90 Zellen, den durch proteasomalen Stress ausgelösten Anstieg der Bag3 und Hsp70 Proteinlevel senkt. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass sAPPα die Zellviabilität nach proteasomalen Stress erhöht und weniger Aggresomen gebildet werden. Die Analyse der proteasomalen Aktivität zeigte, dass sAPPα die proteasomale Aktivität gestresster junger Zellen erhöhen kann. In alten IMR90 Zellen konnte keine Beeinflussung der Autophagie und der proteasomalen Aktivität festgestellt werden. Das ist ein Anhaltspunkt dafür, dass im Alter das Proteasom zu stark geschädigt ist, um durch sAPPα aktiviert zu werden. Das bei der amyloidogenen Prozessierung von APP entstehende sAPPβ zeigte eine ähnliche protektive Eigenschaft. rnInsgesamt konnte ein protektiver Einfluss von sAPPα und sAPPβ unter proteotoxischen Bedingungen in jungen und klonalen Zellen gezeigt werden, wodurch die Zellviabilität verbessert wird. rn

Erkennung der alpha-Kette des GM-CSF-Rezeptors (CSF2RA) durch einen HLA-unabhängigen alpha:beta-T-Zellrezeptor

Aus dem tumorreaktiven T-Zellrepertoire der Melanompatientin Ma-Mel-86/INTH, bei der im Verlauf Lymphknotenmetastasen HLA-Klasse I-negativer Tumorzellen auftraten, wurden durch Stimulation mit autologen Tumorzellen CD8+ T-Zellklone isoliert und expandiert, die auf Melanomzellen der Patientin CSF2RA (engl. GM-CSF receptor alpha chain) in HLA-unabhängiger Weise erkannten. Aus einem der T-Zellklone wurde ein CSF2RA-reaktiver α:β-T-Zellrezeptor (TCR, engl. T-cell receptor) kloniert (Bezeichnung: TCR-1A.3/46). Die α-Kette des TCR enthielt die Domänen TRAV14/DV4*01, TRAJ48*01 und TRAC*01, die β-Kette die Domänen TRBV10-3*01, TRBD2*01, TRBJ2-7*01 und TRBC2*01. Durch Austausch der humanen konstanten gegen die homologen murinen Domänen wurde der TCR optimiert (Bezeichnung: cTCR-1A.3/46) und hinsichtlich seiner Expression und Funktionalität nach retroviralem Transfer in humane PBMC (engl. peripheral blood mononuclear cells) im 51Chromfreisetzungstest, im IFN-γ-ELISpot-Assay und in einem Degranulations-Assay validiert. TCR-transgene T-Zellen lysierten nicht nur spezifisch die HLA-defizienten, CSF2RA+ Melanomlinien des Modells Ma-Mel-86, sondern erkannten auch Zelllinien verschiedener Spezies nach Transfektion von CSF2RA sowie Monozyten, Granulozyten, dendritische Zellen und ein breites Spektrum hämatologischer Malignome myeloiden Ursprungs ungeachtet deren HLA-Phänotypen. Lymphatische Zellen sowie CD34+ Blutstammzellen wurden in In vitro-Untersuchungen nicht erkannt. Der Zusatz von GM-CSF zu Zellen, die CSF2RA und CSF2RB exprimierten, inhibierte die Erkennung durch TCR-transgene PBMC, während die Koexpression der α- und der ß-Kette des GM-CSF-Rezeptors alleine keinen negativen Effekt auf die Erkennung hatte. Daraus war zu schließen, dass CSF2RA präferentiell freistehend und weniger nach Integration in den heteromultimerischen GM-CSF-Rezeptor-Komplex erkannt wurde. In der zweidimensionalen Collier-de-Perles-Visualisierung der IMGT-Datenbank (engl. International immunogenetics information system) wies der CSF2RA-reaktive TCR-1A.3/46 im Vergleich zu TCR von konventionellen, HLA-restringierten T-Zellen keine Besonderheiten auf. Darüber hinaus waren auch die von den HLA-unabhängigen T-Zellen exprimierten CD8-Moleküle identisch zu den CD8-Molekülen HLA-abhängiger CTL (engl. cytotoxic T lymphocytes). Die Präsenz von CD8-Molekülen förderte die HLA-unabhängige Erkennung von CSF2RA, schien aber dafür nicht zwingend erforderlich zu sein, da Antikörper gegen CD8 die Erkennung zu ca. 65 % blockierten und TCR-transgene CD4+ T-Zellen im Vergleich zu TCR-transduzierten CD8+ T-Zellen eine deutlich verringerte, aber noch erhaltene Funktionalität aufwiesen. Es ist derzeit nicht klar, ob HLA-unabhängige T-Zellen gegen CSF2RA im peripheren Blut der Patientin vorkamen, weil sie der im Tiermodell postulierten Thymusselektion MHC-unabhängiger TCR (Tikhonova et al., Immunity 36:79, 2012) entkommen waren, oder weil ein ursprünglich gegen einen HLA-Peptid-Komplex gerichteter TCR eine HLA-unabhängige Kreuzreaktivität aufwies. CSF2RA verbessert die Glucoseutilisation in malignen Zellen, und es wurden ihm embryotrophe Eigenschaften zugeschrieben (Spielholz et al., Blood 85:973, 1995; Sjöblom et al., Biol. Reprod. 67:1817, 2002). Damit kann CSF2RA malignes Wachstum fördern und ist somit ein potentielles Zielmolekül für die Immuntherapie. Seine HLA-unabhängige Erkennung würde sowohl die HLA-Vielfalt als auch den HLA-Verlust als typische Limitationen der T-Zellimmuntherapie umgehen. Zur Überprüfung der In vivo-Spezifität des HLA-unabhängigen TCR gegen CSF2RA und damit zum Ausschluss relevanter off-tumor-/on-target- bzw. off-tumor-/off-target-Effekte ist jedoch eine Testung in einem präklinischen Tiermodell erforderlich.

