Service-oriented infrastructure to support the control, monitoring and management of a shop floor system

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Electrotécnica e de Computadores

Reactive hybrid knowledge bases

Hybrid knowledge bases are knowledge bases that combine ontologies with non-monotonic rules, allowing to join the best of both open world ontologies and close world rules. Ontologies shape a good mechanism to share knowledge on theWeb that can be understood by both humans and machines, on the other hand rules can be used, e.g., to encode legal laws or to do a mapping between sources of information. Taking into account the dynamics present today on the Web, it is important for these hybrid knowledge bases to capture all these dynamics and thus adapt themselves. To achieve that, it is necessary to create mechanisms capable of monitoring the information flow present on theWeb. Up to today, there are no such mechanisms that allow for monitoring events and performing modifications of hybrid knowledge bases autonomously. The goal of this thesis is then to create a system that combine these hybrid knowledge bases with reactive rules, aiming to monitor events and perform actions over a knowledge base. To achieve this goal, a reactive system for the SemanticWeb is be developed in a logic-programming based approach accompanied with a language for heterogeneous rule base evolution having as its basis RIF Production Rule Dialect, which is a standard for exchanging rules over theWeb.

Enterprise reference lexicon building from business models

Nowadays, a significant increase on the demand for interoperable systems for exchanging data in business collaborative environments has been noticed. Consequently, cooperation agreements between each of the involved enterprises have been brought to light. However, due to the fact that even in a same community or domain, there is a big variety of knowledge representation not semantically coincident, which embodies the existence of interoperability problems in the enterprises information systems that need to be addressed. Moreover, in relation to this, most organizations face other problems about their information systems, as: 1) domain knowledge not being easily accessible by all the stakeholders (even intra-enterprise); 2) domain knowledge not being represented in a standard format; 3) and even if it is available in a standard format, it is not supported by semantic annotations or described using a common and understandable lexicon. This dissertation proposes an approach for the establishment of an enterprise reference lexicon from business models. It addresses the automation in the information models mapping for the reference lexicon construction. It aggregates a formal and conceptual representation of the business domain, with a clear definition of the used lexicon to facilitate an overall understanding by all the involved stakeholders, including non-IT personnel.

Automatic extraction of concepts from texts and applications

The extraction of relevant terms from texts is an extensively researched task in Text- Mining. Relevant terms have been applied in areas such as Information Retrieval or document clustering and classification. However, relevance has a rather fuzzy nature since the classification of some terms as relevant or not relevant is not consensual. For instance, while words such as "president" and "republic" are generally considered relevant by human evaluators, and words like "the" and "or" are not, terms such as "read" and "finish" gather no consensus about their semantic and informativeness. Concepts, on the other hand, have a less fuzzy nature. Therefore, instead of deciding on the relevance of a term during the extraction phase, as most extractors do, I propose to first extract, from texts, what I have called generic concepts (all concepts) and postpone the decision about relevance for downstream applications, accordingly to their needs. For instance, a keyword extractor may assume that the most relevant keywords are the most frequent concepts on the documents. Moreover, most statistical extractors are incapable of extracting single-word and multi-word expressions using the same methodology. These factors led to the development of the ConceptExtractor, a statistical and language-independent methodology which is explained in Part I of this thesis. In Part II, I will show that the automatic extraction of concepts has great applicability. For instance, for the extraction of keywords from documents, using the Tf-Idf metric only on concepts yields better results than using Tf-Idf without concepts, specially for multi-words. In addition, since concepts can be semantically related to other concepts, this allows us to build implicit document descriptors. These applications led to published work. Finally, I will present some work that, although not published yet, is briefly discussed in this document.

Semantics bias in cross-national comparative analyses : Is it good or bad to have "fair" health?

The Health Behavior in School-aged Children is a cross-national study collecting data on social and health indicators on adolescents in 43 countries. The study provides comparable data on health behaviors and health outcomes through the use of a common protocol, which have been a back bone of the study sine its initiation in 1983. Recent years, researchers within the study have noticed a questionable comparability on the widely used item on self-rated health. One of the four response categories to the item "Would you say your health is….?" showed particular variation, as the response category "Fair" varied from 20 % in Latvia and Moldova to 3-4 % in Bulgaria and Macedonia. A qualitative mini-survey of the back-translations showed that the response category "Fair" had a negative slant in 25 countries, a positive slant in 10 countries and was considered neutral in 9 countries. This finding indicates that there are what may be called semantic issues affecting comparability in international studies, since the same original word (in an English original) is interpreted differently across countries and cultures. The paper test and discuss a few possible explanations to this, however, only leaving to future studies to hold a cautious approach to international comparisons if working with the self-rated health item with four response categories.

