Papel regulatório da proteína anexina-1 e de seu derivado Ac2-26 no modelo experimental de asma alérgica em camundongos

A asma é uma doença inflamatória crônica caracterizada por hiper-reatividade das vias aéreas, acúmulo de eosinófilos, secreção de muco e remodelamento. No decorrer do estabelecimento do processo inflamatório, há liberação de mediadores endógenos que atuam limitando a evolução do quadro patológico e garantindo a manutenção da homeostasia (COHN, ELIAS e CHUPP, 2004). Dentre estes recebem destaque os hormônios glicocorticóides, reconhecidos por sua atividade anti-inflamatória, dependente, em parte, da geração de fatores intermediários como a proteína anexina-1 (AnxA1) (KAMAL, FLOWER e PERRETTI, 2005; PERRETTI, 2003). Neste estudo investigou-se o papel regulatório da AnxA1 e do peptídeo derivado Ac2-26 (50 - 200 g/animal) no modelo experimental de asma alérgica murina. Camundongos BALB/c (AnxA1+/+) e depletados do gene codificante para AnxA1 (AnxA1-/-) foram sensibilizados com ovoalbumina (OVA 50 g) e hidróxido de alumínio (5 mg), por via subcutânea. Após 14 dias, foi feito reforço com OVA (25 g), por via intraperitoneal, e nos dias 19, 20 e 21 foram desafiados com OVA (25 g), por via intranasal. O tratamento consistiu na administração intranasal do peptídeo Ac2-26 (50 - 200 g), 1 h antes de cada desafio. As análises foram feitas 24 h após o último desafio e incluíram: i) função pulmonar (resistência e elastância) e hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina (3 27 mg/ml) através de pletismografia invasiva; ii) alterações morfológicas através de histologia clássica; iii) quantificação de colágeno e iv) quantificação de mediadores inflamatórios através de ELISA. Verificou-se que camundongos AnxA1-/-, quando ativamente sensibilizados e desafiados com OVA apresentaram exacerbação do quadro de hiper-reatividade das vias aéreas, assim como do número de eosinófilos no lavado broncoalveolar e no infiltrado peribrônquico, deposição de colágeno e nos níveis de IL-13 em comparação aos controles AnxA1+/+. Em paralelo, observou-se que o peptídeo Ac2-26 levou a uma redução da hiper-reatividade das vias aéreas frente à estimulação com metacolina nos animais AnxA1+/+. O peptídeo Ac2-26 reduziu o infiltrado inflamatório no parênquima pulmonar e o número de eosinófilos peribronquiolares, além da produção de muco no tecido pulmonar e da geração IL-4, IL-13, eotaxina-1 e -2. Em conjunto, nossos achados mostram que os camundongos AnxA1-/- mostraram-se mais responsivos à estimulação antigênica, o que foi indicativo de que a AnxA1 parece exercer um papel regulatório importante sobre a resposta inflamatória alérgica murina. Além disso, o efeito inibitório do peptídeo Ac2-26 sobre a resposta alérgica pulmonar foi indicativo de que este se coloca como um composto anti-inflamatório e anti-alérgico promissor para utilização na terapia da asma.

Difração de raios X por policristais: uma ferramenta para caracterização e determinação estrutural do protótipo a fármaco LASSBio-1755

