Mining dei Workflow di un Laboratorio di Anatomia Patologica

Il presente lavoro nasce dall’obiettivo di individuare strumenti statistici per indagare, sotto diversi aspetti, il flusso di lavoro di un Laboratorio di Anatomia Patologica. Il punto di partenza dello studio è l’ambiente di lavoro di ATHENA, software gestionale utilizzato nell’Anatomia Patologica, sviluppato dalla NoemaLife S.p.A., azienda specializzata nell’informatica per la sanità. A partire da tale applicativo è stato innanzitutto formalizzato il workflow del laboratorio (Capitolo 2), nelle sue caratteristiche e nelle sue possibili varianti, identificando le operazioni principali attraverso una serie di “fasi”. Proprio le fasi, unitamente alle informazioni addizionali ad esse associate, saranno per tutta la trattazione e sotto diversi punti di vista al centro dello studio. L’analisi che presentiamo è stata per completezza sviluppata in due scenari che tengono conto di diversi aspetti delle informazioni in possesso. Il primo scenario tiene conto delle sequenze di fasi, che si presentano nel loro ordine cronologico, comprensive di eventuali ripetizioni o cicli di fasi precedenti alla conclusione. Attraverso l’elaborazione dei dati secondo specifici formati è stata svolta un’iniziale indagine grafica di Workflow Mining (Capitolo 3) grazie all’ausilio di EMiT, un software che attraverso un set di log di processo restituisce graficamente il flusso di lavoro che li rappresenta. Questa indagine consente già di valutare la completezza dell’utilizzo di un applicativo rispetto alle sue potenzialità. Successivamente, le stesse fasi sono state elaborate attraverso uno specifico adattamento di un comune algoritmo di allineamento globale, l’algoritmo Needleman-Wunsch (Capitolo 4). L’utilizzo delle tecniche di allineamento applicate a sequenze di processo è in grado di individuare, nell’ambito di una specifica codifica delle fasi, le similarità tra casi clinici. L’algoritmo di Needleman-Wunsch individua le identità e le discordanze tra due stringhe di caratteri, assegnando relativi punteggi che portano a valutarne la similarità. Tale algoritmo è stato opportunamente modificato affinché possa riconoscere e penalizzare differentemente cicli e ripetizioni, piuttosto che fasi mancanti. Sempre in ottica di allineamento sarà utilizzato l’algoritmo euristico Clustal, che a partire da un confronto pairwise tra sequenze costruisce un dendrogramma rappresentante graficamente l’aggregazione dei casi in funzione della loro similarità. Proprio il dendrogramma, per la sua struttura grafica ad albero, è in grado di mostrare intuitivamente l’andamento evolutivo della similarità di un pattern di casi. Il secondo scenario (Capitolo 5) aggiunge alle sequenze l’informazione temporale in termini di istante di esecuzione di ogni fase. Da un dominio basato su sequenze di fasi, si passa dunque ad uno scenario di serie temporali. I tempi rappresentano infatti un dato essenziale per valutare la performance di un laboratorio e per individuare la conformità agli standard richiesti. Il confronto tra i casi è stato effettuato con diverse modalità, in modo da stabilire la distanza tra tutte le coppie sotto diversi aspetti: le sequenze, rappresentate in uno specifico sistema di riferimento, sono state confrontate in base alla Distanza Euclidea ed alla Dynamic Time Warping, in grado di esprimerne le discordanze rispettivamente temporali, di forma e, dunque, di processo. Alla luce dei risultati e del loro confronto, saranno presentate già in questa fase le prime valutazioni sulla pertinenza delle distanze e sulle informazioni deducibili da esse. Il Capitolo 6 rappresenta la ricerca delle correlazioni tra elementi caratteristici del processo e la performance dello stesso. Svariati fattori come le procedure utilizzate, gli utenti coinvolti ed ulteriori specificità determinano direttamente o indirettamente la qualità del servizio erogato. Le distanze precedentemente calcolate vengono dunque sottoposte a clustering, una tecnica che a partire da un insieme eterogeneo di elementi individua famiglie o gruppi simili. L’algoritmo utilizzato sarà l’UPGMA, comunemente applicato nel clustering in quanto, utilizzando, una logica di medie pesate, porta a clusterizzazioni pertinenti anche in ambiti diversi, dal campo biologico a quello industriale. L’ottenimento dei cluster potrà dunque essere finalmente sottoposto ad un’attività di ricerca di correlazioni utili, che saranno individuate ed interpretate relativamente all’attività gestionale del laboratorio. La presente trattazione propone quindi modelli sperimentali adattati al caso in esame ma idealmente estendibili, interamente o in parte, a tutti i processi che presentano caratteristiche analoghe.

