白杄体细胞胚胎发生及其植株再生的研究

本文以白杄的合子胚为材料，建立了体细胞胚胎发生及其植株再生系统．通过对影响体细胞胚胎发生的主要因素的系统研究，实现了体细胞胚的高频率发生。运用扫描电镜、整体染色封片及石蜡切片等方法全面观察了体细胞胚胎发生过程中的形态学、细胞学及组织化学变化。建立了胚性细胞悬浮系，测定了几个重要生长参数的变化动态，优化了体细胞胚的液体培养条件。采用垂直平板聚丙烯酰胺电泳方法分析了体细胞胚胎发生过程中三种同工酶的变化。通过压片法观察了长期继代过程中胚性愈伤组织细胞及其再生植株根尖细胞染色体数目的变化。具体结果如下： 合子胚在4-6 ℃低温条件下保存1~3个月后，接种于LP+2mg/L2.4-D+lmg/L 6-BA的培养基上，黑暗条件下培养1个月后，产生浅黄色、褐色和白色半透明三种愈伤组织，其中白色半透明愈伤组织是胚性愈伤组织。黑暗中胚性愈伤组织在MS+lmg/L 2，4-D+lmg/L KT的继代培养基上可保持旺盛的增殖能力和分化潜力。当胚性愈伤组织转到MS+5mg/L ABA+50g/L PEG+5mg/L AgN03的分化培养基上，1个月后可产生大量正常的子叶期成熟体细胞胚。成熟体细胞胚在相对湿度为75%的条件下干化20天后，转到含0.5%活性炭的无激素1/2MS基本培养基上，约40天后长出1.5—2.5cm的根，约60天后长出真叶。光，ABA、蔗糖、AgN03 PEG浓度是影响体细胞胚胎发生的主要因素。 在相同的培养条件下，以新产生的子叶期体细胞胚为外植体，也可诱导体细胞胚胎发生。 胚性愈伤组织起源于合子胚子叶和下胚轴的表皮及表皮下的一些细胞。胚性愈伤组织中的一些单个胚性细胞经过第一次分裂产生两个细胞，即胚细胞和胚柄细胞，它们继续进行分裂几次以后形成胚性胚柄团结构。胚性胚柄团在分化培养基上可发育为成熟的子叶期胚。体细胞胚的成熟过程大致可分四个时期：胚性胚柄团、球形胚至鱼雷形胚、子叶前期胚和子叶期成熟胚。通过PAS反应研究后发现，在体细胞胚发育过程中，淀粉粒在胚性胚柄团时期开始积累，至心形胚时期达到积累高峰，子叶胚时期仅在器官原基及其附近细胞肉有淀粉粒分布。结果表明，淀粉是体细胞胚胎发生的一种重要能量来源。 在初始细胞密度为3.O%（鲜重）、摇床转速为150r/min的条件下，用与固体培养基成分相似的液体培养基对胚性愈伤组织进行悬浮培养，胚性愈伤组织的生长率大大提高。在悬浮培养过程中，培养物的鲜重、干重、紧实细胞体积及胚性胚柄团数目依次在6～10天内达到高峰。培养液的pH值和电导率分别在6—8天达到最低点。 胚性和非胚性愈伤组织的三种同工酶酶谱都明显不同;胚性愈伤组织的过氧化物酶和酸性磷酸酯酶活性较高，而非胚性愈伤组织的酯酶活性较高。体细胞胚发育过程中，三种同工酶酶谱都呈规律性变化;j活性都有逐渐增强的趋势，但酸性磷酸酯酶活性到了最后时期又突然下降。 胚性愈伤组织经过长期继代后，生长率和分化能力没有明显变化，但有些细胞内染色体数目发生了无规律的变化( 2n=7—24，2n>28)，而再生植株根尖细胞染色体数目比较稳定( 2n=28).

水松生殖生物学的研究

本文运用组织化学技术、透射电镜技术，就水松雌雄配子体发育，精卵细胞形成和结构，受精作用以及细胞质遗传等问题进行了较为详细的研究。主要结果如下： 1 绒毡层发育与雄配子体发育，尤其与花粉外壁的形成关系密切。绒毡层组织在小孢子母细胞和减数分裂时期达到发育高峰。四分体阶段和游离小孢子发育前期，绒毡层细胞中内质网、脂体、线粒体非常活跃，参与孢粉素和乌氏体的形成和转移。乌氏体有球形、星芒状两种类型，它们主要参与花粉外壁内层和外壁外层的建成。小孢子发育后期绒毡层细胞开始明显解体。 2 减数分裂阶段，质体、线粒俺等细胞器和造粉体随细胞核和染色体的变化，出现有规律的迁移现象。减数分裂前期，细胞核移到细胞的一侧;各种细胞器和造粉体迁移到细胞的另一侧，并随染色体移向细胞中部而转移到细胞质周缘。减数分裂中期l和后期，各种细胞器和造粉体汇聚在赤道板丙侧分布。说明细胞质中微管系统在起调节作用。 3 花粉壁形成开始于四分体时期。片层状结构的外壁内层随纤维状原外壁的出现雨形成。外壁外层和花粉内壁在小孢子发育中期几乎同时形成。小孢子细胞和绒毡层组织共同参与了外壁内层和外壁外层孢粉素物质的合成、转运。水松成熟花粉由孢粉素组成的外壁外层、片层状结构的外壁内层及有分层状结构的内壁构成。 4 传粉到受精间隔要四个月左右的时间。六月上旬，花粉管和精原细胞抵达颈卵器上部。精原细胞富含淀粉粒、质体、线粒体和异形泡并分区分布。受精前，精原细胞分裂形成两个大小和形状相同豹精细胞。精细胞含有质体、线粒体和异型泡等细胞器。 5 雌配子体游离核持续时间长，从颈卵器原始细胞形成到卵细胞发育成熟所需时间较短。复合颈卵器结构，颈细胞和套层细胞形态结构特殊。中央细胞不经分裂，直接行使卵细胞的功能。 6 成熟卵细胞中除弋量各种形式的内含物外，细胞质被庞大的内质网包围、分割，形成网膜系统。质体、淀粉等细胞器被包含成大内含物。在卵核周围细胞质中没有发现质体和发育完好的线粒体存在。 7 受精作用发生在六月十日左右。雌雄核融合时，朝向精核一面的卵核形成凹陷，精核陷入其中与卵核进一步融合。精卵融合可发生在颈卵器的上部、中部、下部甚至底部。有旋转受精、两个精核同时与一个卵核受精及多卵细胞现象等。 8 新细胞质主要为雄性细胞质成分。合子转移到颈卵器基部分裂，形成原胚游离核。合子、新细胞质和游离核周围淀粉鞘显著。八游离核时期形成细胞壁，新细胞质和淀粉粒转移到原胚细胞中。 9 水松的质体和线粒体为父系遗传。

