Mass spectrometry-based protein profiling strategies for biomarker discovery in liver and inflammatory bowel diseases

The study of protein expression profiles for biomarker discovery in serum and in mammalian cell populations needs the continuous improvement and combination of proteins/peptides separation techniques, mass spectrometry, statistical and bioinformatic approaches. In this thesis work two different mass spectrometry-based protein profiling strategies have been developed and applied to liver and inflammatory bowel diseases (IBDs) for the discovery of new biomarkers. The first of them, based on bulk solid-phase extraction combined with matrix-assisted laser desorption/ionization - Time of Flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and chemometric analysis of serum samples, was applied to the study of serum protein expression profiles both in IBDs (Crohn’s disease and ulcerative colitis) and in liver diseases (cirrhosis, hepatocellular carcinoma, viral hepatitis). The approach allowed the enrichment of serum proteins/peptides due to the high interaction surface between analytes and solid phase and the high recovery due to the elution step performed directly on the MALDI-target plate. Furthermore the use of chemometric algorithm for the selection of the variables with higher discriminant power permitted to evaluate patterns of 20-30 proteins involved in the differentiation and classification of serum samples from healthy donors and diseased patients. These proteins profiles permit to discriminate among the pathologies with an optimum classification and prediction abilities. In particular in the study of inflammatory bowel diseases, after the analysis using C18 of 129 serum samples from healthy donors and Crohn’s disease, ulcerative colitis and inflammatory controls patients, a 90.7% of classification ability and a 72.9% prediction ability were obtained. In the study of liver diseases (hepatocellular carcinoma, viral hepatitis and cirrhosis) a 80.6% of prediction ability was achieved using IDA-Cu(II) as extraction procedure. The identification of the selected proteins by MALDITOF/ TOF MS analysis or by their selective enrichment followed by enzymatic digestion and MS/MS analysis may give useful information in order to identify new biomarkers involved in the diseases. The second mass spectrometry-based protein profiling strategy developed was based on a label-free liquid chromatography electrospray ionization quadrupole - time of flight differential analysis approach (LC ESI-QTOF MS), combined with targeted MS/MS analysis of only identified differences. The strategy was used for biomarker discovery in IBDs, and in particular of Crohn’s disease. The enriched serum peptidome and the subcellular fractions of intestinal epithelial cells (IECs) from healthy donors and Crohn’s disease patients were analysed. The combining of the low molecular weight serum proteins enrichment step and the LCMS approach allowed to evaluate a pattern of peptides derived from specific exoprotease activity in the coagulation and complement activation pathways. Among these peptides, particularly interesting was the discovery of clusters of peptides from fibrinopeptide A, Apolipoprotein E and A4, and complement C3 and C4. Further studies need to be performed to evaluate the specificity of these clusters and validate the results, in order to develop a rapid serum diagnostic test. The analysis by label-free LC ESI-QTOF MS differential analysis of the subcellular fractions of IECs from Crohn’s disease patients and healthy donors permitted to find many proteins that could be involved in the inflammation process. Among them heat shock protein 70, tryptase alpha-1 precursor and proteins whose upregulation can be explained by the increased activity of IECs in Crohn’s disease were identified. Follow-up studies for the validation of the results and the in-depth investigation of the inflammation pathways involved in the disease will be performed. Both the developed mass spectrometry-based protein profiling strategies have been proved to be useful tools for the discovery of disease biomarkers that need to be validated in further studies.

Sviluppo di tecniche di analisi ifenate per la quantificazione di biomarcatori di esposizione a tossici ambientali: gli acidi mercapturici

Human biomonitoring (HBM) is an ideal tool for evaluating toxicant exposure in health risk assessment. Chemical substances or their metabolites related to environmental pollutants can be detected as biomarkers of exposure using a wide variety of biological fluids. Individual exposure to aromatic hydrocarbon compounds (benzene, toluene, and o-xylene –“BTX”) were analysed with a liquid chromatography coupled to electrospray ionisation-mass spectrometry (μHPLC-ESI-MS/MS) method for the simultaneous quantitative detection of the BTX exposure biomarker SPMA, SBMA and o-MBMA in human urine. Urinary S-phenylmercapturic acid (SPMA) is a biomarker proposed by the American Conference of Governmental Industrial Hygienists (ACGIH) for assessing occupational exposure to benzene (Biological Exposure Index of 25 microg/g creatinine). Urinary S-benzylmercapturic (SBMA) and o-methyl S-benzyl mercapturic acid (o-MBMA) are specific toluene and o-xylene metabolites of glutathione detoxicant pathways, proposed as reliable biomarkers of exposure. To this aim a pre-treatment of the urine with solid phase extraction (SPE) and an evaporation step were necessary to concentrate the mercapturic acids before instrumental analysis. A liquid chromatography separation was carried out with a reversed phase capillary column (Synergi 4u Max-RP) using a binary gradient composed of an acquous solution of formic acid 0.07% v/v and methanol. The mercapturic acids were determinated by negative-ion-mass spectrometry and the data were corrected using isotope-labelled analogs as internal standards. The analytical method follows U.S. Food and Drug Administration guidance and was applied to assess exposure to BTX in a group of 396 traffic wardens. The association between biomarker results and individual factors, such as age, sex and tobacco smoke were also investigated. The present work also included improvements in the methods used by modifying various chromatographic parameters and experimental procedures. A partial validation was conducted to evaluate LOD, precision, accuracy, recovery as well as matrix effects. Higher sensitivity will be possible in future biological monitoring programmes, allowing evaluation of very low level of BTX human exposure. Keywords: Human biomonitoring, aromatic hydrocarbons, biomarker of exposure, HPLC-MS/MS.

