Efecto de la adición de ingredientes funcionales en el comportamiento reológico y la textura de puré de patata (Cv. Kennebec) fresco y congelado

El interés creciente en encontrar alimentos precocinados congelados que se asemejen a productos naturales, capaces de superar un procesado con el menor daño, ha generado un aumento en el estudio de nuevos productos en este campo de la investigación. Las características de cada matriz alimentaria, la composición y estructura de los ingredientes, así como el efecto de las interacciones entre ellos, modifica la textura, estructura y las propiedades físicas y sensoriales del alimento, así como su aceptación por el consumidor. En este contexto, la investigación realizada en esta tesis doctoral se ha llevado a cabo en puré de patata considerado como una matriz alimentaria semisólida y se ha centrado en analizar los efectos de la concentración y modificación de la composición en las propiedades reológicas y de textura, en las propiedades físico-químicas y estructurales, así como en los atributos sensoriales de los purés de patata cuando a estos se le añaden diferentes ingredientes funcionales como fibra de guisante, inulina, aceite de oliva, aislado de proteína de soja, ácidos grasos omega 3 y/o sus mezclas. Para ello, se han realizado cuatro estudios donde se determinan las propiedades reológicas mediante ensayos dinámicos oscilatorios y en estado estacionario, los parámetros instrumentales de textura mediante ensayos de extrusión inversa y de penetración cónica, además de los cambios estructurales a través de cromatografía iónica con detector de pulsos amperométrico, cromatografía de gases con detector de ionización de llama y microscopía electrónica de barrido. Conjuntamente, se han evaluado los atributos sensoriales de los diferentes purés generando los descriptores que mejor definen la calidad sensorial del producto, utilizando un panel de jueces entrenados y valorándose la aceptación global de los nuevos productos mediante un panel de consumidores. En un primer estudio, el puré de patata natural congelado elaborado con crioprotectores se enriqueció con fibra dietética insoluble (fibra de guisante), fibra dietética soluble (inulina) y sus mezclas. La fibra de guisante influyó significativa y negativamente en la textura del puré de patata, percibiéndose en el producto un incremento de la dureza y de la arenosidad, mientras que la inulina produjo un ablandamiento del sistema. En un segundo estudio, el puré de patata natural fresco y congelado/descongelado elaborado con y sin crioprotectores, se enriqueció con fibra dietética soluble (inulina), aceite de oliva virgen extra y sus mezclas. La adición de estos dos ingredientes generó un ablandamiento de la matriz del sistema, produciéndose, sin embargo, un efecto sinérgico entre ambos ingredientes funcionales. La inulina tuvo un efecto más significativo en la viscosidad aparente del producto, mientras que el aceite de oliva virgen extra afectó más significativamente a la pseudoplasticidad, al índice de consistencia y a la viscosidad plástica del mismo. El proceso de congelación y descongelación utilizado favoreció la reducción del tamaño de las partículas de inulina haciéndolas imperceptibles al paladar, obteniéndose productos más cremosos y con mayor aceptabilidad global que sus homólogos frescos. En un tercer estudio, el puré de patata natural fresco y congelado/descongelado elaborado con crioprotectores se enriqueció con mezclas de fibra dietética soluble (inulina) y aislado de proteína de soja. Los resultados demostraron que el ciclo de congelación y descongelación realizado no afecta el grado de polimerización de la inulina. La estructura química de la inulina tampoco se vio afectada por la incorporación de la soja. El proceso de congelación/descongelación, así como la adición de concentraciones altas de inulina y bajas de aislado de proteína de soja, favorecen la disminución de la contribución de la componente viscosa en las propiedades viscoelásticas del puré de patata. La cremosidad fue el único atributo sensorial que presentó una correlación lineal significativa entre las puntuaciones otorgadas por panelistas entrenados y no entrenados. Por último, se elaboró un puré de patata natural fresco y congelado/descongelado optimizado con crioprotectores y enriquecido con la suma de ácido docosahexaenoico (DHA, C22:6 n-3) y ácido eicosapentaenoico (EPA, C20:5 n-3) y con ácido α-linolénico (ALA, C18:3 n-3) microencapsulados. El ciclo de congelación y descongelación no afectó al perfil de ácidos grasos del puré de patata. La adición de omega 3 procedente de aceites de lino y pescado microencapsulados mejora los indicadores nutricionales que definen la calidad de la grasa, obteniéndose un producto más saludable. ABSTRACT The growing interest in finding frozen precooked products that are like a natural product and capable of withstanding initial processing with minimum damage and remaining stable during preservation and reheating prior to consumption has generated an increase in studies of new products in this field of research. The characteristics of each food matrix, the composition and structure of the ingredients and the effect of interactions between them alter the texture, structure and physical and sensory properties of the food product and its acceptance by the consumer. In this context, the research conducted in this doctoral thesis was carried out on mashed potato, considered as a semi-solid food matrix, and focused on analysing the effects of concentration and modification of the composition of the mashed potato matrix on the rheological and textural properties, physicochemical and structural properties and sensory attributes of mashed potato when various functional ingredients are added to it, such as pea fibre, inulin, olive oil, soy protein isolate, omega 3 fatty acids and/or mixtures of these ingredients. Four studies were conducted for this purpose. Rheological properties were determined by oscillatory dynamic tests and stationary state tests, and instrumental texture parameters by backward extrusion and cone penetration tests. Structural changes were studied by ion chromatography with pulsed amperometric detector, gas chromatography with flame ionisation detector and scanning electron microscopy. The sensory attributes of the various mashed potato mixtures were evaluated by generating the descriptors that best defined the sensory quality of the products and using a panel of trained judges, and overall acceptance of the new products was evaluated by a panel of consumers. In the first study, frozen natural mashed potato incorporating cryoprotectants was enriched with insoluble dietary fibre (pea fibre), soluble dietary fibre (inulin) and mixtures of the two. Pea fibre had a significant negative influence on the texture of the mashed potato, producing an increase in hardness and granularity, whereas inulin produced a softening of the system. In the second study, fresh and frozen/thawed natural mashed potato prepared with and without cryoprotectants was enriched with soluble dietary fibre (inulin), extra virgin olive oil and mixtures of the two. The addition of these two ingredients generated softening of the matrix of the system, but a synergic effect between the two functional ingredients was produced. Inulin had a more significant effect on the apparent viscosity of the product, whereas extra virgin olive oil had a more significant effect on its pseudoplasticity, consistency index and plastic viscosity. The freezing and thawing process that was used contributed to a reduction in the size of the inulin particles, making them imperceptible to the palate and producing creamier products with greater overall acceptability than their fresh equivalents. In the third study, the fresh and frozen/thawed natural mashed potato incorporating cryoprotectants was enriched with mixtures of soluble dietary fibre (inulin) and soy protein isolate. The results showed that the freezing and thawing process that was performed did not affect the degree of polymerisation of the inulin. The chemical structure of the inulin was also not affected by the incorporation of soy. The freezing and thawing process and the addition of high concentrations of inulin and low concentrations of soy protein isolate favoured a decrease in the contribution of the viscous component to the viscoelastic properties of the mashed potato. Creaminess was the only sensory attribute that presented a significant linear correlation between the scores given by trained and untrained panellists. Lastly, fresh and frozen/thawed natural mashed potato optimised with cryoprotectants was prepared and enriched with the sum of docosahexaenoic acid (DHA, C22:6 n-3) and eicosapentaenoic acid (EPA, C20:5 n-3) and with α-linolenic acid (ALA, C18:3 n-3), microencapsulated. The freezing and thawing process did not affect the fatty acid profile of the mashed potato. The addition of omega 3 obtained from microencapsulated linseed and fish oils improved the nutritional indicators that define the quality of the fat, producing a healthier product.

Influence of origin of the beans on protein quality and nutritive value of commercial soybean meals

Estudio sobre la influencia del origen de los granos en la calidad de proteínas y el valor nutritivo de las harinas de soja comerciales

Nutritive value and protein quality of soybean meals according to origin and crop year

Resultados de la investigación sobre el valor nutritivo y calidad de la proteína de la alimentación basada en soja en función del origen y del año de la recolección.

Variation among origins in nutrient composition and protein quality of soybean meals

Investigación sobre las variaciones en la composición y en la calidad de las proteinas de la alimentación animal basada en la soja en función de los orígenes

Contaminación y efectos secundarios en suplementos deportivos (proteínas, aminoácidos, creatina y suplementos para la pérdida de peso).

En muchos países la producción de suplementos deportivos no está correctamente regulada a nivel gubernamental. Esto implica la posibilidad de que los ingredientes declarados como componentes del producto no concuerden con los que se indican en la etiqueta del mismo. La literatura ha descrito casos de doping positivo debido a que las sustancias no declaradas en las etiquetas de dichos suplementos se encuentran en la lista de sustancias prohibidas. Este Trabajo Fin de Grado tiene por objetivo realizar una revisión bibliográfica de los estudios y/o análisis que clarifiquen qué suplementos de proteínas, aminoácidos, creatina y orientados a la pérdida de peso y qué marcas o laboratorios son los más fiables y los que no tanto. Dicho estudio se ha enfocado a suplementos que se consumen tanto en el alto rendimiento como a nivel recreativo y social, donde el desconocimiento en este sentido es mucho mayor. También se expondrán los efectos secundarios asociados a su contaminación y/o a su uso inapropiado. ABSTRACT In many countries, the production of sport supplements is not properly regulated by the government. This means that it is possible the ingredients do not match the label claims. In some cases, undeclared substances contained in supplements may include some that are banned by anti-doping laws. This End of Degree Project aims to make a literature review of studies and / or analysis which clarify what kind of protein, amino acids, creatine and fat loss supplements and which brands or laboratories are less reliable, as well as to inform those that do are, not only in high performance sport, but also at the social and recreational level, where the lack of knowledge in this sense is much higher. Also, associated side effects to such contamination and inappropriate use found in the review will be exposed.

Estudio Multimodal de la Funcionalidad Cortical en ratones Transgénicos con Síndrome X Frágil y la modulación del dolor

El dolor es un síntoma frecuente en la práctica médica. En España, un estudio realizado en el año 2000 demostró que cada médico atiende un promedio de 181 pacientes con dolor por mes, la mayoría de ellos con dolor crónico moderado1. Del 7%-8% de la población europea está afectada y hasta el 5% puede ser grave2-3, se estima, que afecta a más de dos millones de españoles4. En la consulta de Atención Primaria, los pacientes con dolor neuropático tienen tasas de depresión mucho mayores 5-6-7. El dolor neuropático8 es el dolor causado por daño o enfermedad que afecta al sistema somato-sensorial, es un problema de salud pública con un alto coste laboral, debido a que existe cierto desconocimiento de sus singularidades, tanto de su diagnóstico como de su tratamiento, que al fallar, el dolor se perpetúa y se hace más rebelde a la hora de tratarlo, en la mayoría de las ocasiones pasa a ser crónico. Los mecanismos fisiopatológicos son evolutivos, se trata de un proceso progresivo e integrado que avanza si no recibe tratamiento, ocasionando graves repercusiones en la calidad de vida de los pacientes afectados9. De acuerdo a Prusiner (premio nobel de medicina 1997), en todas las enfermedades neurodegenerativas hay algún tipo de proceso anormal de la función neuronal. Las enfermedades neurodegenerativas son la consecuencia de anormalidades en el proceso de ciertas proteínas que intervienen en el ciclo celular, por lo tanto da lugar al cúmulo de las mismas en las neuronas o en sus proximidades, disminuyendo o anulando sus funciones, como la enfermedad de Alzheimer y el mismo SXF. La proteína FMRP (Fragile Mental Retardation Protein), esencial para el desarrollo cognitivo normal, ha sido relacionada con la vía piramidal del dolor10-11-12. El Síndrome de X Frágil13-14 (SXF), se debe a la mutación del Gen (FMR-1). Como consecuencia de la mutación, el gen se inactiva y no puede realizar la función de sintetizar la proteína FMRP. Por su incidencia se le considera la primera causa de Deficiencia Mental Hereditaria sólo superada por el Síndrome de Down. La electroencefalografía (EEG) es el registro de la actividad bioeléctrica cerebral que ha traído el desarrollo diario de los estudios clínicos y experimentales para el descubrimiento, diagnóstico y tratamiento de un gran número de anormalidades neurológicas y fisiológicas del cerebro y el resto del sistema nervioso central (SNC) incluyendo el dolor. El objetivo de la presente investigación es por medio de un estudio multimodal, desarrollar nuevas formas de presentación diagnóstica mediante técnicas avanzadas de procesado de señal y de imagen, determinando así los vínculos entre las evaluaciones cognitivas y su correlación anatómica con la modulación al dolor presente en patologías relacionadas con proteína FMRP. Utilizando técnicas biomédicas (funcionalestructural) para su caracterización. Para llevar a cabo esta tarea hemos utilizado el modelo animal de ratón. Nuestros resultados en este estudio multimodal demuestran que hay alteraciones en las vías de dolor en el modelo animal FMR1-KO, en concreto en la modulación encefálica (dolor neuropático), los datos se basan en los resultados del estudio estructural (imagen histología), funcional (EEG) y en pruebas de comportamiento (Laberinto de Barnes). En la Histología se muestra una clara asimetría estructural en el modelo FMR1 KO con respecto al control WT, donde el hemisferio Izquierdo tiene mayor densidad de masa neuronal en KO hembras 56.7%-60.8%, machos 58.3%-61%, en WT hembras 62.7%-62.4%, machos 55%-56.2%, hemisferio derecho-izquierdo respectivamente, esto refleja una correlación entre hemisferios muy baja en los sujetos KO (~50%) con respecto a los control WT (~90%). Se encontró correlación significativa entre las pruebas de memoria a largo plazo con respecto a la asimetría hemisférica (r = -0.48, corregido <0,05). En el estudio de comportamiento también hay diferencias, los sujetos WT tuvieron 22% un de rendimiento en la memoria a largo plazo, mientras que en los machos hay deterioro de memoria de un 28% que se corresponden con la patología en humanos. En los resultados de EEG estudiados en el hemisferio izquierdo, en el área de la corteza insular, encuentran que la latencia de la respuesta al potencial evocado es menor (22vs32 15vs96seg), la intensidad de la señal es mayor para los sujetos experimentales FMR1 KO frente a los sujetos control, esto es muy significativo dados los resultados en la histología (140vs129 145vs142 mv). Este estudio multimodal corrobora que las manifestaciones clínicas del SXF son variables dependientes de la edad y el sexo. Hemos podido corroborar en el modelo animal que en la etapa de adulto, los varones con SXF comienzan a desarrollar problemas en el desempeño de tareas que requieren la puesta en marcha de la función ejecutiva central de la memoria de trabajo (almacenamiento temporal). En el análisis del comportamiento es difícil llegar a una conclusión objetiva, se necesitan más estudios en diferentes etapas de la vida corroborados con resultados histológicos. Los avances logrados en los últimos años en su estudio han sido muy positivos, de tal modo que se están abriendo nuevas vías de investigación en un conjunto de procesos que representan un gran desafío a problemas médicos, asistenciales, sociales y económicos a los que se enfrentan los principales países desarrollados, con un aumento masivo de las expectativas de vida y de calidad. Las herramientas utilizadas en el campo de las neurociencias nos ofrecen grandes posibilidades para el desarrollo de estrategias que permitan ser utilizadas en el área de la educación, investigación y desarrollo. La genética determina la estructura del cerebro y nuestra investigación comprueba que la ausencia de FMRP también podría estar implicada en la modulación del dolor como parte de su expresión patológica siendo el modelo animal un punto importante en la investigación científica fundamental para entender el desarrollo de anormalidades en el cerebro. ABSTRACT Pain is a common symptom in medical practice. In Spain, a study conducted in 2000 each medical professional treats an average of 181 patients with pain per month, most of them with chronic moderate pain. 7% -8% of the European population is affected and up to 5% can be serious, it is estimated to affect more than two million people in Spain. In Primary Care, patients with neuropathic pain have much higher rates of depression. Neuropathic pain is caused by damage or disease affecting the somatosensory system, is a public health problem with high labor costs, there are relatively unfamiliar with the peculiarities in diagnosis and treatment, failing that, the pain is perpetuated and becomes rebellious to treat, in most cases becomes chronic. The pathophysiological mechanisms are evolutionary, its a progressive, if untreated, causing severe impact on the quality of life of affected patients. According to Prusiner (Nobel Prize for Medicine 1997), all neurodegenerative diseases there is some abnormal process of neuronal function. Neurodegenerative diseases are the result of abnormalities in the process of certain proteins involved in the cell cycle, reducing or canceling its features such as Alzheimer's disease and FXS. FMRP (Fragile Mental Retardation Protein), is essential for normal cognitive development, and has been linked to the pyramidal tract pain. Fragile X Syndrome (FXS), is due to mutation of the gene (FMR-1). As a consequence of the mutation, the gene is inactivated and can not perform the function of FMRP synthesize. For its incidence is considered the leading cause of Mental Deficiency Hereditary second only to Down Syndrome. Electroencephalography (EEG) is the recording of bioelectrical brain activity, is a advancement of clinical and experimental studies for the detection, diagnosis and treatment of many neurological and physiological abnormalities of the brain and the central nervous system, including pain. The objective of this research is a multimodal study, is the development of new forms of presentation using advanced diagnostic techniques of signal processing and image, to determine the links between cognitive evaluations and anatomic correlation with pain modulation to this protein FMRP-related pathologies. To accomplish this task have used the mouse model. Our results in this study show alterations in multimodal pain pathways in FMR1-KO in brain modulation (neuropathic pain), the data are based on the results of the structural study (histology image), functional (EEG) testing and behavior (Barnes maze). Histology In structural asymmetry shown in FMR1 KO model versus WT control, the left hemisphere is greater density of neuronal mass (KO females 56.7% -60.8%, 58.3% -61% males, females 62.7% -62.4 WT %, males 55% -56.2%), respectively right-left hemisphere, this reflects a very low correlation between hemispheres in KO (~ 50%) subjects compared to WT (~ 90%) control. Significant correlation was found between tests of long-term memory with respect to hemispheric asymmetry (r = -0.48, corrected <0.05). In the memory test there are differences too, the WT subjects had 22% yield in long-term memory, in males there memory impairment 28% corresponding to the condition in humans. The results of EEG studied in the left hemisphere, in insular cortex area, we found that the latency of the response evoked potential is lower (22vs32 15vs96seg), the signal strength is higher for the experimental subjects versus FMR1 KO control subjects, this is very significant given the results on histology (140vs129 145vs142 mv). This multimodal study confirms that the clinical manifestations of FXS are dependent variables of age and sex. We have been able to corroborate in the animal model in the adult stage, males with FXS begin developing problems in the performance of tasks that require the implementation of the central executive function of working memory (temporary storage). In behavior analysis is difficult to reach an objective conclusion, more studies are needed in different life stages corroborated with histologic findings. Advances in recent years were very positive, being opened new lines of research that represent a great challenge to physicians, health care, social and economic problems facing the major developed countries, with a massive increase in life expectancy and quality. The tools used in the field of neuroscience offer us great opportunities for the development of strategies to be used in the area of education, research and development. Genetics determines the structure of the brain and our research found that the absence of FMRP might also be involved in the modulation of pain as part of their pathological expression being an important animal model in basic scientific research to understand the development of abnormalities in brain.

