O enfermeiro na sala de vacinação: uma análise reflexiva da prática

Objetiva-se analisar a prática do enfermeiro em sala de vacina, mediante o modelo de vigilância à saúde como referência. Trata-se da análise crítica reflexiva realizada através de observação, durante as práticas como docentes, em Unidades Básicas de Saúde. Percebeu-se que o enfermeiro responsável pela sala de vacinação desenvolve pouca atividade fixa específica, indo à sala para resolver algumas dificuldades ou na ausência de funcionários. O perfil epidemiológico e o modelo de vigilância à saúde são pouco usados, sinalizado pelo comportamento indiferente dos usuários. As atividades de vacinação devem ser desenvolvidas por uma equipe de enfermagem com participação do enfermeiro, a fim de oferecer um serviço de qualidade e atender a demanda individual e coletiva

Conhecimentos sobre o HPV e cancro do colo do útero nos adolescentes

O Cancro do Colo do Útero (CCU) é uma das principais causas de morte por neoplasia nas mulheres, em todo o mundo. A principal etiologia do CCU é a infeção persistente pelas estirpes oncogénicas do Vírus do Papiloma Humano (HPV) (Ferreira, 2013). Esta temática é de grande interesse para a Saúde Pública por se tratar de uma infeção que na maioria dos casos se apresenta de forma assintomática, afetando ambos os sexos (Leite, Lisboa, & Azevedo, 2011). O presente trabalho tem como objetivos avaliar os conhecimentos dos alunos do Ensino Secundário do Agrupamento de escolas Emidio Garcia, em Bragança, sobre o HPV e CCU e conhecer os dados referentes à cobertura vacinal da população do Concelho de Bragança, relativamente à vacina do HPV no ano de 2014. O estudo efetuado é de tipologia observacional-descritivo e correlacional, de paradigma quantitativo através de um processo sistemático de recolha de dados, num plano transversal. Numa amostra de 196 alunos do ensino secundário do Agrupamento de escolas Emídio Garcia em Bragança, com base num erro amostral de 5%, com um nível de confiança de fidelidade de 95%, classificada como amostra não probabilística, acidental/ocasional. O instrumento de recolha de dados utilizado foi um questionário da autoria de Diana Ramada e Rui Medeiros, validado e devidamente autorizado. As principais conclusões do estudo relativamente aos conhecimentos sobre esta temática por parte dos alunos, revelam que o maior conhecimento reside nos mais jovens com idades compreendidas entre os 15 e 16 anos em relação aos alunos de 18 e 19 anos. São alunos que estão bem informados no que diz respeito às manifestações e aos fatores de risco da infeção por HPV, conscientes de que afeta tanto o sexo feminino com o masculino e que os indivíduos do sexo masculino podem ser portadores assintomáticos. Reconhecem que a infeção pelo vírus do HPV é curável e que a persistência desta infeção pode provocar CCU. Existe uma lacuna relativamente ao HPV ser o agente mais comum das IST, em que 93,4% dos inquiridos respondeu ser o HIV. Revelam desconhecimento relativamente à localização e modos de transmissão deste vírus. Manifestaram interesse por adquirir e aprofundar conhecimentos, assinalando a escola e os profissionais de saúde como centro de informação. Existe, no entanto, um aspeto positivo a concluir, ao se verificar que a vacinação tem uma grande adesão e que é cumprido o esperado pelo Plano Nacional de Vacinação, diminuindo o risco de infeção por HPV e em consequência reduzindo a incidência do CCU, por infeção persistente de HPV.

Seasonal influenza vaccine effectiveness in Portugal: results from the EuroEVA project 2015/16

The EuroEVA study aimed to estimate the 2015-16 end of season influenza vaccine effectiveness for all population and for the influenza vaccination target group. The presented results resulted from implementation of the study during 2015/2016 season.

Influenza vaccine effectiveness in Portugal: season 2015/2016 report

This report was prepared as part of the Project “Monitoring Influenza vaccine effectiveness during influenza seasons and pandemics in the European Union” and describes the results obtained in Portugal under the Protocol Agreement celebrated between EpiConcept SARL, Paris and National Health Institute Dr. Ricardo Jorge, Lisbon. Data and activities related to the individuals 65 years and more were funded by European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme under grant agreement no 634446.