Food lipids: their effects on quality and oxidative stability of animal tissues and emulsions

Lipolysis and oxidation of lipids in foods are the major biochemical and chemical processes that cause food quality deterioration, leading to the characteristic, unpalatable odour and flavour called rancidity. In addition to unpalatability, rancidity may give rise to toxic levels of certain compounds like aldehydes, hydroperoxides, epoxides and cholesterol oxidation products. In this PhD study chromatographic and spectroscopic techniques were employed to determine the degree of lipid oxidation in different animal products and its relationship with technological parameters like feeding fat sources, packaging, processing and storage conditions. To achieve this goal capillary gas chromatography (CGC) was employed not only to determine the fatty acids profile but also, after solid phase extraction, the amount of sterols (cholesterol and phytosterols) and cholesterol oxidation products (COPs). To determine hydroperoxides, primary products of oxidation and quantify secondary products UV/VIS absorbance spectroscopy was applied. Beef and pork meat in this study were analysed. In actual fact, lipid oxidation is a major deterioration reaction in meat, meat products and results in adverse changes in the colour, flavour, texture of meat and develops different compounds which should be a risk to human health as oxysterols. On beef and pork meat, a study of lipid fraction during storage was carried out to evaluate its shelf-life and some nutritional features life saturated/unsaturated fatty acids ratio and sterols content, in according to the interest that has been growing around functional food in the last years. The last part of this research was focused on the study of lipid oxidation in emulsions. In oil-in-water emulsions antioxidant activity of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) was evaluated. The rates of lipid oxidation of 1.0% stripped soybean oil-in-water emulsions with DOPC were followed by monitoring lipid hydroperoxide and hexanal as indicators of primary and secondary oxidation products and the droplet surface charge or zeta potential (ζ) of the emulsions with varying concentrations of DOPC were tested. This manuscript reports the main results obtained in the three activities briefly summarized as follows: 1. study on effects of feeding composition on the photoxidative stability of lipids from beef meat, evaluated during storage under commercial retail conditions; 2. evaluation of effects of diets and storage conditions on the oxidative stability of pork meat lipids; 3. study on oxidative behavior of DOPC in stripped soybean oil-in-water emulsions stabilized by nonionic surfactant.

Measurement of nonmethane organic carbon

The present dissertation focuses on the measurement of nonmethane organic carbon compounds (NMOC) and their exchange by biosphere-atmosphere interactions. To access the accuracy, precision, and reproducibility of NMOC analysis, two intercomparison experiments were carried out during the present study. These experiments comprised the sampling of NMOCs on graphitised carbon blacks, followed by gas-chromatographic analysis. Furthermore, they comprised the sampling of short chain carbonyl compounds on solid phase extraction cartridges and their analysis by high pressure liquid chromatography. To investigate the exchange of NMOCs between vegetation and the atmosphere, plant enclosure studies were performed on two European deciduous tree species. These measurements were conducted during two consecutive summer seasons by utilisation of the above specified techniques on sunlit and shaded leaves of European beech (Fagus sylvatica L., monoterpene emitter) and sunlit leaves of English oak (Quercus robur L., isoprene emitter). According to its broad geographical distribution, the impact of European beech on the European monoterpene budget was characterized by a model simulation. Complementary an instrument was developed, that is capable of measuring the amount of total NMOC that is exchanged by biosphere-atmosphere interactions. The instrument was tested under laboratory conditions and was evaluated versus an independent method performing branch enclosure measurements.

Development of Original Analytical Methods for the Determination of Drugs of Abuse in Biological Samples

Drug abuse is a major global problem which has a strong impact not only on the single individual but also on the entire society. Among the different strategies that can be used to address this issue an important role is played by identification of abusers and proper medical treatment. This kind of therapy should be carefully monitored in order to discourage improper use of the medication and to tailor the dose according to the specific needs of the patient. Hence, reliable analytical methods are needed to reveal drug intake and to support physicians in the pharmacological management of drug dependence. In the present Ph.D. thesis original analytical methods for the determination of drugs with a potential for abuse and of substances used in the pharmacological treatment of drug addiction are presented. In particular, the work has been focused on the analysis of ketamine, naloxone and long-acting opioids (buprenorphine and methadone), oxycodone, disulfiram and bupropion in human plasma and in dried blood spots. The developed methods are based on the use of high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to various kinds of detectors (mass spectrometer, coulometric detector, diode array detector). For biological sample pre-treatment different techniques have been exploited, namely solid phase extraction and microextraction by packed sorbent. All the presented methods have been validated according to official guidelines with good results and some of these have been successfully applied to the therapeutic drug monitoring of patients under treatment for drug abuse.

