Fracionamento biomonitorado de fração isolada do extrato hexânico de Pterodon polygalaeoflorus

O gênero Pterodon compreende algumas espécies largamente distribuídas sobre a região central do Brasil. Seus frutos são comercialmente disponíveis no mercado da flora medicinal sendo amplamente utilizados pelas suas propriedades farmacológicas como antirreumático, anti-inflamatório e analgésicas. O objetivo deste trabalho foi biomonitorar o fracionamento do extrato hexânico de Pterodon polygalaeflorus Benth. (ExPpg), utilizando modelos de inflamação aguda (edema de pata e bolha de ar). O fracionamento/sub-fracionamento foi realizado por cromatografia em coluna de sílica e as amostras analisadas por cromatografia em camada fina e cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas. O edema de pata foi induzido em camundongos SW por injeção (s.c.) de carragenina. Uma hora antes da inoculação de carragenina os animais foram tratados v.o. com veículo (EtOH 15%, 1,25% Tween-20), indometacina (10 mg/kg p.c.) ou ExHPpg/frações/sub-frações de Ppg. No modelo bolha de ar, a cavidade foi desenvolvida em camundongos SW através da injeção de ar estéril (s.c.) no dorso e a inflamação induzida por carragenina. Uma hora antes de inocular a carragenina os animais foram tratados (v.o) com o veículo, indometacina (10 mg/kg) ou ExHPpg/Fr2Ppg/sub-frações. Após 4 h o exsudato da bolha foi coletado para contagem total e diferencial de leucócitos (Panótico rápido) e dosagem de proteínas (biureto), e a pele referente à bolha foi removida para análises macroscópica e histológica (HE). Também foi realizado estudo de migração de neutrófilos pelo ensaio do transwell. Após demonstração do efeito antiedematogênico do ExHPpg, este foi fracionado em quatro frações. A fração Fr2Ppg, mais ativa no modelo de edema de pata, também inibiu os diferentes parâmetros inflamatórios avaliados no modelo de bolha de ar, com a menor dose testada, e foi sub-fracionada em cinco sub-frações. Destas, as SF2.1 e SF2.2 foram as que mostraram melhor efeito anti-inflamatório pelo modelo da bolha de ar. Em relação ao grupo controle com carragenina, o ExHppg, Fr2Ppg, SF 2.1 e SF 2.2, na dose 0,02 mg/kg, exerceram inibições de 70,6%, 62,8%, 54,7% e 79% no número total de células no exsudato, reduções de 76,8%, 76,9%, 71,1% e 73,3% na concentração de proteína, respectivamente. Com a dose de 0,2 mg/kg, foram observadas inibições apenas para ExHPpg e SF 2.1, com intensidades menores, na leucometria total (62,9% e 48,62%, respectivamente), e na concentração de proteína para SF 2.1 e SF 2.2 (reduções de 68,2% e 30,4%, respectivamente). As análises macroscópica e histológica mostraram redução importante da vasodilatação e do infiltrado inflamatório pelo tratamento com o ExHppg, Fr2Ppg, SF 2.1 e SF 2.2. No ensaio de transwell a Fr2Ppg exibiu 31,4% de inibição na migração de neutrófilos. As sub-frações SF2.1 e SF2.2 foram avaliadas por GC-MS, identificando-se de diversos compostos majoritários. Em resumo, este trabalho confirma o potencial anti-inflamatório da espécie Pterodon polygalaeflorus e mostra um fracionamento efetivo do ExHPpg quanto à composição e ação anti-inflamatória.

Modulação das vias de sinalização intracelulares pelo sistema NAD(P)H oxidase em melanoma humano

Evidências têm mostrado que as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas pela NAD(P)H oxidase são importantes moduladores de diversas funções celulares como migração, crescimento, proliferação e sobrevivência. Estudos recentes demonstraram o envolvimento da atividade da NAD(P)H oxidase no crescimento e sobrevivência de células de melanoma. Neste trabalho, investigamos o efeito da inibição da NAD(P)H oxidase por difenileneiodônio (DPI) sobre o crescimento das células de melanoma humano MV3 e observamos que este composto reduziu o crescimento destas células em aproximadamente 50%. A inibição da NAD(P)H oxidase induziu mudanças no formato celular, com arredondamento, diminuição do espraiamento e descolamento celular. Esta redução foi acompanhada por um rearranjo do citoesqueleto de actina, diminuição da fosforilação no resíduo Tyr397 da quinase de adesão focal (FAK) e redução na associação de FAK com actina e com a tirosina quinase c-Src. Isto indica que a inibição da geração de ROS está modulando negativamente vias de sinalização ativadas por integrinas, o que freqüentemente conduz a um tipo particular de morte celular conhecida por anoikis. Comprovando a ocorrência deste fenômeno, observamos que a inibição da atividade da NAD(P)H oxidase aumentou a apoptose das células de melanoma e induziu a ativação da caspase-3. Nossos resultados mostram ainda que a inibição da viabilidade celular por DPI foi revertida com o pré-tratamento das células MV3 com um inibidor de tirosina fosfatases (ortovanadato de sódio). Em resumo, este estudo mostra que a geração de ROS por NAD(P)H oxidase está envolvida nos mecanismos de sobrevivência em células de melanoma, uma vez que afetam as vias de sinalização dependentes de FAK-Src, através da inibição da atividade de proteína tirosina fosfatases.