棕榈藤茎结构的研究

本文通过棕榈藤茎13属50余种的比较解剖观察，系统地比较了棕榈藤茎的解剖特征，评价其在各种棕榈藤茎鉴别中的作用，并在此基础上，解决了棕榈藤茎属一级的鉴定问题。除此之外，还讨论了棕榈藤茎的解剖特征与地理分布、系统分类和演化的关系。主要研究结果如下： （1）应用棕榈藤茎的解剖特征，可以区分到属（见分属检索表），但鉴定到种仍较困难。对棕榈藤茎的鉴定有重要价值的特征有：后生木质部导管和韧皮部的数目，基本薄壁组织细胞的类型，表皮细胞表面观的形状及排列样式，表皮细胞表面有无反射体等，对棕榈藤茎的鉴定有辅助意义的特征有：韧皮部中筛管和伴胞的排列方式，针晶囊的多少和大小等。 （2）依据表皮细胞的形状、排列样式和反射体的有无，可将棕榈藤茎的表皮细胞分为以下5种类型和3种亚型：1.针叶藤型：表皮细胞为长方形，细胞交错排列成砖墙状（如Plectocomia, Laccosperma, Retispatha, Plectocomiopsis）.2.黄藤型：表皮细胞为不规则的四边形，细胞排列成斜向网状（如Daemonorops）。3.省藤型：A亚型：表皮细胞六边形，细胞排列成网状，表皮表面有反射体，气孔平列型或四轮列型。B亚型：表皮细胞四边型，细胞交错排列如砖墙状，细胞长轴平行于茎轴，孔梭形四轮列型。C亚型：表皮细胞四边形，细胸垂周壁呈波浪形，细胞交错排列如砖墙状，细胞长轴平行于茎轴。4.Eremospatha型：表皮细胞六边形，细胞排列成网状，表皮表面无反射体，气孔平列型或四轮列型。5.Calsopatha型：表皮细胞近四边形，细胞排列成不规则网状，细胞长轴几乎垂直于茎轴。表皮表面无反射体。 （3）对白藤（Calamus tetradactylus Hance）茎纤维的成熟模式研究表明，纤维细胞壁的加厚可持续3年以上时间，但在细胞壁加厚的早期和末基匀较缓慢，细胞壁加厚的顺序通常由藤茎的基部向基本向顶部，藤茎的外部向内部以及纤维鞘的内部向外部。 （4）产于西部非洲棕榈藤的种类，其茎的结构特征明显地不同于分布在东南亚的种类，如前者的表皮层表面一般覆盖着膜质，而后者表面常覆盖一层硅质。另外，典型的双后生木质部导管仅见于西部非洲的种类。 （5）棕榈藤茎的后生木质部导管分子为单的平直穿孔板，管间纹孔式为对列式，直径大等于，故属进化类型。而棕榈藤茎韧皮部的演化趋势为：单韧皮部较原始，双韧皮部较进化。 （6）从棕榈藤的生长性看，直立棕榈藤的导管直径较爬行棕榈藤的大小，这可能与自立棕榈藤茎需要更大的机械支持力有关。 （7）通过对棕榈藤茎的结构研究，支持Uhl和Dansfield（1987）对棕榈藤的分类处理，即：将Calamus, Calospatha Ceratolobus, Daemonorops, Pogonotium, Retispatha放在Calamnieae亚族中;另将Korthalsia与Myrialepis, Plectocomia, Plectocomiopsis分别置于Metroxylinae和Plectocomiinae亚族中。