Expresión de la resistencia en plantas de tomate a nematodos formadores de nódulos (Meloidogyne javanica)

La resistencia genética mediada por los genes R es uno de los sistemas de defensa de las plantas frente a patógenos y se activa una vez que los patógenos han superado la defensa basal que otorgan la cutícula y pared celular. Los mecanismos de resistencia genética se inician a su vez, por el reconocimiento de productos derivados de genes de avirulencia de los patógenos (avr) por parte de las proteínas R. Tanto la respuesta de defensa basal como la respuesta de defensa por genes R están influenciadas por patrones de regulación hormonal, que incluye a las principales hormonas vegetales ácido salicílico (SA), ácido jasmónico (JA) y etileno (ET). En tomate (Solanum lycopersicum) uno de los genes R es el gen MiG1, que confiere resistencia a nematodos formadores de nódulos (Meloidogyne javanica, M. incognita y M. arenaria). Uno de los eventos más importantes que caracterizan a la respuesta de resistencia es la reacción hipersensible (HR), que está mediada por la activación temprana de una serie de sistemas enzimáticos, entre los que destaca el de las peroxidasas (PRXs) Clase III. Su función es importante tanto para limitar el establecimiento y expansión del nematodo, al generar ambientes altamente tóxicos por su contribución en la producción masiva de ROS, como por su implicación en la síntesis y depósito de lignina generando barreras estructurales en el sitio de infección. Además de estos mecanismos de defensa asociados a la resistencia constitutiva, las plantas pueden desarrollar resistencia sistémica adquirida (SAR) que en la naturaleza ocurre, en ocasiones, en una fase posterior a que la planta haya sufrido el ataque de un patógeno. Así mismo hay diferentes productos de origen químico como el benzotiadiazol o BTH (ácido S-metil benzol-(1,2,3)-tiadiozole-7-carbónico ester) que pueden generar esta misma respuesta SAR. Como resultado, la planta adquiere resistencia sistémica frente a nuevos ataques de patógenos. En este contexto, el presente trabajo aborda en primer lugar el análisis comparativo, mediante microarrays de oligonucleótidos, de los transcriptomas de los sistemas radicales de plantas de tomate de 8 semanas de edad de dos variedades, una portadora del gen de resistencia MiG1 (Motelle) y otra carente del mismo y, por tanto, susceptible (Moneymaker), antes y después de la infección por M. javanica. Previo a la infección se observó que la expresión de un gran número de transcritos era más acusada en la variedad resistente que en la susceptible, entre ellos el propio gen MiG1 o los genes PrG1 (o P4), LEJA1 y ER24, lo que indica que, en ausencia de infección, las rutas hormonales del SA, JA y ET están más activas en la raíz de la variedad resistente. Por el contrario, un número mucho menor de transcritos presentaban su expresión más reducida en Motelle que en Moneymaker, destacando un gen de señalización para sintetizar la hormona giberelina (GA). La infección por M. javanica causa importantes cambios transcripcionales en todo el sistema radical que modifican sustancialmente las diferencias basales entre plantas Motelle y Moneymaker, incluida la sobreexpresión en la variedad resistente de los transcritos de MiG1, que se reduce parcialmente, mientras que las rutas hormonales del SA y el JA continuan más activas que en la susceptible (evidente por los genes PrG1 y LEJA1). Además, los cambios asociados a la infección del nematodo se evidencian por las grandes diferencias entre los dos tiempos post-infección considerados, de tal forma que en la fase temprana (2 dpi) de la interacción compatible predomina la sobreexpresión de genes de pared celular y en la tardía (12 dpi) los relacionados con el ARN. En el análisis de la interacción incompatible, aunque también hay muchas diferencias entre ambas fases, hay que destacar la expresión diferencial común de los genes loxA y mcpi (sobrexpresados) y del gen loxD (reprimido) por su implicación en defensa en otras interacciones planta-patógeno. Cabe destacar que entre las interacciones compatible e incompatible hubo muy pocos genes en común. En la etapa temprana de la interacción compatible destacó la activación de genes de pared celular y la represión de la señalización; en cambio, en la interacción incompatible hubo proteínas principalmente implicadas en defensa. A los 12 días, en la interacción compatible los genes relacionados con el ARN y la pared celular se sobreexpresaban principalmente, y se reprimían los de proteínas y transporte, mientras que en la incompatible se sobreexpresaron los relacionados con el estrés, el metabolismo secundario y el de hormonas y se reprimieron los de ARN, señalización, metabolismo de hormonas y proteínas. Por otra parte, la técnica de silenciamiento génico VIGS reveló que el gen TGA 1a está implicado en la resistencia mediada por el gen MiG1a M. javanica. Así mismo se evaluó el transcriptoma de todo el sistema radical de la variedad susceptible tras la aplicación del inductor BTH, y se comparó con el transcriptoma de la resistente. Los resultados obtenidos revelan que el tratamiento con BTH en hojas de Moneymaker ejerce notables cambios transcripcionales en la raíz; entre otros, la activación de factores de transcripción Myb (THM16 y THM 27) y del gen ACC oxidasa. Las respuestas inducidas por el BTH parecen ser de corta duración ya que no hubo transcritos diferenciales comunes a las dos fases temporales de la infección comparadas (2 y 12 dpi). El transcriptoma de Moneymaker tratada con BTH resultó ser muy diferente al de la variedad resistente Motelle, ambas sin infectar, destacando la mayor expresión en el primero del gen LeEXP2, una expansina relacionada con defensa frente a nematodos. Las respuestas inducidas por los nematodos en Moneymaker-BTH también fueron muy distintas a las observadas previamente en la interacción incompatible mediada por MiG1, pues sólo se detectaron 2 genes sobreexpresados comunes a ambos eventos. Finalmente, se abordó el estudio de la expresión diferencial de genes que codifican PRXs y su relación con la resistencia en la interacción tomate/M. javanica. Para ello, se realizó en primer lugar el estudio del análisis del transcriptoma de tomate de la interacción compatible, obtenido en un estudio previo a partir de tejido radical infectado en distintos tiempos de infección. Se han identificado 16 unigenes de PRXs con expresión diferencial de los cuales 15 se relacionan por primera vez con la respuesta a la infección de nematodos. La mayoría de los genes de PRXs identificados, 11, aparecen fuertemente reprimidos en el sitio de alimentación, en las células gigantes (CG). Dada la implicación directa de las PRXs en la activación del mecanismo de producción de ROS, la supresión de la expresión génica local de genes de PRXs en el sitio de establecimiento y alimentación pone de manifiesto la capacidad del nematodo para modular y superar la respuesta de defensa de la planta de tomate en la interacción compatible. Posteriormente, de estos genes identificados se han elegido 4: SGN-U143455, SGN-U143841 y SGN-U144042 reprimidos en el sitio de infección y SGN-U144671 inducido, cuyos cambios de expresión se han determinado mediante análisis por qRT-PCR y de hibridación in situ en dos tiempos de infección (2 dpi y 4 dpi) y en distintos tejidos radicales de tomate resistente y susceptible. Los patrones de expresión obtenidos demuestran que en la interacción incompatible la transcripción global de los 4 genes estudiados se dispara en la etapa más temprana en el sitio de infección, detectándose la localización in situ de transcritos en el citoplasma de las células corticales de la zona meristemática afectadas por el nematodo. A 4 dpi se observó que los niveles de expresión en el sitio de infección cambian de tendencia y los genes SGN-U144671 y SGN-U144042 se reprimen significativamente. Los diferentes perfiles de expresión de los genes PRXs en los dos tiempos de infección sugieren que su inducción en las primeras 48 horas es crucial para la respuesta de defensa relacionada con la resistencia frente a la invasión del nematodo. Por último, al analizar el tejido radical sistémico, se detectó una inducción significativa de la expresión en la fase más tardía de la infección del gen SGN-U144042 en el genotipo susceptible y del SGN-U143841 en ambos genotipos. En este estudio se describe por primera vez la inducción de la expresión sistémica de genes de PRXs en tomate durante la interacción compatible e incompatible con M. javanica lo que sugiere su posible implicación funcional en la respuesta de defensa SAR activada por la infección previa del nematodo. ABSTRACT Plants defend themselves from pathogens by constitutive and/or induced defenses. A common type of induced defense involves plant resistance genes (R), which are normally activated in response to attack by specific pathogen species. Typically, a specific plant R protein recognizes a specific pathogen avirulence (avr) compound. This initiates a complex biochemical cascade inside the plant that results in synthesis of antipathogen compounds. This response can involve chemical signaling, transcription, translation, enzymes and metabolism, and numerous plant hormones such as salicylic acid (SA), jasmonates (JA) and ethylene (ET). Induced plant defense can also activate Class III peroxidases (PRXs), which produce reactive oxygen species (ROS), regulate extracellular H2O2, and play additional roles in plant defense. R-gene activation and the resulting induced defense often remain localized in the specific tissues invaded by the plant pathogen. In other cases, the plant responds by signaling the entire plant to produce defense compounds (systemic induction). Plant defense can also be induced by the exogenous application of natural or synthetic elicitors, such as benzol-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothionic acid. There is much current scientific interest in R-genes and elicitors, because they might be manipulated to increase agricultural yield. Scientists also are interested in systemic induction, because this allows the entire plant to be defended. In this context, one of the aims of this investigation was the transcriptoma analysis of the root systems of two varieties of tomato, the resistant variety (Motelle) that carrier MiG1 and the susceptible (Moneymaker) without MiG1, before and after infection with M. javanica. The overexpression was more pronounced in the transcriptoma of the resistant variety compared with susceptible, before infection, including the MiG1 gene, PrG1 (or P4) genes, LEJA1 and ER24, indicating that hormone SA, JA and ET are active in the resistant variety. Moreover, GA hormone presents an opposite behavior. M. javanica infection causes significant transcriptional changes in both compatible (Moneymaker-M. javanica) and incompatible (Motelle-M. javanica) interaction. In the incompatible transcriptome root system, was notably reduced the expression of the MiG1 gene, and a continuity in the expression of the hormonal pathways of SA and JA. In other hand, transcriptional profile changes during compatible interaction were associated with nematode infection. The large differences between the two times point infection considered (2 dpi and 12 dpi) indicates an overexpression of cell wall related genes in the first phase, and conversely an overexpression of RNA genes in the late phase. Transcriptoma analysis of incompatible interaction, although there were differences between the two phases, should be highlighted the common differential gene expression: loxA and mcpi (overexpressed) and loxD gene (suppressed), as they are involved in defenses in other plant-pathogen interactions. The VIGS tool has provided evidence that TGA 1a is involved in MiG1 mediated resistance to M. javanica. Likewise, the systemic application of BTH was assessed and compared with susceptible and resistant variety. Root system transcriptoma of BTH treatment on leaves showed the activation of Myb transcription factors (THM16 and THM27), the ACC oxidase gene. and the LeEXP2 gene, encoding for an expansin enzyme, related with defense against nematodes. The activation appears to be reduced by subsequent infection and establishment of nematodes. To assist in elucidate the role of tomato PRXs in plant defence against M. javanica, the transcriptome obtained previously from isolated giant cells (GC) and galls at 3 and 7 dpi from the compatible interaction was analysed. A total of 18 different probes corresponding to 16 PRX encoding genes were differentially expressed in infection site compared to the control uninfected root tissues. Most part of them (11) was down-regulated. These results yielded a first insight on 15 of the PRX genes responding to tomato–Meloidogyne interaction and confirm that repression of PRX genes might be crucial for feeding site formation at the initial stages of infection. To study the involvement of PRX genes in resistance response, four genes have been selected: SGN-U143455, SGN-U143841 and SGN-U144042 consistently down-regulated and SGN-U144671 consistently up-regulated at infection site in compatible interaction. The expression changes were determined by qRT-PCR and in situ location at 2 dpi and 4 dpi, and in different root tissues of resistant and susceptible plants. Early upon infection (2 dpi), the transcripts levels of the four genes were strongly increased in infected tissue of resistant genotype. In situ hybridization showed transcript accumulation of them in meristem cortical cells, where the nematode made injury. The results obtained provide strong evidence that early induction of PRX genes is important for defence response of the resistance against nematode invasion. Moreover, the induction patterns of SGN-U144042 gene observed at 4 dpi in distal noninfected root tissue into the susceptible genotype and of SGN-U143841 gene in both genotypes suggest a potential involvement of PRX in the systemic defence response.

