Differentiation of human pluripotent stem cells to the neuronal dopaminergic fate

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2013

A doença de Gaucher foi descrita pela primeira vez por Phillipe Gaucher em 1882. É uma doença rara e hereditária que se deve à deficiência da enzima glucocerebrosidade. Esta deficiência leva ao armazenamento excessivo de glucosilceramida no fígado, baço, osso e medula óssea. Além disso, pacientes com doença de Gaucher podem apresentar, também, manifestações neurológicas. A apresentação clínica desta doença envolve, então, um fenótipo sistémico e um fenótipo neurológico. Ao longo dos anos, tem vindo a ser descrito três tipos principais da doença de Gaucher, com base na presença (tipo 2 e tipo 3) ou ausência (tipo 1) e da severidade das características neurológicas (Elstein, Abrahamov et al. 2001). O tipo 1 é o mais comum; é particularmente prevalente entre os judeus de Ashkenazi e é caracterizado como a variante não-neurpática. O tipo 2 e 3 são caracterizados como variantes neuropáticas, porque, para além da apresentação sistémica, o sistema nervoso central é afectado e são distinguidos pela idade de início e progressão da doença. (Grabowski, Barnes et al. 2011). A marca do tipo 2 é a grave neurodegeneração. O tipo 3 tem manifestações neurológicas mais atenuadas. (Grabowski, Barnes et al. 2.011, B. e N. 2013) A descoberta neuropatológica mais consistente nas formas neuropáticas da doença de Gaucher é o acúmulo periadventicial de glucosilceramida juntamente com neuroinflamação e perda neuronal. Actualmente, tratamentos para doença de Gaucher, clinicamente usados para o tipo sistémico da doença, incluem a terapia de reposição enzimática e terapia de redução de substrato. A terapia de reposição enzimática envolve perfusão regular de glucocerebrosidase recombinante para a corrente sanguínea dos pacientes. A enzima recombinante é sujeita a endocitose por macrófagos e a função lisossómica é parcialmente restabelecida (& B. N., 2013; Elstein, Abrahamov, Hadas-Halpern, & Zimran, 2001). A terapia de resução de susbstrato envolve a administração oral de um inibidor de glucosilceramida sintetase, por conseguinte, impedindo a síntese do substrato. Significativamente, não existem actualmente tratamentos disponíveis para os aspectos neurológicos da GD, sendo portanto, necessário a procura por novas abordagens. Neurónios de pacientes com este distúrbio são difíceis de encontrar; por conseguinte, são necessárias fontes alternativas para o estudo dos mecanismos patogénicos básicos e o desenvolvimento de terapias. Uma vez que a nossa abordagem é diferenciar células pluripotentes para os neurónios, inicialmente, tentou-se estabelecer um protocolo prático, reprodutível e eficiente para a diferenciação de células estaminais embrionárias humanas em neurónios dopaminérgicos. As células estaminais embrionárias humanas têm a capacidade de se diferenciar nas três camadas germinativas (ectoderme, mesoderme e endoderme) tanto in vitro como in vivo. (Reubinoff, Pera, Fong, Trounson, & Bongso, 2000; Thomson, 1998) A pluripotência in vitro é muitas vezes demonstrada pela capacidade para formar corpos embrióides, que consistem numa massa multicelular, exibindo células das três camadas germinativas. A pluripotência in vivo pode ser confirmada pela capacidade para formar teratomas, após injecção de células num animal hospedeiro, normalmente esse animal é caracterizado por imunodeficiência combinada grave (SCID). (Heins et al., 2004; Reubinoff et al., 2000) Realizámos vários protocolos com diferentes abordagens: 1) sobre-expressão de fatores de transcrição específicos, 2) co-cultura com células PA6 e 3) formação de corpos embrióides. Além disso, foram testados diferentes parâmetros, incluindo diversos substratos (gelatina, matrigel, fibroblastos e células estromais), densidades celulares, multiplicidade de infecção e meios de indução neuronal. No final de algumas experiências realizadas foi possível observar células diferenciadas, incluindo neurónios maduros e estas células foram analisadas pela técnica de imunofluorescência para identificar marcadores neuronais - β-tubulina III (TUJ1) e tirosina hidroxilase (TH). Posteriormente, efectuou-se uma tentativa de purificar neurónios maduros por citometria de fluxo. Ao adaptar este protocolo para células estaminais pluripotentes induzidas derivadas de fibroblastos de pacientes com a doença de Gaucher, podemos obter neurónios com mutações específicas da doneça, que pode proporcionar novas oportunidades para a pesquisa básica da mesma, e no desenvolvimento de novos compostos terapêuticos.