Programa Nacional de Vigilância da Gripe: relatório da época 2015/2016

O vírus da gripe é uma das maiores causas de morbilidade e mortalidade em todo o mundo, afetando um elevado número de indivíduos em cada ano. Em Portugal a vigilância epidemiológica da gripe é assegurada pelo Programa Nacional de Vigilância da Gripe (PNVG), através da integração da informação das componentes clínica e virológica, gerando informação detalhada relativamente à atividade gripal. A componente clínica é suportada pela Rede Médicos-Sentinela e tem um papel especialmente relevante por possibilitar o cálculo de taxas de incidência permitindo descrever a intensidade e evolução da epidemia de gripe. A componente virológica tem por base o diagnóstico laboratorial do vírus da gripe e tem como objetivos a deteção e caraterização dos vírus da gripe em circulação. Para o estudo mais completo da etiologia da síndrome gripal foi efectuado o diagnóstico diferencial de outros vírus respiratórios: vírus sincicial respiratório tipo A (RSV A) e B (RSV B), o rhinovírus humano (hRV), o vírus parainfluenza humano tipo 1 (PIV1), 2 (PIV2) e 3 (PIV3), o coronavírus humano (hCoV), o adenovírus (AdV) e o metapneumovirus humano (hMPV). Desde 2009 a vigilância da gripe conta também com a Rede Portuguesa de Laboratórios para o Diagnóstico da Gripe que atualmente é constituída por 15 hospitais onde se realiza o diagnóstico laboratorial da gripe. A informação obtida nesta Rede Laboratorial adiciona ao PNVG dados relativos a casos de doença respiratória mais severa com necessidade de internamento. Em 2011/2012, foi lançado um estudo piloto para vigiar os casos graves de gripe admitidos em Unidades de Cuidados Intensivos (UCI) que deu origem à atual Rede de vigilância da gripe em UCI constituída em 2015/2016 por 31 UCI (324 camas). Esta componente tem como objetivo a monitorização de novos casos de gripe confirmados laboratorialmente e admitidos em UCI, permitindo a avaliação da gravidade da doença associada à infeção pelo vírus da gripe. O Sistema da Vigilância Diária da Mortalidade constitui uma componente do PNVG que permite monitorizar a mortalidade semanal por “todas as causas” durante a época de gripe. É um sistema de vigilância epidemiológica que pretende detetar e estimar de forma rápida os impactos de eventos ambientais ou epidémicos relacionados com excessos de mortalidade. A notificação de casos de Síndrome Gripal (SG) e a colheita de amostras biológicas foi realizada em diferentes redes participantes do PNVG: Rede de Médicos-Sentinela, Rede de Serviços de Urgência/Obstetrícia, médicos do Projeto EuroEVA, Rede Portuguesa de Laboratórios para o Diagnóstico da Gripe e Rede vigilância da gripe em UCI. Na época de vigilância da gripe de 2015/2016 foram notificados 1.273 casos de SG, 87% dos quais acompanhados de um exsudado da nasofaringe para diagnóstico laboratorial. No inverno de 2015/2016 observou-se uma atividade gripal de baixa intensidade. O período epidémico ocorreu entre a semana 53/2015 e a semana 8/2016 e o valor mais elevado da taxa de incidência semanal de SG (72,0/100000) foi observado na semana 53/2015. De acordo com os casos notificados à Rede Médicos-Sentinela, o grupo etário dos 15 aos 64 anos foi o que apresentou uma incidência cumulativa mais elevada. O vírus da gripe foi detetado em 41,0% dos exsudados da nasofaringe recebidos tendo sido detetados outros vírus respiratórios em 24% destes. O vírus da gripe A(H1)pdm09 foi o predominantemente detetado em 90,4% dos casos de gripe. Foram também detetados outros vírus da gripe, o vírus B - linhagem Victoria (8%), o vírus A(H3) (1,3%) e o vírus B- linhagem Yamagata (0,5%). A análise antigénica dos vírus da gripe A(H1)pdm09 mostrou a sua semelhança com