Functional characterization of YODA, a mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MAP3K) that regulates a novel innate immunity pathway in Arabidopsis thaliana

Las cascadas de señalización mediadas por proteína quinasas activadas por mitógeno (MAP quinasas) son capaces de integrar y transducir señales ambientales en respuestas celulares. Entre estas señales se encuentran los PAMPs/MAMPs (Pathogen/Microbe-Associated Molecular Patterns), que son moléculas de patógenos o microorganismos, o los DAMPs (Damaged-Associated Molecular Patterns), que son moléculas derivadas de las plantas producidas en respuesta a daño celular. Tras el reconocimiento de los PAMPs/DAMPs por receptores de membrana denominados PRRs (Pattern Recognition Receptors), como los receptores con dominio quinasa (RLKs) o los receptores sin dominio quinasa (RLPs), se activan respuestas moleculares, incluidas cascadas de MAP quinasas, que regulan la puesta en marcha de la inmunidad activada por PAMPs (PTI). Esta Tesis describe la caracterización funcional de la MAP quinasa quinasa quinasa (MAP3K) YODA (YDA), que actúa como un regulador clave de la PTI en Arabidopsis. Se ha descrito previamente que YDA controla varios procesos de desarrollo, como la regulación del patrón estomático, la elongación del zigoto y la arquitectura floral. Hemos caracterizado un alelo mutante hipomórfico de YDA (elk2 o yda11) que presenta una elevada susceptibilidad a patógenos biótrofos y necrótrofos. Notablemente, plantas que expresan una forma constitutivamente activa de YDA (CA-YDA), con una deleción en el dominio N-terminal, presentan una resistencia de amplio espectro frente a diferentes tipos de patógenos, incluyendo hongos, oomicetos y bacterias, lo que indica que YDA juega un papel importante en la regulación de la resistencia de las plantas a patógenos. Nuestros datos indican que esta función es independiente de las respuestas inmunes mediadas por los receptores previamente caracterizados FLS2 y CERK1, que reconocen los PAMPs flg22 y quitina, respectivamente, y que están implicados en la resistencia de Arabidopsis frente a bacterias y hongos. Hemos demostrado que YDA controla la resistencia frente al hongo necrótrofo Plectosphaerella cucumerina y el patrón estomático mediante su interacción genética con la RLK ERECTA (ER), un PRR implicado en la regulación de estos procesos. Por el contrario, la interacción genética entre ER y YDA en la regulación de otros procesos de desarrollo es aditiva en lugar de epistática. Análisis genéticos indicaron que MPK3, una MAP quinasa que funciona aguas abajo de YDA en el desarrollo estomático, es un componente de la ruta de señalización mediada por YDA para la resistencia frente a P. cucumerina, lo que sugiere que el desarrollo de las plantas y la PTI comparten el módulo de transducción de MAP quinasas asociado a YDA. Nuestros experimentos han revelado que la resistencia mediada por YDA es independiente de las rutas de señalización reguladas por las hormonas de defensa ácido salicílico, ácido jasmónico, ácido abscísico o etileno, y también es independiente de la ruta de metabolitos secundarios derivados del triptófano, que están implicados en inmunidad vegetal. Además, hemos demostrado que respuestas asociadas a PTI, como el aumento en la concentración de calcio citoplásmico, la producción de especies reactivas de oxígeno, la fosforilación de MAP quinasas y la expresión de genes de defensa, no están afectadas en el mutante yda11. La expresión constitutiva de la proteína CA-YDA en plantas de Arabidopsis no provoca un aumento de las respuestas PTI, lo que sugiere la existencia de mecanismos de resistencia adicionales regulados por YDA que son diferentes de los regulados por FLS2 y CERK1. En línea con estos resultados, nuestros datos transcriptómicos revelan una sobre-representación en plantas CA-YDA de genes de defensa que codifican, por ejemplo, péptidos antimicrobianos o reguladores de muerte celular, o proteínas implicadas en la biogénesis de la pared celular, lo que sugiere una conexión potencial entre la composición e integridad de la pared celular y la resistencia de amplio espectro mediada por YDA. Además, análisis de fosfoproteómica indican la fosforilación diferencial de proteínas relacionadas con la pared celular en plantas CA-YDA en comparación con plantas silvestres. El posible papel de la ruta ER-YDA en la regulación de la integridad de la pared celular está apoyado por análisis bioquímicos y glicómicos de las paredes celulares de plantas er, yda11 y CA-YDA, que revelaron cambios significativos en la composición de la pared celular de estos genotipos en comparación con la de plantas silvestres. En resumen, nuestros datos indican que ER y YDA forman parte de una nueva ruta de inmunidad que regula la integridad de la pared celular y respuestas defensivas, confiriendo una resistencia de amplio espectro frente a patógenos. ABSTRACT Plant mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades transduce environmental signals and developmental cues into cellular responses. Among these signals are the pathogen- or microbe-associated molecular patterns (PAMPs or MAMPs) and the damage-associated molecular patterns (DAMPs). These PAMPs/DAMPs, upon recognition by plant pattern recognition receptors (PRRs), such as Receptor-Like Kinases (RLKs) and Receptor-Like Proteins (RLPs), activate molecular responses, including MAPK cascades, which regulate the onset of PAMP-triggered immunity (PTI). This Thesis describes the functional characterization of the MAPK kinase kinase (MAP3K) YODA (YDA) as a key regulator of Arabidopsis PTI. YDA has been previously described to control several developmental processes, such as stomatal patterning, zygote elongation and inflorescence architecture. We characterized a hypomorphic, non-embryo lethal mutant allele of YDA (elk2 or yda11) that was found to be highly susceptible to biotrophic and necrotrophic pathogens. Remarkably, plants expressing a constitutive active form of YDA (CA-YDA), with a deletion in the N-terminal domain, showed broad-spectrum resistance to different types of pathogens, including fungi, oomycetes and bacteria, indicating that YDA plays a relevant function in plant resistance to pathogens. Our data indicated that this function is independent of the immune responses regulated by the well characterized FLS2 and CERK1 RLKs, which are the PRRs recognizing flg22 and chitin PAMPs, respectively, and are required for Arabidopsis resistance to bacteria and fungi. We demonstrate that YDA controls resistance to the necrotrophic fungus Plectosphaerella cucumerina and stomatal patterning by genetically interacting with ERECTA (ER) RLK, a PRR involved in regulating these processes. In contrast, the genetic interaction between ER and YDA in the regulation of other ER-associated developmental processes was additive, rather than epistatic. Genetic analyses indicated that MPK3, a MAP kinase that functions downstream of YDA in stomatal development, also regulates plant resistance to P. cucumerina in a YDA-dependent manner, suggesting that the YDA-associated MAPK transduction module is shared in plant development and PTI. Our experiments revealed that YDA-mediated resistance was independent of signalling pathways regulated by defensive hormones like salicylic acid, jasmonic acid, abscisic acid or ethylene, and of the tryptophan-derived metabolites pathway, which are involved in plant immunity. In addition, we showed that PAMP-mediated PTI responses, such as the increase of cytoplasmic Ca2+ concentration, reactive oxygen species (ROS) burst, MAPK phosphorylation, and expression of defense-related genes are not impaired in the yda11 mutant. Furthermore, the expression of CA-YDA protein does not result in enhanced PTI responses, further suggesting the existence of additional mechanisms of resistance regulated by YDA that differ from those regulated by the PTI receptors FLS2 and CERK1. In line with these observations, our transcriptomic data revealed the over-representation in CA-YDA plants of defensive genes, such as those encoding antimicrobial peptides and cell death regulators, and genes encoding cell wall-related proteins, suggesting a potential link between plant cell wall composition and integrity and broad spectrum resistance mediated by YDA. In addition, phosphoproteomic data revealed an over-representation of genes encoding wall-related proteins in CA-YDA plants in comparison with wild-type plants. The putative role of the ER-YDA pathway in regulating cell wall integrity was further supported by biochemical and glycomics analyses of er, yda11 and CA-YDA cell walls, which revealed significant changes in the cell wall composition of these genotypes compared with that of wild-type plants. In summary, our data indicate that ER and YDA are components of a novel immune pathway that regulates cell wall integrity and defensive responses, which confer broad-spectrum resistance to pathogens.

Protein diagenesis in Patella shells: implications for amino acid racemisation dating

Se analiza la racemización de aminoácidos en proteínas inter e intracristalinas en conchas de Patella y su utilización como herramienta geocronológica, fundamentalmente empleadas en yacimientos arqueológicos.The inter- and intra-crystalline fractions of Patella vulgata limpets recovered from archaeological sites in Northern Spain (covering Neolithic, Mesolithic, Magdalenian, Solutrean, and Aurignacian periods) were examined for amino acid composition and racemisation over time. The calcitic apex and rim areas of the shells were found to probably be composed of similar proteins, as the D/L values and amino acids were comparable and varied in the same way with increasing age; however, the mineral structures present in these areas differed. The aragonitic intermediate part of the shell showed a distinctly different amino acid composition and mineral structure. The main protein leaching from the inter-crystalline fraction occurred within the first 6000 yr after the death of the organism. In contrast, the intra-crystalline fraction — comprised of a different protein composition than the inter-crystalline fraction — appeared to behave as a closed system for at least 34 ka, as reflected by the lack of a significant decrease in the amino acid content; however, changes in the amino acid percentages occurred during this period. The concentration of aspartic acid remained almost constant with age both in inter- and intra-crystalline proteins, and its contribution to the total amino acid content increased with age at the expense of other amino acids such as glutamic acid, serine, glycine and alanine. Temperature is thought to play a key role in the amino acid racemisation of P. vulgata and could explain why in the localities belonging to the Gravettian and Solutrean period, which formed during relatively cold conditions, D/L values were similar to those detected in shells from sites formed during the Magdalenian.

Efectos de una intervención nutricional personalizada a largo plazo sobre los hábitos alimentarios de jugadores profesionales de baloncesto y su influencia en la percepción del esfuerzo y la fatiga