Analysis of the nuclear properties of Brightest Cluster Galaxies and comparison with "normal" radio galaxies.

The aim of this PhD thesis is the study of the nuclear properties of radio loud AGN. Multiple and/or recent mergers in the host galaxy and/or the presence of cool core in galaxy clusters can play a role in the formation and evolution of the radio source. Being a unique class of objects (Lin & Mohr 2004), we focus on Brightest Cluster Galaxies (BCGs). We investigate their parsec scale radio emission with VLBI (Very Long Baseline Interferometer) observations. From literature or new data , we collect and analyse VLBA (Very Long Baseline) observations at 5 GHz of a complete sample of BCGs and ``normal'' radio galaxies (Bologna Complete Sample , BCS). Results on nuclear properties of BCGs are coming from the comparison with the results for the Bologna COmplete Sample (BCS). Our analysis finds a possible dichotomy between BCGs in cool-core clusters and those in non-cool-core clusters. Only one-sided BCGs have similar kinematic properties with FRIs. Furthermore, the dominance of two-sided jet structures only in cooling clusters suggests sub-relativistic jet velocities. The different jet properties can be related to a different jet origin or to the interaction with a different ISM. We larger discuss on possible explanation of this.

Studio e ottimizzazione della struttura di un aerogeneratore ad asse verticale senza fondamenta

Sviluppo di un aerogeneratore ad asse verticale a pale, che fornisca una potenza di 100 KW utilizzando un generatore senza interposizione di moltiplicatore di giri per la produzione di energia elettrica. Si vuole progettare una macchina che possa essere montata sul luogo di esercizio, avendo quindi tutta la componentistica trasportabile e senza richiedere l’uso di trasporti eccezionali per evitare di avere costi aggiuntivi che con semplici accorgimenti possono essere evitati. La macchina dovrà per quanto possibile evitare la presenza di fondamenta che incrementino i costi di realizzazione e pregiudichino il sito urbanizzandolo fortemente.