谷子体细胞无性系变异和抗除草剂基因转化研究

谷子是我国北方具有区域重要性的禾谷类粮食作物。谷子的体细胞无性系变异和外源基因转化相对其它作物研究较少。本研究利用谷子生产的育种中应用的多个优良品种为材料，分析了谷子体细无性系变异发生的影响因素、变异性和频率、DNA分子水平变异和育种应用等问题;采用基因枪法和花粉管通道法，进行了谷子抗除草剂基因转化研究。 主要结果包括： 1. 通过几种外植体的愈伤组织诱导分析,找到了小花分化期前后的谷子幼穗是愈伤组织诱导的最好外植体.提出谷子愈伤组织可按生长状态和结构划分为质密型、松软型和松散型三种基本类型的观点。前两种为胚性愈伤组织并可相互转换，松软型愈伤组织生长状态稳定，可塑性好，是继代培养和因基化的首选类型。供试品种中豫谷1号、高39、郑407和矮宁黄为易培养品种，矮88、豫谷2号、系238、冀14号、C445和青丰谷为相对难培养品种。这些结果为谷子组织培养和生物技术操作提供了基础资料。 2. 首次对多个谷子品种较大群体的无性系变异进行了分析。结果表明，以R_2株系为单位的谷子体细胞无性系表现型变异频率平均为13.0%，不同基因型的变幅为4.3～32.9%;变异涉及株高、抽穗期、穗粒重、出谷率、叶鞘色、育性、抗病性、米色、穗型等多个性状，多数变异为株高和抽穗期等数量性状，少数为矮秆等质量性状：变异的性状多数能在R_3稳定并遗传给后代。从谷子体细胞无性系变异中选出了一批农艺性状得到改良的新品系，其中系103已进入省区域试验，并提供给多家育种单位作为亲本应用。 3. 将RAPD分析技术引入谷子体细胞无性系变异研究。豫谷2号无性系的RAPD多态性变化既有亲本带的缺失，也有新带的产生。用RAPD多态性变化的SMC值度量无性系同亲本相比DNA水平变异的大小，表现型发生变异的无性系,其SMC值分别为0.905～1.0;表现型未发生变异的无性系，RAPD多态性也可能发生变化，其SMC值分布为0.953～1.0。 4. 通过Gus基因瞬时表达单位数的比较，优化了JQ－700基因枪转化谷子松型愈伤组织的操作参数：质粒DNA用量3μg/mg钨粉，CaCl_2农度1.5M，亚精胺浓度40mM，样品室高度7cm，粗弹头为微弹载体，每皿愈伤组织用量1～2g，每次轰击钨粉用量50μg，轰击前4小时和轰击后16～20小时，用含蔗糖150g/l的高渗培养基处理。利用该技术体系，以bar基因为目的基因转化豫谷2号愈伤组织。经选择培养和植株再生，首次获得了抗0.1% bialaphos的正常可育植株，经PCR和Southern blot分析，bar基因已整合到转化体的基因组中，为创造抗除草剂的谷子新种质提供了材料和技术基础。 5. 研究了花粉管通道法转化和花粉介导的基因枪转化谷子的可行性。花粉管通道法转化后代中，获得了抗0.1% bialaphos的抗性植株，经X-gluc组织化学检测，抗性植株叶片的Gus反应为阳性。初步说明该植株可能为转化体，在谷子上为花粉管通道法转化的可行性提供了佐证。花粉介导的基因枪转化未获得转化体。 本文对体细胞无性系变异形成的原因和应用、无性系变异的分子生物学分析、以及谷子的外源基因转化方法等问题进行了讨论。

胡杨体细胞再生植株及耐机制的研究

胡杨（Populus euphratica Oliv.）是干旱荒漠风沙前治地区唯一分布的乔木树种，具有极强的抗逆性，突出地表现出较强的耐盐碱能力。由于胡杨在繁殖上存在问题，种子采后极易丧失生活力和无性扦插繁殖难以生根，加之人们对胡杨耐盐抗逆机制缺乏了解，应而极大地制约了这一珍贵抗逆种质资源的开发和利用，现有资源的保存也受到严重危胁。试验首先利用植物细胞工程技术开展了胡杨体细胞再生植株的系统研究，并在分子水平上就愈伤组织的培养和器官发生过程中表达的特异蛋白开展了深入工作。其次，对胡杨耐盐机制进行了研究，分析了胡杨细胞盐胁迫响应蛋白，开展了盐胁迫条件下细胞对离子吸收和分配特性以及与耐盐有关的形态结构的研究。这一工作的开展对于有效地保存、开发和利用胡杨种质资源，对于荒漠化治理，以及深入认识胡杨耐盐性、丰富和发展木本植物耐盐理论，具有十分重要的意义。 研究取得的主要结果如下： 1.较好地解决了胡杨试管培养中黄萎和退化等难以克服的问题，通过全面和系统的比较研究和对培养条件的优化，首次获得了高频率的和成熟的胡杨体细胞再生植株体系。胡杨愈伤组织、离体叶片和离体茎段不定芽再生频率分别可达82.9％、100％和83％，试管苗生根为86.2％。 2.提出了以愈伤组织表达蛋白状况作为判定其器官发生能力的观点，确定了三类愈伤组织和器官发生中三个不同分化阶段的蛋白分子标记。利用SDS-PAGE和IEF－SDS－PAGE对胡杨不同类型愈伤组织和愈伤组织分化不定芽过程的蛋白进行了研究。结果表明：不同类型愈伤组织中表达的蛋白存在着一定差异。在光下和BA／NAA为1诱导产生的具有较强器官发生能力的茎基愈伤组织，其蛋白组分明显地少于其它类型的愈伤组织，表明其分化程度较低。经过黑暗和BA／NAA为0.5的继代培养，愈伤组织产生了特异的24。5KD和58.6KD的标记蛋白，并且也表达了其器官发生时表达的19KD和31KD蛋白。说明愈伤组织经过继代培养其器官发生能力下降是与细胞分化程度增加相关的。茎基愈伤组织在光下和BA／NAA为5的条件下进行器官发生诱导，随着愈伤组织形成分生细胞团块和不定芽原基明显地表达了20KD和55KD蛋白带，并且20KD蛋白中包含有特异的pI为5。5－6.5的蛋白。43KD和pI为6.5-7.5的蛋白为器官发生前期蛋白。本文不愈伤组织表达蛋白状况与器官发生能力间关系进行了讨论。 3.分离和鉴定了胡杨细胞盐胁迫响应蛋白，从蛋白表达上证实盐胁迫对胡杨细胞产生的影响明显地分为渗透胁迫和离子伤害胁迫两种效应。对悬浮培养的胡杨细胞进行NaCL和PEG(6000)胁迫处理，SDS－PAGE分析表明：NaCL和PEG胁迫处理的细胞均明显地表达了28KD和59KD蛋白带，表明28KD和59DK蛋白是与渗透胁迫有关的。66KD和60KD蛋白带仅在高水平盐胁迫细胞中显著表达，应而是与盐胁迫中离子伤害有关的蛋白。进一步证实胡杨细胞中28KD和66KD蛋白带表达受ABA诱导。通过IEF－SDS－PAGE证实，28KD蛋白包含有pI为8.0-9.0的蛋白，渗透胁迫和离子胁迫相关的分离和鉴定为通过蛋白途径克隆与渗透胁迫和离子胁迫相关基因，为深入认识胡杨耐盐机制奠定了基础。 4.通过X－射线细胞微区分析以及与毛白杨细胞比较发现，胡杨细胞对培养介质中高浓度的盐离子具有较强的拒吸作用和一定的忍耐性。胡杨细胞中液泡不具有积聚离子的功能，细胞分室性渗调节作用不明显。胡杨细胞膜对离子进入具有选择功能，表现在培养介质中Na和CL离子进入细胞和由细胞质进入液泡不以等摩尔数形式进行，进入的CL离子比Na离子约高50％，说明了二者通过质膜是由不同机制控制的，是分开进行的，也说明胡杨细胞拒Na离子强于拒CL离子。另外胡杨细胞受到盐胁迫时还表现出比较强的维持细胞内离子平衡的功能。正是由于上述特性，才赋予了胡杨细胞具有较强的耐盐性。 5.利用电子显微镜和光学显微镜中相差和微分干涉等技术，对胡杨细胞和组织结构进行了观察。与毛白杨细胞相比，胡杨细胞中具有较丰富的线粒体和质体，盐胁迫和渗透胁迫均明显地提高了细胞质中线粒体数和质体数，并使质体中内含体增多，细胞质中和液泡内缘出现明显的嗜饿物质。研究还发现，胡杨细胞膜与细胞壁之间呈齿状结合，说明了膜与壁之间结合的牢固性和稳定性，解释了胡杨细胞在胁迫中不易发生质壁分离的原因。胡杨细胞在受到盐或渗透胁迫时，细胞内出现明显的丝状结晚，细胞核变大，核仁明显。在器官和组织结构方面，胡杨根系具有发达的根冠和根内皮层，根毛较多，叶片输导组织不发达等。这些结构的存在与胡杨的抗逆性是密切相关的。文中从形态结构上阐述了胡杨的耐盐碱特性。