El presente trabajo consistió en el desarrollo de una intervención nutricional a largo plazo llevada a cabo con jugadores profesionales de baloncesto, en función al cumplimiento de las recomendaciones nutricionales, con los siguientes dos objetivos: 1) valorar los cambios que dicha intervención produce sobre las prácticas nutricionales diarias de estos deportistas y 2) conocer la influencia de las modificaciones nutricionales producidas sobre la tasa de percepción del esfuerzo por sesión (RPE-Sesión) y la fatiga, a lo largo de una temporada competitiva, tanto para entrenamientos como partidos oficiales. Los objetivos del estudio se fundamentan en: 1) la numerosa evidencia científica que muestra la inadecuación de los hábitos nutricionales de los jugadores de baloncesto y otros deportistas respecto a las recomendaciones nutricionales; 2) el hecho ampliamente reconocido en la literatura especializada de que una ingesta nutricional óptima permite maximizar el rendimiento deportivo (a nivel físico y cognitivo), promoviendo una rápida recuperación y disminuyendo el riesgo de enfermedades y lesiones deportivas. No obstante, pocos estudios han llevado a cabo una intervención nutricional a largo plazo para mejorar los hábitos alimentarios de los deportistas y ninguno de ellos fue realizado con jugadores de baloncesto; 3) la elevada correlación entre la percepción del esfuerzo (RPE) y variables fisiológicas relacionadas al desarrollo de un ejercicio (por ej.: frecuencia cardíaca, consumo máximo de oxígeno o lactato sanguíneo) y los múltiples estudios que muestran la atenuación de la RPE durante la realización del ejercicio mediante una ingesta puntual de nutrientes, (especialmente de hidratos de carbono) aunque ninguno fue desarrollado en baloncesto; 4) el estudio incipiente de la relación entre la ingesta nutricional y la RPE-Sesión, siendo éste un método validado en baloncesto y otros deportes de equipo como indicador de la carga de trabajo interna, el rendimiento deportivo y la intensidad del ejercicio realizado; 5) el hecho de que la fatiga constituye uno de los principales factores influyentes en la percepción del esfuerzo y puede ser retrasada y/o atenuada mediante la ingesta de carbohidratos, pudiendo disminuir consecuentemente la RPE-Sesión y la carga interna del esfuerzo físico, potenciando el rendimiento deportivo y las adaptaciones inducidas por el entrenamiento; 6) la reducida evidencia acerca del comportamiento de la RPE-Sesión ante la modificación de la ingesta de nutrientes, encontrándose sólo un estudio llevado a cabo en baloncesto y 7) la ausencia de investigaciones acerca de la influencia que puede tener la mejora del patrón nutricional de los jugadores sobre la RPE-Sesión y la fatiga, desconociéndose si la adecuación de los hábitos nutricionales conduce a una disminución de estas variables en el largo plazo para todos los entrenamientos y partidos oficiales a nivel profesional. Por todo esto, este trabajo comienza con una introducción que presenta el marco teórico de la importancia y función de la nutrición en el deporte, así como de las recomendaciones nutricionales actuales a nivel general y para baloncesto. Además, se describen las intervenciones nutricionales llevadas a cabo previamente con otros deportistas y las consecuentes modificaciones sobre el patrón alimentario, coincidiendo este aspecto con el primer objetivo del presente estudio. Posteriormente, se analiza la RPE, la RPE-Sesión y la fatiga, focalizando el estudio en la relación de dichas variables con la carga de trabajo físico, la intensidad del entrenamiento, el rendimiento deportivo y la recuperación post ejercicio. Finalmente, se combinan todos los aspectos mencionados: ingesta nutricional, RPE percepción del esfuerzo y fatiga, con el fin de conocer la situación actual del estudio de la relación entre dichas variables, conformando la base del segundo objetivo de este estudio. Seguidamente, se exponen y fundamentan los objetivos antes mencionados, para dar lugar después a la explicación de la metodología utilizada en el presente estudio. Ésta consistió en un diseño de estudios de caso, aplicándose una intervención nutricional personalizada a tres jugadores de baloncesto profesional (cada jugador = un estudio de caso; n = 1), con el objetivo de adecuar su ingesta nutricional en el largo plazo a las recomendaciones nutricionales. A su vez, se analizó la respuesta individual de cada uno de los casos a dicha intervención para los dos objetivos del estudio. Para ello, cada jugador completó un registro diario de alimentos (7 días; pesada de alimentos) antes, durante y al final de la intervención. Además, los sujetos registraron diariamente a lo largo del estudio la RPE-Sesión y la fatiga en entrenamientos físicos y de balón y en partidos oficiales de liga, controlándose además en forma cuantitativa otras variables influyentes como el estado de ánimo y el sueño. El análisis de los datos consistió en el cálculo de los estadísticos descriptivos para todas las variables, la comparación de la ingesta en los diferentes momentos evaluados con las recomendaciones nutricionales y una comparación de medias no paramétrica entre el período pre intervención y durante la intervención con el test de Wilcoxon (medidas repetidas) para todas las variables. Finalmente, se relacionaron los cambios obtenidos en la ingesta nutricional con la percepción del esfuerzo y la fatiga y la posible influencia del estado de ánimo y el sueño, a través de un estudio correlacional (Tau_b de Kendall). Posteriormente, se presentan los resultados obtenidos y la discusión de los mismos, haciendo referencia a la evidencia científica relacionada que se encuentra publicada hasta el momento, la cual facilitó el análisis de la relación entre RPE-Sesión, fatiga y nutrición a lo largo de una temporada. Los principales hallazgos y su correspondiente análisis, por lo tanto, pueden resumirse en los siguientes: 1) los tres jugadores de baloncesto profesional presentaron inicialmente hábitos nutricionales inadecuados, haciendo evidente la necesidad de un nutricionista deportivo dentro del cuerpo técnico de los equipos profesionales; 2) las principales deficiencias correspondieron a un déficit pronunciado de energía e hidratos de carbono, que fueron reducidas con la intervención nutricional; 3) la ingesta excesiva de grasa total, ácidos grasos saturados, etanol y proteínas que se halló en alguno/s de los casos, también se adecuó a las recomendaciones después de la intervención; 4) la media obtenida durante un período de la temporada para la RPE-Sesión y la fatiga de entrenamientos, podría ser disminuida en un jugador individual mediante el incremento de su ingesta de carbohidratos a largo plazo, siempre que no existan alteraciones psico-emocionales relevantes; 5) el comportamiento de la RPE-Sesión de partidos oficiales no parece estar influido por los factores nutricionales modificados en este estudio, dependiendo más de la variación de elementos externos no controlables, intrínsecos a los partidos de baloncesto profesional. Ante estos resultados, se pudo observar que las diferentes características de los jugadores y las distintas respuestas obtenidas después de la intervención, reforzaron la importancia de utilizar un diseño de estudio de casos para el análisis de los deportistas de élite y, asimismo, de realizar un asesoramiento nutricional personalizado. Del mismo modo, la percepción del esfuerzo y la fatiga de cada jugador evolucionaron de manera diferente después de la intervención nutricional, lo cual podría depender de las diferentes características de los sujetos, a nivel físico, psico-social, emocional y contextual. Por ello, se propone que el control riguroso de las variables cualitativas que parecen influir sobre la RPE y la fatiga a largo plazo, facilitaría la comprensión de los datos y la determinación de factores desconocidos que influyen sobre estas variables. Finalmente, al ser la RPE-Sesión un indicador directo de la carga interna del entrenamiento, es decir, del estrés psico-fisiológico experimentado por el deportista, la posible atenuación de esta variable mediante la adecuación de los hábitos nutricionales, permitiría aplicar las cargas externas de entrenamiento planificadas, con menor estrés interno y mejor recuperación entre sesiones, disminuyendo también la sensación de fatiga, a pesar del avance de la temporada. ABSTRACT This study consisted in a long-term nutritional intervention carried out with professional basketball players according to nutritional recommendations, with the following two main objectives: 1) to evaluate the changes produced by the intervention on daily nutritional practices of these athletes and 2) to determine the influence of long term nutritional intake modifications on the rate of perceived exertion per session (Session-RPE) and fatigue, throughout a competitive season for training as well as competition games. These objectives are based on: 1) much scientific evidence that shows an inadequacy of the nutritional habits of basketball players and other athletes regarding nutritional recommendations; 2) the fact widely recognized in the scientific literature that an optimal nutrition allows to achieve the maximum performance of an athlete (both physically and cognitively), promoting fast recovery and decreasing risks of sports injuries and illnesses. However, only few studies carried out a long term nutritional intervention to improve nutritional practices of athletes and it could not be found any research with basketball players; 3) the high correlation between the rate of perceived exertion (RPE) and physiological variables related to the performance of physical exercise (e.g.: heart rate, maximum consumption of oxygen or blood lactate) and multiple studies showing the attenuation of RPE during exercise due to the intake of certain nutrients (especially carbohydrates), while none of them was developed in basketball; 4) correlation between nutritional intake and Session-RPE has been recently studied for the first time. Session-RPE method has been validated in basketball players and other team sports as an indicator of internal workload, sports performance and exercise intensity; 5) fatigue is considered one of the main influential factor on RPE and sport performance. It has also been observed that carbohydrates intake may delay or mitigate the onset of fatigue and, thus, decrease the perceived exertion and the internal training load, which could improve sports performance and training-induced adaptations; 6) there are few studies evaluating the influence of nutrient intake on Session-RPE and only one of them has been carried out with basketball players. Moreover, it has not been analyzed the possible effects of the adequacy of players’ nutritional habits through a nutritional intervention on Session-RPE and fatigue, variables that could be decreased for all training session and competition games because of an improvement of daily nutritional intake. Therefore, this work begins with an introduction that provides the conceptual framework of this research focused on the key role of nutrition in sport, as well as on the current nutritional recommendations for athletes and specifically for basketball players. In addition, previous nutritional interventions carried out with other athletes are described, as well as consequential modifications on their food pattern, coinciding with the first objective of the present study. Subsequently, RPE, Session-RPE and fatigue are analyzed, with focus on their correlation with physical workload, training intensity, sports performance and recovery. Finally, all the aforementioned aspects (nutritional intake, RPE and fatigue) were combined in order to know the current status of the relation between each other, this being the base for the second objective of this study. Subsequently, the objectives mentioned above are explained, continuing with the explanation of the methodology used in the study. The methodology consisted of a case-study design, carrying out a long term nutritional intervention with three professional basketball players (each player = one case study; n = 1), in order to adapt their nutritional intake to nutritional recommendations. At the same time, the individual response of each player to the intervention was analyzed for the two main objectives of the study. Each player completed a food diary (7 days; weighing food) in three moments: before, during and at the end of the intervention. In addition, the Session-RPE and fatigue were daily recorded throughout the study for all trainings (training with ball and resistance training) and competition games. At the same time, other potentially influential variables such as mood state and sleeping were daily controlled throughout the study. Data analysis consisted in descriptive statistics calculation for all the variables of the study, the comparison between nutritional intake (evaluated at different times) and nutritional recommendations and a non-parametric mean comparison between pre intervention and during intervention periods was made by Wilcoxon test (repeated measurements) for all variables too. Finally, the changes in nutritional intake, mood state and sleeping were correlated with the perceived exertion and fatigue through correctional study (Tau_b de Kendall). After the methodology, the study results and the associated discussion are presented. The discussion is based on the current scientific evidence that contributes to understand the relation between Session-RPE, fatigue and nutrition throughout the competitive season. The main findings and results analysis can be summarized as follows: 1) the three professional basketball players initially had inadequate nutritional habits and this clearly shows the need of a sports nutritionist in the coaching staff of professional teams; (2) the major deficiencies of the three players’ diet corresponded to a pronounced deficit of energy intake and carbohydrates consumption which were reduced with nutritional intervention; (3) the excessive intake of total fat, saturated fatty acids, ethanol and protein found in some cases were also adapted to the recommendations after the intervention; (4) Session-RPE mean and fatigue of a certain period of the competition season, could be decreased in an individual player by increasing his carbohydrates intake in the long term, if there are no relevant psycho-emotional disorders; (5) the behavior of the Session-RPE in competition games does not seem to be influenced by the nutritional factors modified in this study. They seem to depend much more on the variation of external non-controllable factors associated with the professional basketball games. Given these results, the different characteristics of each player and the diverse responses observed after the intervention in each individual for all the variables, reinforced the importance of the use of a case study design for research with elite athletes as well as personalized nutritional counselling. In the same way, the different responses obtained for RPE and fatigue in the long term for each player due to modification of nutritional habits, show that there is a dependence of such variables on the physical, psychosocial, emotional and contextual characteristics of each player. Therefore it is proposed that the rigorous control of the qualitative variables that seem to influence the RPE and fatigue in the long term, may facilitate the understanding of data and the determination of unknown factors that could influence these variables. Finally, because Session-RPE is a direct indicator of the internal load of training (psycho-physiological stress experienced by the athlete), the possible attenuation of Session-RPE through the improvement in nutritional habits, would allow to apply the planned external loads of training with less internal stress and better recovery between sessions, with a decrease in fatigue, despite of the advance of the season.

Identification of the method to quantify soluble fibre and the effect of the source of fibre on the ileal and faecal digestibility of soluble and insoluble fibre in rabbits = Identificación del método para cuantificar la fibra soluble y el efecto de la fuente de fibra en la digestibilidad ileal y fecal de la fibra soluble e insoluble en conejos