Cluster-derived Gold/Iron catalysts for environmental applications

During the last years we assisted to an exponential growth of scientific discoveries for catalysis by gold and many applications have been found for Au-based catalysts. In the literature there are several studies concerning the use of gold-based catalysts for environmental applications and good results are reported for the catalytic combustion of different volatile organic compounds (VOCs). Recently it has also been established that gold-based catalysts are potentially capable of being effectively employed in fuel cells in order to remove CO traces by preferential CO oxidation in H2-rich streams. Bi-metallic catalysts have attracted increasing attention because of their markedly different properties from either of the costituent metals, and above all their enhanced catalytic activity, selectivity and stability. In the literature there are several studies demostrating the beneficial effect due to the addition of an iron component to gold supported catalysts in terms of enhanced activity, selectivity, resistence to deactivation and prolonged lifetime of the catalyst. In this work we tried to develop a methodology for the preparation of iron stabilized gold nanoparticles with controlled size and composition, particularly in terms of obtaining an intimate contact between different phases, since it is well known that the catalytic behaviour of multi-component supported catalysts is strongly influenced by the size of the metal particles and by their reciprocal interaction. Ligand stabilized metal clusters, with nanometric dimensions, are possible precursors for the preparation of catalytically active nanoparticles with controlled dimensions and compositions. Among these, metal carbonyl clusters are quite attractive, since they can be prepared with several different sizes and compositions and, moreover, they are decomposed under very mild conditions. A novel preparation method was developed during this thesis for the preparation of iron and gold/iron supported catalysts using bi-metallic carbonyl clusters as precursors of highly dispersed nanoparticles over TiO2 and CeO2, which are widely considered two of the most suitable supports for gold nanoparticles. Au/FeOx catalysts were prepared by employing the bi-metallic carbonyl cluster salts [NEt4]4[Au4Fe4(CO)16] (Fe/Au=1) and [NEt4][AuFe4(CO)16] (Fe/Au=4), and for comparison FeOx samples were prepared by employing the homometallic [NEt4][HFe3(CO)11] cluster. These clusters were prepared by Prof. Longoni research group (Department of Physical and Inorganic Chemistry- University of Bologna). Particular attention was dedicated to the optimization of a suitable thermal treatment in order to achieve, apart from a good Au and Fe metal dispersion, also the formation of appropriate species with good catalytic properties. A deep IR study was carried out in order to understand the physical interaction between clusters and different supports and detect the occurrence of chemical reactions between them at any stage of the preparation. The characterization by BET, XRD, TEM, H2-TPR, ICP-AES and XPS was performed in order to investigate the catalysts properties, whit particular attention to the interaction between Au and Fe and its influence on the catalytic activity. This novel preparation method resulted in small gold metallic nanoparticles surrounded by highly dispersed iron oxide species, essentially in an amorphous phase, on both TiO2 and CeO2. The results presented in this thesis confirmed that FeOx species can stabilize small Au particles, since keeping costant the gold content but introducing a higher iron amount a higher metal dispersion was achieved. Partial encapsulation of gold atoms by iron species was observed since the Au/Fe surface ratio was found much lower than bulk ratio and a strong interaction between gold and oxide species, both of iron oxide and supports, was achieved. The prepared catalysts were tested in the total oxidation of VOCs, using toluene and methanol as probe molecules for aromatics and alchols, respectively, and in the PROX reaction. Different performances were observed on titania and ceria catalysts, on both toluene and methanol combustion. Toluene combustion on titania catalyst was found to be enhanced increasing iron loading while a moderate effect on FeOx-Ti activity was achieved by Au addition. In this case toluene combustion was improved due to a higher oxygen mobility depending on enhanced oxygen activation by FeOx and Au/FeOx dispersed on titania. On the contrary ceria activity was strongly decreased in the presence of FeOx, while the introduction of gold was found to moderate the detrimental effect of iron species. In fact, excellent ceria performances are due to its ability to adsorb toluene and O2. Since toluene activation is the determining factor for its oxidation, the partial coverage of ceria sites, responsible of toluene adsorption, by FeOx species finely dispersed on the surface resulted in worse efficiency in toluene combustion. Better results were obtained for both ceria and titania catalysts on methanol total oxidation. In this case, the performances achieved on differently supported catalysts indicate that the oxygen mobility is the determining factor in this reaction. The introduction of gold on both TiO2 and CeO2 catalysts, lead to a higher oxygen mobility due to the weakening of both Fe-O and Ce-O bonds and consequently to enhanced methanol combustion. The catalytic activity was found to strongly depend on oxygen mobility and followed the same trend observed for catalysts reducibility. Regarding CO PROX reaction, it was observed that Au/FeOx titania catalysts are less active than ceria ones, due to the lower reducibility of titania compared to ceria. In fact the availability of lattice oxygen involved in PROX reaction is much higher in the latter catalysts. However, the CO PROX performances observed for ceria catalysts are not really high compared to data reported in literature, probably due to the very low Au/Fe surface ratio achieved with this preparation method. CO preferential oxidation was found to strongly depend on Au particle size but also on surface oxygen reducibility, depending on the different oxide species which can be formed using different thermal treatment conditions or varying the iron loading over the support.