Nicht geträgerte Radioarsenisotope: ihre Herstellung, Abtrennung und Markierung von Proteinen

Das Element Arsen besitzt eine Reihe von Isotopen, die in nahezu trägerfreier Form (nca) produziert werden können und deshalb in der Radiopharmazie für die Diagnose oder Endoradiotherapie Verwendung finden können. Bei der Positronenemissionstomographie (PET) gibt es eine gewisse Lücke bei der Versorgung mit langlebigen Positronenemittern, die zur Untersuchung von langsamen physiologischen Prozessen wie z.B. der Biodistribution und Anreicherung von Antikörpern in Tumorgewebe eingesetzt werden können. Die beiden Arsenisotope 72As (T1/2 = 26 h, 88 % beta+) und 74As (T1/2 = 17,8 d, 29 % beta+) vereinen eine lange physikalische Halbwertszeit mit einer hohen Positronenemissionsrate und sind daher geeignete Kandidaten. Da das Verhalten von radioaktivem Arsen und seine Verwendung in der molekularen Bildgebung international relativ wenig bearbeitet sind, wurde die Radiochemie des Arsens von der Isotopenproduktion an Kernreaktor und Zyklotron, über die Entwicklung von Abtrennungsmethoden für Germanium und Arsen, bis hin zur Entwicklung einer soliden Markierungschemie für Antikörper weiterentwickelt. Die in dieser Arbeit bearbeiteten Felder sind: 1. Die Isotopenproduktion der relevanten Arsenisotope (72/74/77As) wurde an Kernreaktor und Zyklotron durch Bestrahlung von GeO2- und Germaniummetalltargets durchgeführt. Pro 6 h Bestrahlung von 100 mg Germanium konnten ca. 2 MBq 77As am TRIGA Reaktor in Mainz hergestellt werden. Am Zyklotron des DKFZ in Heidelberg konnten unter optimierten Bedingungen bei der Bestrahlung von Germaniummetall (EP = 15 Mev, 20 µA, 200 µAh) ca. 4 GBq 72As und ca. 400 MBq 74As produziert werden. 2. Die Entwicklung neuer Abtrennungsmethoden für nca 72/74/77As von makroskopischen Mengen Germanium wurde vorangetrieben. Für die Aufarbeitung von GeO2- und Germaniummetalltargets kamen insgesamt 8 verschiedene Methoden wie Festphasenextraktion, Flüssig-Flüssig-Extraktion, Destillation, Anionenaustauschchromatographie zum Einsatz. Die erzielten Ausbeuten lagen dabei zwischen 31 und 56 %. Es wurden Abtrennungsfaktoren des Germaniums zwischen 1000 und 1•10E6 erreicht. Alle erfolgreichen Abtrennungsmethoden lieferten *As(III) in 500 µl PBS-Puffer bei pH 7. Diese Form des Radioarsens ist für die Markierung von SH-modifizierten Molekülen, wie z.B. Antikörpern geeignet. 3. Die Entwicklung von Methoden zur Bestimmung des Oxidationszustandes von nca *As in organischem, neutralem wässrigen, oder stark sauren Medium mittels Radio-DC und Anionenaustauschchromatographie wurde durchgeführt und führte zu einem besseren Verständnis der Redoxchemie des nca *As. 4. SH-modifizierte Antikörper wurden mit 72/74/77As(III) markiert. Dabei wurden zwei Methoden (Modifizierung mit SATA und TCEP) miteinander verglichen. Während das *As(III) bei Verwendung von TCEP in Ausbeuten > 90 % mit dem Antikörper reagierte, wurde für SATA-modifizierte Antikörper in Abhängigkeit von der verwendeten Abtrennungsmethode eine breite Spanne von 0 % bis > 90 % beobachtet. 5. Es wurden Phantommessungen mit 18F, 72As und 74As am µ-PET-Scanner durchgeführt, um erste Aussagen über die zu erwartende Auflösung der Arsenisotope zu erhalten. Die Auflösung von 74As ist mit 18F vergleichbar, während die von 72As erkennbar schlechter ist.

Oligodeoxynucleotide-polypeptide block copolymers

Synthesis and characterization of monodisperse oligonucleotide-polypeptide di- and triblock copolymers are described. These block copolymers are promising building blocks for the formation of defined structures by sequential DNA self-assembly. The oligonucleotide sequences (ODN, 46 bases) obtained from standard solid phase synthesis were designed to form four-arm DNA junctions. The hybridization of the four single stranded oligonucleotides at room temperature to a stable four-arm junction is selective and quantitative. The junctions exhibit good thermal stability as proven by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and UV analysis. The second block consists of monodisperse elastin-like polypeptides (ELPs) with a pentapeptide repeat unit of (Val-Pro-Gly-Val-Gly) synthesized by genetic engineering. ODN-ELP diblock copolymers were obtained either by thiol coupling or by activated ester chemistry. Taking advantage of the endgroup control of both components (ODN, ELP), combination of the two different synthetic approaches leads to the synthesis of ODN-ELP-ODN triblock copolymers. Dynamic light scattering measurements of the single components and the synthesized diblock copolymers reveal their monodispersity. Hybridization of four ODN-ELP diblock copolymers carrying the four junction sequences shows quantitative self-assembly. In conclusion, this work provides the first example of the synthesis of perfectly defined ODN-ELP block copolymers and their potential use in DNA self-assembly.