Video metadata extraction in a videoMail system

Currently the world swiftly adapts to visual communication. Online services like YouTube and Vine show that video is no longer the domain of broadcast television only. Video is used for different purposes like entertainment, information, education or communication. The rapid growth of today’s video archives with sparsely available editorial data creates a big problem of its retrieval. The humans see a video like a complex interplay of cognitive concepts. As a result there is a need to build a bridge between numeric values and semantic concepts. This establishes a connection that will facilitate videos’ retrieval by humans. The critical aspect of this bridge is video annotation. The process could be done manually or automatically. Manual annotation is very tedious, subjective and expensive. Therefore automatic annotation is being actively studied. In this thesis we focus on the multimedia content automatic annotation. Namely the use of analysis techniques for information retrieval allowing to automatically extract metadata from video in a videomail system. Furthermore the identification of text, people, actions, spaces, objects, including animals and plants. Hence it will be possible to align multimedia content with the text presented in the email message and the creation of applications for semantic video database indexing and retrieving.

Product extension services deployment platform

Due to the progresses made in the branch of embedded technologies, manufacturers are becoming able to pack their shop floor level manufacturing resources with even more complex functionalities. This technological progression is radically changing the way production systems are designed and deployed, as well as, monitored and controlled. The dissemination of smart devices inside production processes confers new visibility on the production system while enabling for a more efficient and effective management of the operations. By turning the current manufacturing resources functionalities into services based on a Service Oriented Architecture (SOA), in order to expose them as a service to the user, the binomial manufacturing resource/service will push the entire manufacturing enterprise visibility to another level while enabling the global optimization of the operations and processes of a production system while, at the same time, supporting its accommodation to the operational spike easily and with reduced impact on production. The present work implements a Cloud Manufacturing infrastructure for achieving the resource/service value-added i.e. to facilitate the creation of services that are the composition of currently available atomic services. In this context, manufacturing resource virtualization (i.e. formalization of resources capabilities into services accessible inside and outside the enterprise) and semantic representation/description are the pillars for achieving resource service composition. In conclusion, the present work aims to act on the manufacturing resource layer where physical resources and shop floor capabilities are going to be provided to the user as a SaaS (Software as a Service) and/or IaaS (Infrastructure as a Service).

Optimization of production of anti-cancer vaccines based on dendritic cells

Cancer remains as one of the top killing diseases in first world countries. It’s not a single, but a set of various diseases for which different treatment approaches have been taken over the years. Cancer immunotherapy comes as a “new” breath on cancer treatment, taking use of the patients’ immune system to induce anti-cancer responses. Dendritic Cell (DC) vaccines use the extraordinary capacity of DCs’ antigen presentation so that specific T cell responses may be generated against cancer. In this work, we report the ex vivo generation of DCs from precursors isolated from clinical-grade cryopreserved umbilical cord blood (UCB) samples. After the thawing protocol for cryopreserved samples was optimized, the generation of DCs from CD14+ monocytes, i.e., moDCs, or CD34+ hematopoietic stem cells (HSCs), i.e, CD34-derived DCs, was followed and their phenotype and function evaluated. Functional testing included the ability to respond to maturation stimuli (including enzymatic removal of surface sialic acids), Ovalbumin-FITC endocytic capacity, cytokine secretion and T cell priming ability. In order to evaluate the feasibility of using DCs derived from UCB precursors to induce immune responses, they were compared to peripheral blood (PB) moDCs. We observed an increased endocytosis capacity after moDCs were differentiated from monocyte precursors, but almost 10-fold lower than that of PB moDCs. Maturation markers were absent, low levels of inflammatory cytokines were seen and T cell stimulatory capacity was reduced. Sialidase enzymatic treatment was able to mature these cells, diminishing endocytosis and promoting higher T cell stimulation. CD34-derived DCs showed higher capacity for both maturation and endocytic capacity than moDCs. Although much more information was acquired from moDCs than from CD34-derived DCs, we conclude the last as probably the best suited for generating an immune response against cancer, but of course much more research has to be performed.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO: O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ------------------------------------ ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites. 3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO:O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ---------------------------- ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites.3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