Global lymphoid tissue remodeling during a viral infection is orchestrated by a B cell-lymphotoxin-dependent pathway

Adaptive immune responses are characterized by substantial restructuring of secondary lymphoid organs. The molecular and cellular factors responsible for virus-induced lymphoid remodeling are not well known to date. Here we applied optical projection tomography, a mesoscopic imaging technique, for a global analysis of the entire 3-dimensional structure of mouse peripheral lymph nodes (PLNs), focusing on B-cell areas and high endothelial venule (HEV) networks. Structural homeostasis of PLNs was characterized by a strict correlation between total PLN volume, B-cell volume, B-cell follicle number, and HEV length. After infection with lymphocytic choriomeningitis virus, we observed a substantial, lymphotoxin (LT) beta-receptor-dependent reorganization of the PLN microarchitecture, in which an initial B-cell influx was followed by 3-fold increases in PLN volume and HEV network length on day 8 after infection. Adoptive transfer experiments revealed that virus-induced PLN and HEV network remodeling required LTalpha(1)beta(2)-expressing B cells, whereas the inhibition of vascular endothelial growth factor-A signaling pathways had no significant effect on PLN expansion. In summary, lymphocytic choriomeningitis virus-induced PLN growth depends on a vascular endothelial growth factor-A-independent, LT- and B cell-dependent morphogenic pathway, as revealed by an in-depth mesoscopic analysis of the global PLN structure.

Innate-like control of human iNKT cell autoreactivity via the hypervariable CDR3beta loop

Invariant Natural Killer T cells (iNKT) are a versatile lymphocyte subset with important roles in both host defense and immunological tolerance. They express a highly conserved TCR which mediates recognition of the non-polymorphic, lipid-binding molecule CD1d. The structure of human iNKT TCRs is unique in that only one of the six complementarity determining region (CDR) loops, CDR3beta, is hypervariable. The role of this loop for iNKT biology has been controversial, and it is unresolved whether it contributes to iNKT TCR:CD1d binding or antigen selectivity. On the one hand, the CDR3beta loop is dispensable for iNKT TCR binding to CD1d molecules presenting the xenobiotic alpha-galactosylceramide ligand KRN7000, which elicits a strong functional response from mouse and human iNKT cells. However, a role for CDR3beta in the recognition of CD1d molecules presenting less potent ligands, such as self-lipids, is suggested by the clonal distribution of iNKT autoreactivity. We demonstrate that the human iNKT repertoire comprises subsets of greatly differing TCR affinity to CD1d, and that these differences relate to their autoreactive functions. These functionally different iNKT subsets segregate in their ability to bind CD1d-tetramers loaded with the partial agonist alpha-linked glycolipid antigen OCH and structurally different endogenous beta-glycosylceramides. Using surface plasmon resonance with recombinant iNKT TCRs and different ligand-CD1d complexes, we demonstrate that the CDR3beta sequence strongly impacts on the iNKT TCR affinity to CD1d, independent of the loaded CD1d ligand. Collectively our data reveal a crucial role for CDR3beta for the function of human iNKT cells by tuning the overall affinity of the iNKT TCR to CD1d. This mechanism is relatively independent of the bound CD1d ligand and thus forms the basis of an inherent, CDR3beta dependent functional hierarchy of human iNKT cells.