Valutazione della presenza di contaminanti perfluoroalchilici in alimenti destinati al consumo umano

Le sostanze perfluoralchiliche (PFAS), composti fluorurati ampiamente utilizzati negli ultimi anni in diverse applicazioni industriali e commerciali, sono ritrovati diffusamente nell’ambiente e in diverse specie animali. Recentemente i PFAS hanno destato preoccupazione anche per la salute umana. Il rischio di esposizione è principalmente legato alla dieta (i prodotti ittici sembrano essere gli alimenti più contaminati). Lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare la presenza del perfluorottanosulfonato (PFOS) e dell’acido perfluorottanoico (PFOA), in diverse matrici alimentari: latte vaccino commercialmente disponibile in Italia, latte materno italiano, diverse specie di pesce commercialmente disponibili in Italia e 140 branzini di diverse aree (principalmente Mediterraneo). I campioni di latte sono stati trattati con estrazione liquido-liquido seguita da due fasi di purificazione mediante cartucce SPE prima dell’iniezione nell’UPLC-MS/MS. L’analisi del latte vaccino ha evidenziato una contaminazione diffusa di PFOS, ma a basse concentrazioni (fino a 97 ng/L), mentre il PFOA è stato ritrovato raramente. In questo studio, in grado di individuare anche i livelli delle ultra-tracce, sono state osservate nel latte materno concentrazioni di 15-288 ng/L per il PFOS e di 24-241 ng/LPFOA. Le concentrazioni e le frequenze più alte, per entrambi i PFAS, sono stati ritrovate in campioni di latte forniti da donne primipare, suggerendo un rischio di esposizione per i primogeniti. Il metodo utilizzato per i campioni di pesce era basato su un’estrazione con solvente organico seguita da due fasi di purificazione: una con i sali e una con fase solida dispersiva. L’estratto, analizzato in UPLC-MS/MS, ha confermato la contaminazione di questa matrice a livelli significativi, ma anche l’alta variabilità delle concentrazioni misurate. Il monitoraggio monospecie ha mostrato una contaminazione rilevante (PFOS 11,1- > 10000 ng/L; PFOA < 9-487 ng/L), soprattutto nei branzini pescati, rispetto a quelli allevati.

Bioraffineria di vinacce per la produzione ed il recupero di acidi grassi volatili

Obiettivo della presente ricerca è stato la valutazione dell’utilizzo degli scarti derivanti dal processo di vinificazione come substrato per la digestione anerobica finalizzata alla produzione di VFA (“Volatile Fatty Acids”). I VFA sono acidi grassi a corta catena, convenzionalmente fino a 6 atomi di carbonio, che possono essere utilizzati industrialmente nell’ambito della “Carboxilation Platfrorm” per produrre energia, prodotti chimici, o biomateriali. La sperimentazione si è articolata in due fasi principali: 1) Produzione di VFA in processi batch alimentati con vinacce e fecce come substrato; 2) Recupero dei VFA prodotti dall’effluente anaerobico (digestato) mediante processi di adsorbimento con resine a scambio anionico. Nella prima fase sono stati studiati i profili di concentrazione dei principali VFA nel brodo di fermentazione al variare della tipologia di substrato (vinacce e fecce, bianche e rosse) e della temperatura di incubazione (35 °C e 55 °C). La condizione ottimale rilevata per la produzione di VFA è stata la digestione anaerobica di vinacce rosse disidratate e defenolizzate alla temperatura di 35 °C (mesofilia), che ha permesso di raggiungere una concentrazione di VFA totali nel digestato di circa 30 g/L in 16 giorni di monitoraggio. Nella seconda fase è stato analizzato il processo di estrazione in fase solida (Solid Phase Extraction, SPE) con resine a scambio anionico per il recupero dei VFA dal digestato di vinacce rosse. Sono state messe a confronto le prestazioni di quattro diverse resine a scambio anionico: Sepra SAX, Sepra SAX-ZT, Sepra NH2, Amberlyst A21. I parametri operativi ottimali per l’adsorbimento sono risultati essere condizioni di pH acido pari al valore naturale delle soluzioni indicate sopra (~2.5) e tempo di contatto di 2 ore. Tra le quattro resine quella che ha fornito i migliori risultati è stata la Amberlyst A21, una resina polimerica a scambio anionico debolmente basica il cui gruppo funzionale caratteristico è un’ammina terziaria. Infine è stato valutato il processo di desorbimento dei VFA adsorbiti dalla resina con tre diverse soluzioni desorbenti: acqua demineralizzata, etanolo (EtOH) ed acqua basificata con NaOH (1 mol/L). I risultati migliori sono stati conseguiti nel caso dell’EtOH, ottenendo un recupero finale del 9,1% dei VFA inizialmente presenti nel digestato di vinacce rosse incubate in termofilia.

Untersuchung der Pharmakokinetik von Ciprofloxacin und Piperacillin bei Intensivpatienten mit kontinuierlichen Hämodialyseverfahren