Novos protótipos de fármacos estão constantemente a ser sintetizados e muitas estruturas cristalinas de outros ainda são desconhecidas. Tão importante quanto o planejamento e síntese de novos fármacos é a sua caracterização estrutural, uma vez que a sua estrutura (conformação) pode estar diretamente relacionada com a ação terapêutica. O uso da difração de raios X tem sido muito importante na determinação estrutural dos novos compostos sintetizados. Neste trabalho foi feita a determinação da estrutura de LASSBio-1755 com os dados de difração de raios X por policristais. Este composto foi sintetizado no Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas (LASSBio) da Universidade Federal do Rio de Janeiro. O composto LASSBio-1755 pertence a uma nova série de compostos cicloalquil-N-acilidrazônicos planejados para o desenvolvimento de protótipos com atividades antinociceptiva e anti-inflamatórios. Este composto cristalizou-se num sistema triclínico com grupo espacial (P ), com parâmetros de cela unitária a = 4,86647(9) Å, b = 9,3108(2) Å, c = 11,3402(2) Å, α = 106,649(1), β = 101,958(1), γ = 82,629(2) e V = 480,30(2) Å3. A estrutura cristalina de LASSBio-1755 consiste em duas fórmulas unitárias por cela unitária (Z = 2), acomodando uma molécula na unidade assimétrica (Z' = 1). O Método de Rietveld foi utilizado para refinar a estrutura cristalina e o indicador de qualidade do ajuste, bem como os fatores R foram, respectivamente: χ2 = 1,131, RBragg = 0,856%, Rwp =4,174% e o Rexp= 3,692%. As técnicas de calorimetria exploratória diferencial, termogravimetria e espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier também foram utilizadas para análise do composto LASSBio-1755 e os seus resultados corroboraram com os obtidos através da técnica de difração de raios X por policristais.

Efeitos da privação de sono paradoxal na resposta inflamatória de ratos e avaliação do efeito antinociceptivo do ATL-1, um análogo sintético de 15-epi-lipoxinas

Sono e imunidade parecem apresentar uma relação de reciprocidade. A ativação do sistema imune altera o padrão de sono e distúrbios do sono podem afetar a função imune. Além disso, é bem descrito que a privação de sono paradoxal (PSP) leva à hiperalgesia e o tratamento com fármacos clássicos, como opióides ou antidepressivos tricíclicos, não é capaz de reverter este quadro. Neste trabalho, avaliamos se a PSP afetaria a resposta inflamatória e a sobrevida em ratos e se o tratamento com um análogo sintético de lipoxinas (ATL-1) seria capaz de reverter a hiperalgesia induzida pela PSP. Todos os protocolos experimentais foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais, da UERJ (CEUA/032/2010). Ratos Wistar machos foram submetidos a 96 h de PSP, induzidas pelo método de plataforma única (PU) ou de múltiplas plataformas modificado (MPM). Após 96 h de PSP os animais foram submetidos ao modelo da bolha de ar ou pleurisia utilizando-se a carragenina como agente flogístico, ou ainda a PSP foi aplicada antes ou após a indução de um modelo de ligação e perfuração do ceco (CLP). Quatro horas após a injeção de carragenina os animais apresentaram um aumento no recrutamento de leucócitos para a cavidade da bolha, porém não houve diferença entre animais PSP e controles. O número total de leucócitos no plasma não se alterou após a injeção de carragenina. Na pleurisia, os animais PSP apresentaram um aumento nos níveis de IL-6, IL-1β e TNF-α no plasma, enquanto apenas IL-1β e IL-6 estavam aumentados no exsudato pleural dos animais que receberam carragenina. O padrão de recrutamento de leucócitos para o local da injúria foi bastante semelhante entre os animais controle e PSP 2 h, 4 h e 24 h após a injeção de carragenina. Houve um aumento progressivo com o tempo, apresentando um pico em 24 h, no entanto, não foi observada diferença significativa na resposta dos grupos PSP. A PSP aplicada antes ou após a indução do CLP reduziu a sobrevida dos animais, mas não alterou o acúmulo de neutrófilos, nos dois protocolos. Quando a PSP foi aplicada antes do CLP, os níveis séricos de IL-6 estavam aumentados nos grupos PSP e PSPCLP, porém quando a PSP foi aplicada após o CLP, ambas IL-6 e IL-1β estavam aumentadas nos grupo PSPCLP. O efeito do tratamento com ATL-1 (10 g/kg, i.v.) na hiperalgesia induzida pela PSP foi determinado através do teste da formalina. O análogo reduziu o número de comportamentos relacionados à dor em animais PSP e controles na fase inflamatória do teste. Nossos resultados demonstraram que a PSP por 96 h aumentou os níveis plasmáticos de citocinas, reduziu a sobrevida dos animais, contudo não foi capaz de alterar o recrutamento de leucócitos frente a um estímulo inflamatório ou infeccioso. O aumento de mediadores inflamatórios observado nesses animais pode estar relacionado à hiperalgesia em animais PSP, uma vez que o tratamento com o ATL-1 reverteu esse efeito, possivelmente através de mecanismos envolvendo sua ação anti-inflamatória.