Nedd4-1 and beta-arrestin-1 are key regulators of Na+/H+ exchanger 1 ubiquitylation, endocytosis, and function

The ubiquitously expressed mammalian Na(+)/H(+) exchanger 1 (NHE1) controls cell volume and pH but is also critically involved in complex biological processes like cell adhesion, cell migration, cell proliferation, and mechanosensation. Pathways controlling NHE1 turnover at the plasma membrane, however, are currently unclear. Here, we demonstrate that NHE1 undergoes ubiquitylation at the plasma membrane by a process that is unprecedented for a mammalian ion transport protein. This process requires the adapter protein ?-arrestin-1 that interacts with both the E3 ubiquitin ligase Nedd4-1 and the NHE1 C terminus. Truncation of NHE1 C terminus to amino acid 550 abolishes binding to ?-arrestin-1 and NHE1 ubiquitylation. Overexpression of ?-arrestin-1 or of wild type but not ligase-dead Nedd4-1 increases NHE1 ubiquitylation. siRNA-mediated knock-down of Nedd4-1 or ?-arrestin-1 reduces NHE1 ubiquitylation and endocytosis leading to increased NHE1 surface levels. Fibroblasts derived from ?-arrestin-1 and Nedd4-1 knock-out mice show loss of NHE1 ubiquitylation, increased plasmalemmal NHE1 levels and greatly enhanced NHE1 transport compared with wild-type fibroblasts. These findings reveal Nedd4-1 and ?-arrestin-1 as key regulators of NHE1 ubiquitylation, endocytosis, and function. Our data suggest a broader role for ?-arrestins in the regulation of membrane ion transport proteins than currently known.

Distribution of amyloid precursor protein and amyloid-beta in ocular hypertensive C57BL/6 mouse eyes

Amyloid precursor protein (APP) and amyloid-beta (Abeta) appear to participate in the pathophysiology of retinal ganglion cell (RGC) death in glaucoma. We, therefore, determined the distribution of APP and Abeta in the retinas of C57BL/6 mice after induction of chronic ocular hypertension.

Susceptibility of primary human endothelial cells to C. perfringens beta-toxin suggesting similar pathogenesis in human and porcine necrotizing enteritis

Clostridium perfringens type C causes fatal necrotizing enteritis in different mammalian hosts, most commonly in newborn piglets. Human cases are rare, but the disease, also called pigbel, was endemic in the Highlands of Papua New Guinea. Lesions in piglets and humans are very similar and characterized by segmental necro-hemorrhagic enteritis in acute cases and fibrino-necrotizing enteritis in subacute cases. Histologically, deep mucosal necrosis accompanied by vascular thrombosis and necrosis was consistently reported in naturally affected pigs and humans. This suggests common pathogenetic mechanisms. Previous in vitro studies using primary porcine aortic endothelial cells suggested that beta-toxin (CPB) induced endothelial damage contributes to the pathogenesis of C. perfringens type C enteritis in pigs. In the present study we investigated toxic effects of CPB on cultured primary human macro- and microvascular endothelial cells. In vitro, these cells were highly sensitive to CPB and reacted with similar cytopathic and cytotoxic effects as porcine endothelial cells. Our results indicate that porcine and human cell culture based in vitro models represent valuable tools to investigate the pathogenesis of this bacterial disease in animals and humans.

Intraperitoneal Echinococcus multilocularis infection in mice modulates peritoneal CD4+ and CD8+ regulatory T cell development

Intraperitoneal proliferation of the metacestode stage of Echinococcus multilocularis in experimentally infected mice is followed by an impaired host immune response favoring parasite survival. We here demonstrate that infection in chronically infected mice was associated with a 3-fold increase of the percentages of CD4+ and CD8+ peritoneal T (pT) cells compared to uninfected controls. pT cells of infected mice expressed high levels of IL-4 mRNA, while only low amounts of IFN-gamma mRNA were detected, suggesting that a Th2-biased immune response predominated the late stage of disease. Peritoneal dendritic cells from infected mice (AE-pDCs) expressed high levels of TGF-beta mRNA and very low levels of IL-10 and IL-12 (p40) mRNA, and the expression of surface markers for DC-maturation such as MHC class II (Ia) molecules, CD80, CD86 and CD40 was down-regulated. In contrast to pDCs from non-infected mice, AE-pDCs did not enhance Concanavalin A (ConA)-induced proliferation when added to CD4+ pT and CD8+ pT cells of infected and non-infected mice, respectively. In addition, in the presence of a constant number of pDCs from non-infected mice, the proliferation of CD4+ pT cells obtained from infected animals to stimulation with ConA was lower when compared to the responses of CD4+ pT cells obtained from non-infected mice. This indicated that regulatory T cells (Treg) may interfere in the complex immunological host response to infection. Indeed, a subpopulation of regulatory CD4+ CD25+ pT cells isolated from E. multilocularis-infected mice reduced ConA-driven proliferation of CD4+ pT cells. The high expression levels of Foxp3 mRNA by CD4+ and CD8+ pT cells suggested that subpopulations of regulatory CD4+ Foxp3+ and CD8+ Foxp3+ T cells were involved in modulating the immune responses within the peritoneal cavity of E. multilocularis-infected mice.