Infektionen zählen bei hämodialysepflichtigen Intensivpatienten zu den häufigsten Todesursachen. Um die Wirksamkeit und Sicherheit der Antibiotikatherapie zu verbessern, müssen verschiedene Faktoren, zum Beispiel die Pharmakodynamik und Pharmakokinetik des Antibiotikums, die Art des Hämodialyseverfahrens, die Art des Dialysefilters und der Zustand des Patienten berücksichtigt werden. Im Rahmen einer klinischen Studie wurde die antibiotische Wirkung von Piperacillin und Ciprofloxacin bei kontinuierlichen Hämodialyseverfahren mittels pharmakokinetischer Methoden bestimmt.Für die klinische Studie wurde eine HPLC-Methode mit kombinierter Festphasenextraktion (SPE) entwickelt und nach den Grenzwerten der EMA Guideline on Bioanalytical Method Validation validiert. Die Methode erwies sich für die gleichzeitige Bestimmung von Piperacillin und Ciprofloxacin in Plasma- und Dialysatproben als valide und zuverlässig. Die ermittelten Konzentrationen der beiden Antibiotika wurden für die Berechnung der pharmakokinetischen Parameter verwendet.In der klinischen Studie wurden bei 24 Intensivpatienten mit kontinuierlicher venovenöser Hämodialyse (CVVHD) bzw. kontinuierlicher venovenöser Hämodiafiltration (CVVHDF), bei denen Piperacillin/Tazobactam, Ciprofloxacin oder eine Kombination dieser Antibiotika indiziert war, die Antibiotikakonzentrationen im Plasma und Dialysat im Steady State gemessen. Unmittelbar vor einer Antibiotikainfusion (0 min) wurde ein Volumen von sechs Milliliter Blut entnommen. Weitere Blutentnahmen erfolgten 30 Minuten nach der Infusion sowie nach 1, 2, 3, 4, 8, 12 und 24 Stunden. Sobald ein Filtratbeutel ausgetauscht wurde, wurden parallel zu den Blutproben Dialysatproben entnommen. Die Konzentrationen von Piperacillin und Ciprofloxacin wurden nach der Festphasenextraktion aus den Plasmaproben mit der validierten HPLC-Methode innerhalb von 15 Minuten zuverlässig bestimmt. Neben den gemessenen Plasmakonzentrationen (Cmax, Cmin) wurden pharmakokinetische Parameter wie t0,5, VdSS, AUC, Cltot, ClCRRT und Clextrarenal berechnet. Für Piperacillin wurde untersucht, ob die Plasmaspiegel der Patienten für das gesamte Dosierungsintervall oberhalb der geforderten vierfachen MHK von 64 mg/l liegen. Für Ciprofloxacin wurde untersucht, ob die aus gemessenen Plasmaspiegeln berechnete AUC den Quotienten aus AUC und MHK (=AUIC) ≥ 125 h erfüllt.Bei zehn der 21 mit Piperacillin behandelten Patienten lagen die Plasmaspiegel unterhalb der angestrebten Konzentration von 64 mg/l für das gesamte Dosierungsintervall. Das Patientenkollektiv wies eine große interindividuelle Variabilität auf. Mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % waren 26 - 70 % der Patienten unterdosiert. In der Gruppe der mit Ciprofloxacin behandelten Patienten wurde die angestrebte AUIC von 125 h nur bei neun der 20 Patienten erreicht. Mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % waren 29 - 76 % der Patienten unterdosiert. Die kontinuierlichen Nierenersatzverfahren hatten nur einen geringen Anteil an der totalen Clearance der untersuchten Antibiotika. Während die Clearance des kontinuierlichen Nierenersatzverfahren bei Piperacillin für ein Drittel der Arzneistoffelimination verantwortlich war, trug diese im Fall von Ciprofloxacin lediglich zu 16 % zur Arzneistoffelimination bei.Die Dosierung von Piperacillin/Tazobactam bzw. Ciprofloxacin sollte bei kritisch kranken Intensivpatienten mit kontinuierlicher Hämodialyse mindestens 4 mal 4/0,5 g pro Tag bzw. 2 mal 400 mg pro Tag betragen. Diese Empfehlungen sind insbesondere für die verwendeten Dialyseverfahren und -bedingungen zutreffend. Zur weiteren Optimierung der Antibiotikatherapie ist ein Therapeutisches Drug Monitoring empfehlenswert.

Synthese und Evaluierung von 68Ga-Schiff'schen Basen zur Diagnostik der koronaren Herzerkrankung

ZusammenfassungrnDie häufigsten Todesfälle weltweit sind auf Herzerkrankungen zurückzuführen. Bei der koronaren Herzkrankheit (KHK) sammeln sich über Jahre arteriosklerotische Ablagerungen in den Herzkranzgefäßen an und führen so zu einer verminderten Durchblutung und Versorgung des Herzmuskelgewebes mit Sauerstoff und Nährstoffen. Zur nuklearmedizinischen Bildgebung finden am häufigsten das SPECT-Nuklid 201Tl sowie die beiden 99mTc-Radiopharmaka Sestamibi und Tetrofosmin Anwendung. Die PET-Technik ist der SPECT-Technik in Bezug auf absolute Quantifizierung sowie Auflösung überlegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein mögliches PET-Radiopharmakon zur Diagnostik der KHK zu entwickeln. Um eine dem 99mTc-Nuklid vergleichbare Verfügbarkeit im klinischen Alltag zu erreichen, sollte als Basis des neuen Radiopharmakons das mittels Radionuklid-Generator verfügbare 68Ga dienen. Schiff’sche Basen-Verbindungen zeigten nach Komplexierung mit 67/68Ga eine deutliche Aufnahme in die Herzmuskelzellen. Auf dieser Grundlage wurden verschiedene Schiff’sche Basen-Strukturen synthetisiert. Diese unterscheiden sich einerseits durch das Substitutionsmuster der verwendeten Aldehyde und andererseits durch das verwendete Rückgrat. Alle synthetisierten Chelatoren wurden erfolgreich mit 68Ga radioaktiv markiert und konnten anschließend aufgereinigt werden. Die Evaluierung dieser Substanzen in vitro zeigte, dass sie in unterschiedlichen Medien stabil ist. Die Lipophilie der 68Ga-Verbindungen (log D) lag zwischen 0,87±0,24 und 2,72±0,14. Die Ladung der Verbindungen wurde mittels Papierelektrophorese bei pH= 7 als kationisch bestimmt. Zusätzlich fanden in vitro-Untersuchungen zur Bestimmung der Aufnahme der Komplexe in HL-1 Herzzellen statt. Um den Einfluss des Zellmembranpotentials bzw. des Mitochondrienmembranpotentials zu untersuchen, wurde ein Teil der Zellen dafür mit Valinomycin (Ionophor, zerstört das Potential) behandelt. Mittels ex vivo-Biodistributionen wurde die Organverteilung von zwei Schiff’schen Basen (68Ga-BADED-2 und 68Ga-BAPDMEN-2) mit dem routinemäßig in der Klinik eingesetzten Derivat 99mTc-Sestamibi sowie dem 18F-Flurpiridaz in Ratten verglichen. Alle Verbindungen zeigten dabei eine deutliche Herzaufnahme von mehr als 2 % der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe. Durch in vivo-PET-Aufnahmen wurden die Zeit-Aktivitätskurven der 68Ga-Verbindungen sowie zum Vergleich des 18F-Flurpiridaz bestimmt. Die Aufnahmen lagen im Bereich von 0,63±0,15 für 68Ga-BAPEN-3 bis 2,72±0,86 für 68Ga-BADED-8.In dem zweiten Teil der Arbeit wurden die Vorteile des hochaffinen Herztracers Flurpiridaz mit dem lipophilen, positiv-geladenen Ga-Schiff’sche Base-Chelator kombiniert. Hierzu wurde zunächst das Insektizid Flurpiridaz synthetisiert und mit dem BAPEN-Rückgrat gekoppelt. Die entstandene Verbindung wurde erstmals mit 68Ga radioaktiv markiert und muss in weiterführenden Arbeiten evaluiert werden.