在异倍性水平多胚苗水稻的特征特性研究

通过无融合生殖方式固定水稻杂种优势是水稻育种中极具诱惑力的研究内容之一。自从1979年以来，我国水稻无融合生殖充种研究主要集中在筛选和鉴定水稻多胚苗材料。根据前人的研究结果，具有无融合生殖特性的植物大多数为多倍体。本试验以多胚苗水稻APIV及其衍生系为研究材料，在二倍体[APIV_((2))]、同源三倍体[APIV_((3))]和同源四倍体[APIV_((4))]水平，对其多个世代中的特征特性，其中包括形态学特征，遗传学和胚胎学特性进行了研究，旨在探讨在多倍性水平筛选水稻无融合生殖种质的可能性，获得如下主要研究结果： 1.在二倍体APIV_((2))的多个世代中，只发现单胚苗、双胚苗和三胚苗植株，多胚苗频率比较低(4.67～5.14%)，多胚苗性状的表达在一定程度上受到环境因素的影响，并且，多胚苗植株的成活率比较低(11.70～17.39%)，大部分多胚苗植株在三叶期之前死亡，这很可能与其胚乳的营养供应有关。根据APIV_((2))的多胚苗性状在多个自交世代和杂交世代中的表达特点，多胚苗性状不是显性性状，也不是隐性性状，而是一种比较特殊的数量性状。 2.胚胎学的研究结果表明，在APIV_((2))的2857个子房的胚囊中没有观察到与不定胚生殖有关的特异生殖现象;APIV_((2))在发生受精之前的胚囊构型包括正常蓼型胚囊（76.5%）、退化型胚囊（16.0%）和变异型胚囊（7.5%），在变异型胚囊中包括双卵卵器胚囊（86.7%）和三卵卵器胚囊（13.3%）;APIV_((2))的双受精与前人在正常二倍体水稻中所观察到的结果大致相符;在不同季节的颖花和同一季节同一稻穗的不同颖花内多卵和多胚苗频率存在着明显差异。 3.在同源四倍体水稻的诱导中对种芽进行预处理，促使其胚芽鞘明显伸长后再进行诱导处理是诱导成功的关键技术。在同源四倍体APIV_((4))的同一稻穗中强势颖花的多卵频率要明显地高于弱势颖花的多卵频率。在APIV_((4))去雄后的颖花中意外地观察到了单胚和双胚现象。同源四倍体水稻APIV_((4))的有性生殖能力明显变弱，在花药内正常花粉粒少而败育花粉粒多;在受精前正常胚囊数少而退化胚囊数比较多（36.0%）;花粉管进入胚囊的时间比较晚;双受精频率低而单受精频率高。 4.异倍性水稻间具有一定的可交配性，但其结实率比较低（0.20～-1.64%），通过常规杂交方法所获得的同源三倍体成活植株的频率更低（0.07%）。在湖南湘潭的秋季条件下同源三倍体水稻植株雄性完全败育，但有部分稻穗能结实（0.59%～7.71%)，由此可获得饱满种子和不饱满种子。 5.通过子房培养可以获得异倍性水稻间杂种植株。在APIV_((4))/APIV_((2))杂交组合的子房培养中出现了一株双胚苗;同源三倍体成活植株的获得率仍然比较低（0.78%），但比通过常规杂交法首先获得种子，进而获得同源三倍体成活植株的效率要倍出11.14倍。根据试验结果，提出了6个问题进行讨论。认为在杂交后代中有可能筛选到多胚苗发生频率更高的单株;多胚苗性状是比较复杂的数量性状;同源四倍体水稻的有性生殖能力明显变弱;通过合理配组和复重授粉可以提高异倍性水稻间的杂并结实率;通过子房培养可以明显提高获得同源三倍体成活植株的效率;在多倍体水稻中筛选无融合生殖种质在比二倍体水稻中筛选可能更容易成功。