The role of α2,3- and α2,6-sialylation

RESUMO: Os glicoconjugados que decoram a superfície celular e os lípidos e proteínas secretados ocupam o ponto de encontro onde normalmente ocorrem interacções críticas homólogas (hospedeiro-hospedeiro) e heterólogas (hospedeiro-patogénio). Apesar de ser largamente aceite que os glicanos são parte integrante do processo de imunidade, continua a não ser claro qual o papel que os glicanos, em toda a sua diversidade, tomam no quadro geral da imunidade. Os glicanos, que são frequentemente terminados por resíduos de ácido siálico, podem ser alterados por factores externos, tais como patogénios, ou por acontecimentos fisiológicos celulares específicos. Normalmente em posição terminal, as glico-estruturas que contêm ácido siálico assumem um papel fundamental numa quantidade substancial de receptores imunes envolvidos na adesividade e tráfico celular, tal como as Selectinas e as Siglecs, das quais se sabe apresentarem uma relevante função imune. À altura do início desta tese, era sabido que os ácidos siálicos expressos à superfície das células poderiam modular mecanismos importantes nas respostas imunes adaptativas. Considerando a posição de charneira que as células dendríticas (DCs) ocupam na transição da resposta imune inata para a adaptativa, antecipámos que os ácidos siálicos poderiam também modular mecanismos relevantes nas DCs humanas. As DCs têm uma função muito relevante na verificação e captura antigénica, migração para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica aos linfócitos, uma sequência de funções que conduz, em ultima instância, à indução da resposta inata adaptativa. Considerando estas premissas, a nossa hipótese principal foi que os ácidos siálicos podem influenciar funções relevantes das DCs, tais como captura de antigénios, maturação, migração para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica às células Para testar esta hipótese, dividimos o trabalho em quatro partes: 1) Analisámos os glicanos sialilados de superfície, expressos durante a diferenciação de monócitos humanos em DCs (moDCs). Os nossos dados mostraram que a expressão dos glicanos com ligações em O (O-glicanos) e sialilados em α2,3, assim como glicanos com ligações em N (N-glicanos) sialilados em α2,6 e α2,3 aumentou durante o processo de diferenciação das moDCs. Contribuindo para esta nova configuração glicosídica, três sialiltransferases (STs) poderão estar envolvidas: a ST6Gal-1 correlaciona-se com a expressão aumentada de N-glicanos sialilados em α2,6; a ST3Gal-1 contribui para a sialilação em α2,3 de O-glicanos, em especial de antigénios T; e a ST3Gal-4 poderá ser responsável pelo aumento de N-glicanos sialilados em α2,3. Após estímulo e consequente maturação das moDCs, ambos os níveis de expressão génica de ST6Gal-1 e ST3Gal-4 são negativamente modificados sendo, também, que a expressão de ST3Gal-1 varia consoante o estímulo. 2) Estudámos posteriormente as consequências da modulação dos ácidos siálicos de superfície nas funções das DCs. Observámos que a remoção dos ácidos siálicos de superfície diminui significativamente a capacidade de macropinocitose e endocitose mediada por receptores nas moDCs. Em contrapartida, o tratamento com sialidase aumentou significativamente a capacidade das moDCs para fagocitar Escherichia coli. Determinou-se também que este mecanismo requer a existência de ácido siálico presente nas E. coli indicando um mecanismo de interacção hospedeiro-patogénio dependente de ácido siálico em ambas as partes envolvidas. As moDCs tratadas com sialidase também apresentam um nível superior de expressão de moléculas de MHC e moléculas co-estimulatórias, sugerindo um fenótipo celular mais maduro. Recorrendo ao modelo de ratinho, utilizaram-se DCs derivadas de células da medula (BMDCs) de ratinhos deficientes em ST3Gal-1 e ST6Gal-1. Estes ensaios revelaram que quer a endocitose quer a maturação são influenciadas por modificações 37 nos glicanos sialilados em α2,3 ou α2,6. A detecção e quantificação de proteínas Nglicosiladas e sialiladas em α2,6 apontou para um potencial envolvimento de integrinas β2 nestes mecanismos. 3) O efeito da sialilação em α2,6 na migração das DCs para os gânglios linfáticos foi também analisado. Observámos que BMDCs deficientes para ST6Gal-1 apresentam uma redução de cerca de 50% nos níveis de migração das DCs para os gânglios linfáticos, tal como aferido em ensaios de inflamação in situ e estudos de transferência adoptiva de células. Uma redução dos níveis deste tipo de migração foi também observada quando BMDCs nativas foram transferidas para ratinhos receptores deficientes em ST6Gal-1. São, contudo, necessários mais ensaios de forma a identificar as moléculas envolvidas neste processo. 4) Por último, analisámos o impacto da sialilação na estimulação antigénica das DCs às células T. Assim, concluiu-se que moDCs tratadas com sialidase apresentam um nível de expressão superior de IL-12, TNF-ɑ, IL-6 e IL-10, e activação do factor de transcrição nuclear kappa B (NF-κB). As DCs tratadas com sialidase induziram uma maior proliferação nas células T, com expressão correspondente de interferão-γ. Este dado sugere que a remoção de ácidos siálicos de superfície contribui para o desenvolvimento de uma resposta pro-inflamatória do tipo 1 por células T auxiliares (resposta Th1). Considerando estes dados no seu todo, concluímos que o ácido siálico tem um papel marcante nas funções imunes das DCs. Alterações à concentração de ácido siálico à superfície das células podem alterar a endocitose/fagocitose, maturação, migração para os tecidos e gânglios linfáticos e capacidade estimulatória para com as células T. Complementando estes dados, as ligações glicosídicas de ácidos siálicos criados por ST6Gal-1 e ST3Gal-1 são funcionalmente relevantes. A modulação programada da sialilação do glicocálice, mediada por sialidases individuais ou sialiltransferases é uma possibilidade aceitável para a melhoria da fagocitose por DCs e da sua potência imunológica. Este facto tem um significado particular para imunoterapias baseadas em DCs, podendo provar-se decisivo para a sua eficiência e aplicabilidade num futuro muito próximo.