Original analytical methods for the determination of psychoactive compounds in complex matrices

This thesis work aims to develop original analytical methods for the determination of drugs with a potential for abuse, for the analysis of substances used in the pharmacological treatment of drug addiction in biological samples and for the monitoring of potentially toxic compounds added to street drugs. In fact reliable analytical techniques can play an important role in this setting. They can be employed to reveal drug intake, allowing the identification of drug users and to assess drug blood levels, assisting physicians in the management of the treatment. Pharmacological therapy needs to be carefully monitored indeed in order to optimize the dose scheduling according to the specific needs of the patient and to discourage improper use of the medication. In particular, different methods have been developed for the detection of gamma-hydroxybutiric acid (GHB), prescribed for the treatment of alcohol addiction, of glucocorticoids, one of the most abused pharmaceutical class to enhance sport performance and of adulterants, pharmacologically active compounds added to illicit drugs for recreational purposes. All the presented methods are based on capillary electrophoresis (CE) and high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to various detectors (diode array detector, mass spectrometer). Biological samples pre-treatment was carried out using different extraction techniques, liquid-liquid extraction (LLE) and solid phase extraction (SPE). Different matrices have been considered: human plasma, dried blood spots, human urine, simulated street drugs. These developed analytical methods are individually described and discussed in this thesis work.

Development and application of mass-spectrometric methods for the quantification and characterization of organic compounds in ice cores

Eisbohrkerne stellen wertvolle Klimaarchive dar, da sie atmosphärisches Aerosol konservieren. Die Analyse chemischer Verbindungen als Bestandteil atmosphärischer Aerosole in Eisbohrkernen liefert wichtige Informationen über Umweltbedingungen und Klima der Vergangenheit. Zur Untersuchung der α-Dicarbonyle Glyoxal und Methylglyoxal in Eis- und Schneeproben wurde eine neue, sensitive Methode entwickelt, die die Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) mit der Hochleistungsflüssigchromatographie-Massenspektrometrie (HPLC-MS) kombiniert. Zur Analyse von Dicarbonsäuren in Eisbohrkernen wurde eine weitere Methode entwickelt, bei der die Festphasenextraktion mit starkem Anionenaustauscher zum Einsatz kommt. Die Methode erlaubt die Quantifizierung aliphatischer Dicarbonsäuren (≥ C6), einschließlich Pinsäure, sowie aromatischer Carbonsäuren (wie Phthalsäure und Vanillinsäure), wodurch die Bestimmung wichtiger Markerverbindungen für biogene und anthropogene Quellen ermöglicht wurde. Mit Hilfe der entwickelten Methoden wurde ein Eisbohrkern aus den Schweizer Alpen analysiert. Die ermittelten Konzentrationsverläufe der Analyten umfassen die Zeitspanne von 1942 bis 1993. Mittels einer Korrelations- und Hauptkomponentenanalyse konnte gezeigt werden, dass die organischen Verbindungen im Eis hauptsächlich durch Waldbrände und durch vom Menschen verursachte Schadstoffemissionen beeinflusst werden. Im Gegensatz dazu sind die Konzentrationsverläufe einiger Analyten auf den Mineralstaubtransport auf den Gletscher zurückzuführen. Zusätzlich wurde ein Screening der Eisbohrkernproben mittels ultrahochauflösender Massenspektrometrie durchgeführt. Zum ersten Mal wurden in diesem Rahmen auch Organosulfate und Nitrooxyorganosulfate in einem Eisbohrkern identifiziert.