光敏核不育水稻叶片蛋白质的双向电泳分析及苗期的光周期反应

光敏核不育水稻农垦58S由晚粳农垦58突变形成。具有在适宜温度条件下，长日照诱导雄性不育、短日照诱导雄性可育的基本特性。光敏核不育水稻育性转换机理的阐明是两系法杂交稻技术的关键。 1.克隆光敏不育基因是研究光敏核不育水稻育性转换机理的一个重要方面，本文对通过反映农垦58S和农垦58遗传背景差异的蛋白质或受光周期调节的蛋白质实现克隆光敏不育基因的策略进行了可行性研究，得到以下结果： (1).利用双向电泳技术在光敏核不育水稻是58S叶片中发现一个不存在于农垦58的蛋白质，其分子量为59.8kDa，等电点pH为5.9（称为Pa），该蛋白的存在不受光照条件、发育时期的影响，反映出农垦58S与农垦58遗传背景的差异。 (2).Pa蛋白与农垦58S叶绿体P61蛋白具有相同的分子量、等电点和N－端氨基酸顺序，在不同品种水稻中具有相同的分布，因此它们很可能是同一个蛋白质分子。 (3).利用双向电泳技术发现P61(Pa)和P41蛋白不仅存在于光敏不育系中，也存在于常规可育粳稻中，与光敏不育性状没有平行关系。 (4).利用双向电脉技术发现10天14小时长日照能在农垦58S和农垦58中诱导一个分子量为36kDa、等电点pH为5.2的蛋白质（称为P_b)，该蛋白的表达受光敏色素的调控。因此P61（Pa）、P41及P_b蛋白均与光敏不育性状无直接关系，推测克隆这些蛋白的基因无法直接获得光敏不育基因。 2.在育性转换光周期敏感期已经发现长日照使农垦58S叶绿体发育不良，但在苗期光周期敏感期内，目前尚不知长日照是否会有同样的效应。本文以光周期对农垦58S苗期叶绿体发育的影响为主要内容，研究了农垦58S苗期的光周期反应，得到以下结果： (1).农垦58S从5叶龄期至6叶龄期开始对光周期敏感，短日照开始能诱导茎尖分化幼穗。 (2).不同的光周期对农垦58S 4叶龄期新展叶片叶绿体发育的影响无明显差异，叶结体结构与功能均表现正常。 (3).不同的光周期对农垦58S 6叶龄期新展叶片叶绿体发育的影响有明显差异。与短日照相比，长日照引起农垦58S部分叶绿体发育不良，导致光化学活性减弱、超分子结构异常。长日光周期对农垦58S叶绿体发育的不良效应可能是光周期敏感期内存在的一种特殊现象。