-------------------------------ABSTRACT: Glycans decorating cell surface and secreted proteins and lipids occupy the junction where critical host–host and host-pathogen interactions occur. In spite of the wide acceptance that glycans are centrally implicated in immunity, exactly how glycans and their variety and variability contribute to the overall immune response remains poorly defined. Glycans, frequently terminated by sialic acid residues, may be modified by external factors such as pathogens or upon specific physiological cellular events. The terminal, privileged positions of sialic acid-modified structures makes them key, fundamental determinants for a number of immune receptors with known involvement in cellular adhesiveness and cell trafficking, such as Selectins and Siglecs, with known relevant immune functions. At the time this thesis was initiated, it was established that sialic acids expressed at cell surface could modulate important mechanisms of the adaptive immune responses. Given the key role of dendritic cells (DCs) in the transition from innate to the adaptive immune responses, we anticipated that sialic acids could also modulate important mechanisms of human DCs. DCs have a relevant role in antigen screening and uptake, migration to lymph nodes and antigen presentation to lymphocytes, ultimately triggering the adaptive immune response. Therefore, our primary hypothesis was that sialic acids may modulate DC functions, such as antigen uptake, maturation, homing to lymph nodes and antigen presentation to T cells. To test this hypothesis, we divided our work in four parts. 1) Surface sialylated glycans expressed during differentiation from human monocytes to DCs (moDCs) were analyzed. Our data showed that α2,3-sialylated O-glycans and α2,6- and α2,3-sialylated N-glycans expression increased during moDC differentiation. Three main sialyltransferases (STs) are committed with this new glycan configuration: ST6Gal- 1 correlates with the increased expression of α2,6-sialylated N-glycans; ST3Gal-1 32 contributes for the α2,3-sialylation of O-glycans, especially T antigens; and ST3Gal-4 may contribute for the increased α2,3-sialylated N-glycans. Upon moDC maturation, ST6Gal-1 and ST3Gal-4 are downregulated and ST3Gal-1 is altered in a stimulus dependent manner. 2) We subsequently analyzed the consequences of the modulation of cell surface sialic acids in DC functions. We observed that removing surface sialic acid by sialidase significantly decreased the capacity of moDCs to micropinocytose and receptormediated endocytose. In contrast, treatment with a sialidase significantly improved the capacity of moDCs to phagocytose Escherichia coli. The improved phagocytosis mechanism required E. coli sialic acids, indicating a mechanism of host–pathogen interaction dependent on sialic acid moieties. Sialidase-treated moDCs have increased expression of MHC and co-stimulatory molecules, suggesting a more mature phenotype. Experiments using mouse bone marrow-derived DCs (BMDCs) from ST3Gal-1-/- and ST6Gal-1-/- strains indicated that endocytosis and maturation are influenced by changes in either α2,3 or α2,6-sialylated glycans. The analysis of α2,6-sialylated, N-glycosylated proteins, strongly suggested the potential involvement of β2 integrins, underlying these mechanisms. 3) The effect of α2,6-sialylation in DC homing to lymph nodes was also analyzed. We observed that BMDCs deficient for ST6Gal-1 have an almost 50% reduction in DC homing, as assayed by in situ inflammation and adoptive transfer studies. A reduction in DC homing was also observed when wild type BMDCs were transferred into ST6Gal-1-/- recipient mice. Further investigations are necessary to identify the molecules involved in this process. 4) Finally, we also analyzed the impact of sialylation on DCs ability to prime T cells. Sialidase-treated moDCs show increased gene expression of IL-12, TNF-α, IL-6 and IL- 10 cytokines, and activation of the transcription factor nuclear factor-κB. Sialidase33 treated DCs induced a higher proliferative response of T cells with concomitant higher expression of interferon-γ, suggesting that the clearance of cell surface sialic acids contributes to the development of a T helper type 1 proinflammatory response. Together, our data strongly support sialic acid’s relevance in DC immune functions. Alterations of cell surface sialic acid content can alter the endocytosis/phagocytosis, maturation, migration/homing and the ability for T cell priming in human DCs. Moreover, sialic acid linkages created by ST6Gal-1 and ST3Gal-1 are functionally relevant. The engineering of cell surface sialylation, mediated by individual sialidases or sialyltransferases is a likely possibility to fine tune DC phagocytosis and immunological potency, with particular significance to DC-based therapies.