Avaliação estereológica glomerular em rins de ratos após isquemia-reperfusão por clampeamento arteriovenoso e arterial

A técnica de isquemia-reperfusão tem sido utilizada em cirurgias conservadoras do rim como a nefrectomia parcial e em transplantes renais. Para se realizar a isquemia pode-se fazer o bloqueio do fluxo sanguíneo da artéria renal ou o bloqueio simultâneo da artéria e da veia renal. O evento isquêmico acarreta em dano celular ao rim principalmente pelo estresse oxidativo local e a liberação de radicais livres assim como o aumento da resposta inflamatória. Diversos autores verificaram lesão renal após a isquemia-reperfusão, porém, apenas testes funcionais foram realizados até o momento. Os autores que tentaram avaliar a lesão morfológica do rim apenas fizeram a quantificação de escores subjetivos. O nosso objetivo é avaliar por quantificação estereológica o dano causado pela isquemia-reperfusão comparando o clampeamento somente arterial com o clampeamento arteriovenoso. Utilizamos 24 ratos wistar, machos, de quatro meses de idade. Os animais foram divididos em três grupos: o grupo Sham (n=8), o grupo de clampeamento somente da artéria renal (n=8) e o grupo de clampeamento simultâneo da artéria e da veia renal (n=8). Os animais foram submetidos a laparotomia mediana. Os animais do grupo Sham permaneceram os 60 minutos anestesiados mas sem obstrução do fluxo sanguíneo de seus vasos renais. Os animais do grupo de clampeamento arterial foram submetidos à clampeamento de sua arterial renal esquerda por 60 minutos e os animais do grupo de clampeamento arterial e venoso tiveram seus vasos renais esquerdos clampeados simultaneamente e em bloco pelo mesmo tempo. Após os 60 minutos os animais foram suturados e mantidos por 30 dias em caixas próprias sendo mortos por sobredose anestésica após decorrido esse tempo. Os rins foram coletados e mantidos em solução de formalina tamponada e posteriormente processados para análise histológica e estereológica. Foram analisados a densidade volumétrica (Vv) dos glomérulos, o número de glomérulos/mm3(Nv) e o volume glomerular médio (VGM). A Vv e Nv se encontrou reduzida nos rins esquerdos submetidos à isquemia mas foi somente significativa nos animais do grupo de clampeamento arterial e venoso. Mesmo usando o rato como modelo animal experimental, a partir de nossos resultados recomendamos o uso do clampeamento somente arterial nos casos em que mínina lesão ao rim é imperiosa.

Influência da superexpressão da claudina-3 na radiorresposta de células de câncer de cólon