组织培养产生小麦族属间易位和其它染色体变异的分子细胞遗传学分析

组织培养能够诱导染色体断裂和重接进而产生染色体易位的观点已被广泛认识。大量的研究注意到了组织培养产生的核型不稳定性，其中大多数研究的对象是栽培作物及其属间或种间杂种幼胚和幼穗再生植株。借助于减数分裂分析、染色体分带和其它检测技术，在再生植株中发现了包括易位在内的许多染色体变异。可以相信，除了传统的同源和部分同源染色体配对时的自发易位和辐射诱变等方法以外，远缘杂种组织培养有可能作为产生染色体易位的又一种选择。尽管如此，至今还没有取得培养细胞中染色体易位的直接证据。本研究以普通小麦×硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种为材料，研究了组织培养过程中离体细胞的染色体变异，用基因组原位杂交技术（GISH）证实组织培养诱导小麦染色体与簇毛麦染色体发生易位。同时，研究了小麦×黑麦杂种培养细胞中的染色体变异和黑麦B-染色体的变化。利用组织培养技术获得了小麦-黑麦和小麦-长穗偃麦草代换系和附加系。 1 普通小麦比较容易与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体TH_1和TH_1W杂交，所选的9个普通小麦品种或品系与TH_1和TH_1W配制的19个杂交组合，平均结实率为46.7%，共计获得19个杂交组合2316粒杂种种子。正反交结果表明，以普通小麦为母本的杂交结实率高于反交结实率。在继代培养过程中，杂种幼胚愈伤组织生长迅速，甚至直接诱导出绿苗，共获得不同杂交组合2005株再生植株。 2 普通小麦与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种愈伤组织发生了比较大范围的染色体数目和结构变异。在检查的中国春×TH_1W、TH_1W×84加7911515、TH_1×84加7911515、TH_1W×91E27、鲁资357×TH_1W等5个杂种组合的1730个愈伤组织细胞中，平均有19.1%的细胞发生了染色体数目变异，不同杂交组合变化在12.7%（中国春×TH_1W）至30.7%（TH_1×84加7911515），其中，以染色体数目减少的变异为主，数目增加的变异比较少。杂种愈伤组织平均有6.3%的细胞发生了染色体断裂，产生染色体断片、环状染色体、端着丝点染色体和缺失染色体。断裂的染色体可能重新融合在一起，形成双着丝点染色体。 3 培养时间影响普通小麦×硬粒小麦-簇毛麦双二倍体和普通小麦×黑麦杂种愈伤组织细胞中的染色体数目和结构变异。在一定时间里，随着培养时间的延长，未发生核型变异的细胞逐渐减少，发生变异的细胞逐渐增多，主要表现在染色体数目减少的细胞增多，而染色体数目增加的细胞有减少的趋势。在长时间培养（190日龄）的愈伤组织中染色体加倍的细胞消失了，表明长时间培养对高倍性的细胞具有不利的选择，使这类细胞难以在长期继代培养中生存下去。愈伤组织在第一次继代培养时就发现有核型变异，说明染色体变异在愈伤组织培养初期就可以发生。 4 以簇毛麦总基因组DNA为探针，采用荧光原位杂交技术在普通小麦×硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种愈伤组织细胞中发现小麦染色体与簇毛麦染色体发性易位，这一结果是组织培养诱导培养细胞中属间染色体易位的第一个直观的证据。易位的染色体既有臂间易位，也有小片段易位。易位的染色体不仅可以在愈伤组织细胞中存在，也能够在再生植株中表达。在64株中国春×TH_1W和NPFP×TH_1再生植株中，观察到了3个易位株，其中1个易位株是一个小麦染色体与一个簇毛麦染色体发生了相互易位，易位的簇毛麦染色体片段比较小，大约为簇毛麦染色体臂的1/2，而易位的小麦染色体大约是臂长的1/3，另外2个易位株染色体断点位于或靠近着丝点。本研究的结果再次证实了利用组织培养能够创造小麦与外源染色体之间发生易位。 5 ~(60)Co γ-射线辐射处理对于普通小麦中国春与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体TH_1W杂种愈伤组织细胞的染色体变异有很大的影响。表现在未发生变异的细胞大大减少，发生染色体数目变异的细胞急剧增加，主要是染色体数目减少的变异提高了21.3%，相反染色体增加的变异不但没有增加，而且还有所减少。经过辐射处理的愈伤组织细胞染色体结构变异也有大幅度增加，变异频率提高，变异类型增加。发生染色体断裂和重接形成双着丝点染色体的细胞频率达到22.3%，比对照提高13.9%。辐射诱变对培养细胞中簇毛麦染色体变异发生明显的影响。与此同时，簇毛麦染色体与小麦染色体易位频率比对照提高了近2倍。观察结果还表明愈伤组织辐射处理比延长培养时间诱导染色体变异的效果更好。 6 尽管愈伤组织中发生的染色体变异在再生植株中多有发现，但是，只有比较小范围染色体变异的愈伤组织细胞具有再生能力形成再生植株，那些发生剧烈变异的细胞通常不具有再生能力，因而不能在再生植株中得到表达。普通小麦与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种大多数再生植株染色体数目与供体杂种保持一致，只有少数植株发生染色体数目变异。显然，发生较大染色体变异的愈伤组织细胞在增殖和分化过程中处于不利的地位，逐渐被淘汰。 7 在普通小麦与硬粒小麦-簇毛麦与黑麦杂种愈伤组织中，观察到相当高频率的染色体加倍细胞，为利用组织培养创造双二倍体提供了一种可能。但是，加倍的细胞只是培养初期的愈伤组织中出现，经过一段时间的培养，这种细胞大多消失了。而且，大多数再生植株染色体数目未发生加倍，其中并没有出现期望的双二倍体植株。表明加倍了的细胞在愈伤组织生长和分化过程中大范围变异的细胞一样受到不利的选择，再生能力比较差。因此，利用组织培养创造双二倍体需要更大的努力。 8 一些黑麦品种含有数目不等的B-染色体。B-染色体的多少对普通小麦与黑麦的杂交结实率有比较大的影响，数目越多，杂交结实率越低。在培养初期的愈伤组织细胞中，B-染色体的频率很高，例如69%的中国春×芬7416杂种的40日龄愈伤组织细胞中含有数目不等的B-染色体。常染色体的倍性影响B-染色体的分布，染色体数目加倍的双二倍体细胞中含多数B-染色体的细胞频率大大高于单倍体细胞。经过一段时间的培养之后，绝大多数B-染色体都不存在了，只有极少数细胞含有1个B-染色体。可能的原因是离体培养过程对B-染色体产生了不利的选择。 9 利用组织培养技术，从普通小麦与八倍体小黑麦杂种幼胚再生植株自交后代中选育出2个异代换系，从4D缺体小麦×八倍体小黑麦再生植株回交后代中选育出1个附加系。荧光原位杂交、C-分带和种子贮藏蛋白分析证明这两个代换系1D/1R代换，附加的也是1R染色体。从4D缺体小麦与八倍体小偃麦杂种再生植株自交和回交后代中选育出5个代换系和2个附加系。染色体配对和RAPD分析证实了长穗偃麦草染色质的存在。其中一些小麦-长穗偃麦草代换系和附加系对叶锈病免疫或高抗，对条锈病的一些生理小种和白粉病具有比较高的抗性。而且，附加系924和代换系807蛋白质含量分别达到19.32%和18.83%。 10 当普通小麦鲁资357与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂交时，无论是实生苗还是再生植株都发生杂种致死现象。细胞学观察没有发现植株染色体发生变异，荧光原位杂交表明簇毛麦染色也没有发生可见的变异。推测这种杂种致死现象是由于鲁资357和硬粒小麦81086A（TH_1和TH_1W的硬粒小麦亲本）中可能分别带有互补的杂种致死基因所致。