Rapid cytopathic effects of Clostridium perfringens beta-toxin on porcine endothelial cells

Clostridium perfringens type C isolates cause fatal, segmental necro-hemorrhagic enteritis in animals and humans. Typically, acute intestinal lesions result from extensive mucosal necrosis and hemorrhage in the proximal jejunum. These lesions are frequently accompanied by microvascular thrombosis in affected intestinal segments. In previous studies we demonstrated that there is endothelial localization of C. perfringens type C beta-toxin (CPB) in acute lesions of necrotizing enteritis. This led us to hypothesize that CPB contributes to vascular necrosis by directly damaging endothelial cells. By performing additional immunohistochemical studies using spontaneously diseased piglets, we confirmed that CPB binds to the endothelial lining of vessels showing early signs of thrombosis. To investigate whether CPB can disrupt the endothelium, we exposed primary porcine aortic endothelial cells to C. perfringens type C culture supernatants and recombinant CPB. Both treatments rapidly induced disruption of the actin cytoskeleton, cell border retraction, and cell shrinkage, leading to destruction of the endothelial monolayer in vitro. These effects were followed by cell death. Cytopathic and cytotoxic effects were inhibited by neutralization of CPB. Taken together, our results suggest that CPB-induced disruption of endothelial cells may contribute to the pathogenesis of C. perfringens type C enteritis.

Opioids trigger alpha 5 beta 1 integrin-mediated monocyte adhesion

Inflammatory reactions involve a network of chemical and molecular signals that initiate and maintain host response. In inflamed tissue, immune system cells generate opioid peptides that contribute to potent analgesia by acting on specific peripheral sensory neurons. In this study, we show that opioids also modulate immune cell function in vitro and in vivo. By binding to its specific receptor, the opioid receptor-specific ligand DPDPE triggers monocyte adhesion. Integrins have a key role in this process, as adhesion is abrogated in cells treated with specific neutralizing anti-alpha5beta1 integrin mAb. We found that DPDPE-triggered monocyte adhesion requires PI3Kgamma activation and involves Src kinases, the guanine nucleotide exchange factor Vav-1, and the small GTPase Rac1. DPDPE also induces adhesion of pertussis toxin-treated cells, indicating involvement of G proteins other than Gi. These data show that opioids have important implications in regulating leukocyte trafficking, adding a new function to their known effects as immune response modulators.

Monoclonal antibody directed against Neospora caninum tachyzoite carbohydrate epitope reacts specifically with apical complex-associated sialylated beta tubulin

Monoclonal antibodies (mabs) were generated against whole sonicated Neospora caninum tachyzoites as immunogen. Initial ELISA screening of the reactivity of hybridoma culture supernatants using the same antigen and antigen treated with sodium periodate prior to antibody binding resulted in the identification of 8 supernatants with reactivity against putative carbohydrate epitopes. Following immunoblotting, mab6D12 (IgG1), binding a 52/48-kDa doublet, and mab6C6 (IgM), binding a 190/180-kDa doublet, were selected for further studies. Immunofluorescence of tachyzoite-infected cultures localized the corresponding epitopes not to the surface, but to interior epitopes at the apical part of N. caninum tachyzoites. During in vitro tachyzoite to bradyzoite stage conversion, mab6C6 labeling translocated toward the cyst periphery, while for mab6D12 no changes in localization were noted. Upon extraction of tachyzoites with the nonionic detergent Triton-X-100, the 52-kDa band recognized by mab6D12 was present exclusively in the insoluble, cytoskeletal fraction of both N. caninum and Toxoplasma gondii tachyzoites. Tandem mass spectrometry analysis identified this protein as N. caninum beta tubulin. The 48-kDa band labeled by mab6D12 was a Vero cell protein contamination. The protein(s) reacting with mab6C6 could not be conclusively identified by mass spectrometry. Immunofluorescence consistently failed to label T. gondii tachyzoites, indicating that beta tubulin in T. gondii and N. caninum could be differentially modified or that the reactive epitope in T. gondii is masked. Immunogold TEM of isolated apical cytoskeletal preparations and dual immunofluorescence with antibody to tubulin confirmed that mab6D12 binds to the anterior part of apical complex-associated microtubules. The sodium periodate sensitivity of the beta tubulin associated epitope was confirmed by immunoblotting and ELISA, and treatment of N. caninum cytoskeletal proteins with sialidase prior to mab6D12 labeling resulted in a profound loss of antibody binding, suggesting that mab6D12 reacts with sialylated beta tubulin.