O câncer colorretal (CCR) é o terceiro tipo de câncer mais incidente no mundo para o sexo masculino, o segundo para o sexo feminino e a radioterapia é um dos tratamentos de primeira linha no combate a este tipo de câncer. Durante a progressão do CCR as células sofrem alterações morfogenéticas, sendo a desorganização do complexo juncional apical (CJA) um dos eventos iniciais desse processo. As junções oclusivas (JTs) são um dos principais componentes da CJA e desempenham papel importante no controle do fluxo paracelular, na determinação da polaridade celular e na transdução de sinais relacionados com a progressão tumoral. As claudinas são proteínas transmembrana, constituintes das JTs e cumprem um importante papel no controle desses eventos. Alterações na expressão das claudinas são observadas em tumores de diferentes órgãos e têm sido relacionadas com a progressão tumoral. No entanto os mecanismos que regulam essas alterações e sua consequência na progressão do CCR são poucos conhecidos. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar a influência da superexpressão da claudina-3 na radiorresposta de células CCR. Nossos resultados mostraram que a superexpressão de claudina-3 minimiza alterações morfológicas causadas pela radiação, causa diminuição da resistência elétrica transepitelial e não tem efeito na permeabilidade a macromoléculas após a irradiação. Além disso, observamos que a superexpressão de claudina-3 aumenta o potencial proliferativo das células e que esta característica torna as células mais sensíveis a radiação. Porém quando avaliamos eventos celulares relacionados a progressão tumoral observamos que apesar da radiação diminuir a capacidade migratória das progênies, as células que superexpressam claudina-3 apresentam migração mais elevada. Além disso, verificamos que a superexpressão de claudina-3 diminui a invasão e a capacidade de formação de colônias frente ao tratamento com a radiação. Em seguida fomos avaliar o efeito da inibição das vias de proliferação (MEK/ERK) e sobrevivência (PI3K-Akt) na resposta das células que superexpressam claudina-3 frente a radiação. Observamos que a inibição de MEK é capaz de sensibilizar as células que superexpressam claudina-3 à radiação no ensaio de proliferação celular, no entanto a inibição de MEK e PI3K antes da exposição à radiação é capaz aumentar a migração e a capacidade de formação de colônias de células que superexpressam claudina-3 contribuindo para o aumento do potencial maligno. Em conjunto nossos resultados mostram que a superexpressão de claudina-3 contribui para um fenótipo mais maligno, no entanto frente ao tratamento com a radiação é capaz de sensibilizar as células.

Transplante de células de medula óssea (BMCs) de camundongos em modelo experimental para o desenvolvimento de aterosclerose: aspectos estruturais, ultraestrutuais e moleculares da aorta

As células tronco são caracterizadas pela sua capacidade de se diferenciar em várias linhagens de células e exibir um pontente efeito parácrino. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da terapia com células da medula óssea (BMCs) na glicose sanguínea, no metabolismo lipídico e remodelamento da parede da aorta em um modelo experimental para aterosclerose. Camundongos C57BL/6 foram alimentados com uma dieta controle (grupo CO) ou uma dieta aterogênica (grupo AT - 60% gordura). Após 16 semanas, o grupo AT foi dividido em quatro sub grupos: grupo AT 14 dias e o grupo AT 21 dias receberam uma injeção de PBS na veia caudal e mortos 14 e 21 dias após respectivamente; grupo AT-BMC 14 dias e AT-BMC 21 dias que receberam uma injeção com BMCs na veia caudal e mortos 14 e 21 dias após, respectivamente. O grupo CO foi sacrificado juntamente com outros grupos. O transplante BMCs reduziu os niveis de glicose, triglicerídeos e colesterol total no sangue. Não houve diferença significativa em relação à massa corporal entre os grupos transplantados e não transplantados, sendo todos diferentes do grupo CO. Não houve diferença significativa na curva glicemica entre os grupos AT 14 dias, AT-BMC 14 dias e AT 21 dias e estes diferentes do grupo CO e do grupo AT-BMC 21 dias. O Qa (1/mm2) foi quantitativamente reduzido no grupo AT 14 dias e AT 21 dias quando comparado ao grupo CO. Este Qa se mostrou elevado no grupo AT-BMC 21 dias quando comparado a todos os grupos. O aumento da expessura da parede da aorta foi observado em todos os grupos aterogênicos, entretanto o aumento da espessura foi significativamente menor no grupo AT-BMC 21 dias em relação ao grupo AT 14 dias e AT 21 dias. A percentagem de fibras elásticas se apresentou significativamente maior no grupo AT 21 dias quando comparado ao CO e AT-BMC 21 dias. Não houve diferença significativa entre o grupo CO e AT-BMC 21 dias. Vacúolos na túnica média, delaminação e o adelgaçamento das lamelas elásticas foram observados nos grupos AT-14 dias e AT-21 dias. O menor número destes foi visualizado no grupo AT-BMC 14 dias e AT-BMC 21 dias. A imunomarcação para alfa actina de músculo liso (α-SMA) e fator de crescimento vascular e endotelial (VEGF) mostrou menor marcação em grupos transplantados com BMCs. A marcação para antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) mostrou-se mais expressiva no grupo AT-BMC 21 dias grupo. Marcação para CD105, CD133 e CD68 foi observada nos grupos AT 14 dias e AT 21 dias. Estas marcações não foram observadas nos grupos AT-BMC 14 dias e AT-BMC 21 dias. Nas eletromicrografias observamos o remodelamento benéfico no grupo AT-BMC14 dias e AT-BMC 21 dias, com a organização estrutural similar ao grupo CO. Vesículas de pinocitose, projeção da célula muscular lisa e a delaminação da lamina elástica interna são observados nos grupos AT 14 dias e AT 21 dias. Célula endotelial preservada, com lamina elástica interna de contorno regular e contínua é observada no grupo CO e nos grupos AT-BMC 14 dias e AT-BMC 21 dias. Como conclusão, os nossos resultados reforçam o conceito de que, em um modelo aterosclerótico utilizando camundongos e dieta aterogênica, a injeção de BMCs melhora os níveis de glicose, metabolismo lipídico e ocasiona um remodelamento benéfico na parede da aorta.