棉花抗虫基因工程研究

本文通过根农杆菌（Agrobacterium tumfaciens）介导法分别将Signal和KDEL修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂（Cowpea trypsin inhibitor, CpTI）基因、豌豆外源凝集素（Pea lectin, P-Lec）和大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（Soybean Kunitz typsin inhibitor, SKTI）双价抗虫基因、雪花莲外源凝集素（Galanthus nivals agglutinin, GNA）基因以及高效复合启动子OM控制的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis, B.t.）杀虫毒蛋白基因导入了陆地棉（Gossypium hirsutum L.）栽培品种新陆早1号、新陆中2号、晋棉7号、冀合321、辽9和晋棉12号，并获得了大批转基因再生植株。 实验中对影响棉花转化和再生的一些条件进行了研究，从根农杆菌培养、棉花无菌苗的制备、转化操作和共培养等方面对转化条件进行了探讨;从激素配化、植物表达载体、外植体类型、基因型等方面对抗性愈伤组织的诱导进行了摸索;从激素、从碳源、培养容器、pH值、抗褐化剂及固化剂的选择等方面对影响植株再生的条件进行了优化。 本文开创性地采用嫁接代替移栽，从而极大地提高了转化植株定植成活率，缩短了缓苗时间并增加了转化植株当代的繁殖系数。 在建立了一套较为高效的陆地棉转化及再生系统基础上，本文还进行了其它转化方式和转化体系的初步探讨。利用棉花幼嫩种子无菌苗下胚轴作为外植体，通过改变愈伤组织诱导培养基配方面提高胚性愈伤组织的诱导频率，进而得到更多的体细胞胚状和再生植株，缩短再生周期;尝试用胚性愈伤组织作为外植体的根农杆菌介导法转化，确定了一些与转化有关的条件;建立了一套棉花茎尖培养程序，为运用基因枪法轰击棉花茎尖分生组织或用根农杆菌直接转化茎尖分生组织，以克服根农杆菌转化棉花时体胚发生的基因型局限开辟了一条新途径。 本文还建立了一种快速鉴定转化植株后代的方法。这一简便方法还有助于进行转基因棉纯合系的筛选以及外源基因的遗传稳定性研究。 转基因植株经Npt-II ELISA、PCR、PCR Southern 检测证明外源抗虫基因CpTI、SKTI、P-lec、GNA以及B.t.基因已存在于转化植株基因组内。修饰的CpTI转基因植株抗棉铃虫（Heliothis armigera Hubner）试验结果表明，其杀虫效果显著优于前期未修饰的CpTI转化植株。P－lec和SKTI双价转基因植株抗棉铃虫试验结果表明，转基因植株对棉铃虫幼虫具有较强的杀虫活力。 目前，已获得转以上抗虫基因棉花T1代植株。为今后进一步将植物基因工程技术应用于棉花遗传改良打下了基础。

温敏转绿型水稻叶绿素缺失突变体1103s失绿复绿特性研究

叶绿素突变泛指能导致叶绿素代谢失调的核基因或叶绿体基因突变。发生叶绿素突变的植物个体普遍表现为叶色的变化，目前已报道的多数叶绿素突变体为人工诱变产物。叶绿素缺失突变导致的叶结素代谢缺陷实际上反映了叶绿体发育过程的缺陷，研究叶绿素突变更重要的意义是在于阐明叶绿体发育过程。 本研究所用材料1103s是一类特殊的叶绿素突变体，为籼性光敏核不育水稻（Oryza sativa L.）8902s群体中发现的自发突变体。该突本所具有的失绿特性为特定温度条件下才表现出来的瞬时性状，在环境温度恢复后，失绿组织可复发。遗传分析表明该突变由隐性核基因控制。本文不1103s所具有的温度敏感和失绿复绿特性，在亚细胞水平和生理化水平进行了详细的探讨。 叶绿素含量的检测表明，诱导后表现失绿的叶片组织内叶绿素含量明显降低，叶绿素a/b比值升高，原脱植基叶绿素含量低于绿色组织。失绿组织中的这种原脱植基叶绿素在失绿组织中含量的减少是由两方面因素造成的，其一是叶绿素合成过程中原脱植基叶绿素合成之前的某一步过程反应受阻;其二是原脱植基叶绿素向叶绿素转化的过程是正常进行的。 对1103s叶绿体内部的超微结构观察表明：1.控制叶绿素缺失性状的是一多效基因。该基因在特定温度条件下表达时，不仅影响到叶绿体的发育，也对细胞质中的其他细胞器产生重要的影响，其结果是细胞质中的高度有序的内膜系统被大量形状不规则的泡状结构所取代。放大后发现，这类泡状结构由（1）线粒体（2）功能未知的泡状结构I，其内部含颗粒状物质泡结构被膜内还有数层不连续的膜残片（3）功能未知的泡状结构II，其内部含大颗粒状物质。2.该突变体表达失绿和复绿过程中，叶绿体内部膜结构的变化伴随叶绿素含量的变化也有退脂和恢复的过程，但与已报道的其他突体有两个明显的不同：首先，在退化细胞的叶绿体内未观察到前片层体的存在。前片层体是叶绿体发育过程中黄化体阶段常见的非常明显的特殊结构，在电镜下为有规律的晶格状结构。已有研究表明，前片层体的形成与原脱植基叶绿素的积累有密切关系。与组培白化苗中检测到的结果不同，失绿组织中原脱植基叶绿素的含量不但没有积累，反而少于绿色组织中的含量，而造成该突变体在失绿过程中质体内无前片层体形成。其次，1103s在叶绿体退化过程中类囊体膜的变化不同于其化温敏的转绿型叶绿素突变体，尤其是在失绿过程中，其类囊体膜不是以直接解体的方式减少而是以单类囊体膜紧靠为主要特征。 对野生型 8902s与1103s类囊体膜结构的冰冻蚀刻分析表明，1103s失绿叶片上的失绿组织和绿色组织中，EFs面的大颗粒结构均异常。其异常之处表现在每个颗粒明显解离成两个亚单位（上面观），而在野生型8902s中则无上述现象出现。亚单位的解离程度在失绿组织中更明显。有间接证据研究表明，EFs面上的大颗粒代表PS II。如果该推论正确，那么失绿叶片的失绿组织和绿色组织中，PS II都可能是异常的。 另外，通过对失绿组织和绿色组织全叶蛋白双向电泳图谱的比较，得到了一个特异缺失的叶蛋白组分，该蛋白的分子量为51kd。此蛋白在失绿叶片上的失绿组织和绿色组织之间存在组织差异性。通过对该蛋白在不同温度处理和不同遗传背景下的变化规律分析，发现该蛋白是一存在于许多水稻品系叶片中的高含量组分，此蛋白表达本身不受变温诱导过程的影响，而是受另一感温过程的调控。初步分析表明该蛋白为一失绿相关蛋白。 综上所述，1103s所具有的失绿和复绿特性是核基因多效表达的结果，有一感温过程调控下游蛋白表达的复杂过程。此外，该突变特性很可能与PS II的结构异常有关。