La presente tesis constituye un avance en el estudio de los métodos para cuantificar la fibra soluble y los efectos de las fracciones de fibra y las fuentes de fibra sobre la digestión de las diferentes fracciones de fibra (soluble e insoluble) en el conejo. Hay un efecto positivo de la fibra soluble sobre la salud intestinal de los conejos y, por ende, una reducción de la mortalidad en animales destetados. Pese a esto, no está claro si estos efectos se deben específicamente a la fracción soluble. Por lo que los objetivos generales de esta tesis fueron: 1) comparar diferentes metodologías químicas e in vitro para cuantificar la fibra soluble y estudiar las posibles interferencias en la cuantificación de la fibra soluble por las mucinas, y viceversa, 2) determinar los efectos de la fibra, el lugar de fermentación, el método para valorar la fibra soluble e insoluble, y la corrección de la fibra soluble por el contenido intestinal de mucinas sobre la digestibilidad de las distintas fracciones de la fibra y 3) evaluar los efectos individuales de las fracciones soluble e insoluble de la fibra de pulpa de remolacha y de manzana, sobre la digestibilidad de la fibra soluble e insoluble y los parámetros digestivos. Para ello se llevaron a cabo 4 estudios. En el primer estudio se compararon diferentes metodologías químicas e in vitro para valorar la fibra soluble de diferentes alimentos y se estudió la posible interferencia en la determinación de la fibra soluble y mucinas. Para ello se utilizaron seis ingredientes (pulpa de remolacha, pectinas de pulpa de remolacha, pulpa de remolacha lavada, paja de cereal, cascarilla de girasol y lignocelulosa) y siete piensos de conejos con diferentes niveles de fibra soluble. En un primer experimento se analizó la fibra dietética total (FDT), la fibra dietética insoluble (FDI), la fibra dietética soluble (FDS), la fibra neutro detergente corregida por cenizas y proteínas (aFNDmo-pb), y la digestibilidad in vitro 2 pasos pepsina/pancreatina (residuo corregido por cenizas y proteína, ivMSi2) de los ingredientes y piensos. Además la fibra soluble se calculó mediante la diferencia entre FDT-FDI (FDSFDI), FDT- ivMSi2 (FDSivMSi2), y FDT - aFNDmo-pb (FDSaFNDmo-pb). Cuando la fibra soluble se determinó directamente como FDS o se calculó como FDT-FDI no se observaron diferencias (109 g/kg MS, en promedio). Sin embargo, cuando la fibra soluble se calculó como FDT - aFNDmo-pb su valor fue un 40% menor (153 g/kg MS. P < 0,05), mientras que la FDSFDI (124 g/kg MS) no fue diferente a ninguna de las otras metodologías. La correlación entre los tres métodos fue elevada (r > 0,96. P < 0,001. n = 13), pero disminuyó o incluso desapareció cuando la pulpa o las pectinas de la remolacha fueron excluidas del análisis. En un segundo experimento, se comparó el método ivDMi2 usando crisoles (método de referencia) con una modificación del mismo usando bolsas ANKOM digeridas individualmente o en colectivo para simplificar la determinación de la FDSivMSi2. La FDSivMSi2 no difirió entre los métodos comparados. En un tercer experimento, se analizó la posible interferencia entre la determinación de la fibra soluble y las mucinas intestinales. Se observó un contenido de FDT y de mucinas elevado en las muestras de pectinas de remolacha (994 y 709 g/kg MS), así como en el moco intestinal de conejo (571 y 739 g/kg MS) cuando se aplicó el método de mucinas por precipitación con etanol. Sin embargo, después de aplicar una pectinasa en el material precipitado, la cantidad de mucinas recuperadas en las muestras de pectinas de remolacha fue cercana a cero, mientras que en el moco intestinal fue similar a los resultados previos al uso de la enzima. Con los resultados de este ensayo se estimaron los carbohidratos de mucinas retenidos en los contenidos digestivos y se propuso una corrección para la determinación de la digestibilidad de la FDT y fibra soluble. En conclusión, la contaminación de las mucinas de la digesta con fibra soluble se soluciona usando pectinasas. El segundo estudio se centró en estudiar: 1) el efecto del tipo de fibra, 2) el sitio de fermentación, 3) el método para cuantificar fibra y 4) la corrección por mucinas sobre la digestibilidad de la fibra. Para ello se formularon tres piensos con diferentes niveles de fibra soluble (FDT-aFNDmo-pb). Un pienso bajo en fibra soluble (LSF. 85 g/kg DM), un pienso medio en fibra soluble (MSF. 102 g/kg DM), y un pienso alto en fibra soluble (HSF. 145 g/kg DM). Estos piensos se obtuvieron reemplazando un 50% del heno del alfalfa en el pienso MSF por una mezcla de pulpa de manzana y remolacha (HSF) o por una mezcla de cascarilla de avena y proteína de soja (LSF). Se utilizaron 30 conejas canuladas para determinar la digestibilidad ileal y fecal. La digestibilidad cecal se calculó mediante diferencia entre la digestibilidad fecal e ileal. La fibra insoluble se determinó como aFNDmo-pb, IDF, e ivMSi2, mientras que la fibra soluble se calculó como FDSFDI, FDSaFNDmo-pb, y FDSivMSi2. La digestibilidad de la FDT y la fibra soluble se corrigieron por las mucinas. La concentración de mucinas en la digesta ileal y fecal, aumento desde el grupo LSF hasta el grupo con el pienso HSF (P < 0,01). La corrección por mucinas aumentó las digestibilidades de la FDT y la fibra soluble a nivel ileal, mientras que a nivel cecal las redujo. (P < 0.01). El coeficiente de digestibilidad ileal de FDT aumentó desde el grupo LSF al grupo HSF (0,12 vs. 0,281. P < 0,01), sin diferencias en el coeficiente de digestibilidad cecal (0,264), por lo que la tendencia a nivel fecal entre los grupos se mantuvo. El coeficiente de digestibilidad ileal de la fibra insoluble aumento desde el grupo con el pienso LSF al grupo con el pienso HSF (0,113 vs. 0,210. P < 0,01), sin diferencias a nivel cecal (0,139) y sin efecto del método usado, resultando en una digestibilidad elevada a nivel fecal, con tendencias similares a las observadas a nivel ileal. El coeficiente de digestibilidad de la FND fue elevada en comparación con la FDI o la ivMSi2 (P > 0.01). El coeficiente de la digestibilidad ileal de la fibra soluble fue mayor en el grupo LSF respecto al grupo LSF (0,436 vs. 0,145. P < 0,01) y el método no afectó a esta determinación. El coeficiente de la digestibilidad cecal de la fibra soluble se redujo desde el grupo LSF hasta el grupo HSF (0,721 vs. 0,492. P < 0,05). El valor más bajo de digestibilidad cecal y fecal de fibra soluble fue medido con el método FDSaFNDmo-pb (P < 0,01). Se observó una alta correlación entre las digestibilidades de la fibra soluble determinada como FDSFDI, FDSaFNDmo-pb, y FDSivMSi2, por lo tanto la información proporcionada por una u otra metodología fueron similares. Sin embargo, cuando se compararon con efectos fisiológicos (producción de mucinas y peso del ciego y pH del ciego de un trabajo previo), la FDSaFNDmo-pb globalmente mostró estar mejor correlacionado con estos parámetros fisiológicos. En conclusión, la corrección por mucinas es necesaria para determinar la digestibilidad ileal de la FDT y fibra soluble, mientras que la elección de uno u otro método es menos relevante. La inclusión de pulpa de manzana y remolacha incrementa la cantidad de FDT que desaparece antes de llegar al ciego. En el tercer estudio se estudió el efecto de la fracción fibrosa soluble e insoluble de la pulpa de remolacha y el método de cuantificación de la fibra soluble e insoluble sobre la digestibilidad de la fibra y algunos parámetros digestivos. Para ello se formularon cuatro piensos con niveles similares de fibra insoluble (315g aFNDmo-pb/kg MS) y proteína (167 g/kg MS). El pienso control contuvo el nivel más bajo de fibra soluble (30,3 g/kg, con cascarilla de girasol y paja como fuente de fibra). Un segundo pienso se obtuvo mediante la sustitución de 60 g de almidón/kg del pienso control por pectinas de remolacha (82,9 g fibra soluble/kg MS). Los otras dos piensos resultaron de la sustitución parcial de las fuentes de fibra del pienso control por la fracción insoluble de la pulpa de remolacha y la pulpa de remolacha entera (42.2 y 82.3 g fibra soluble/kg MS, respectivamente). Cincuenta y seis conejos en cebo (14/pienso), de 2,4  0.21 kg de peso, fueron usados para determinar la digestibilidad ileal y fecal de la FDT, FDI, aFNDmo-pb, FDSFDI, y FDSaFNDmo-pb. La concentración de mucinas en el íleon y heces se utilizaron para corregir la digestibilidad de la FDT y fibra soluble. También se midió el peso de diferentes segmentos del tracto digestivo y el pH del contenido digestivo. Los conejos alimentados con el pienso de fibra insoluble de pulpa de remolacha mostraron los consumos más bajos con respecto a los demás grupos (124 vs. 139 g/d, respectivamente. P < 0,05). El flujo de mucinas ileales fue más alto (P < 0.05) en el grupo alimentado con el pienso de pectinas de remolacha (9,0 g/d en promedio) que los del grupo control (4,79 g/d), mostrando los otros dos grupos valores intermedios, sin detectarse diferencias a nivel fecal. La digestibilidad ileal de la FDT (corregida por mucinas) y la fibra insoluble no se vieron afectadas por el tipo de pienso. El método usado para determinar la fibra insoluble afectó su digestibilidad ileal (0,123 para FDI vs. 0,108 para aFNDmo-pb. P < 0.01). De todas formas, los métodos no afectaron al cálculo de la fibra fermentada antes del ciego (4,9 g/d en promedio). Los conejos alimentados con el pienso de pulpa de remolacha y con el pienso con la fracción insoluble de la pulpa de remolacha mostraron las digestibilidades fecales más altas de la fibra insoluble (0,266 en promedio vs. 0,106 del grupo control), mientras que en los animales del pienso con pectinas esta digestibilidad fue un 47% mayor respecto al pienso control (P < 0,001). La digestibilidad fecal de la fibra insoluble fue un 20% más alta cuando se usó la FND en lugar de FDI para determinarla (P < 0.001). Esto hizo variar la cantidad de fibra insoluble fermentada a lo largo del tracto digestivo (9,5 ó 7,5 g/d cuando fue calculada como FDI o aFNDmo-pb, respectivamente. P < 0,001). Las digestibilidades ileales de la fibra soluble fueron positivas cuando los análisis de fibra soluble de los contenidos ileales fueron corregidos por mucinas, (P < 0,001) excepto para la digestibilidad ileal de la FDSIDF del grupo control. Una vez corregidas por mucinas, los conejos alimentados con los piensos que contuvieron la fracción soluble de la pulpa de remolacha (pienso de pectina y pulpa de remolacha) mostraron una mayor digestibilidad ileal de la fibra soluble, respecto al grupo control (0,483 vs. -0,010. P = 0.002), mientras que el grupo del pienso de fibra insoluble de pulpa de remolacha mostró un valor intermedio (0,274). La digestibilidad total de la fibra soluble fue similar entre todos los grupos (0.93). Los conejos alimentados con pulpa de remolacha y su fracción insoluble mostraron los pesos relativos más altos del estómago respecto a los del pienso control y de pectinas (11 y 56 % respectivamente; P < 0,05). Por otra parte, el peso relativo del ciego aumentó en los animales que consumieron tanto la fracción soluble como insoluble de la pulpa de remolacha, siendo un 16% más pesados (P < 0,001) que el grupo control. El pH del contenido cecal fue más bajo en los animales del grupo de pulpa de remolacha que en los del grupo control (5,64 vs. 6,03; P < 0,001), mientras que los del grupo de pectinas y de fibra insoluble de pulpa de remolacha mostraron valores intermedios. En conclusión, el efecto positivo de la pulpa de remolacha en el flujo de mucinas a nivel ileal se debe a la fracción soluble e insoluble de la pulpa de remolacha. La mitad de la fibra soluble de la pulpa de remolacha desaparece antes de llegar al ciego, independientemente si esta proviene de pectinas puras o de la pulpa de remolacha. El pH cecal esta mejor correlacionado con la cantidad de FDT que desaparece antes del ciego más que con la que se degrada en el ciego. En el último estudio se estudiaron los efectos de la fibra soluble e insoluble de la pulpa de manzana sobre la digestibilidad de la fibra y algunos parámetros digestivos. Cuatro dietas fueron formuladas con niveles similares de fibra insoluble (aFNDmo-pb 32,4%) y proteína (18,6% ambos en base seca). El pienso control contuvo el nivel más bajo de fibra soluble (46 g de fibra soluble/kg, con cascarilla de girasol y paja de cereales como la fuentes de fibra). Un segundo pienso fue obtenido mediante la sustitución de 60 g de almidón/kg del pienso control por pectinas de manzana (105 g fibra soluble/kg). Los otros dos piensos se obtuvieron por la substitución de parte de las fuentes de fibra del pienso control por pulpa de manzana o pulpa de manzana despectinizada (93 y 71 g de fibra soluble/kg, respectivamente). La digestibilidad fecal fue determinada en 23 conejos/pienso con 1.68 ± 0.23 kg de peso vivo, los cuales fueron sacrificados a los 60 d edad para recolectar su contenido digestivo para determinar digestibilidad ileal y otros parámetros digestivos. La fibra soluble de manzana (pectinas y pulpa entera) estimuló el flujo ileal de mucinas (P = 0,002), pero no asi la pulpa despectinizada. La corrección por mucinas incrementó la digestibilidad de la FDT y la fibra soluble a nivel fecal, y especialmente a nivel ileal. Cerca de la mitad de la fibra soluble proveniente de los piensos con cualquiera de las fracciones de la pulpa de manzana fue degradada a nivel ileal, sin mostrar diferencias entre los grupos (46 y 86% en promedio a nivel ileal y fecal respectivamente). La inclusión de pulpa despectinizada de manzana mejoró la digestibilidad de la FND a nivel fecal (P < 0,05) pero no a nivel ileal. El contenido cecal de los conejos alimentados con la pulpa de manzana tuvieron el pH cecal más ácido que los del pienso control (5,55 vs. 5,95. P < 0,001), mientras que los animales con el pienso de pectinas de manzana y de pulpa de manzana despectinizada mostraron valores intermedios. En conclusión los efectos positivo de la pulpa de manzana en el flujo de mucinas se debió principalmente a la fracción soluble de la pulpa de manzana. La mitad de la fibra soluble fue degradada antes del ciego independientemente de si esta provino de las pectinas o de la pulpa de manzana. El pH cecal estuvo mejor correlacionado con la cantidad de FDT fermentada en todo el tracto digestivo y antes de llegar al ciego que con la que se degradó en el ciego. Al integrar los resultados de los estudio 2, 3 y 4 se concluyó que la corrección de mucinas de los contenidos digestivos al determinar FDT y fibra soluble es necesaria para ajustar los cálculos de su digestibilidad. Esta corrección es mucho más importante a nivel ileal y en dietas bajas en fibra soluble. Por otra parte, la FDT desapareció en proporciones importantes antes de llegar al ciego, especialmente en piensos que contienen pulpa de remolacha o de manzana o alguna fracción soluble o insoluble de las mismas y estas diferencias observadas entre los piensos a nivel ileal se correlacionaron mejor con el pH cecal, lo que indicaría que la FDT se solubilizó antes de llegar al ciego y una vez en esté fermentó. Estos resultados implican que determinar la fibra soluble como FDSaFNDmo-pb es la mejor opción y que en la determinación de la digestibilidad de la FDT y fibra soluble se debe considerar la corrección por mucinas especialmente a nivel ileal y en piensos bajos en fibra soluble. ABSTRACT The present thesis constitutes a step forward in advancing the knowledge of the methods to quantify soluble fibre and the effects of the fibre fractions and source of fibre on the site the digestion of different fractions of fibre (soluble and insoluble) in the rabbit. There is a positive effect of soluble fibre on rabbit digestive health and therefore on the reduction of mortality in weaning rabbits. Nevertheless, it is no so clear that the effects of soluble fibre on rabbits are due particularly to this fraction. This thesis aims: 1) to compare the quantification of soluble fibre in feeds using different chemical and in vitro approaches, and to study the potential interference between soluble fibre and mucin determinations, 2) to identify the effects of type of fibre, site of fermentation, method to quantify insoluble and soluble fibre, and correction of the intestinal soluble fibre content for intestinal mucin on the digestibility of fibre fractions and 3) to evaluate the individual effect of soluble and insoluble fibre from sugar beet pulp and apple pulp on ileal and faecal soluble and insoluble digestibility and digestive traits. These objectives were developed in four studies: The first study compared the quantification of soluble fibre in feeds using different chemical and in vitro approaches, and studied the potential interference between soluble fibre and mucin determinations. Six ingredients, sugar beet pulp (SBP), SBP pectins, insoluble SBP, wheat straw, sunflower hulls and lignocellulose, and seven rabbit diets, differing in soluble fibre content, were evaluated. In experiment 1, ingredients and diets were analysed for total dietary fibre (TDF), insoluble dietary fibre (IDF), soluble dietary fibre (SDF), aNDFom (corrected for protein, aNDFom-cp) and 2-step pepsin/pancreatin in vitro DM indigestibility (corrected for ash and protein, ivDMi2). Soluble fibre was estimated by difference using three procedures: TDF - IDF (SDFIDF), TDF - ivDMi2 (SDFivDMi2), and TDF - aNDFom-cp (SDFaNDFom-cp). Soluble fibre determined directly (SDF) or by difference, as SDFivDMi2 were not different (109 g/kg DM, on average). However, when it was calculated as SDFaNDFom-cp the value was 40% higher (153 g/kg DM, P < 0.05), whereas SDFIDF (124 g/kg DM) did not differ from any of the other methods. The correlation between the four methods was high (r ≥ 0.96. P ≤ 0.001. n = 13), but it decreased or even disappeared when SBP pectins and SBP were excluded and a lower and more narrow range of variation of soluble fibre was used. In experiment 2, the ivDMi2 using crucibles (reference method) were compared to those made using individual or collective ankom bags in order to simplify the determination of SDFivDMi2. The ivDMi2 was not different when using crucibles or individual or collective ankom bags. In experiment 3, the potential interference between soluble fibre and intestinal mucin determinations was studied using rabbit intestinal raw mucus, digesta and SBP pectins, lignocelluloses and a rabbit diet. An interference was observed between the determinations of soluble fibre and crude mucin, as the content of TDF and apparent crude mucin were high in SBP pectins (994 and 709 g/kg DM) and rabbit intestinal raw mucus (571 and 739 g/kg DM). After a pectinase treatment, the coefficient of apparent mucin recovery of SBP pectins was close to zero, whereas that of rabbit mucus was not modified. An estimation of the crude mucin carbohydrates retained in digesta TDF is proposed to correct TDF and soluble fibre digestibility. In conclusion, the values of soluble fibre depend on the methodology used. The contamination of crude mucin with soluble fibre is avoided using pectinase. The second study focused on the effect of type of fibre, site of fermentation, method for quantifying insoluble and soluble dietary fibre, and their correction for intestinal mucin on fibre digestibility. Three diets differing in soluble fibre were formulated (85 g/kg DM soluble fibre, in the low soluble fibre [LSF] diet; 102 g/kg DM in the medium soluble fibre [MSF] diet; and 145 g/kg DM in the high soluble fibre [HSF] diet). They were obtained by replacing half of the dehydrated alfalfa in the MSF diet with a mixture of beet and apple pulp (HSF diet) or with a mix of oat hulls and soybean protein (LSF diet). Thirty rabbits with ileal T-cannulas were used to determine total tract apparent digestibility (CTTAD) and ileal apparent digestibility (CIAD). Caecal digestibility was determined by difference between CTTAD and CIAD. Insoluble fibre was measured as aNDFom-cp, IDF, and ivDMi2, whereas soluble fibre was calculated as SDFaNDFom-cp, SDFIDF, SDFivDMi2. The intestinal mucin content was used to correct the TDF and soluble fibre digestibility. Ileal and faecal concentration of mucin increased from the LSF to the HSF diet group (P < 0.01). Once corrected for intestinal mucin, The CTTAD and CIAD of TDF and soluble fibre increased whereas caecal digestibility decreased (P < 0.01). The CIAD of TDF increased from the LSF to the HSF diet group (0.12 vs. 0.281. P < 0.01), with no difference in the caecal digestibility (0.264), resulting in a higher CTTAD from the LSF to the HSF diet group (P < 0.01). The CIAD of insoluble fibre increased from the LSF to the HSF diet group (0.113 vs. 0.21. P < 0.01), with no difference in the caecal digestibility (0.139) and no effect of fibre method, resulting in a higher CTTAD for rabbits fed the HSF diet compared with the MSF and LSF diets groups (P < 0.01). The CTTAD of aNDFom-cp was higher compared with IDF or ivDMi2 (P < 0.01). The CIAD of soluble fibre was higher for the HSF than for the LSF diet group (0.436 vs. 0.145. P < 0.01) and fibre method did not affect it. Caecal soluble fibre digestibility decreased from the LSF to the HSF diet group (0.721 vs. 0.492. P < 0.05). The lowest caecal and faecal soluble fibre digestibility was measured using SDFaNDFom-cp (P < 0.01). There was a high correlation among the digestibilities of soluble fibre measured as SDFaNDFom-cp, SDFIDF, and SDFivDMi2. Therefore, these methodologies provide similar information. However, the method that seems to be globally better related to the physiological traits (ileal flow of mucins, and relative weight of the caecum and caecal pH from previous work) was the SDFaNDFom-cp. In conclusion, a correction for intestinal mucin is necessary for ileal TDF and soluble fibre digestibility whereas the selection of the fibre method has a minor relevance. The inclusion of sugar beet and apple pulp increased the amount of TDF fermented in the small intestine. The third study examined the effect of fibre fractions of sugar beet pulp (SBP) and the method for quantifying soluble and insoluble fibre on soluble and insoluble fibre digestibility and digestive traits. Four diets were formulated with similar level of insoluble fibre (aNDFom-cp: 315 g/kg DM) and protein (167 g/kg DM). Control diet contained the lowest level of soluble fibre (30.3 g/kg DM, including sunflower hulls and straw as sole sources of fibre). A second diet was obtained by replacing 60 g starch/kg of control diet with SBP pectins (82.9 g soluble fibre/kg DM). Two more diets were obtained by replacing part of the fibrous sources of the control diet with either insoluble SBP fibre or SBP (42.2 and 82.3 g soluble fibre/kg DM, respectively). Fifty six (14/diet) rabbits weighing 2.40  0.213 kg were used to determine faecal and ileal digestibility of total dietary fibre (TDF), insoluble dietary fibre (IDF), neutral detergent fibre corrected for ash and CP (aNDFom-cp) and soluble fibre estimated as SDFaNDFom-cp and SDFIDF. Faecal and ileal mucin content was used to correct TDF and soluble fibre digestibility. It was also recorded weight of digestive segments and digesta pH. Rabbits fed insoluble SBP showed the lowest feed intake with respect to the other 3 diets (124 vs. 139 g/d, respectively. P < 0.05). Ileal mucin flow was higher (P < 0.05) in animals fed pectin and SBP diets (9.0 g/d, as average) than those fed control diet (4.79 g/d), showing InsSBP group an intermediate value. No differences on mucin content were detected at faecal level. There was no diet effect on the CIAD of TDF (corrected for mucin) and insoluble fibre. Fibre methodology influenced the CIAD of insoluble fibre (0.123 for IDF vs. 0.108 for aNDFom-cp. P < 0.01). Anyway, the amount of insoluble fibre fermented before the caecum did not differ between both methods (4.9 g/d, on average). Rabbits fed insoluble SBP and SBP diets showed the highest CTTAD of insoluble fibre (0.266 on average vs. 0.106 for control group), whereas those fed pectin diet had an intermediate value (0.106. P < 0.001). The CTTAD of insoluble fibre measured with IDF was higher than that measured with aNDFom-cp (by 20%. P < 0.001). It led that the amount of insoluble fibre fermented along the digestive tract were different (9.5 or 7.5 g/d when calculated as IDF or aNDFom-cp, respectively; P < 0.001). When the CIAD of soluble fibre was corrected for mucin they became positive (P < 0.001) except for control group measured as SDFIDF. Once corrected for mucin content, rabbits fed soluble fibre from SBP (pectin and SBP groups) showed higher CIAD of soluble fibre than control group (0.483 vs. -0.019. respectively), whereas the value for insoluble SBP group was intermediate 0.274. The CTTAD of soluble fibre (mucin corrected) was similar among diets 0.93. Rabbits fed with SBP and insoluble SBP diets showed higher total digestive tract and stomach relative weight than those fed pectin and control diets (by 11 and 56 %. respectively, P < 0.05). The caecal relative weight did not differ in rabbits fed pectin, insoluble SBP, and SBP diets (62 g/kg BW, as average) and they were on average 16% higher (P < 0.001) than in control group. Caecal content of rabbits fed SBP diet was more acid than those fed control diet (5.64 vs. 6.03. P < 0.001), whereas those from pectin and insoluble SBP diets showed intermediate values. In conclusion, the positive effect of SBP fibre on ileal mucin flow was due to both its soluble and insoluble fibre fraction. Half of the soluble SBP fibre was degraded before the caecum independently it came from pectin or SBP. The caecal pH correlated better with the ileal amount of fermented TDF in the digestive tract rather than with that fermented in the caecum. The last study examined the effect of soluble and insoluble fibre of apple pulp on fibre digestibility and digestive traits. Four diets were formulated with similar level of insoluble fibre (aNDFom-cp: 324 g/kg DM) and protein (18.6 g/kg DM). Control diet contained the lowest level of soluble fibre (46 g soluble fibre/kg DM, including oat hulls and straw as sole sources of fibre). A second diet was obtained by replacing 60 g starch/kg of control diet with apple pectins (105 g soluble fibre/kg DM). Two more diets were obtained by substituting part of the fibrous sources of the control diet by either apple pulp or depectinized apple pulp (93 and 71 g soluble fibre/kg, respectively). The CTTAD was determined in 23 rabbits/diet weighing 1.68  0.23 kg BW, and 23 rabbits/diet were slaughtered at 60 d of age to collect ileal digesta to determine CIAD and record other digestive traits. Soluble fibre from apple stimulated ileal flow of mucin (P = 0.002), but depectinized apple pulp did not. The correction for mucin increased the digestibility of crude protein, total dietary fibre, and soluble fibre at faecal, but especially at ileal level, depending in this case on the diet. Around half of the soluble fibre in diets containing any fibre fraction from apple was degraded at ileal level, with no differences among these diets (0.46 vs. 0.066 for control group, P=0.046). Faecal soluble fibre digestibility was 0.86 on average for all groups). Inclusion of the apple insoluble fibre improved NDF digestibility at faecal (0.222 vs. 0.069. P < 0.05) but not at ileal level. Caecal content of rabbits fed apple pulp diet was more acid than those fed control diet (5.55 vs. 5.95. P < 0.001), whereas those from pectin and depectinised apple pulp diets showed intermediate values. In conclusion, the positive effect of apple fibre on ileal mucin flow was mainly due to its soluble fibre fraction. Half of the soluble apple fibre was degraded before the caecum independently it came from pectin or apple pulp. The caecal pH correlated better with the total and ileal amount of fermented TDF in the digestive tract rather than with that fermented in the caecum. The results obtained in the studies 2, 3 and 4 were considered together. These results showed that the mucin correction is necessary when the TDF and soluble fibre digestibility is determined, and it correction is more important at ileal level and in diets with low level of soluble fibre. On another hand, incrementing the soluble fibre using sugar beet and apple pulp increased the amount of TDF disappear before the caecum. Moreover, the caecal pH correlated better with the ileal amount of fermented TDF in the digestive tract rather than with that fermented in the caecum. This suggests that an ileal fibre solubilisation may occur rather than ileal fermentation. Therefore the implications of this work were that: the estimation of soluble fibre as SDFaNDFom-cp is an adequate method considering its correlation with the physiological effects; and the TDF and soluble fibre digestibility must be corrected with intestinal mucins, especially when the ileal digestibility is determined.