Sinalização da MAPK/ERK na diferenciaçãao da oligodendroglia: efeitos de inibidores da MEK sobre a morfologia e distribuição de proteínas de oligodendrócitos/mielina in vitro

A via de sinalização da cinase regulada por fatores extracelulares, da família das proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPK/ERK) é importante tanto para a sobrevivência como para a progressão da diferenciação de oligodendrócitos. Neste trabalho, a via da MAPK/ERK foi avaliada na oligodendroglia in vitro com a utilização de inibidores da MEK. A morfologia celular, assim como a distribuição de proteínas foram analisadas em diferentes estágios de maturação da oligodendroglia. Culturas primárias de oligodendrócitos foram tratadas com os inibidores da MEK PD98059 ou U0126, aos 5 ou 11dias in vitro (div), por 30min, 24 ou 48h. A oligodendroglia foi distinguida com marcadores estágio-específicos: A2B5, 23nucleotídeo cíclico 3 fosfodiesterase (CNPase) e proteína básica de mielina (MBP), e classificada de acordo com sua morfologia em diferentes estágios de desenvolvimento. O tratamento aumentou significativamente o número de células com morfologia mais imatura e diminuiu o número de células maduras. Além disso, aumentou o número de células redondas e sem prolongamentos as quais não puderam ser classificadas em nenhum dos estágios de desenvolvimento da oligodendroglia. Os efeitos mais evidentes foram observados logo após o menor tempo de tratamento. Células redondas eram positivas para CNPase e MBP, porém não foram marcadas com A2B5 ou com NG2, indicando que seriam células maduras incapazes de estender ou manter seus prolongamentos. De fato, estas mudanças foram acompanhadas por alterações na distribuição de proteínas de oligodendrócitos como a MBP e a CNPase, assim como alterações em proteínas de citoesqueleto, como actina, tubulina e na cinase de adesão focal (FAK). A MBP foi observada nas células tratadas em um padrão de distribuição desorganizado e disperso, oposto ao padrão contínuo que é observado nas células das culturas controle. Além disso, o tratamento causou uma desorganização na distribuição da CNPase, actina e tubulina. Nas células das culturas controle, estas proteínas apresentam um padrão organizado compondo as estruturas de citoqueleto semelhantes a nervuras. Após um pequeno período de tratamento (30min), actina e tubulina apresentaram o mesmo padrão de marcação puntiforme que a CNPase apresentou. O tratamento também reduziu os pontos de adesão focal demonstrados pela FAK. Com o decorrer do tratamento, após 24 e 48h, actina e tubulina aparentavam estar se reorganizando em um padrão filamentar. Estes resultados indicam um efeito importante da via da MAPK/ERK na ramificação e alongamento dos prolongamentos dos oligodendrócitos, com possíveis consequências para a formação da bainha de mielina.

Dose terapêutica de radiação ionizante induz um fenótipo migratório em células de carcinoma de colon humano (caco-2): vias de sinalização envolvidas