a estirpe vacinal 2015/2016 (A/California/7/2009), a maioria dos vírus pertencem ao novo grupo genético 6B.1, que foi o predominantemente detetado em circulação na Europa. Os vírus do tipo B apesar de detetados em número bastante mais reduzido comparativamente com o subtipo A(H1)pdm09, foram na sua maioria da linhagem Victoria que antigenicamente se distinguem da estirpe vacinal de 2015/2016 (B/Phuket/3073/2013). Esta situação foi igualmente verificada nos restantes países da Europa, Estados Unidos da América e Canadá. Os vírus do subtipo A(H3) assemelham-se antigenicamente à estirpe selecionada para a vacina de 2016/2017 (A/Hong Kong/4801/2014). Geneticamente a maioria dos vírus caraterizados pertencem ao grupo 3C.2a, e são semelhantes à estirpe vacinal para a época de 2016/2017. A avaliação da resistência aos antivirais inibidores da neuraminidase, não revelou a circulação de estirpes com diminuição da suscetibilidade aos inibidores da neuraminidase (oseltamivir e zanamivir). A situação verificada em Portugal é semelhante à observada a nível europeu. A percentagem mais elevada de casos de gripe foi verificada nos indivíduos com idade inferior a 45 anos. A febre, as cefaleias, o mal-estar geral, as mialgias, a tosse e os calafrios mostraram apresentar uma forte associação à confirmação laboratorial de um caso de gripe. Foi nos doentes com imunodeficiência congénita ou adquirida que a proporção de casos de gripe foi mais elevada, seguidos dos doentes com diabetes e obesidade. A percentagem total de casos de gripe em mulheres grávidas foi semelhante à observada nas mulheres em idade fértil não grávidas. No entanto, o vírus da gripe do tipo A(H1)pdm09 foi detetado em maior proporção nas mulheres grávidas quando comparado as mulheres não grávidas. A vacina como a principal forma de prevenção da gripe é especialmente recomendada em indivíduos com idade igual ou superior a 65 anos, doentes crónicos e imunodeprimidos, grávidas e profissionais de saúde. A vacinação antigripal foi referida em 13% dos casos notificados. A deteção do vírus da gripe ocorreu em 25% dos casos vacinados e sujeitos a diagnóstico laboratorial estando essencialmente associados ao vírus da gripe A(H1)pdm09, o predominante na época de 2015/2016. Esta situação foi mais frequentemente verificada em indivíduos com idade compreendida entre os 15 e 45 anos. A confirmação de gripe em indivíduos vacinados poderá estar relacionada com uma moderada efetividade da vacina antigripal na população em geral. A informação relativa à terapêutica antiviral foi indicada em 67% casos de SG notificados, proporção superior ao verificado em anos anteriores. Os antivirais foram prescritos a um número reduzido de doentes (9,0%) dos quais 45.0% referiam pelo menos a presença de uma doença crónica ou gravidez. O antiviral mais prescrito foi o oseltamivir. A pesquisa de outros vírus respiratórios nos casos de SG negativos para o vírus da gripe, veio revelar a circulação e o envolvimento de outros agentes virais respiratórios em casos de SG. Os vírus respiratórios foram detetados durante todo o período de vigilância da gripe, entre a semana 40/2015 e a semana 20/2016. O hRV, o hCoV e o RSV foram os agentes mais frequentemente detetados, para além do vírus da gripe, estando o RSV essencialmente associado a crianças com idade inferior a 4 anos de idade e o hRV e o hCoV aos adultos e população mais idosa (≥ 65 anos). A Rede Portuguesa de Laboratórios para o Diagnóstico da Gripe, efetuou o diagnóstico da gripe em 7443 casos de infeção respiratória sendo o vírus da gripe detetado em 1458 destes casos. Em 71% dos casos de gripe foi detetado o vírus da gripe A(H1)pdm09. Os vírus da gripe do tipo A(H3) foram detetados esporadicamente e em