Sintesi di nanoparticelle polimeriche basate su acido(D,L-lattico-co-glicolico) per applicazioni in nanomedicina

Questo lavoro di tesi rientra nel progetto europeo SaveMe, al quale partecipa il gruppo di ricerca del dipartimento di chimica organica nel quale ho svolto l’attività di tirocinio. Obiettivo finale di tale progetto è la sintesi di nanoparticelle a base di PLGA (acido poli(D,L-lattico-co-glicolico)) superficialmente funzionalizzate con biomolecole, per l’impiego nel trattamento e nella diagnosi del cancro al pancreas. L’obiettivo da raggiungere nel primo anno di ricerca per il mio gruppo era la sintesi delle nanoparticelle centrali (core nanosystems). Nel presente lavoro sono quindi riportati i metodi di sintesi di polimeri derivati da PLGA e suoi copolimeri con PEG (polietilenglicole) aventi vari gruppi funzionali terminali: acidi idrossamici, amminici e acidi carbossilici. I polimeri sintetizzati sono stati caratterizzati tramite test colorimetrici qualitativi, 1H-NMR, 13C-NMR, spettrometria IR e TGA. Sono state sintetizzate nanoparticelle polimeriche (PNPs), con le tecniche Oil/Water (O/W) e nanoprecipitazione (NP), basate sui polimeri ottenuti, aventi quindi funzioni acide, idrossamiche ed amminiche sulla superficie. Su queste PNPs è stato effettuata una decorazione superficiale con nanoparticelle metalliche di maghemite (CAN-Maghemite). Le nanoparticelle polimeriche sono state caratterizzate tramite DLS e delle PNPs decorate sono state ottenute immagini TEM. Sono riportati inoltre i test di viabilità cellulare delle nanoparticelle ottenute.

Controllo molecolare del differenziamento osteoblestico per applicazioni nel campo della rigenerazione del tessuto osseo

The aim of the study was to identify expression signatures unique for specific stages of osteoblast differentiation in order to improve our knowledge of the molecular mechanisms underlying bone repair and regeneration. We performed a microarray analysis on the whole transcriptome of human mesenchymal stem cells (hMSCs) obtained from the femoral canal of patients undergoing hip replacement. By defining different time-points within the differentiation and mineralization phases of hMSCs, temporal gene expression changes were visualised. Importantly, the gene expression of adherent bone marrow mononuclear cells, being the undifferentiated progenitors of bone cells, was used as reference. In addition, only the cultures able to form mineral nodules at the final time-point were considered for the gene expression analyses. To obtain the genes of our interest, we only focused on genes: i) whose expression was significantly upregulated; ii) which are involved in pathways or biological processes relevant to proliferation, differentiation and functions of bone cells; iii) which changed considerably during the different steps of differentiation and/or mineralization. Among the 213 genes identified as differentially expressed by microarray analysis, we selected 65 molecular markers related to specific steps of osteogenic differentiation. These markers are grouped into various gene clusters according to their involvement in processes which play a key role in bone cell biology such as angiogenesis, ossification, cell communication, development and in pathways like TGF beta and Wnt signaling pathways. Taken together, these results allow us to monitor hMSC cultures and to distinguish between different stages of differentiation and mineralization. The signatures represent a useful tool to analyse a broad spectrum of functions of hMSCs cultured on scaffolds, especially when the constructs are conceived for releasing growth factors or other signals to promote bone regeneration. Morover, this work will enhance our understanding of bone development and will enable us to recognize molecular defects that compromise normal bone function as occurs in pathological conditions.