O câncer colo-retal é a terceira neoplasia mais frequente em todo o mundo e a recorrência local e neoplasia refratária são desafios no tratamento do câncer colo-retal após a cirurgia convencional. Com o intuito de controlar a recorrência e aumentar a média de sobrevida dos pacientes, uma estratégia multidisciplinar que combina a radioterapia (RT) e a quimioterapia com o processo cirúrgico tem sido protocolo clínico de escolha. Embora esta combinação seja capaz de otimizar o tratamento, nem todos os pacientes são beneficiados com o protocolo quimio-rádio combinado, uma vez que existem os insucessos terapêuticos relacionados com a incidência de neoplasias secundárias tardias em pacientes que foram submetidos à RT para tratamento de neoplasias anteriores. Além da doença refratária, outro agravante da RT são os efeitos colaterais produzidos pela radiação ionizante (IR), em especial àqueles do trato gastrointestinal. Estes efeitos estão relacionados com alterações da homeostase do epitélio intestinal, através da desorganização dos complexos juncionais. Porém, os mecanismos que medeiam estes efeitos ainda não estão elucidados. Este estudo avaliou as vias de sinalização que medeiam os efeitos da IR em células Caco-2. Foi observado que a IR causa uma desorganização da junção aderente via Src, EGFR e MAPK, sendo estas alterações acompanhadas por desorganização do citoesqueleto de actina em todo o volume celular. Src, EGFR e MAPK participam de maneira diferenciada na modulação destes efeitos. Observamos também que a radiação aumenta a motilidade dessas células via Src e MAPK e não induz alteração na proliferação celular até 48 horas após o tratamento. Este é o primeiro trabalho que correlaciona vias de sobrevivência celular como Src, EGFR e MAPK com alterações nas proteínas de junção aderente, alterações do citoesqueleto e migração celular. Estes eventos são relacionados aos efeitos colaterais primários e tardios induzidos pela IR, e podem favorecer à aquisição de um fenótipo maligno herdável durante o fracionamento de doses na RT, favorecendo a progressão tumoral do câncer colo-retal. Logo, além da correlação das vias de sinalização envolvidas nos eventos induzidos pela IR mostrados neste estudo, os resultados também corroboram para um melhor entendimento da atividade farmacológica dos inibidores químicos utilizados, uma vez que muitos deles encontram-se em fase de ensaios pré-clínicos e clínicos.

Análise dos aspectos biológicos e epidemiológicos de cepas de Escherichia coli associadas à infecção do trato urinário (ITU)

A invasão de bactérias no trato urinário caracteriza a infecção do sistema urinário. A Escherichia coli é o principal microrganismo associado a esta infecção devido a sua importância em causar ITU, recebeu a denominação de UPEC (Escherichia coli uropatogênica). No presente trabalho pesquisamos em 50 cepas de UPEC, inicialmente isolados de urina de pacientes ambulatoriais com infecções sintomática ou assintomática, a presença de 7 fatores de virulência, através das técnicas de PCR simples e multiplex para verificação dos genes que codificam adesinas P (pap) , fímbria S (sfa), adesina afimbrial (afa), sideroforo (aerobactina- aer), toxinas fator necrotizante citotóxico (cnf) e alfa-hemolisinas (hly), proteína de membrana (traT); ilhas de patogenicidade (virulência) através do marcador PAI. O marcador pCVD432 de EAEC também foi pesquisado nestas amostras. O método difusão em disco foi o utilizado para a determinação dos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos. Podemos observar duas faixas etárias de maior incidência de ITU entre as mulheres: 19 a 35 anos, e acima de 50 anos. Sessenta e oito por cento das amostras apresentaram pelo menos um fator de virulência, onde os genes traT (54%) e aer (34%) foram os mais prevalentes. A sequência pCVD432 foi detectado em 6 amostras. No entanto, no ensaio de adesão em células Hep-2, doze amostras não apresentaram aderência (NA 24%). Nas 38 cepas restantes, 24 (48%) apresentaram aderência agregativa (AA). Observamos aderência sem padrão típico (SPT) em 48% das amostras, tendo sido dividido em discreto (SPT-D 22%), moderado (SPT-M 18%) e intenso (SPT-I 8%). Notamos os seguintes perfis de resistência para os antimicrobianos testados: ampicilina (44%), gentamicina (8%), nitrofurantoína (2%), norfloxacino (18%) e sulfametozaxol-trimetoprima (34%).

Produção in vitro, análise fitoquímica e avaliação da atividade antineoplásica de metabólitos de Hovenia dulcis Thunb. (Rhamnaceae) obtidos por diferentes estratégias biotecnológicas