Methodenentwicklung zur Spurenanalyse organischer Biomarker in Speläothemen und Tropfwasser mittels Flüssigchromatographie-(HR-)Massenspektrometrie

Speläotheme und Tropfwasser spielen eine wichtige Rolle bei der Erforschung von Naturerscheinungen. Während sich bisherige Studien größtenteils auf anorganische Proxies konzentrieren, wächst das Interesse an organischen Biomarkern, vor allem Lipidbiomarkern.rnAufgrund dessen wurde eine neue Methode entwickelt, um Fettsäuren mit einer geradzahligen Kettenlänge C12-C20 in Speläothem- und Tropfwasserproben zu bestimmen. Dabei kam eine Festphasenextraktion mit anschließender HPLC-MS Messung zum Einsatz. Die Methode wurde auf mehrere Proben aus der Herbstlabyrinth-Adventhöhle angewendet. Die benötigte Probenmenge wurde im Vergleich zu früheren Studien von etwa 4 L auf 60-100 mL bei Tropfwasser und von 10-100 g auf ca. 0,5-3,5 g bei Stalagmitproben reduziert. Es konnte eine interne Variation der Analyten festgestellt werden. Korrelationen der Fettsäuren ließen vermuten, dass C12-C18 von der gleichen Quelle stammen, während C20 teilweise andere Quellen besitzt. Korrelationen mit δ13C verdeutlichten, dass es einen Zusammenhang zwischen der Vegetationsdichte und dem Vorkommen der Fett-säuren in dem Probenmaterial gibt. Vergleiche mit Mg Konzentrationen zeigten, dass die Niederschlagsmenge zwar den Transport der Fettsäuren mit dem Tropfwasser beeinflusst, allerdings nicht ihre ermittelte Konzentration in Stalagmitproben. Die ermittelten Ergebnisse ließen darauf schließen, dass eindeutigere Vegetations-Proxies als die Fettsäuren gefunden werden müssen. Ein erstmaliges non-target screening verdeutlichte, dass Lignine und Tannine als charakteristische Biomarker eingesetzt werden können.rn

Entwicklung von chiralen- sowie RP-HPLC-Methoden in Verbindung mit hochauflösender MS und deren Anwendung zur Analyse sekundärer organischer Aerosole in der Atmosphäre