número muito reduzido (2%), e em 11% o vírus da gripe A (não subtipado). O vírus da gripe do tipo B foi detetado em 16% dos casos. A frequência de cada tipo e subtipo do vírus da gripe identificados na Rede Hospitalar assemelha-se ao observado nos cuidados de saúde primários (Rede Médicos-Sentinela e Serviços de Urgência). Foi nos indivíduos adultos, entre os 45-64 anos, que o vírus A(H1)pdm09 representou uma maior proporção dos casos de gripe incluindo igualmente a maior proporção de doentes que necessitaram de internamento hospitalar em unidades de cuidados intensivos. O vírus da gripe do tipo B esteve associado a casos de gripe confirmados nas crianças entre os 5 e 14 anos. Outros vírus respiratórios foram igualmente detetados sendo o RSV e os picornavírus (hRV, hEV e picornavírus) os mais frequentes e em co circulação com o vírus da gripe. Durante a época de vigilância da gripe, 2015/2016, não se observaram excessos de mortalidade semanais. Nas UCI verificou-se uma franca dominância do vírus da gripe A(H1)pdm09 (90%) e a circulação simultânea do vírus da gripe B (3%). A taxa de admissão em UCI oscilou entre 5,8% e 4,7% entre as semanas 53 e 12 tendo o valor máximo sido registado na semana 8 de 2016 (8,1%). Cerca de metade dos doentes tinha entre 45 e 64 anos. Os mais idosos (65+ anos) foram apenas 20% dos casos, o que não será de estranhar, considerando que o vírus da gripe A(H1)pdm09 circulou como vírus dominante. Aproximadamente 70% dos doentes tinham doença crónica subjacente, tendo a obesidade sido a mais frequente (37%). Comparativamente com a pandemia, em que circulou também o A(H1)pdm09, a obesidade, em 2015/2016, foi cerca de 4 vezes mais frequente (9,8%). Apenas 8% dos doentes tinha feito a vacina contra a gripe sazonal, apesar de mais de 70% ter doença crónica subjacente e de haver recomendações da DGS nesse sentido. A taxa de letalidade foi estimada em 29,3%, mais elevada do que na época anterior (23,7%). Cerca de 80% dos óbitos ocorreram em indivíduos com doença crónica subjacente que poderá ter agravado o quadro e contribuído para o óbito. Salienta-se a ausência de dados históricos publicados sobre letalidade em UCI, para comparação. Note-se que esta estimativa se refere a óbitos ocorridos apenas durante a hospitalização na UCI e que poderão ter ocorrido mais óbitos após a alta da UCI para outros serviços/enfermarias. Este sistema de vigilância da gripe sazonal em UCI poderá ser aperfeiçoado nas próximas épocas reduzindo a subnotificação e melhorando o preenchimento dos campos necessários ao estudo da doença. A época de vigilância da gripe 2015/2016 foi em muitas caraterísticas comparável ao descrito na maioria dos países europeus. A situação em Portugal destacou-se pela baixa intensidade da atividade gripal, pelo predomínio do vírus da gripe do subtipo A(H1)pdm09 acompanhada pela deteção de vírus do tipo B (linhagem Victoria) essencialmente no final da época gripal. A mortalidade por todas as causas durante a epidemia da gripe manteve-se dentro do esperado, não tendo sido observados excessos de mortalidade. Os vírus da gripe do subtipo predominante na época 2015/2016, A(H1)pdm09, revelaram-se antigénicamente semelhantes à estirpe vacinal. Os vírus da gripe do tipo B detetados distinguem-se da estirpe vacinal de 2015/2016. Este facto conduziu à atualização da composição da vacina antigripal para a época 2016/2017. A monitorização contínua da epidemia da gripe a nível nacional e mundial permite a cada inverno avaliar o impacto da gripe na saúde da população, monitorizar a evolução dos vírus da gripe e atuar de forma a prevenir e implementar medidas eficazes de tratamento da doença, especialmente quando esta se apresenta acompanhada de complicações graves.