Impatto degli interventi antropici di difesa costiera sulla struttura e distribuzione della popolazione di Lentidium mediterraneum (Mollusca bivalvia)

Il presente elaborato si inserisce all’interno del progetto THESEUS (Innovative Technologies for safer European coasts in a changing climate), nella sezione denominata “work package 3”. I principali obiettivi di questo studio sono: 1) valutare l’impatto delle differenti strategie di difesa di zone intertidale dell’ecosistema spiaggia lungo il litorale dell’Emilia-Romagna; 2) analizzare nel dettaglio la struttura e la distribuzione del microbivalve Lentidium mediterraneum, tipico do questa zona, per valutarne un eventuale utilizzo nei progetti di monitoraggio e analisi degli impatti antropici legati alle variazioni morfodinamiche. Sono state scelte tre spiagge: Cesenatico, in cui da molti anni sono presenti strutture di difesa rigide della spiaggia, e dove ogni anno, al termine della stagione estiva, vengono costruite delle dune artificiali, rimosse a fine primavera, per proteggere gli stabilimenti balneari dalle mareggiate invernali; Cervia, in cui sono presenti solo le dune artificiali stagionali; Lido di Dante, considerato naturale per l’assenza di strutture di protezione. Il campionamento è stato effettuato in 3 tempi per ciascun sito. 2 tempi senza le dune artificiali, e uno con. Per ciascun sito e ciascun tempo sono stati replicati 3 transetti, random, per ogni livello di marea. Sono stati prelevati campioni per un totale di 14879 individui e identificati 40 taxa. Da questi sono stati estratti gli esemplari di Lentidium mediterraneum da analizzare. Le analisi uni e multivariate effettuate sull’intera comunità hanno messo in evidenza differenze fra le spiagge, fra i tempi di campionamento e i livelli di marea. Si è, inoltre evidenziato come tali differenze fossero in parte dovute alle densità di Lentidium mediterraneum. Oltre alle analisi classiche nel presente lavoro di tesi è stato proposto un modello concettuale di trasporto del Lentidium mediterraneum che se validato confermerebbe la possibilità di utilizzare il microbivalve come “proxy biologico”.