Hovenia dulcis Thunberg, natural da Ásia Oriental, é cultivada no Brasil onde é conhecida como uva-do-japão. A espécie possui várias indicações na medicina popular e alguns estudos apontam o seu potencial antineoplásico, tripanocida e hepatoprotetor. Metabólitos secundários são substâncias não essenciais para a sobrevivência celular, mas que fornecem vantagens adaptativas aos vegetais, sendo atribuído, para algumas delas, atividades biológicas importantes. Substâncias de interesse medicinal têm sido obtidas por técnicas da cultura de tecidos vegetais, como a calogênese e a cultura de células em suspensão, que permitem a síntese de matéria-prima de forma contínua e homogênea, independentemente de fatores ambientais e sazonais. O presente estudo objetivou o estabelecimento de culturas in vitro de H. dulcis, visando à produção de metabólitos de interesse, com vistas à avaliação do seu potencial antineoplásico sobre células K562. Foram testados protocolos para o estabelecimento de diferentes sistemas, como culturas de calos, de células em suspensão (CCS) e compact callus clusters (CCC) e ainda a avaliação do uso de elicitores na otimização de metabólitos produzidos in vitro. Foi verificado que a adição dos fitorreguladores KIN e TDZ, substituindo o BAP, não foi capaz de induzir a formação de calos friáveis, bem como a manutenção das culturas em ausência de luz. O uso do nitrato de prata promoveu a friabilidade de calos em todas as concentrações testadas, considerando-se 2,0 mg.L-1 a melhor concentração. Foram alcançadas taxas de 100% de formação de CCS tanto na presença, quanto em ausência de AgNO3. O maior acúmulo de biomassa foi verificado na concentração mais baixa de PIC (0,625 mg.L-1). A análise dos espectros de RMN indicou a presença de (+)-dihidromiricetina, (+)-galocatequina, hovenitina II, hovenosideo G, hodulosideo III, hodulosideo IV, hodulosideo I e hovenidulciosideo B1 nas culturas de calos friáveis. No estabelecimento de culturas CCC, observou-se a formação de calos compactos verdes em todas as concentrações de ANA testadas. O aumento da velocidade de rotação para 135 rpm aumentou a dispersão das células com consequente formação dos agregados celulares desejados. A seleção de linhagens celulares demonstrou ser um método eficiente na uniformização do tamanho desses agregados e tal uniformidade se manteve estável por mais de cinco subcultivos em 100% das culturas. Uma fração rica em saponinas foi obtida a partir dos agregados celulares, correspondendo a 1,46% da massa seca. A análise por RMN sugeriu a presença das saponinas Hovenosideo G e dos hovenidulciosideos A2 e B2. O uso de elicitores em cultura de calos mostrou-se adequado à produção de metabólitos secundários, sem alterações morfológicas nos mesmos. A elicitação alterou o perfil cromatográfico analisado por HPLC. Na elicitação com 5,0 mg.L-1 de extrato de levedura foi verificado um aumento de quase três vezes (12,280 3,396 equivalentes de quercetina/mg de extrato) na síntese de flavonoides. Finalmente, os estudos de ação antitumoral in vitro demonstraram citotoxicidade dos extratos de calos não elicitados de H. dulcis sobre linhagem de leucemia mieloide crônica (IC50 de 74,05 μg.mL-1.) e inibição do crescimento de tais células (K562), sugerindo o potencial antineoplásico para um produto biotecnológio (calo) desta espécie.

Alterações da expressão da proteína PHEX na Hanseníase

A hanseníase é uma doença infecciosa causada pelo Mycobacteruim leprae, um bacilo intracelular obrigatório, que prolifera principalmente na pele e nos nervos periféricos no interior de células como macrófagos e células de Schwann. A transmissão ocorre por meio das mucosas das vias respiratórias, provavelmente por aerossóis expelidos por indivíduos infectados. O homem é o seu hospedeiro natural sendo a multiplicação do bacilo muito lenta, com um período de geração estimado de 14 dias. Apesar da mínima variação no genoma do M. leprae, a doença é caracterizada por um espectro de formas clínicas bem definido, decorrente da capacidade de resposta imune do hospedeiro. Em pacientes classificados como multibacilares (MB) a doença é disseminada, com inúmeras lesões de pele e proliferação bacilar considerável. Nesses indivíduos ocorre hiporresponsividade celular ao M. leprae. Nas formas paucibacilares (PB), os pacientes apresentam uma ou poucas lesões, a carga bacilar é pequena e, às vezes não observada por meio da baciloscopia tradicional e ocorre resposta imune patógeno-específica. As incapacidades físicas nos pacientes decorrem da neuropatia e osteopatia e podem ser irreversíveis. Essas deformidades podem avançar mesmo após a diminuição da carga bacilar com o final do tratamento poliquimioterápico. A presente tese teve por objetivo estudar as implicações da proteína PHEX nas alterações fisiopatológicas da hanseníase, em especial as alterações ósseas. A proteína PHEX (Phosphate-regulating gene with Homologies to Endopeptidase on the X chromosome) é expressa em várias células humanas e, no primeiro artigo que compõe essa tese, demonstramos que o M.leprae leva à diminuição da expressão de PHEX em linhagens de células de Schwann e osteoblastos humanos. Este efeito foi igualmente causado por outras espécies de micobactérias. No segundo manuscrito ora submetido, observamos que em leucócitos sanguíneos de pacientes hansenianos também ocorreu modulação negativa de PHEX. Este efeito não se relacionou com a capacidade de produção de citocinas inflamatórias frente ao M. leprae in vitro ou com alterações bioquímicas. O efeito inibidor da mineralização ocasionado pela modulação negativa de PHEX talvez contribua para a doença óssea da hanseníase, auxiliando a explicar a capacidade do M. leprae de penetrar e sobreviver no osso.