Produção de IL-1β, IL-6 e IL-8 por fibroblastos estimulados por cimentos endodônticos e submetidos à terapia laser de baixa potência

O sucesso do tratamento endodôntico depende da cuidadosa realização de todas as suas fases, terminando com uma obturação tridimensional que alcance todo o sistema de canais radiculares. Desta forma, os materiais obturadores, ou as substâncias liberadas, entrarão em contato com os tecidos perirradiculares, o que poderá influenciar a resposta inflamatória e o processo de reparo. A terapia laser de baixa potência (TLBP) tem sido estudada quanto à sua ação anti-inflamatória, favorecendo o reparo. O objetivo deste estudo foi investigar a produção das citocinas IL-1β, IL-6 e IL-8 por fibroblastos de gengiva humana (linhagem FMM1) como resposta à presença dos extratos dos cimentos endodônticos AH Plus, MTA Fillapex e EndoSequence BC Sealer, bem como a eficácia da TLBP, neste modelo. Para isto, extratos destes cimentos, recém-manipulados e após 24 h do endurecimento, foram preparados em meio de cultura DMEM fresco, conforme as normas ISO 10993-12. Inicialmente, a citotoxicidade dos cimentos foi avaliada, após a interação das células com a diluição seriada destes extratos (1:1 a 1:16), por meio do ensaio MTT. Para a análise da produção de citocinas, 106 células por poço foram cultivadas em placas de cultura de 24 poços, para a interação com os extratos dos cimentos, na diluição 1:4. Estabeleceram-se os grupos não irradiado e irradiado. No grupo irradiado, as culturas celulares receberam duas irradiações do laser InGaAlP (660 nm, 30 mW, 5 J/cm2 e área do feixe de 0,028 cm2), com intervalo de 12 h. O grupo não irradiado foi submetido às mesmas condições ambientais que o irradiado. Os sobrenadantes das culturas foram coletados, centrifugados, aliquotados e armazenados congelados, para a posterior análise pelo ensaio de ELISA. Todos os dados obtidos (médias erro padrão) foram tratados estatisticamente por ANOVA one-way, complementado pelo teste de Tuckey e ANOVA two-way, com correção de Bonferroni (p< 0,05). A citotoxicidade dos cimentos AH Plus e EndoSequence BC Sealer revelou-se tempo/concentração-dependente, enquanto a do MTA Fillapex mostrou-se concentração-dependente. Os cimentos endodônticos induziram a produção das citocinas IL-1β, IL-6 e IL-8 pelos fibroblastos, sem diferença significativa com os controles (p> 0,05). Somente o LPS de E. coli induziu a secreção de IL-8, com diferença estatística (p< 0,05). A TLBP não foi capaz de modular a produção das citocinas em questão, significativamente.

Fracionamento biomonitorado de fração isolada do extrato hexânico de Pterodon polygalaeoflorus