Clonagem e expressão do gene que codifica o inibidor de quimotripsina de Erythrina velutina WILLD. - caracterização e avaliação de seu potencial farmacológico

Proteinases are enzymes distributed widely founded in several organisms and perform many different functions, from maintaining homeostasis to the worsening of some diseases such as cancer, autoimmune diseases and infections. The proteins responsible of controlling the action of these enzymes are the inhibitors, that are classified based on their target proteases and are founded since simple organisms, such as bacteria, to higher organisms, such as larger plants and mammals. Plant proteinase inhibitors act by reducing or inactivating the activity of target proteases, thus, these proteins have been studied as potential tools in the treatment of diseases related to protease activities. In this context, an inhibitor of chymotrypsin from Erythrina velutina, called EvCI was previously purified and it was observed that this protein plays in vitro anticoagulant activity and anti-inflammatory activity in in vivo model. Aiming to reduce the environmental impact caused by the purification EvCI in high amounts and to facilitate the process of obtaining this protein, the recombinant chymotrypsin inhibitor from Eryhrina velutina was produced after cloning and expression in Escherichia coli. The bacteria were grown in LB medium and after induction of the expression this material was subjected to procedures for cell lysis and the product was applied on Nickel-affinity column. The proteins adsorbed were digested by thrombin and applied on Chymotrypsin-Sepharose affinity column, obtaining the purified inhibitor, named recEvCI. After electrophoresis, the recombinant inhibitor showed an approximately molecular mass of 17 kDa, and reduced the chymotrypsin and elastase activities in vitro. The recombinant inhibitor was sequenced and was found similar amino acids residues when compared to other inhibitors deposited in the database, with some modifications. recEvCI showed high stability under pH variations and reducing conditions, maintaining its activity around 80%. This protein increased the blood coagulation time in vitro by acting on the intrinsic pathway and did not show cytotoxicity against strains of mouse 3T3 fibroblasts and RAW 264.7 macrophages. recEvCI showed microbicide activity related to release of nitric oxide and consequently the activation of macrophages, futhermore having proinflammatory effects assessed by increased release of TNF-α. These results indicate that recEvCI can be biotechnologically used as a new tool in the control of coagulation-related diseases as well as can be an activating agent of the immune system in immunosuppressed individuals

Efetividade da doxiciclina na profilaxia contra letptospirose

Leptospirosis is a worldwide zoonosis of considerable medical and economical importance that affects humans in both urban and rural contexts, as well as domestic animals and wild fauna. Leptospira interrogans is the causative agent and is transmitted to humans by indirect contact with contaminated soil or water. The clinical syndromes include sub clinical infection, self-limited anicteric febrile illness, and severe and potentially fatal illness, known as Weil´s syndrome. In developed countries, leptospirosis is related to occupational or recreational activities while in developing countries, outbreaks occur during floods. In those regions, traditional strategies to prevent the transmission are difficulties to be implemented because of costs and lack of community acceptance. In addition, no efficient vaccine is available for human use. Several studies have suggested that chemoprophylaxis with doxycycline pre and post-exposure may be effective to prevent leptospirosis. Leptospirosis has been reported in rural areas of the State of Rio Grande do Norte, Brazil since 1985 in rice farmers who present the anicteric illness. The disease cause great social and economics impact. The study was conducted in São Miguel where an epidemic of leptospirosis in rice farmers was reported. The main objective was to determine the efficacy of doxycycline in preventing Leptospira exposure. A taxa de soroprevalência de leptospirose na população estudada antes e após a colheita foi de 14,2% (n=22) e de 16.6% (n=27) respectivamente. Anti-Leptospira serology was determined for 61 subjects in two instances, pre and post-exposure to potential contaminated water. There was an increased risk of 29.0 per cent in acquiring infection for individuals that did not use doxycycline. In addition, an increased risk of 30.0 % observed in farmers who did not use protection when exposed to Leptospira. The adhesion to preventive chemoprophylaxis was 55.7%. Therefore doxycycline, under specific circunstances appears to be an effective alternative to protect against leptosprirosis infection. A large sample composed of individuals to adhere to preventive therapy is needed to define time, dosage and length of use of doxycycline in this area

Linfócitos T : uma análise do perfil diferencial da expressão gênica na imunorregulação

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016.