Carboxilesterase na adaptação do metabolismo de lipídios do pacu à hipoxia

Os peixes são vertebrados que vivem em vários habitats. Adaptações de sua fisiologia e de sua bioquímica são estudadas para entender como conseguem sobreviver aos desafios presentes em cada ambiente. A diminuição da concentração de oxigênio dissolvido na água é um fenômeno natural cíclico em águas do Pantanal e da Amazônia. A crescente poluição antrópica dos rios da Amazônia e do Pantanal pode, somada à hipoxia, oferecer ameaça à permanência de muitas espécies de peixes. Ao estudarmos a carboxilesterase (CarbE), enzima importante para a biotransformação de xenobióticos, observamos que sua atividade diminuía em plasma de pacu, um peixe típico do Pantanal, mantido em hipoxia durante 42 horas. As carboxilesterases participam de inúmeras reações químicas no organismo, incluindo uma transesterificação capaz de produzir ésteres etílicos tóxicos de ácido graxo (FAEE, fatty acid ethyl esters) a partir de etanol e ésteres de ácidos graxos. Já que a diminuição da atividade de CarbE poderia ser uma vantagem, pois que o etanol (um produto da glicólise em peixes sob hipoxia) seria menos esterificado, resolvemos saber mais sobre a bioquímica da CarbE do plasma e do fígado de pacus. Os pacus foram submetidos à hipoxia por diminuição da concentração até 0,5 mg O2/L por meio de borbulhamento de nitrogênio na água. Os animais ficaram nessas condições por 42 horas, quando então coletamos sangue e retiramos seus fígados. A atividade de CarbE ensaiada foi 50% menor no soro e 25% menor nos microssomos de fígado se comparada com a de peixes sob 6 mg O2/L. A CarbE isolada do soro dos pacus em normoxia possui massa molecular relativa de 56.000. A eletroforese em gel desnaturante com a fração purificada rendeu três bandas, mas o gel nativo apresentou só duas bandas com atividades sobre α-naftil acetato. Inferimos que mais do que uma isoforma da enzima está no plasma dos pacus. A CarbE isolada do soro não possui atividade de lipase sobre o Tween 20, mas os microssomos dos fígados dos animais em normoxia e hipoxia possuem. No entanto, a CarbE possui atividade sobre acil-CoA assim como o microssomo de fígado. A enzima pura apresenta Vmáx três vezes maior e uma KM quatro vezes maior do que a atividade presente nos microssomos. Além disso, os microssomos do fígado dos pacus em normoxia podem hidrolisar acil-CoA com o dobro da velocidade daqueles em hipoxia. A atividade clássica de CarbE do soro foi inibida por 4-HNE a 4 mM. A atividade de acil-CoA dos microssomos de fígado também foi sensível a 4-HNE a 4 mM, enquanto 2 mM de 4-HNE inibiu metade desta atividade do soro.

Avaliação da indução de lesões no DNA por lasers terapêuticos de baixa potência

Na medicina regenerativa há uma crescente utilização de lasers de baixa intensidade em protocolos terapêuticos para tratamento de doenças em tecidos moles e no tecido ósseo. Lasers emitem feixes de luz com características específicas, nas quais o comprimento de onda, a frequência, potência e modo de missão são propriedades determinantes para as respostas fotofísica, fotoquímica e fotobiológica. Entretanto, sugere-se que lasers de baixa potência induzem a produção de radicais livres, que podem reagir com biomoléculas importantes, como o DNA. Essas reações podem causar lesões e induzir mecanismos de reparo do DNA para preservar a integridade do código genético e homeostase celular. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar lesões no DNA de células do sangue periférico de ratos Wistar e a expressão dos genes ERCC1 e ERCC2 em tecidos biológicos expostos a lasers de baixa intensidade em comprimentos de onda, fluências, potências e modos de emissão utilizados em protocolos terapêuticos. Para tal, amostras de sangue periférico foram expostas ao laser vermelho (660 nm) e infravermelho (808 nm) em diferentes fluências, potências e modos de emissão, e a indução de lesões no DNA foi avaliada através do ensaio cometa. Em outros experimentos, lesões no DNA foram analisadas através do ensaio cometa modificado, utilizando as enzimas de reparo: formamidopirimidina DNA glicosilase (FPG) e endonuclease III. Pele e músculo de ratos Wistar foram expostos aos lasers e amostras desses tecidos foram retiradas para extração de RNA, síntese de cDNA e avaliação da expressão dos genes por PCR quantitativo em tempo real. Os dados obtidos neste estudo sugeriram que a exposição aos lasers induz lesões no DNA dependendo da fluência, potência e modo de emissão, e que essas lesões são alvos da FPG e endonuclease III. A expressão relativa do RNAm de ERCC1 e de ERCC2 foi alterada nos tecidos expostos dependendo do comprimento de onda e fluência utilizada. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que danos oxidativos no DNA poderiam ser considerados para segurança do paciente e eficácia terapêutica, bem como alterações na expressão dos genes de reparo do DNA participariam dos efeitos de bioestimulação que justificam as aplicações terapêutica de lasers de baixa potência.