O gênero Pterodon compreende algumas espécies largamente distribuídas sobre a região central do Brasil. Seus frutos são comercialmente disponíveis no mercado da flora medicinal sendo amplamente utilizados pelas suas propriedades farmacológicas como antirreumático, anti-inflamatório e analgésicas. O objetivo deste trabalho foi biomonitorar o fracionamento do extrato hexânico de Pterodon polygalaeflorus Benth. (ExPpg), utilizando modelos de inflamação aguda (edema de pata e bolha de ar). O fracionamento/sub-fracionamento foi realizado por cromatografia em coluna de sílica e as amostras analisadas por cromatografia em camada fina e cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas. O edema de pata foi induzido em camundongos SW por injeção (s.c.) de carragenina. Uma hora antes da inoculação de carragenina os animais foram tratados v.o. com veículo (EtOH 15%, 1,25% Tween-20), indometacina (10 mg/kg p.c.) ou ExHPpg/frações/sub-frações de Ppg. No modelo bolha de ar, a cavidade foi desenvolvida em camundongos SW através da injeção de ar estéril (s.c.) no dorso e a inflamação induzida por carragenina. Uma hora antes de inocular a carragenina os animais foram tratados (v.o) com o veículo, indometacina (10 mg/kg) ou ExHPpg/Fr2Ppg/sub-frações. Após 4 h o exsudato da bolha foi coletado para contagem total e diferencial de leucócitos (Panótico rápido) e dosagem de proteínas (biureto), e a pele referente à bolha foi removida para análises macroscópica e histológica (HE). Também foi realizado estudo de migração de neutrófilos pelo ensaio do transwell. Após demonstração do efeito antiedematogênico do ExHPpg, este foi fracionado em quatro frações. A fração Fr2Ppg, mais ativa no modelo de edema de pata, também inibiu os diferentes parâmetros inflamatórios avaliados no modelo de bolha de ar, com a menor dose testada, e foi sub-fracionada em cinco sub-frações. Destas, as SF2.1 e SF2.2 foram as que mostraram melhor efeito anti-inflamatório pelo modelo da bolha de ar. Em relação ao grupo controle com carragenina, o ExHppg, Fr2Ppg, SF 2.1 e SF 2.2, na dose 0,02 mg/kg, exerceram inibições de 70,6%, 62,8%, 54,7% e 79% no número total de células no exsudato, reduções de 76,8%, 76,9%, 71,1% e 73,3% na concentração de proteína, respectivamente. Com a dose de 0,2 mg/kg, foram observadas inibições apenas para ExHPpg e SF 2.1, com intensidades menores, na leucometria total (62,9% e 48,62%, respectivamente), e na concentração de proteína para SF 2.1 e SF 2.2 (reduções de 68,2% e 30,4%, respectivamente). As análises macroscópica e histológica mostraram redução importante da vasodilatação e do infiltrado inflamatório pelo tratamento com o ExHppg, Fr2Ppg, SF 2.1 e SF 2.2. No ensaio de transwell a Fr2Ppg exibiu 31,4% de inibição na migração de neutrófilos. As sub-frações SF2.1 e SF2.2 foram avaliadas por GC-MS, identificando-se de diversos compostos majoritários. Em resumo, este trabalho confirma o potencial anti-inflamatório da espécie Pterodon polygalaeflorus e mostra um fracionamento efetivo do ExHPpg quanto à composição e ação anti-inflamatória.

Avaliação das alterações macro-hemodinâmicas, microcirculatórias, gasométricas, metabólicas e inflamatórias secundárias à sedação com dexmedetomidina em um modelo experimental de endotoxemia em hamsters

Pela sua alta incidência, morbidade, mortalidade e custos ao sistema de saúde, a sepse se destaca entre as diversas indicações de internação em unidade de terapia intensiva (UTI). A disfunção da microcirculação tem papel central na gênese e manutenção da síndrome séptica, sendo um marco fisiopatológico desta síndrome. Pacientes críticos invariavelmente estão ansiosos, agitados, confusos, desconfortáveis e/ou com dor. Neste contexto, drogas sedativas são amplamente utilizadas na medicina intensiva. A dexmedetomidina, um agonista potente e altamente seletivo dos receptores alfa-2 adrenérgicos, vem conquistando espaço como o sedativo de escolha nas UTIs por seus efeitos de sedação consciente, redução da duração e incidência de delirium e preservação da ventilação espontânea. Apesar destas possíveis vantagens, a indicação de uso da dexmedetomidina na síndrome séptica ainda carece de conhecimentos sobre seus efeitos na microcirculação e perfusão orgânica. Com o intuito de caracterizar os efeitos microcirculatórios da dexmedetomidina em um modelo murino de endotoxemia que permite estudos in vivo da inflamação e disfunção da perfusão microvascular, hamsters Sírios dourados submetidos à endotoxemia induzida por administração intravenosa de lipopolissacarídeo de Escherichia coli (LPS, 1,0 mg.kg-1) foram sedados com dexmedetomidina (5,0 μg.kg.h-1). A microscopia intravital da preparação experimental (câmara dorsal) permitiu a realização de uma análise quantitativa das variáveis microvasculares e do rolamento e adesão de leucócitos à parede venular. Também foram analisados os parâmetros macro-hemodinâmicos e gasométricos (arterial e venoso portal), as concentrações de lactato arterial e venoso portal, a água pulmonar total e a sobrevivência do animal. Animais não-endotoxêmicos e/ou tratados com solução salina a 0,9% serviram como controles neste experimento. O LPS aumentou o rolamento e a adesão de leucócitos à parede venular, diminuiu a densidade capilar funcional e a velocidade das hemácias nos capilares e induziu acidose metabólica. O tratamento com dexmedetomidina atenuou significativamente estas respostas patológicas (p < 0,05). A frequência de pulso dos animais foi significativamente reduzida pela droga (p < 0,05). Outros resultados não foram tão expressivos (estatisticamente ou clinicamente). Estes resultados indicam que a utilização de dexmedetomidina produz um efeito protetor sobre a microcirculação da câmara dorsal de hamsters endotoxêmicos. Efeitos anti-inflamatórios da dexmedetomidina sobre os leucócitos e o endotélio poderiam melhorar a perfusão capilar e representar o mecanismo in vivo de ação da droga na microcirculação.