Effects of nutrition on digestión efficicency and gaseous emissions from slurry in growing-finishing pigs. II. Effect of protein source in practical diets.

Uso de diferentes fuentes de proteína en la alimentación de cerdos en fase de cebo y su relación con las emisiones de gases amoniaco y metano.

Cartografía de QTL asociados a la tolerancia a estrés hídrico en frijol común (Phaseolus vulgaris L.)

Phaseolus vulgaris L. (frijol común o judía) es una leguminosa de gran demanda para la nutrición humana y un producto agrícola muy importante. Sin embargo, la producción de frijol se ve limitada por presiones ambientales como la sequía. En México, el 85% de la cosecha de frijol se produce en la temporada de primavera-verano, principalmente en las regiones del altiplano semiárido con una precipitación anual entre 250 y 400 mm. A pesar del implemento de tecnología en el campo, los factores naturales impiden al agricultor llegar a los rendimientos deseados. El Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), como instituto de investigación gubernamental en México, tiene como objetivo la mejora de cultivos estratégicos, uno de ellos, P. vulgaris. Los estudios en relación a la sequía se enfocan especialmente en la selección de genotipos tolerantes, los cuales son sometidos en condiciones de estrés y monitoreando parámetros como el rendimiento y peso de semilla, además de algunos indicadores tales como índice de cosecha. El resultado de estos trabajos ha sido la obtención de variedades con mayor tolerancia a la sequía, tales como Pinto Villa y Pinto Saltillo. En los últimos años se ha avanzado notablemente en el conocimiento de las bases moleculares en las respuestas de las plantas al estrés. De acuerdo a diversos estudios se ha demostrado que las plantas bajo estrés por sequía experimentan cambios en la expresión de genes involucrados en la señalización, regulación de la transcripción y la traducción, transporte de agua y la función directa en la protección celular. También se ha observado que el déficit de agua es causado por las temperaturas extremas y la alta concentración de sales, por lo que al nivel molecular, las respuestas al estrés tienen puntos de especificidad y puntos de entrecruzamiento. La sequía puede generar estreses secundarios, tales como el nutricional, oxidativo y osmótico. Sin embargo, es necesario identificar y caracterizar muchos de los componentes involucrados en las respuestas al déficit hídrico, la caracterización de estos genes permitirá tener una mejor comprensión de los mecanismos bioquímicos y fisiológicos involucrados en la tolerancia al estrés. Actualmente, con el apoyo de la biología molecular se han identificado algunos genes que otorgan ventajas para la adaptación a ambientes desfavorables. Por lo que el objetivo del presente trabajo es identificar marcadores genéticos asociados a rasgos fenotípicos con énfasis a la tolerancia a estrés hídrico en P. vulgaris. Una vez establecidos los marcadores asociados al estrés hídrico, es factible considerar su uso para la selección asistida por marcadores en líneas o variedades de frijol de interés para los mejoradores. Se evaluaron 282 familias F3:5 derivadas de la cruza entre los cultivares Pinto Villa y Pinto Saltillo. Las familias se sembraron bajo un diseño simple de látice 17x17, el experimento se llevo acabo en el ciclo primavera-verano del 2010 y 2011, y otoñoinvierno de 2010 en el Campo Experimental Bajío del INIFAP con dos repeticiones para cada tratamiento de humedad (riego completo y sequía terminal). En todos los genotipos se realizó el fenotipado (variables fenotípicas) y el genotipado a través de marcadores moleculares. Los análisis estadísticos se basaron en el análisis de componentes principales (Eigen Analysis Selection Index Method, ESIM), la asociación entre marcadores SNP y el fenotipado (paquete SNPassoc para R) y el análisis de varianza (ANOVA). Los valores ESIM mostraron que las variables de Rendimiento, Días a floración, Días a madurez fisiológica e Índice de cosecha fueron sobresalientes en sequía terminal, por lo que se sugieren tomarse en consideración para los estudios de sequía en P. vulgaris como monitores de evaluación a la resistencia. Se identificaron nueve familias sobresalieron por sus valores ESIM (PV/PS6, 22, 131, 137, 149, 154, 201, 236 y 273), además de presentar valores superiores para el rendimiento en comparación con los parentales. Estos genotipos son candidatos interesantes para realizar estudios de identificación de loci asociados con la respuesta al estrés, y como potenciales parentales en el desarrollo de nuevas variedades de frijol. En los análisis de asociación SNPassoc se identificaron 83 SNPs significativos (p<0,0003) asociados a los rasgos fenotípicos, obteniendo un total de 222 asociaciones, de las cuales predomina el modelo genético de codominancia para las variables Días a floración, Periodo reproductivo y Biomasa total. Treinta y siete SNPs se identificaron a diferentes funciones biológicas a través del análisis de anotación funcional, de los cuales 12 SNPs (9, 18, 28, 39, 61, 69, 80, 106, 115, 128, 136 y 142) sobresalen por su asociación al fenotipado, y cuya anotación funcional indica que se encuentran en genes relacionados a la tolerancia a la sequía, tales como la actividad kinasa, actividad metabólica del almidón, carbohidratos y prolina, respuesta al estrés oxidativo, así como en los genes LEA y posibles factores de transcripción. En el caso de los análisis ANOVA, se identificaron 72 asociaciones entre los SNPs y las variables fenotípicas (F< 3,94E-04). Las 72 asociaciones corresponden a 30 SNPs y 7 variables fenotípicas, de las que predomina Peso de 100 semillas y Periodo reproductivo. Para los rasgos de Rendimiento, Índice de cosecha y Días a madurez fisiológica se presentaron asociaciones con seis SNPs (17, 34, 37, 50, 93 y 107), de los cuales, a los SNP37 y SNP107 fueron identificados a la anotación biológica de protein binding. Por otro lado, los SNP106 y SNP128 asociados al Periodo reproductivo, son genes con actividad kinasa y actividad metabólica del almidón, respectivamente. Para los marcadores tipo AFLP, se identificaron 271 asociaciones (F<2,34E-04). Las asociaciones corresponden a 86 AFLPs con todas las variables fenotípicas evaluadas, de las que predomina peso de 100 semillas, Días a floración y Periodo reproductivo. Debido a que los en los AFLPs no es posible determinar su anotación biológica, se proponen como marcadores potenciales relacionados a la resistencia a la sequía en frijol. Los AFLPs candidatos requieren más estudios tales como la secuenciación de los alelos respectivos, así como la identificación de éstas secuencias en el genoma de referencia y su anotación biológica, entre otros análisis, de esta manera podríamos establecer aquellos marcadores candidatos a la validación para la selección asistida. El presente trabajo propone tanto genotipos como marcadores genéticos, que deben ser validados para ser utilizados en el programa de mejoramiento de P. vulgaris, con el objetivo de desarrollar nuevas líneas o variedades tolerantes a la sequía. ABSTRACT Phaseolus vulgaris L. (common bean or judia) is a legume of great demand for human consumption and an important agricultural product. However, the common bean production is limited by environmental stresses, such as drought. In Mexico, 85% of the common bean crop is produced in the spring-summer season mainly in semiarid highland regions with a rainfall between 250 and 400 mm per year. In spite of the improvement of crop technology, the natural factors hamper getting an optimal yield. The National Institute for Forestry, Agriculture and Livestock (INIFAP) is a government research institute from Mexico, whose main objective is the genetic breeding of strategic crops, like P. vulgaris L. The drought tolerance studies particularly focus on the selection of bean tolerant genotypes, which are subjected to stress conditions, by means of monitoring parameters such as yield and seed weight, plus some agronomic indicators such as harvest index. The results of these works have led to obtain cultivars with higher drought tolerance such as Pinto Villa and Pinto Saltillo. Significant achievements have been recently made in understanding the molecular basis of stress plant responses. Several studies have shown that plants under drought stress present changes in gene expression related to cell signalling, transcriptional and translational regulation, water transport and cell protection. In addition, it has been observed that the extreme temperatures and high salt concentrations can cause a water deficiency so, at the molecular level, stress responses have specific and crossover points. The drought can cause secondary stresses, such as nutritional, oxidative and osmotic stress. It is required the identification of more components involved in the response to water deficit, the characterization of these genes will allow a better understanding of the biochemical and physiological mechanisms involved in stress tolerance. Currently, with the support of molecular biology techniques, some genes that confer an advantage for the crop adaptation to unfavourable environments have been identified. The objective of this study is to identify genetic markers associated with phenotypic traits with emphasis on water stress tolerance in P. vulgaris. The establishment of molecular markers linked to drought tolerance would make possible their use for marker-assisted selection in bean breeding programs. Two hundred and eighty two F3:5 families derived from a cross between the drought resistant cultivars Pinto Villa and Pinto Saltillo were evaluated. The families were sowed under a 17x17 simple lattice design. The experiment was conducted between spring-summer seasons in 2010 and 2011, and autumn-winter seasons in 2010 at the Bajio Experimental Station of INIFAP with two treatments (full irrigation and terminal drought). All families were phenotyped and genotyped using molecular markers. Statistical analysis was based on principal component analysis (Eigen Analysis Selection Index Method, ESIM), association analysis between SNP markers and phenotype (SNPassoc package R) and analysis of variance (ANOVA). The ESIM values showed that seed yield, days to flowering, days to physiological maturity and harvest index were outstanding traits in terminal drought treatment, so they could be considered as suitable parameters for drought-tolerance evaluation in P. vulgaris. Nine outstanding families for the ESIM values were identified (PV/PS6, 22, 131, 137, 149, 154, 201, 236 and 273), in addition, these families showed higher values for seed yield compared to the parental cultivars. These families are promising candidates for studies focused on the identification of loci associated to the stress response, and as potential parental cultivars for the development of new varieties of common bean. In the SNPassoc analysis, 83 SNPs were found significantly associated (p<0.0003) with phenotypic traits, obtaining a total of 222 associations, most of which involved the traits days to flowering, reproductive period and total biomass under a codominant genetic model. The functional annotation analysis showed 37 SNPs with different biological functions, 12 of them (9, 18, 28, 39, 61, 69, 80, 106, 115, 128, 136 and 142) stand out by their association to phenotype. The functional annotation suggested a connection with genes related to drought tolerance, such as kinase activity, starch, carbohydrates and proline metabolic processes, responses to oxidative stress, as well as LEA genes and putative transcription factors. In the ANOVA analysis, 72 associations between SNPs and phenotypic traits (F<3.94E- 04) were identified. All of these associations corresponded to 30 SNPs markers and seven phenotypic traits. Weight of 100 seeds and reproductive period were the traits with more associations. Seed yield, harvest index and days to physiological maturity were associated to six SNPs (17, 34, 37, 50, 93 and 107), the SNP37 and SNP107 were identified as located in protein binding genes. The SNP106 and SNP128 were associated with the reproductive period and belonged to genes with kinase activity and genes related to starch metabolic process, respectively. In the case of AFLP markers, 271 associations (F<2.34E-04) were identified. The associations involved 86 AFLPs and all phenotypic traits, being the most frequently associated weight of 100 seeds, days to flowering and reproductive period. Even though it is not possible to perform a functional annotation for AFLP markers, they are proposed as potential markers related to drought resistance in common bean. AFLPs candidates require additional studies such as the sequencing of the respective alleles, identification of these sequences in the reference genome and gene annotation, before their use in marker assisted selection. This work, although requires further validation, proposes both genotypes and genetic markers that could be used in breeding programs of P. vulgaris in order to develop new lines or cultivars with enhanced drought-tolerance.