Organizzazione strutturale della catena respiratoria mitocondriale

La catena respiratoria mitocondriale è principalmente costituita da proteine integrali della membrana interna, che hanno la capacità di accoppiare il flusso elettronico, dovuto alle reazioni redox che esse catalizzano, al trasporto di protoni dalla matrice del mitocondrio verso lo spazio intermembrana. Qui i protoni accumulati creano un gradiente elettrochimico utile per la sintesi di ATP ad opera dell’ATP sintasi. Nonostante i notevoli sviluppi della ricerca sulla struttura e sul meccanismo d’azione dei singoli enzimi della catena, la sua organizzazione sovramolecolare, e le implicazioni funzionali che ne derivano, rimangono ancora da chiarire in maniera completa. Da questa problematica trae scopo la presente tesi volta allo studio dell’organizzazione strutturale sovramolecolare della catena respiratoria mediante indagini sia cinetiche che strutturali. Il modello di catena respiratoria più accreditato fino a qualche anno fa si basava sulla teoria delle collisioni casuali (random collision model) che considera i complessi come unità disperse nel doppio strato lipidico, ma collegate funzionalmente tra loro da componenti a basso peso molecolare (Coenzima Q10 e citocromo c). Recenti studi favoriscono invece una organizzazione almeno in parte in stato solido, in cui gli enzimi respiratori si presentano sotto forma di supercomplessi (respirosoma) con indirizzamento diretto (channeling) degli elettroni tra tutti i costituenti, senza distinzione tra fissi e mobili. L’importanza della comprensione delle relazioni che si instaurano tra i complessi , deriva dal fatto che la catena respiratoria gioca un ruolo fondamentale nell’invecchiamento, e nello sviluppo di alcune malattie cronico degenerative attraverso la genesi di specie reattive dell’ossigeno (ROS). E’ noto, infatti, che i ROS aggrediscono, anche i complessi respiratori e che questi, danneggiati, producono più ROS per cui si instaura un circolo vizioso difficile da interrompere. La nostra ipotesi è che, oltre al danno a carico dei singoli complessi, esista una correlazione tra le modificazioni della struttura del supercomplesso, stress ossidativo e deficit energetico. Infatti, la dissociazione del supercomplesso può influenzare la stabilità del Complesso I ed avere ripercussioni sul trasferimento elettronico e protonico; per cui non si può escludere che ciò porti ad un’ulteriore produzione di specie reattive dell’ossigeno. I dati sperimentali prodotti a sostegno del modello del respirosoma si riferiscono principalmente a studi strutturali di elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti (BN-PAGE) che, però, non danno alcuna informazione sulla funzionalità dei supercomplessi. Pertanto nel nostro laboratorio, abbiamo sviluppato una indagine di tipo cinetico, basata sull’analisi del controllo di flusso metabolico,in grado di distinguere, funzionalmente, tra supercomplessi e complessi respiratori separati. Ciò è possibile in quanto, secondo la teoria del controllo di flusso, in un percorso metabolico lineare composto da una serie di enzimi distinti e connessi da intermedi mobili, ciascun enzima esercita un controllo (percentuale) differente sull’intero flusso metabolico; tale controllo è definito dal coefficiente di controllo di flusso, e la somma di tutti i coefficienti è uguale a 1. In un supercomplesso, invece, gli enzimi sono organizzati come subunità di una entità singola. In questo modo, ognuno di essi controlla in maniera esclusiva l’intero flusso metabolico e mostra un coefficiente di controllo di flusso pari a 1 per cui la somma dei coefficienti di tutti gli elementi del supercomplesso sarà maggiore di 1. In questa tesi sono riportati i risultati dell’analisi cinetica condotta su mitocondri di fegato di ratto (RLM) sia disaccoppiati, che accoppiati in condizioni fosforilanti (stato 3) e non fosforilanti (stato 4). L’analisi ha evidenziato l’associazione preferenziale del Complesso I e Complesso III sia in mitocondri disaccoppiati che accoppiati in stato 3 di respirazione. Quest’ultimo risultato permette per la prima volta di affermare che il supercomplesso I+III è presente anche in mitocondri integri capaci della fosforilazione ossidativa e che il trasferimento elettronico tra i due complessi possa effettivamente realizzarsi anche in condizioni fisiologiche, attraverso un fenomeno di channeling del Coenzima Q10. Sugli stessi campioni è stata eseguita anche un analisi strutturale mediante gel-elettroforesi (2D BN/SDS-PAGE) ed immunoblotting che, oltre a supportare i dati cinetici sullo stato di aggregazione dei complessi respiratori, ci ha permesso di evidenziare il ruolo del citocromo c nel supercomplesso, in particolare per il Complesso IV e di avviare uno studio comparativo esteso ai mitocondri di cuore bovino (BHM), di tubero di patata (POM) e di S. cerevisiae.

Struttura e dinamica di popolazione di Axinella polypoides (Schmidt, 1862) (Porifera, Demospongiae) presso l’Isola Gallinara (SV)