Two Immunoregulatory Peptides with Antioxidant Activity from Tick Salivary Glands

Ticks are blood-feeding arthropods that may secrete immunosuppressant molecules, which inhibit host inflammatory and immune responses and provide survival advantages to pathogens at tick bleeding sites in hosts. In the current work, two families of immunoregulatory peptides, hyalomin-A and -B, were first identified from salivary glands of hard tick Hyalomma asiaticum asiaticum. Three copies of hyalomin-A are encoded by an identical gene and released from the same protein precursor. Both hyalomin-A and -B can exert significant anti-inflammatory functions, either by directly inhibiting host secretion of inflammatory factors such as tumor necrosis factor-alpha, monocyte chemotectic protein-1, and interferon-gamma or by indirectly increasing the secretion of immunosuppressant cytokine of interleukin-10. Hyalomin-A and -B were both found to potently scavenge free radical in vitro in a rapid manner and inhibited adjuvant-induced inflammation in mouse models in vivo. The JNK/SAPK subgroup of the MAPK signaling pathway was involved in such immunoregulatory functions of hyalomin-A and -B. These results showed that immunoregulatory peptides of tick salivary glands suppress host inflammatory response by modulating cytokine secretion and detoxifying reactive oxygen species.

抗HIV药物的体外筛选和研究方法

　合适的体内外药物研究方法是研究和开发新药中最关键的环节之一。由于至今尚无理想的艾滋病 (AIDS) 动物模型,目前抗人免疫缺陷病毒(HIV) 药物的筛选和研究仍然主要依赖于各种体外的筛选和研究方法。 本文简要综述了抗HIV 药物的体外筛选和研究方法。

脂质体携载抗HIV-1药物

由于mV耐药株的产生、特殊器官和细胞中}Ⅱv的隐匿、抗}Ⅱv药物的毒副反应及半衰期短等问题的出现．促 使人们寻找高效低毒和具有靶向性的抗Ⅲv药物。脂质体具有被动或主动靶向病毒复制活跃和贮存区、细胞内靶向和控制药 物释放、延长药物半衰期、提高药效和降低毒副作用等优点．是潜在携载抗}Ⅱv药物的良好载体。

Sifuvirtide, a potent HIV fusion inhibitor peptide

Enfuvirtide (ENF) is currently the only FDA approved HIV fusion inhibitor in clinical use. Searching for more drugs in this category with higher efficacy and lower toxicity seems to be a logical next step. In line with this objective, a synthetic peptide

Kinetic study of paracetamol on prolidase activity in erythrocytes by capillary electrophoresis with Ru(bpy)(3)(2+) electrochemiluminescence detection

We explored the CE with Ru(bpy)(3)(2+) electrochemiluminescence detection for the kinetic study of drug-enzyme interaction. Effects of four nonsteroidal anti - inflammatory drugs including aspirin, paracetamol, sodium salicylate and phenacetin on prolidase (PLD) activity in erythrocytes were investigated. Aspirin enhanced PLD activity whereas the other three had inhibiting effects. This may reveal their different effects on the collagen biosynthesis and catabolism that influence tumor invasiveness. Kinetic study of paracetamol on PLD showed that the value of Michaelis constant Km for PLD was 1.23 mM. The mechanism of PLD inhibition by paracetamol is noncompetitive inhibition, and the inhibitor constant K-i value obtained in our research was 9.73 x 10(3) mu g/L.