Efecto sobre el rendimiento productivo y calidad de la canal de la inclusión de guisantes (Pisum sativum) y alberjón (Vicia narbonensis) en el pienso de lechones y cerdos de cebo

Las leguminosas grano presentan un perfil nutricional de gran interés para alimentación de ganado porcino, debido principalmente a su elevado contenido proteico. Sin embargo, la presencia de factores antinutritivos (FAN), que según el género difieren en calidad y cantidad, condiciona la absorción de la proteína, el nutriente más valorado. El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido el estudio del efecto de los principales FAN de guisante y alberjón sobre el rendimiento productivo, de canal y de piezas nobles, cuando sustituyen a la soja, parcial o totalmente, durante la fase estárter y el periodo de engorde de cerdos grasos. Con este motivo se llevaron a cabo 4 ensayos con machos castrados y la misma línea genética: híbrido Duroc x (Landrace x Large white). En el ensayo 1, se estudió la influencia de distintos niveles de inhibidores de proteasas (IP) en el pienso sobre la productividad de lechones durante la fase estárter (40 a 61 días de edad). Para ello, se utilizaron tres variedades de guisantes de invierno que contenían diferentes cantidades de IP, tanto de tripsina (IT) como de quimotripsina (IQ) [unidades de tripsina inhibida/mg (UTI), unidades de quimotripsina inhibida/mg (UQI): 9,87- 10,16, 5,75-8,62 y 12,55-15,75, para guisantes Cartouche, Iceberg y Luna, respectivamente] más elevadas que en la harina de soja 47 (HnaS) y en la soja extrusionada (SE) (UTI/mg - UQI/mg: 0,61-3,56 y 2,36-4,65, para HnaS y SE, respectivamente). El diseño experimental fue al azar, con cuatro tratamientos dietéticos que diferían en las fuentes proteicas y en la cantidad de IP, enfrentando un pienso control de soja a otros tres piensos con guisantes de invierno de las variedades indicadas, que sustituían parcialmente a la soja. Cada tratamiento se replicó cuatro veces, siendo la celda con 6 lechones la unidad experimental. Los animales que consumieron el pienso con guisante Cartouche tuvieron más ganancia media diaria (GMD) que el resto (P < 0,001) con el mismo consumo medio diario (CMD) e índice de conversión (IC). No hubo diferencias significativas entre los animales del pienso control y los que consumieron piensos con guisantes Iceberg y Luna. En el ensayo 2 la leguminosa objeto de estudio fue el alberjón y su FAN el dipéptido _Glutamyl-S-Ethenyl-Cysteine (GEC). El diseño y el periodo experimental fueron los mismos que en el ensayo 1, con cuatro dietas que variaban en el porcentaje de alberjones: 0%, 5%, 15% y 25%, y de GEC (1,54% del grano). Los lechones que consumieron el pienso con 5% tuvieron un CMD y GMD más elevado (P < 0,001), con el mismo IC que los animales pertenecientes al tratamiento 0%. Los índices productivos empeoraron significativamente y de manera progresiva al aumentar el porcentaje de alberjones (15 y 25%). Se obtuvieron ecuaciones de regresión con estructura polinomial que fueron significativas tanto para el nivel de alberjón como para la cantidad de GEC presente en el pienso. El ensayo 3 se efectuó durante el periodo de engorde, sustituyendo por completo la soja a partir de los 84 días de edad con las tres variedades de guisantes de invierno, observando el efecto sobre el rendimiento productivo, de canal y piezas nobles. El diseño, en bloques completos al azar, tuvo cuatro tratamientos según el guisante presente en el pienso y, por lo tanto, los niveles de IP: Control-soja, Cartouche, Iceberg y Luna, con 12 réplicas de 4 cerdos por tratamiento. De 84 a 108 días de edad los animales que consumieron los piensos Control-soja e Iceberg, tuvieron el mismo CMD y GMD, empeorando en los cerdos alimentados con Luna y Cartouche (P < 0,05). El IC fue igual en los tratamientos Control-soja e Iceberg, ocupando una posición intermedia en Cartouche y peor en los cerdos del pienso Luna (P < 0,001). De 109 a 127 días de edad la GMD y el IC fueron iguales, con un CMD más elevado en Control-soja e Iceberg que en los cerdos que consumieron Cartouche y Luna (P < 0,05). No hubo diferencias significativas durante el acabado (128 a 167 días de edad). Globalmente el CMD y GMD fueron más elevados en los cerdos que comieron los piensos Iceberg y Control-soja, empeorando por igual en los que comieron Cartouche y Luna (P < 0,05); el IC fue el mismo en todos los tratamientos. No se observaron diferencias en los datos relacionados con peso y rendimiento de canal y piezas nobles (jamón, paleta y chuletero), ni del contenido de grasa intramuscular en el lomo y proporción de ácidos grasos principales (C16:0, C18:0, C18:1n-9) en la grasa subcutánea. En el ensayo 4, realizado durante el periodo de engorde (60 a 171 días de edad), se valoró el efecto de dietas con distintos niveles de alberjones, y en consecuencia de su factor antinutritivo el dipéptido GEC, sobre el rendimiento productivo y la calidad de la canal y piezas nobles. El diseño fue en cuatro bloques completos al azar, con cuatro tratamientos según el porcentaje de inclusión de alberjón en el pienso: 0%, 5%, 15% y 25%, con 12 réplicas por tratamiento y cuatro cerdos en cada una de ellas. El tratamiento con 5% mejoró la GMD al final de la fase de cebo (152 días de vida) y, junto con el 0%, presentaron los resultados más favorables de peso e IC al final del ensayo (171 días de vida). Del mismo modo, el peso y rendimiento de canal fueron más elevados en los cerdos alimentados con los tratamientos 0% y 5% (P < 0,001). Piensos con el 15 y 25% de alberjones empeoraron los resultados productivos, así como el rendimiento y peso de canal. Sucedió lo mismo con el peso de las piezas nobles (jamón, paleta y chuletero), significativamente superior en 0% y 5% frente a 15% y 25%, siendo los cerdos que consumieron este último pienso los peores. Por el contrario el rendimiento de jamón y chuletero fue más elevado en los cerdos de los tratamientos 25% y 15% que en los que consumieron los piensos con 5% y 0% (P < 0,001); en el rendimiento de paletas se invirtieron los resultados, siendo mayores en los animales de los tratamientos 0% y 5% (P < 0,001). Se obtuvieron ecuaciones de regresión polinomial, para estimar las cantidades de inclusión de alberjones y de GEC más favorables desde el punto de vista productivo, así como los contrastes ortogonales entre los distintos tratamientos. ABSTRACT The grain legumes have a nutritional profile of great interest to feed pigs, mainly due to high protein content. However, the presence of antinutritional factors (ANF), which differ in quality and quantity according to gender, hinder the absorption of the protein, the most valuable nutrient. The aim of this thesis was to study the effect of the main ANF of pea and narbon vetch (NV) on productive performance, of the carcass and main lean cuts, when replacing soybean, partially or totally, during the starter phase and the fattening period of heavy pigs. For this reason were carried four trials with barrows and the same genetic line: Duroc hybrid x (Landrace x Large white). In trial 1, was studied the influence of different levels of protease inhibitors (PI) in the diet over productivity of piglets during the starter phase (40-61 days of age). For this, were used three varieties of winter peas containing different amounts of PI, both trypsin (TI) and chymotrypsin (CI) [inhibited units/mg trypsin (TIU), inhibited units/mg chymotrypsin (CIU): 9.87 - 10.16, 5.75 - 8.62 and 12.55 - 15.75, for peas Cartouche, Iceberg and Luna, respectively] higher than in soybean meal 47 (SBM) and soybeans extruded (SBE) (TIU/mg - CIU/mg: 0.61 - 3.56 and 2.36 - 4.65 for SBM and SBE, respectively). The design was randomized with four dietary treatments differing in protein sources and the amount of PI, with a control diet of soybean and three with different varieties of winter peas: Cartouche, Iceberg and Luna, which partially replace soybean. Each treatment was replicated four times, being the pen with 6 piglets the experimental unit. Pigs that ate the feed with pea Cartouche had better growth (ADG) than the rest (P < 0.001), with the same average daily feed intake (ADFI) and feed conversion ratio (FCR). There were no significant differences between piglets fed with control diet and those fed Iceberg and Luna diets. In trial 2 the legume under study was the NV and your ANF the dipeptide _Glutamyl FAN-S-Ethenyl-Cysteine (GEC). The experimental period and the design were the same as in trial 1, with four diets with different percentage of NV: 0%, 5%, 15% and 25%, and from GEC (1.52% of the grain). The piglets that consumed the feed containing 5% had higher ADG and ADFI (P < 0.05), with the same FCR that pigs belonging to the 0% treatment. Production rates worsened progressively with increasing percentage of NV (15 and 25%). Were obtained regression equations with polynomial structure that were significant for NV percentage and amount of GEC present in the feed. The test 3 was carried out during the fattening period, completely replace soy from 84 days of age with three varieties of winter peas, observing the effect on the yield, carcass and main lean cuts. The design, randomized complete blocks, had four treatments with different levels of PI: Control-soy, Cartouche, Iceberg and Luna, with 12 replicates of 4 pigs per treatment. From 84 to 108 days of age the pigs fed with Control-soy and Iceberg feed, had the same ADFI and ADG, worsening in pigs fed with Luna and Cartouche (P < 0.05). The FCR was similar in diets Control-soy and Iceberg, occupying an intermediate position in Cartouche and worse in pigs fed with Luna (P < 0.001). From 109-127 days of age the ADG and FCR were equal, with higher ADFI in pigs fed with Control-soy and Iceberg, regarding pigs fed with Cartouche and Luna (P < 0.05). There was no difference in the finishing phase (128-167 days of age). In global period, the ADFI and ADG were higher in pigs that ate Control-soy and Iceberg, and worse in those who ate Cartouche and Luna. The FCR was the same in all treatments. No significant differences were observed in the data related to weight and carcass yield, main lean cuts (ham, shoulder and loin chop) and intramuscular fat loin content and major fatty acids proportion (C16:0, C18:0, C18:1n-9) of subcutaneous fat. In experiment 4, made during the fattening period (60-171 days of age), was assessed the effect of diets with different levels of NV, and consequently of GEC, in the performance and quality of carcass and main lean cuts. There was a completely randomized design with four dietary treatments differing in percentage of NV: 0%, 5%, 15% and 25%, with 12 replicates per treatment and four pigs each. Treatment with 5% improved the ADG at the end of the fattening phase (152 days of age) and, together with 0%, showed the most favorable body weight and FCR at the end of the trial (171 days of age). Similarly, the weight and performance of carcass were higher for pigs fed with diets 0% and 5% (P < 0.05). Diets with 15 and 25% worsened the productive and carcass results. The weight of the main lean cuts (ham, shoulder and loin chop) was significantly higher in 0% and 5% vs 15% and 25%.The diet 25% was the worst of all. By contrast the performance of ham and loin chop was higher in pigs fed with diets 25% and 15%, that those who ate diets with 5% and 0% (P < 0.001); the results of shoulder performance were reversed, being greater in pigs feed with diets 0% and 5% (P < 0.001). Polynomial regression equations were obtained to estimate the percentage of NV and GEC more favorable from the point of view of production, and orthogonal contrasts between treatments.