I poriferi rappresentano un importante campo di ricerca anche in ambito applicativo in quanto potenzialmente utili come fonte di metaboliti secondari da impiegarsi in ambito clinico (antitumorali, antibiotici, antivirali, ecc.) e industriale (antifouling). I processi di biosilicificazione interessano invece per aspetti legati alle biotecnologie marine. Questo Phylum ha un importante ruolo strutturale e funzionale nell’ecologia dei popolamenti bentonici, in quanto può essere dominante in numerosi habitat e svolgere un ruolo ecologico fondamentale nelle dinamiche degli ecosistemi marini. Per questo, la variazione spaziale e temporale della loro abbondanza può avere effetti considerevoli su altri membri della comunità. Lo studio delle dinamiche di popolazione e del ciclo riproduttivo dei poriferi potrebbe permettere di valutare come i cambiamenti climatici ne influenzino la crescita e la riproduzione e potrebbe quindi fornire una base per lo sviluppo di corrette tecniche di gestione ambientale. La spugna Axinella polypoides è inserita all’interno delle liste di protezione della Convenzione di Berna e di Barcellona, dove sono elencate le specie da proteggere perché minacciate o in pericolo di estinzione. Questa specie, avendo una morfologia eretta, è fortemente minacciata soprattutto da attività antropiche quali pesca e ancoraggi, ma nonostante questo la letteratura relativa ad essa è scarsa, La sua importanza è legata soprattutto al recente utilizzo come modello per numerosi esperimenti. A. polypoides rappresenta, infatti, il più basso livello nella scala evolutiva in cui sono stati rinvenuti meccanismi biochimici cellulari di reazione all’aumento di temperatura (incremento dell’attività ADP-ribosil ciclasica, sintesi di ossido nitrico) tipici degli organismi superiori. Lo scopo di questa tesi è di aumentare le conoscenze sull’ecologia e sulla biologia di questo porifero, al fine di consentire una migliore predisposizione di eventuali piani di tutela. Dallo studio delle colonie effettuato presso l’Isola Gallinara (SV), emerge una dinamica di crescita lenta ed un ciclo riproduttivo estivo, coerentemente con quanto osservato per altre specie mediterranee del genere Axinella. Le analisi istologiche effettuate hanno mostrato variabilità temporale nella densità e nella dimensione di particolari cellule sferulose, che si ipotizza siano collegate a fenomeni di proliferazione cellulare e rigenerazione in seguito a danni. È stata individuata inoltre la presenza di una particolare tipologia cellulare dendritica la cui funzione si ritiene abbia affinità con le funzioni sensoriali di Phyla superiori. Queste osservazioni, e l’evidente vulnerabilità della specie agli impatti antropici, hanno evidenziato la necessità di sviluppare adeguati piani di monitoraggio e di conservazione.

Monooxygenases involved in the n-alkanes metabolism by Rhodococcus sp. BCP1: molecular characterization and expression of alkB gene

Bioremediation implies the use of living organisms, primarily microorganisms, to convert environmental contaminants into less toxic forms. The impact of the consequences of hydrocarbon release in the environment maintain a high research interest in the study of microbial metabolisms associated with the biodegradation of aromatic and aliphatic hydrocarbons but also in the analysis of microbial enzymes that can convert petroleum substrates to value-added products. The studies described in this Thesis fall within the research field that directs the efforts into identifying gene/proteins involved in the catabolism of n-alkanes and into studying the regulatory mechanisms leading to their oxidation. In particular the studies were aimed at investigating the molecular aspects of the ability of Rhodococcus sp. BCP1 to grow on aliphatic hydrocarbons as sole carbon and energy sources. We studied the ability of Rhodococcus sp. BCP1 to grow on gaseous (C2-C4), liquid (C5-C16) and solid (C17-C28) n-alkanes that resulted to be biochemically correlated with the activity of one or more monooxygenases. In order to identify the alkane monooxygenase that is involved in the n-alkanes degradation pathway in Rhodococcus sp. BCP1, PCR-based methodology was applied by using degenerate primers targeting AlkB monooxygenase family members. As result, a chromosomal region, including the alkB gene cluster, was cloned from Rhodococcus sp. BCP1 genome. We characterized the products of this alkB gene cluster and the products of the orfs included in the flanking regions by comparative analysis with the homologues in the database. alkB gene expression studies were carried out by RT-PCR and by the construction of a promoter probe vector containing the lacZ gene downstream of the alkB promoter. B-galactosidase assays revealed the alkB promoter activity induced by n-alkanes and by n-alkanes metabolic products. Furthermore, the transcriptional start of alkB gene was determined by primer extension procedure. A proteomic approach was subsequently applied to compare the protein patterns expressed by BCP1 growing on n-butane, n-hexane, n-hexadecane or n-eicosane with the protein pattern expressed by BCP1 growing on succinate. The accumulation of enzymes specifically induced on n-alkanes was determined. These enzymes were identified by tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). Finally, a prm gene, homologue to the gene family coding for soluble di-iron monooxygenases (SDIMOs), has been isolated from Rhodococcus sp. BCP1 genome. This gene product could be involved in the degradation of gaseous n-alkanes in this Rhodococcus strain. The versatility in utilizing hydrocarbons and the discovery of new remarkable metabolic activities outline the potential applications of this microorganism in environmental and industrial biotechnologies.