Die Erdatmosphäre besteht hauptsächlich aus Stickstoff (78%), Sauerstoff (21%) und Edelga¬sen. Obwohl Partikel weniger als 0,1% ausmachen, spielen sie eine entscheidende Rolle in der Chemie und Physik der Atmosphäre, da sie das Klima der Erde sowohl direkt als auch indirekt beeinflussen. Je nach Art der Bildung unterscheidet man zwischen primären und sekundären Partikeln, wobei primäre Partikel direkt in die Atmosphäre eingetragen werden. Sekundäre Partikel hingegen entstehen durch Kondensation von schwerflüchtigen Verbindungen aus der Gasphase, welche durch Reaktionen von gasförmigen Vorläufersubstanzen (volatile organic compounds, VOCs) mit atmosphärischen Oxidantien wie Ozon oder OH-Radikalen gebildet werden. Da die meisten Vorläufersubstanzen organischer Natur sind, wird das daraus gebil¬dete Aerosol als sekundäres organisches Aerosol (SOA) bezeichnet. Anders als die meisten primären Partikel stammen die VOCs überwiegend aus biogenen Quellen. Es handelt sich da¬bei um ungesättigte Kohlenwasserstoffe, die bei intensiver Sonneneinstrahlung und hohen Temperaturen von Pflanzen emittiert werden. Viele der leichtflüchtigen Vorläufersubstanzen sind chiral, sowohl die Vorläufer als auch die daraus gebildeten Partikel werden aber in den meisten Studien als eine Verbindung betrachtet und gemeinsam analysiert. Die mit Modellen berechneten SOA-Konzentrationen, welche auf dieser traditionellen Vorstellung der SOA-Bil¬dung beruhen, liegen deutlich unterhalb der in der Atmosphäre gefundenen, so dass neben diesem Bildungsweg auch noch andere SOA-Bildungsarten existieren müssen. Aus diesem Grund wird der Fokus der heutigen Forschung vermehrt auf die heterogene Chemie in der Partikelphase gerichtet. Glyoxal als Modellsubstanz kommt hierbei eine wichtige Rolle zu. Es handelt sich bei dieser Verbindung um ein Molekül mit einem hohen Dampfdruck, das auf Grund dieser Eigenschaft nur in der Gasphase zu finden sein sollte. Da es aber über zwei Alde¬hydgruppen verfügt, ist es sehr gut wasserlöslich und kann dadurch in die Partikelphase über¬gehen, wo es heterogenen chemischen Prozessen unterliegt. Unter anderem werden in An¬wesenheit von Ammoniumionen Imidazole gebildet, welche wegen der beiden Stickstoff-He¬teroatome lichtabsorbierende Eigenschaften besitzen. Die Verteilung von Glyoxal zwischen der Gas- und der Partikelphase wird durch das Henrysche Gesetz beschrieben, wobei die Gleichgewichtskonstante die sogenannte Henry-Konstante ist. Diese ist abhängig von der un¬tersuchten organischen Verbindung und den im Partikel vorhandenen anorganischen Salzen. Für die Untersuchung chiraler Verbindungen im SOA wurde zunächst eine Filterextraktions¬methode entwickelt und die erhaltenen Proben anschließend mittels chiraler Hochleistungs-Flüssigchromatographie, welche an ein Elektrospray-Massenspektrometer gekoppelt war, analysiert. Der Fokus lag hierbei auf dem am häufigsten emittierten Monoterpen α-Pinen und seinem Hauptprodukt, der Pinsäure. Da bei der Ozonolyse des α-Pinens das cyclische Grund¬gerüst erhalten bleibt, können trotz der beiden im Molekül vorhanden chiralen Zentren nur zwei Pinsäure Enantiomere gebildet werden. Als Extraktionsmittel wurde eine Mischung aus Methanol/Wasser 9/1 gewählt, mit welcher Extraktionseffizienzen von 65% für Pinsäure Enan¬tiomer 1 und 68% für Pinsäure Enantiomer 2 erreicht werden konnten. Des Weiteren wurden Experimente in einer Atmosphärensimulationskammer durchgeführt, um die Produkte der α-Pinen Ozonolyse eindeutig zu charakterisieren. Enantiomer 1 wurde demnach aus (+)-α-Pinen gebildet und Enantiomer 2 entstand aus (-)-α-Pinen. Auf Filterproben aus dem brasilianischen Regenwald konnte ausschließlich Pinsäure Enantiomer 2 gefunden werden. Enantiomer 1 lag dauerhaft unterhalb der Nachweisgrenze von 18,27 ng/mL. Im borealen Nadelwald war das Verhältnis umgekehrt und Pinsäure Enantiomer 1 überwog vor Pinsäure Enantiomer 2. Das Verhältnis betrug 56% Enantiomer 1 zu 44% Enantiomer 2. Saisonale Verläufe im tropischen Regenwald zeigten, dass die Konzentrationen zur Trockenzeit im August höher waren als wäh¬rend der Regenzeit im Februar. Auch im borealen Nadelwald wurden im Sommer höhere Kon¬zentrationen gemessen als im Winter. Die Verhältnisse der Enantiomere änderten sich nicht im jahreszeitlichen Verlauf. Die Bestimmung der Henry-Konstanten von Glyoxal bei verschiedenen Saataerosolen, nämlich Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, Kaliumsulfat, Natriumchlorid und Ammoniumnitrat sowie die irreversible Produktbildung aus Glyoxal in Anwesenheit von Ammoniak waren Forschungs¬gegenstand einer Atmosphärensimulationskammer-Kampagne am Paul-Scherrer-Institut in Villigen, Schweiz. Hierzu wurde zunächst das zu untersuchende Saataerosol in der Kammer vorgelegt und dann aus photochemisch erzeugten OH-Radikalen und Acetylen Glyoxal er¬zeugt. Für die Bestimmung der Glyoxalkonzentration im Kammeraerosol wurde zunächst eine beste¬hende Filterextraktionsmethode modifiziert und die Analyse mittels hochauflösender Mas¬senspektrometrie realisiert. Als Extraktionsmittel kam 100% Acetonitril, ACN zum Einsatz wo¬bei die Extraktionseffizienz bei 85% lag. Für die anschließende Derivatisierung wurde 2,4-Di¬nitrophenylhydrazin, DNPH verwendet. Dieses musste zuvor drei Mal mittels Festphasenex¬traktion gereinigt werden um störende Blindwerte ausreichend zu minimieren. Die gefunde¬nen Henry-Konstanten für Ammoniumsulfat als Saataerosol stimmten gut mit in der Literatur gefundenen Werten überein. Die Werte für Natriumnitrat und Natriumchlorid als Saataerosol waren kleiner als die von Ammoniumsulfat aber größer als der Wert von reinem Wasser. Für Ammoniumnitrat und Kaliumsulfat konnten keine Konstanten berechnet werden. Alle drei Saataerosole führten zu einem „Salting-in“. Das bedeutet, dass bei Erhöhung der Salzmolalität auch die Glyoxalkonzentration im Partikel stieg. Diese Beobachtungen sind auch in der Litera¬tur beschrieben, wobei die Ergebnisse dort nicht auf der Durchführung von Kammerexperi¬menten beruhen, sondern mittels bulk-Experimenten generiert wurden. Für die Trennung der Imidazole wurde eine neue Filterextraktionsmethode entwickelt, wobei sich ein Gemisch aus mit HCl angesäuertem ACN/H2O im Verhältnis 9/1 als optimales Extrak¬tionsmittel herausstellte. Drei verschiedenen Imidazole konnten mit dieser Methode quanti¬fiziert werden, nämlich 1-H-Imidazol-4-carbaldehyd (IC), Imidazol (IM) und 2,2‘-Biimidazol (BI). Die Effizienzen lagen für BI bei 95%, für IC bei 58% und für IM bei 75%. Kammerexperimente unter Zugabe von Ammoniak zeigten höhere Imidazolkonzentrationen als solche ohne. Wurden die Experimente ohne Ammoniak in Anwesenheit von Ammoni¬umsulfat durchgeführt, wurden höhere Imidazol-Konzentrationen gefunden als ohne Ammo¬niumionen. Auch die relative Luftfeuchtigkeit spielte eine wichtige Rolle, da sowohl eine zu hohe als auch eine zu niedrige relative Luftfeuchtigkeit zu einer verminderten Imidazolbildung führte. Durch mit 13C-markiertem Kohlenstoff durchgeführte Experimente konnte eindeutig gezeigt werden, dass es sich bei den gebildeten Imidazolen und Glyoxalprodukte handelte. Außerdem konnte der in der Literatur beschriebene Bildungsmechanismus erfolgreich weiter¬entwickelt werden. Während der CYPHEX Kampagne in Zypern konnten erstmalig Imidazole in Feldproben nach¬gewiesen werden. Das Hauptprodukt IC zeigte einen tageszeitlichen Verlauf mit höheren Kon¬zentrationen während der Nacht und korrelierte signifikant aber schwach mit der Acidität und Ammoniumionenkonzentration des gefundenen Aerosols.