A study on the interaction between ibuprofen and bilayer lipid membrane

Ibuprofen is a well-known nonsteroidal anti-inflammatory drug, which can interact with lipid membranes. In this paper, the interaction of ibuprofen with bilayer lipid membrane was studied by UV-vis spectroscopy, cyclic voltammetry and AC impedance spectroscopy. UV-vis spectroscopy data indicated directly that ibuprofen could interact with lipid vesicles. In electrochemical experiments, ibuprofen displayed a biphasic behavior on bilayer lipid membrane supported on a glassy carbon electrode. It could stabilize the lipid membrane in low concentration, while it induced defects formation, even removed off bilayer lipid membrane from the surface of the electrode with increasing concentration. The mechanism about the interaction between ibuprofen and supported bilayer lipid membrane was discussed.

Studies on the non-covalent complexes between oleanolic acid and cyclodextrins using electrospray ionization tandem mass spectrometry

Non-covalent inclusion complexes formed between an anti-inflammatory drug, oleanolic acid (OA), and alpha-, beta- and gamma-cyclodextrins (CDs) were investigated by means of solubility studies and electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MSn). The order of calculated association constants (K-1:1) of complexes between OA and different CDs in solution is in good agreement with the order of their relative peak intensities and the relative CID energies of the complexes under the same ESI-MSn conditions. These results indicate a direct correlation between the behaviors of solution- and gas-phase complexes. ESI-MS can thus be used to evaluate solution-phase non-covalent complexes successfully. The experimental results show that the most stable 1:1 inclusion complexes between three CDs and OA can be formed, but 2:1 CD-OA complexes can be formed with beta- and gamma-CDs. Multi-component complexes of alpha-CD-OA-beta-CD (1:1:1), alpha-CD-OA-gamma-CD (1:1:1) and beta-CD-OA-gamma-CD (1:1:1) were found in equimolar CD mixtures with excess OA. The formation of 2:1 and multi-component 1:1:1 non-covalent CD-OA complexes indicates that beta- and gamma-CD are able to form sandwich-type inclusion non-covalent complexes with OA. The above results can be partly supported by the relative sizes of OA and CD cavities by molecular modeling calculations.

Zebrafish thymidylate synthase binds to its own mRNA in vitro and in vivo

Thymidylate synthase (TS), an essential enzyme for DNA de novo synthesis, is a critical therapeutic target in cancer therapy. Previous study has shown that TS was able to bind to its own mRNA in human and E.coli, resulting in translational repression. Zebrafish is the best animal model for vertebrate study. In order to study the regulatory mechanism of zebrafish TS, the enzyme were expressed in E. coli BL21 (DE3) and it was purified to homogeneity. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was used to detect the interaction of zebrafish TS protein and its own TS transcript in vitro and the results showed that zebrafish TS could bound with its own mRNA specifically. Further study revealed that zebrafish TS was able to interact with its own mRNA in vivo using immunoprecipitation : RT-PCR technique. The results provide evidence that zebrafish may be developed as an useful model for studying the anti-metabolism agents.

Drug-protein interaction studied by technique of microdialysis combined with high performance liquid chromatography

Drug-protein binding is an important process in determining the activity and fate of a pharmaceutical agent once it has entered the body. This review examines the method of microdialysis combined with high-performance liquid chromatography (HPLC) that has been developed;by ours to study such interactions, in which the microdialysis was applied to sample the free drug in the mixed solution of drug with protein, and HPLC to quantify the concentration of free drug in the microdialysate. This technique has successfully been used for determining various types of binding interactions between the low affinity drugs, high affinity drugs and enantiomers to HSA. For the case of competitive binding of two drugs to a protein in solution, a displacement equation has been derived and examined with four nonsteroidal anti-inflammatory drugs and HSA as model drugs and protein, respectively. Microdialysis with HPLC was adopted to determine simultaneously the free solute and displacing agent in drug-protein solutions. The method is able to locate the binding site and determine affinity constants even up to 10(7) L/mol accurately.