Rôle des protéoglycanes à héparane sulfate dans le transfert de gène des cellules CHO et HEK293

La possibilité de programmer une cellule dans le but de produire une protéine d’intérêt est apparue au début des années 1970 avec l’essor du génie génétique. Environ dix années plus tard, l’insuline issue de la plateforme de production microbienne Escherichia coli, fut la première protéine recombinante (r-protéine) humaine commercialisée. Les défis associés à la production de r-protéines plus complexes et glycosylées ont amené l’industrie biopharmaceutique à développer des systèmes d’expression en cellules de mammifères. Ces derniers permettent d’obtenir des protéines humaines correctement repliées et de ce fait, biologiquement actives. Afin de transférer le gène d’intérêt dans les cellules de mammifères, le polyéthylènimine (PEI) est certainement un des vecteurs synthétiques le plus utilisé en raison de son efficacité, mais aussi sa simplicité d’élaboration, son faible coût et sa stabilité en solution qui facilite son utilisation. Il est donc largement employé dans le contexte de la production de r-protéines à grande échelle et fait l’objet d’intenses recherches dans le domaine de la thérapie génique non virale. Le PEI est capable de condenser efficacement l’ADN plasmidique (vecteur d’expression contenant le gène d’intérêt) pour former des complexes de petites tailles appelés polyplexes. Ces derniers doivent contourner plusieurs étapes limitantes afin de délivrer le gène d’intérêt au noyau de la cellule hôte. Dans les conditions optimales du transfert de gène par le PEI, les polyplexes arborent une charge positive nette interagissant de manière électrostatique avec les protéoglycanes à héparane sulfate (HSPG) qui décorent la surface cellulaire. On observe deux familles d’HSPG exprimés en abondance à la surface des cellules de mammifères : les syndécanes (4 membres, SDC1-4) et les glypicanes (6 membres, GPC1-6). Si l’implication des HSPG dans l’attachement cellulaire des polyplexes est aujourd’hui largement acceptée, leur rôle individuel vis-à-vis de cet attachement et des étapes subséquentes du transfert de gène reste à confirmer. Après avoir optimisées les conditions de transfection des cellules de mammifères CHO et HEK293 dans le but de produire des r-protéines secrétées, nous avons entrepris des cinétiques de capture, d’internalisation des polyplexes et aussi d’expression du transgène afin de mieux comprendre le processus de transfert de gène. Nous avons pu observer des différences au niveau de ces paramètres de transfection dépendamment du système d’expression et des caractéristiques structurelles du PEI utilisé. Ces résultats présentés sous forme d’articles scientifiques constituent une base solide de l’enchaînement dans le temps des évènements essentiels à une transfection efficace des cellules CHO et HEK293 par le PEI. Chaque type cellulaire possède un profil d’expression des HSPG qui lui est propre, ces derniers étant plus ou moins permissifs au transfert de gène. En effet, une étude menée dans notre laboratoire montre que les SDC1 et SDC2 ont des rôles opposés vis-à-vis du transfert de gène. Alors que tous deux sont capables de lier les polyplexes, l’expression de SDC1 permet leur internalisation contrairement à l’expression de SDC2 qui l’inhibe. De plus, lorsque le SDC1 est exprimé à la surface des cellules HEK293, l’efficacité de transfection est augmentée de douze pourcents. En utilisant la capacité de SDC1 à induire l’internalisation des polyplexes, nous avons étudié le trafic intracellulaire des complexes SDC1 / polyplexes dans les cellules HEK293. De plus, nos observations suggèrent une nouvelle voie par laquelle les polyplexes pourraient atteindre efficacement le noyau cellulaire. Dans le contexte du transfert de gène, les HSPG sont essentiellement étudiés dans leur globalité. S’il est vrai que le rôle des syndécanes dans ce contexte est le sujet de quelques études, celui des glypicanes est inexploré. Grâce à une série de traitements chimiques et enzymatiques visant une approche « perte de fonction », l’importance de la sulfatation comme modification post-traductionnelle, l’effet des chaînes d’héparanes sulfates mais aussi des glypicanes sur l’attachement, l’internalisation des polyplexes, et l’expression du transgène ont été étudiés dans les cellules CHO et HEK293. L’ensemble de nos observations indique clairement que le rôle des HSPG dans le transfert de gène devrait être investigué individuellement plutôt que collectivement. En effet, le rôle spécifique de chaque membre des HSPG sur la capture des polyplexes et leur permissivité à l’expression génique demeure encore inconnu. En exprimant de manière transitoire chaque membre des syndécanes et glypicanes à la surface des cellules CHO, nous avons déterminé leur effet inhibiteur ou activateur sur la capture des polyplexes sans pouvoir conclure quant à l’effet de cette surexpression sur l’efficacité de transfection. Par contre, lorsqu’ils sont présents dans le milieu de culture, le domaine extracellulaire des HSPG réduit l’efficacité de transfection des cellules CHO sans induire la dissociation des polyplexes. Curieusement, lorsque chaque HSPG est exprimé de manière stable dans les cellules CHO, seulement une légère modulation de l’expression du transgène a pu être observée. Ces travaux ont contribué à la compréhension des mécanismes d'action du vecteur polycationique polyéthylènimine et à préciser le rôle des protéoglycanes à héparane sulfate dans le transfert de gène des cellules CHO et HEK293.