Subpopulações e ativação de linfócitos T CD4+ e T CD8+ em crianças e adolescentes HIV positivos vacinados contra Neisseria meningitidis C

Neisseria meningitidis sorogrupo C (MenC) tem sido causador de surtos no Brasil, desde 2005. Vacinas conjugadas contra MenC estão disponíveis desde 1999 nos países desenvolvidos e mais recentemente no Brasil. São vacinas eficazes em pacientes imunologicamente normais, mas pouco se conhece sobre o impacto em pacientes HIV+. O objetivo principal deste estudo foi investigar se há alguma correlação entre a resposta de LT CD4+ de memória e a resposta de anticorpos específicos para o MenC, assim como conhecer as populações de memória dos LT CD8+, em crianças e adolescentes infectados pelo HIV respondedores ou não à vacina MenC conjugada. Amostras de sangue de 36 pacientes HIV+ foram coletadas antes e após imunização, para análises laboratoriais, soros e células coletadas foram congelados e enviados ao nosso laboratório para a análise da resposta imune humoral e celular. Utilizamos o ensaio bactericida para avaliar a resposta humoral e dividir a população de estudo em soroconversor positivo e soroconversor negativo. A citometria de fluxo foi aplicada para identificação das seis subpopulações de LT CD4+ e T CD8+ e avaliação do perfil de ativação. Não encontramos mudanças no perfil de distribuição das subpopulações antes e após a vacinação. A subpopulação LT CD4+ Int correlacionou positivamente com os títulos de anticorpos e a ativação, de um modo geral, estava elevada nos respondedores, conferindo certa importância para essa célula. Semelhanças foram observadas entre as subpopulações LT CD4+ e T CD8+. Em suma, este estudo revelou importantes associações entre a resposta de anticorpos bactericidas após a vacinação, o perfil de distribuição das subpopulações de LT CD4+ LT CD8+ e seu status de ativação.

Análise da produção científica da Embrapa Informática Agropecuária no triênio 2000-2002.

Introdução. objetivos. Material e métodos. Resultado e discussão. Áreas de conhecimento mais produtiva. Temas mais produtivos. Tipos de publicações privilegiados. Tipos preferidos de publicações versus temas predominantes. Aderência aos projetos estratégicos. Comentários gerais.

Avaliacoes da infeccao de explantes de feijoeiro por Agrobacterium tumefaciens por meio de microscopia.

Phaseolus vulgaris L. e considerada recalcitrante a transformacao por Agrobacterium tumefaciens. Contudo, alteracoes no meio de co-cultivo, utilizacao de linhagens hipervirulentas de Agrobacterium e de vetores binarios contendo genes vir demostraram que o feijoeiro e susceptivel a essa bacteria. O objetivo do presente trabalho foi estudar o efeito da sonificacao nos tecidos vegetais de feijoeiro, bem como a penetracao da Agrobacterium nas camadas subepidermicas do tecido vegetal, usando a metodologia SAAT ("Sonification-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation"). A variedade de feijoeiro utilizada foi a Olathe Pinto, a linhagem de A. tumefaciens foi LBA4404:pTOK.Os embrioes de feijao foram pre-tratados po 14 dias em meio de multibrotacao e, entao submetidos a sonificacao (de 0 ou 60 segundos) na presenca de Agrobacterium. Apos a inoculacao foram co-cultivados por 24 horas em meio liquido seguido de 48 horas em meio solido, ambos, contendo 20 m. L -1 de acetoceringona. Os explantes inoculados foram fixadas em solucao de Karnovsk para avaliacoes em microscopia optica e eletronica de varredura. As analises da microspia demostraram a presenca de rupturas na epiderme, quebras da parede celular e invasao da Agrobacterium nos tecidos subepidermicos. Os reultados demostraram que o metodo SAAT e uma tecnica viavel para a inoculcao de Agrobacterium em explantes de P. vulgaris.