The study of a novel zinc finger gene cluster TZF and a genomic region flanking the histone H 4 replacement gene H 4 r of Drosophila melanogaster

Part I : A zinc finger gene Tzf1 was cloned in the earlier work of the lab by screening a ë-DASH2 cDNA expression library with an anti-Rat SC antibody. A ë-DASH2 genomic DNA library and cosmid lawrist 4 genomic DNA library were screened with the cDNA fragment of Tzf1 to determine the genomic organization of Tzf1. Another putative zinc finger gene Tzf2 was found about 700 bp upstream of Tzf1.RACE experiment was carried out for both genes to establish the whole length cDNA. The cDNA sequences of Tzf and Tzf2 were used to search the Flybase (Version Nov, 2000). They correspond to two genes found in the Flybase, CG4413 and CG4936. The CG4413 transcript seems to be a splicing variant of Tzf transcripts. Another two zinc finger genes Tzf3 and Tzf4 were discovered in silico. They are located 300 bp away from Tzf and Tzf2, and a non-tandem cluster was formed by the four genes. All four genes encode proteins with a very similar modular structure, since they all have five C2H2 type zinc fingers at their c-terminal ends. This is the most compact zinc finger protein gene cluster found in Drosophila melanogaster.Part II: 34,056 bp insert of the cosmid 19G11

Coupled-Cluster-Berechnungen von Parametern der Kernspin-Resonanz-Spektroskopie

Coupled-Cluster-Berechnungen von Parametern derKernspin-Resonanz-Spektroskopie Dissertationsschrift von Alexander A.Auer, Mainz 2002 Im Rahmen einer Studie der Berechnung von 13C-Verschiebungenwerdendie Einfluesse von Elektronenkorrelation, Basissatz,Gleichgewichtsgeometrie sowie Schwingungs- und Rotationseffekten separat betrachtet.Dabei zeigt sich, dass dieCoupled-Cluster-Singles-Doubles-Methode mitstoerungstheoretischer Behandlung der Dreifachanregungen(CCSD(T)) mit entsprechend grossen Basissaetzen bei Beruecksichtigung derNullpunktsschwingungseffekte Ergebnisse mit ca. 1 ppm Abweichung zum Experiment liefert. Eine Analyse der Elektronenkorrelationseffekte beiCoupled-Cluster- (CC-) Berechnungen von indirekten Spin-Spin-Kopplungskonstanten zeigt, dassCC-Methoden mit Hartree-Fock-Orbitalrelaxation zur Berechnung derKopplungskonstanten ungeeignet sind. Eine Loesung ist die Verwendung unrelaxierter CC-Methoden,in denendie HF-Orbitalrelaxation aus der Berechnung der gestoertenWellenfunktion ausgeschlossen wird. Full-Configuration-Interaction-Berechnungen fuer Borhydridzeigen,dass auf CC-Singles-Doubles-Niveau (CCSD) 94% und aufCC-Singles-Doubles-Triples-Niveau (CCSDT) 99% der Korrelationseffekte beschrieben werden. Weiterhin istdie Beruecksichtigung der Nullpunktsschwingung sowie die Wahl eines ausreichend grossen Basissatzes wichtig. Auf Grundlage der vorangegangenen Studien werden im letztenTeil zwei Beispiele zur Anwendung hochgenauer Berechnungen vonNMR-Parametern vorgestellt.Im Rahmen einer Studie der Spin-Spin-Kopplungskonstanten vonCyclopentan wird eine Karplus-Beziehungzwischen den Kopplungskonstanten und der Konformation desMolekuels aufgestellt, desweiteren werden die NMR-Parameter von Methylidinphosphanuntersucht.