Producción y caracterización de la superóxido dismutasa a (SodA) de nocardia brasiliensis en pichia pastoris

Introducción: A mediados de los años 70’s del siglo pasado el descubrimiento de la tecnología del ADN recombinante marca el inicio de la era de la biotecnología moderna. La implementación de estas tecnologías permitió la utilización de organismos como sistemas de expresión que a lo largo de los años ha generado la producción de una gran variedad de productos biológicos. Dentro de estos sistemas Pichia pastoris es un sistema de expresión ampliamente utilizado debido a sus características tales como la producción de proteínas en grandes cantidades, la liberación de los productos al medio de cultivo, la obtención de productos complejos que requieren modificaciones postraduccionales típicas de los eucariotas o que contienen puentes disulfuro, entre otras. Nocardia brasiliensis es una bacteria parcialmente ácido-alcohol resistente la cual forma colonias granulares, con hifas aéreas escasas, sus colonias exhiben un color anaranjado pardo con bordes en blanco. N. brasiliensis es patógena para el ser humano y es el agente causal del actinomicetoma. El actinomicetoma es una enfermedad crónica generalmente localizada en las extremidades. Se caracteriza por ser un proceso lento de tumefacción con nódulos, abscesos y fístulas.La Superóxido Dismutasa (SOD) es una enzima reductora polimérica que cataliza la conversión del ión superóxido a peróxido de hidrógeno y oxígeno molecular. La SOD ha sido propuesta como un factor de virulencia de microorganismos patógenos, cuya acción consiste en bloquear los efectores oxidativos del estallido respiratorio iniciado por los fagocítos en el fagolisosoma. Este mecanismo ha sido descrito para bacterias de los géneros Mycobacterium, Rhodococcus y Nocardia. Objetivo: producir y caracterizar la Superóxido Dismutasa A (SODA) de Nocardia brasiliensis en Pichia pastoris. Metodología: se realizó el diseño de primers adicionando secuencias de sitios de corte para las enzimas XhoI y AvrII, así como una cola de histidinas en el extremo 5’ para la amplificación del gen sodA de N. brasiliensis a partir del ADN genómico de Nocardia brasiliensis. El amplicón se clonó en el vector de expresión pPIC9. Se llevó a cabo la transformación por electroporación de levaduras Pichia pastoris GS115. La producción de SOD se llevó a cabo en inducciones de 96 h con metanol como agente inductor. Los sobrenadantes se dializaron con membranas de celulosa. Los dializados se observaron por SDS-PAGE y western blot. Se analizó la actividad funcional de la enzima con el SOD Assay kit de Sigma Aldrich. Resultados: Por reacción en cadena de la polimerasa se obtuvo una secuencia de 625 pb correspondiente al gen sodA. El fragmento se ligó al vector de expresión pPIC9 y fue caracterizado con las enzimas de restricción XhoI y AvrII. Las cepas trasformadas de P. pastoris GS115 se caracterizaron con el gen aox1 obteniendo cepas Mut+ y Muts. Los análisis por SDSPAGE mostraron bandas no observadas en el control negativo de expresión mientras en los western blot solo una de las clonas mostró señal. Los análisis de actividad funcional sugieren inhibición de la reacción enzimática infiriendo presencia de la proteína SOD en el medio dializado. Conclusiones: Se logró la construcción del sistema de expresión Pichia pastoris con el casete de expresión de la SOD de N. brasiliensis. Así como la generación de cepas Mut+y Muts. En los ensayos de actividad funcional se observó inhibición de la reacción enzimática.