A conspiracy theory for clefts : the syntax and interpretation of cleft constructions

O objetivo final deste estudo é contribuir para a discussão sobre qual a medida em que conceitos semânticos e discursivos estão sintaticamente codificados. Mais especificamente, investiga-se se existe alguma correlação consistente entre alguns aspetos interpretativos e sintáticos de quatro construções clivadas do Português Europeu, e como se deve dar conta teoricamente destas potenciais correlações. As clivadas consideradas são as clivadas canónicas, as pseudoclivadas, as clivadas de é que e as clivadas de SER. Sintaticamente podemos distinguir dois tipos: clivadas bioracionais (canónicas e pseudoclivadas) e clivadas mono-oracionais (clivadas de é que e de SER). Todas as estruturas têm um constituinte clivado focalizado que pode constituir tanto um foco informacional como um foco contrastivo, e uma oração clivada que introduz uma pressuposição existencial. Adicionalmente, o constituinte clivado identifica exaustivamente uma posição vazia na oração clivada. Adota-se a semântica alternativa para o foco (Rooth 1985), segundo a qual o foco entoacional contribui uniformemente um conjunto de alternativas na Forma Lógica. Regras pragmáticas operando neste conjunto dão origem a duas implicaturas que podem ser suspensas: pressuposição existencial e exaustividade. Dado que as clivadas de é que e as de SER têm a mesma interpretação que orações não-clivadas, conclui-se que a sua estrutura sintática particular não contribui para estas propriedades interpretativas. Em contrapartida, as clivadas bioracionais, que são orações copulativas especificacionais, têm uma presuposição existencial e uma interpretação exaustiva que não pode ser suspensa, tal como as orações especificacionais não-clivadas. Argumenta-se que isto se deve ao facto de o constituinte clivado identificar uma variável introduzida por uma descrição definida. Demonstra-se que a oração clivada, uma relativa em posição de complemento de um determinador definido nas clivadas canónicas e uma relativa livre nas pseudoclivadas, tem a mesma denotação que um DP definido, e portanto tem uma pressuposição existencial inerente. A interpretação exaustiva deve-se à relação identificacional entre o constituinte clivado e a descrição definida. Além disso, defende-se que em Português Europeu um traço de foco não desencadeia movimento-A’ para um FocP especializado. Os constituintes focalizados movem-se antes por razões independentes do foco. Isto é confirmado pelo facto de apenas o constituinte clivado das clivadas de é que ter propriedades de movimento A’, os outros parecem estar in situ. Propõe-se que o constituinte clivado das clivadas de é que é um tópico com um traço de foco que se move para um TopP. Esta análise dá conta da existência de restrições discursivas semelhantes para tópicos não focalizados e para o constituinte clivado das clivadas de é que. O traço quantificacional de foco arrastado pela topicalização dá origem a efeitos de intervenção, causando a não-recursividade do foco na periferia esquerda e a sua incompatibilidade com movimento de outros constituintes com traços quantificacionais. A análise prediz as restrições de encaixe observadas para as clivadas de é que. Finalmente, desenvolve-se uma análise sintática das clivadas de SER que aproxima estas estruturas das estruturas com partículas de foco. Propõe-se que a cópula é um operador sensível ao foco que é merged juntamente com o constituinte clivado. As restrições distribucionais da cópula devem-se a requisitos selecionais de núcleos.