Potenciación de la respuesta productiva en rumiantes mediante el empleo de proteínas protegidas

El principal objetivo de esta tesis fue incrementar la eficiencia proteica en las dietas de rumiantes mediante el uso de proteínas protegidas (harina de girasol y guisante de primavera), así como mejorar la predicción de los aportes de proteína microbiana. Una partida de harinas comerciales de girasol (HG) y de guisante de primavera (GP) fueron tratadas con soluciones 4 N de ácido málico (268,2 g/L) o ácido ortofosfórico (130,6 g/L). Para cada harina, ácido y día de tratamiento, dos fracciones de 12,5 kg fueron pulverizadas sucesivamente en una hormigonera con la solución de ácido correspondiente mediante un pulverizador de campo. Las dos fracciones fueron mezcladas posteriormente y se dejaron reposar durante 1 h a temperatura ambiente. La mezcla fue luego secada en una estufa de aire forzado a 120 ºC durante 1 h. La estufa fue apagada inmediatamente después y el material tratado se mantuvo dentro de ésta hasta la mañana siguiente. El material fue removido durante el proceso de secado cada 30 min durante las primeras 2 h y cada 60 min durante las 5 h posteriores. Este proceso se repitió hasta conseguir las cantidades de harinas tratadas necesarias en los distintos ensayos. En el primer experimento (capitulo 3) se llevaron a cabo estudios de digestión ruminal e intestinal para evaluar los efectos de la aplicación de las soluciones ácidas indicadas y calor a fin de proteger las proteínas de HG y GP contra la degradación ruminal. Estos estudios se realizaron con tres corderos canulados en el rumen y en el duodeno. El estudio de digestión ruminal fue realizado en tres periodos experimentales en los que los corderos fueron alimentados sucesivamente con tres dietas isoproteicas que incluían HG y GP, sin tratar o tratadas con ácidos málico u ortofosfórico. Cada periodo experimental de 21 días incluyó sucesivamente: 10 días de adaptación a las dietas, un estudio del tránsito ruminal de las partículas de HG y GP (días 11 a 14), y la incubación de las muestras de ambos alimentos en bolsas de nailon (días 15–21). Las harinas incubadas en cada periodo experimental correspondieron a las que fueron incluidas en las dietas. Las bacterias ruminales fueron marcadas desde el día 11 hasta el día 21 del periodo experimental mediante infusión intra-ruminal continua con una fuente de 15N. Tras finalizar las incubaciones in situ el día 21 el rumen fue vaciado en cada periodo para aislar las bacterias asociadas a la fase sólida y liquida del rumen. El estudio de digestión intestinal fue realizado veinte días después del final del estudio ruminal a fin de eliminar el enriquecimiento en 15N de la digesta. En este estudio se incubaron muestras compuestas obtenidas mediante la combinación de los diferentes residuos no degradados en el rumen de forma que fuesen representativas de la composición química de la fracción no degradada en el rumen (RU). En esta fase los corderos fueron alimentados con la dieta sin tratar para determinar la digestibilidad de las harinas tanto tratadas como sin tratar mediante la técnica de las bolsas móviles. Además, las proteínas contenidas en las harinas tratadas y sin tratar, así como en las muestras correspondientes a los residuos a 0 h, las muestras compuestas anteriormente indicadas y las muestras no digeridas intestinalmente fueron extraídas y sometidas a electroforesis para determinar el sitio de digestión de las diferentes fracciones proteicas. Las estimaciones de la RU y la digestibilidad intestinal de la materia seca, la materia orgánica (solamente para RU), la proteína bruta (PB) y el almidón (solamente en GP) fueron obtenidos considerando la contaminación microbiana y las tasas de conminución y salida de partículas. Las estimaciones de RU y de la digestibilidad intestinal disminuyeron en todas las fracciones evaluadas de ambos alimentos al corregir por la contaminación microbiana acaecida en el rumen. Todas las estimaciones de RU aumentaron con los tratamientos de protección, incrementándose también la digestibilidad intestinal de la materia seca en la HG. Los bajos valores de la digestibilidad de la proteína de GP tratado y sin tratar sugieren la presencia de algún factor antitripsico no termolábil es esta harina. Los tratamientos de protección incrementaron consistentemente la fracción de materia seca y PB digerida intestinalmente en los dos alimentos, mientras que la fracción de almidón en la muestra de GP solamente aumentó numéricamente (60,5% de media). Sin embargo, los tratamientos también redujeron la fermentación de la materia orgánica, lo cual podría disminuir la síntesis de proteína microbiana. Los estudios de electroforesis muestran la práctica desaparición de la albumina por la degradación ruminal en ambos alimentos, así como que los cambios en otras proteínas de la muestra RU fueron más pronunciados en GP que en HG. La composición de las bacterias asociadas con las fases de digesta ruminal sólida (BAS) y líquida (BAL) fue estudiada para revisar la precisión de un sistema de predicción previo que determinaba la infravaloración del aporte de nutrientes correspondiente a las BAS cuando de usa 15N como marcador y las BAL como referencia microbiana (capitulo 4). Al comparar con BAS, BAL mostraron menores contenidos en materia orgánica, polisacáridos de glucosa y lípidos totales y un mayor contenido en PB, así como un mayor enriquecimiento en 15N. Los datos obtenidos en el estudio actual se ajustan bien a la ecuación previa que predice el enriquecimiento en 15N de las BAS a partir del mismo valor en BAL. Esta nueva ecuación permite establecer que se produce una infravaloración de un 22% en el aporte de PB al animal a partir de las BAS sintetizadas si las BAL son usadas como muestras de referencia. Una segunda relación calculada utilizando los valores medios por dieta expuestos en numerosos trabajos encontrados en la literatura confirma la magnitud de este error. Esta infravaloración asociada al uso de BAL como referencia fue mayor para el aporte de glucosa (43,1%) y todavía mayor para el aporte de lípidos (59,9%), como consecuencia de los menores contenidos de ambas fracciones en BAL frente a SAB. Estos errores deberían ser considerados para obtener mayor precisión en la estimación del aporte de nutrientes microbianos y mejorar la nutrición de los rumiantes. En el experimento 2 se realizó un estudio de producción (capitulo 5) para evaluar los efectos del tratamiento de las harinas HG y GP con soluciones de ácido málico o ácido ortofosfórico sobre el crecimiento, el consumo de concentrado y el rendimiento y engrasamiento de las canales de corderos de engorde. Noventa corderos machos de cruce entrefino procedentes de tres granjas comerciales (peso inicial medio = 14,6, 15,3 y 13,3 kg, respectivamente) fueron asignados aleatoriamente a cinco dietas con diferentes niveles de proteína y diferentes tratamientos con ácidos y engordados hasta un peso medio al sacrificio de 25 kg. Las fuentes de proteína en el pienso control (C; PB=18,0%) fueron harina de soja, HG y GP sin tratar. En tres de los piensos experimentales, las harinas tratadas con ácido ortofosfórico sustituyeron a las de HG y GP sin tratar (Control Ortofosfórico, PC; PB=18,0% sobre materia seca), sustituyéndose, además, la harina de soja parcialmente (Sustitución Media Ortofosfórico, MSP; PB=16,7%) o totalmente (Sustitución Total Ortofosfórico, TSP; PB=15,6%). Finalmente, en uno de los piensos el ácido ortofosfórico fue reemplazo por acido málico para proteger ambas harinas (Sustitución Media Málico, MSM; PB= 16,7%). La paja de trigo (fuente de forraje) y el concentrado fueron ofrecidos ad libitum. Dieciocho corderos fueron distribuidos en seis cubículos con tres animales para cada dieta. Los datos fueron analizados según un análisis factorial considerando el peso inicial como covariable y la granja de procedencia como bloque. Los datos de consumo de concentrado y eficiencia de conversión fueron analizados usando el cubículo como unidad experimental, mientras que los datos sobre ganancia media diaria, rendimiento a la canal, grasa dorsal y grasa pélvico renal fueron analizados usando el cordero como unidad experimental. No se encontró ningún efecto asociado con el nivel de PB sobre ninguna variable estudiada. Esto sugiere que usando proteínas protegidas es posible utilizar concentrados con 15,6% de PB (sobre materia seca) disminuyendo así la cantidad de concentrados de proteína vegetal a incluir en los piensos y la calidad de los concentrados proteicos. Los corderos alimentados con la dieta MSM tuvieron mayores ganancias medias diarias (15,2%; P= 0,042), y mejores rendimiento a la canal en caliente (1,3 unidades porcentuales; P= 0,037) que los corderos alimentados con el concentrado MSP. Esto podría ser explicado por los efectos benéficos ruminales del malato o por el mayor efecto de protección conseguido con el ácido málico. ABSTRACT The main objective of this thesis project was to increase the protein efficiency in ruminant diets by using protected protein (sunflower meal and spring pea), and improving the prediction of microbial protein supply. Commercial sunflower meal (SFM) and spring pea (SP) were treated with 4 N solutions (200 mL/kg) of malic acid (268.2 g/L) or orthophosphoric acid (130.6 g/L). Daily, two fractions of 12.5 kg of one of these meals were successively sprayed with the tested acid solution in a concrete mixer using a sprayer. Both fractions were then mixed and allowed to rest for 1 h at room temperature. The blend was then dried in a forced air oven at 120 ºC for 1 h. Then the oven was turned off and the treated material was left in the oven overnight. During the drying process, the material was stirred every 30 min during the first 2 h and then every 60 min for the subsequent 5 h. This process was repeated until the amounts of treated flour needed for the different trials performed. In the first experiment (chapter 3), ruminal and intestinal digestion trials were conducted to study the effects of the application of these acid solutions and heat to protect proteins of SFM and SP against ruminal degradation using three wethers fitted with rumen and duodenum cannulae. The ruminal digestion study was carried out in three experimental periods in which the wethers were successively fed three isoproteic diets including SFM and SP, untreated or treated with malic or orthophosphoric acids. The experimental periods of 21 days included successively: 10 days of diet adaptation, SFM and SP particle ruminal transit study (days 11–14) and ruminal nylon-bag incubations (days 15–21). The meals incubated in each experimental period were those corresponding to the associated diet. Rumen bacteria were labelled from days 11 to 21 by continuous intra-ruminal infusion of a 15N source and the rumen was emptied at the end of in situ incubations in each period to isolate solid adherent bacteria and liquid associate bacteria. The intestinal digestion trial was conducted twenty days after the end of the ruminal studies to eliminate the 15N enrichment in the digesta. The tested samples were composite samples obtained pooling the different ruminally undegraded residues to be representative of the chemical composition of the ruminally undegraded fraction (RU). Wethers were fed the untreated diet to determine the intestinal digestibility of untreated and treated meals using the mobile nylon bag technique. In addition, protein in untreated and treated meals and their 0 h, composite and intestinally undigested samples were extracted and subjected to electrophoresis to determine the digestion site of the different protein fractions. Estimates of the RU and its intestinal digestibility of dry matter, organic matter (only for RU), crude protein (CP) and starch (only in SP) were obtained considering ruminal microbial contamination and particle comminution and outflow rates. When corrected for the microbial contamination taking place in the rumen, estimates of RU and intestinal digestibility decreased in all tested fractions for both feeds. All RU estimates increased with the protective treatments, whereas intestinal digestibility-dry matter also increased in SFM. Low intestinal digestibility-CP values in untreated and treated samples suggested the presence of non-heat labile antitrypsin factors in SP. Protective treatments of both feeds led to consistent increases in the intestinal digested fraction of dry matter and CP, being only numerically different for SP-starch (60.5% as average). However, treatments also reduced the organic matter fermentation, which may decrease ruminal microbial protein synthesis. Electrophoretic studies showed albumin disappearance in both SFM and SP, whereas changes in other RU proteins were more pronounced in SP than SFM. The chemical composition of bacteria associated with solid (SAB) and liquid (LAB) rumen-digesta phases was studied to examine the accuracy of a previous regression system determining the underevaluation of SAB-nutrient supply using 15N as marker and LAB as microbial reference (chapter 4). Compared with SAB, LAB showed lower contents of organic matter, polysaccharide-glucose and total lipids and the opposite for the CP content and the 15N enrichment. Present data fitted well to the previous relationship predicting the 15N enrichment of SAB from the same value in LAB. This new equation allows establishing an underevaluation in the supply of CP from the synthesized SAB in 22.0% if LAB is used as reference. Another relationship calculated using mean diet values from the literature confirmed the magnitude of this error. This underevaluation was higher for the supply of glucose (43.1%) and still higher for the lipid supply (59.9%) as a consequence of the lower contents of these both fractions in LAB than in SAB. These errors should be considered to obtain more accurate estimates of the microbial nutrient supply and to improve ruminant nutrition. A production study was performed in experiment 2 (chapter 5) to examine the effects of treating SFM and SP meals with orthophosphoric or malic acid solutions on growth performance, concentrate intake, and carcass yield and fatness of growing-fattening lambs. Ninety "Entrefino" cross male lambs from three commercial farms (average initial body weights (BW) = 14.6, 15.3 and 13.3 kg) were randomly assigned to five diets with different acid treatment and protein levels, and fattened to an average slaughter weight of 25 kg. Protein sources in the control concentrate (C; CP=18%) were soybean meal and untreated SFM and SP. In three of the experimental concentrates, orthophosphoric acid-treated meals substituted untreated SFM and SP (Orthophosphoric Control, PC; CP=18% dry matter basis), and soybean meal was partially (Medium Substitution Orthophosphoric, MSP; CP=16.7%) or totally removed (Total Substitution Orthophosphoric, TSP; CP=15.6%). In addition, in one concentrate orthophosphoric acid was replaced by malic acid to protect these meals (Medium Substitution Malic, MSM; CP= 16.7%). Wheat straw (roughage source) and concentrate were offered ad libitum. Eighteen lambs were allocated to six pens of three animals on each diet. Data were analyzed using a factorial analysis with initial body weight BW as covariate and farm of origin as block. Data on concentrate intake and feed conversion efficiency were analyzed using pen as experimental unit, while data on average daily gain, carcass yield, dorsal fat, and kidney-pelvic-fat were analyzed with lamb as experimental unit. No effect associated with the CP level was observed on any parameter. This suggests that with protected proteins it is possible to feed concentrates with 15.6% CP (dry matter basis) reducing the quantity of vegetable protein meals to include in the concentrate as well as the quality of the protein concentrates. Lambs feed MSM had higher average daily gains (15.2%; P= 0.042), and better hot carcass yields (1.3 percentage points; P= 0.037) than lambs feed MSP. This probably can be explained by ruminal malate actions and by greater protection effects obtained with malic acid.