Development of gene therapy to deliver the receptor-specific rhTRAIL DHER variant to induce apoptosis in activated hepatic stellate cells for the treatment of liver fibrosis

Dissertação de Mestrado, Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2014

Differentiation of human pluripotent stem cells to the neuronal dopaminergic fate

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2013

Análisis transcripcional de la vía de secreción y metabolismo del metanol durante la producción de una proteína heteróloga en Pichia pastoris

La levadura metilotrófica Pichia pastoris es de gran importancia industrial principalmente en la producción de proteínas heterólogas. En un estudio reciente se emplearon cinco factores ambientales para definir condiciones de cultivo a nivel de bioreactor que condujeron a altos (CM) y bajos (CP) niveles de la producción extracelular de una fitasa recombinante en una cepa Muts de P. pastoris. Los resultados de este estudio mostraron que bajo las condiciones CM, la demanda y consumo de O2 y de metanol fueron más altos y condujeron a valores más altos en la velocidad específica de crecimiento (μ), biomasa (2.7 veces), niveles de producción de fitasa extracelular (5.5 veces) y rendimientos (Yp/x) que en CP. Con el fin de comprender los mecanismos de regulación transcripcional que afectan a la fisiología de P. pastoris por la sobre-producción de la proteína recombinante y las condiciones de cultivo, en este trabajo se realizó un análisis de expresión diferencial de genes (DGE) empleando la tecnología de secuenciación masiva de mRNA (RNAseq) de la cepa Muts de P. pastoris crecida bajo las condiciones CM y CP reportadas previamente. Además se validaron los resultados del estudio de DGE mediante RT-qPCR. Resultados: La expresión de 4,950 genes, el 93% de los genes totales anotados, fueron detectados. Se sub- y sobre-expresaron 350 y 413 genes respectivamente en CM respecto a CP. En CM vs CP se sobre-expresaron significativamente términos relacionados con la biosíntesis de aminoácidos, biosíntesis de nucleósidos de purina, regulación de la traducción, glicosilación de proteínas y mitosis, indicando una mayor actividad anabólica en CM. La transcripción del gen heterólogo y de los genes de la ruta de desasimilación del metanol no mostraron diferencias entre ambas condiciones de cultivo y fue inducida en metanol. Sin embargo las enzimas claves (DAS1 y DAS2) de la ruta de asimilación del metanol se sobre-expresaron significativamente en CM vs CP, indicando que CM está favorecida la producción de biomasa y la generación de energía a través de esta vía, explicando los valores más altos para la μ y biomasa obtenidos en CM respecto a CP. De 110 genes analizados involucrados en la vía de secreción, 20 se sobre-expresaron en CM vs CP, la sobre-expresión de estos genes indicaron que bajo las condiciones de CM, se presenta una mayor actividad transcipcional de los genes implicados en el transporte y translocación hacia el RE (15%), genes implicados en el plegamiento de proteínas en RE (25%), así como genes relacionados en el procesamieto de las proteínas a través del RE (30%) y Golgi (35%) que permitieron un estado fisiológico favorable para la secreción de la proteína heteróloga. De los 44 genes relacionados con el estrés en RE durante la secreción, en CM vs CP se sobre-expresaron genes UPR indicando, que bajo condiciones de CM, se promueve la expresión de genes relacionados con el plegamiento de proteínas y probablemente se evita el acumulamiento de proteínas mal plegadas. La sub-expresión de todos los genes relacionados con autofagia, es uno de los factores que podría explicar la menor actividad proteolítica observada en CM. Finalmente se observó una correlación entre los métodos de RNA-seq y RTqPCR (r2=0.7). Conclusiones: El análisis de la DGE señala que los factores ambientales en CM condujeron a la regulación de la expresión de genes del proceso de secreción y genes relacionados al estrés en RE durante la secreción que condujeron a valores de Yp/x, más altos en CM que en CP y no se atribuyen a una expresión diferencial del gen heterólogo. La regulación de la ruta del metanol hacia la asimilación y una mejor respuesta de adaptación al estrés en CM condujeron a un mayor crecimiento y producción de biomasa en CM que en CP.

Using induced pluripotent stem cells to investigate the mechanistic link between Gaucher disease and Parkinson related synucleinopathies

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015

Produção de novos anticorpos Anti-CD20 na forma de FvFc em células de mamíferos

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015.