Da gestão da informação à gestão do conhecimento: uma proposta para a e-Administração em Portugal

O trabalho proposto tem como objetivo apresentar um projeto de elaboração de um sistema de informação que visa gerir o desenvolvimento de uma ontologia promovida pelo organismo de coordenação da política arquivística para a classificação e avaliação da informação na Administração Central e Local, em Portugal. Entre os produtos propostos a partir do referido sistema, conta-se um website no qual é possível consultar toda a informação contida na ontologia, bem como descarregar versões da mesma, com níveis diferentes de semântica. A referida ontologia foi promovida pelo órgão coordenador da política arquivística portuguesa, e tem por base uma Lista consolidada (LC) de processos de processos de negócio da Administração Pública (AP). Esta lista de natureza incremental e colaborativa foi desenvolvida a partir da identificação de uma macroestrutura representativa das funções exercidas pela AP, a Macroestrutura Funcional (MEF). Concretizado este produto e colocado à disposição da comunidade, na página oficial da Direção-Geral do Livro, dos Arquivos e das Bibliotecas (DGLAB), importa potenciar a sua aplicabilidade. Neste sentido, encontra-se em curso um projeto que envolve os autores, em contexto universitário, orientado para o desenvolvimento de um vocabulário formal, um modelo de dados que represente este conjunto de conceitos referentes aos processos de negócio e aos relacionamentos entre eles. Pretende-se que esta ontologia possa vir a ser disponibilizada em listas ou diretórios de ontologias com mecanismos de pesquisa (bibliotecas de ontologias) de modo a incrementar a sua utilização na web semântica, para além da sua utilização como esquema de classificação em sistemas eletrónicos de gestão de arquivos (SEGA), businesse intelligence systems e sistemas de gestão do conhecimento. Com esta comunicação pretende-se dar a conhecer à comunidade de profissionais um projeto de aplicação transversal para todas as entidades públicas e para as empresas com interesse na área.

The role of deviant-letter position in cognate word processing

Dissertação de mestrado integrado em Psicologia

Metodologias facilitadoras da criatividade em design de moda: uma experiência académica

Este artigo descreve a experiência prática de um trabalho realizado em sala de aula, que trata de agregar técnicas facilitadoras do desenvolvimento da criatividade, num processo de criação de moda. O método usado foi adaptado para o design de moda, através da utilização das técnicas de “brainstorming”, “mapas mentais” e “painéis semânticos” conjugados num exercício prático-experimental de criatividade. O objetivo deste estudo consiste em analisar o desempenho criativo dos alunos e as possibilidades resultantes da utilização e adaptação de tais metodologias de criatividade em design de moda.