体细胞无性系变异与烟草抗黑胫病细胞突变体的筛选

体细胞无性系变异是植物组织培养过程中发生的一种较为普遍的现象，这种现象在遗传学理论和育种实践上都很值得研究。应用这种变异进行筛选人们已经获得了一大批生产上有广泛意义的细胞突变体。但对于无性系变异发生的机理，人们虽然也进行了详细研究，提出了不少假说，但一直未能给出一个较为全面的解释。有些解释仍然建立在推测的基础上，有待进一步的研究。在这些解释中，利用转座子活化进行解释是最使人感兴趣的一种，也是较有说服力的一种。我们的实验分为两个部分，一是对无性系变异发生与转座子的关系进行了初步的探索,一是利用体细胞无性系变异筛选烟草黑胫病细胞突变体的应用进行了研究。 对转座因子的转活性进行分析，通常采用标记基因的表型检测。本实验用农杆菌双元载体pSLJ721（Ac∷GUS）转化烟草（品种：红花大金元）， 然后对转基因烟草的愈伤组织进行GUS酶活性的组织化学分析。通过GUS活性变化来分析转座活性。结果表明组织培养可以增强转座子的活性。间接证明转座子活化是体细胞无性系变异的原因之. 本论文实验方面的另一部分是体细胞无性系变异在烟草抗黑茎病研究上的应用。烟草黑茎病是由烟草致病疫霉引起的一种烟草主要病害。首先从云南地区黑胫病病区分离、纯化黑胫病（Phytophythora parasitica via. Nicotina）病原菌，同时利用红花大金元为实验对象，以组织培养中自然发生的元性系变异为基础，以50％以及80％的黑胫病病菌粗毒素为选择压力，筛选出抗黑胫病毒素的烟草株系，用离体叶片法和茎部接种法进一步鉴定其对黑胫病病菌的抗性。最后进行田间检测以期获得综合性状优良的抗黑胫病细胞突变体。另外我们还利用随机引物扩增多态DNA（RAPD）分析技术，对选择到的九个抗病株系和六株对照的DNA进行分析。在使用的70种随机引物中，共有57个引物产生可检测扩增产物，产生306条搁增带，其中有多态性的条带数为51条，突变体的平均RAPD条带变异率为1.85％，其中有两个RAPD条带（CYA－17－100和Sangon03-350）为突变体所特有，可初步判断为抗黑胫病的RAPD标记。对突变体和对照植株叶片水溶性蛋白SDS电泳观察到一些条带的变异，但没有找到突变体特异的共同条带。

水稻富含甘氨酸蛋白在细胞中的定位及其基因调控元件的转基因分析

水稻Angrp-1基因编码富含甘氨酸蛋白质。氨基酸序列分析表明该蛋白在氨基端可能存在一个信号肽序列，其后为富含甘氨酸序列。亲水性指数显示AnGRP-1蛋白包含两个区域。第一个区域由氨基端的1到27氨基酸残基组成。为强疏水性区。该肽段的氨基端为带正电荷号肽特征。与水稻Osgrp-1和菜豆grp1.8基因编码的信号肽进行同源性比较，发现这三种信号肽具有alafLvLLNIg同源序列。AnGRP-1蛋白的第二区域由第28到183氨基酸残基组成。该区域富含甘氨酸，具轻度亲水性，并且含有15个Gly-Tyr-Gly基序，这些基序中的酷西安酸残基之间相互作用，有可能形成分子间或分子内的连接。 利用水稻原生质体瞬间表达系统，比较Angrp-1基因启动子283bp和－1020bp片段，以及Ubiquitin启动子、Actin启动子和35S启动子的活性。结果表明，在水稻原生质体瞬间表达中，Angrp-1基因的两个启动子片段活性较低，接近本底。三个对照的组成型启动子中，以Ubiquitin启动子的活性最强，Actin启动子次之， 35S启动子最弱。根据以上结果推测水稻Angrp-1基因的表达可能具有组织或发育特异异表达和特性。 为研究Angrp-1基因的稳定表达与调控特性，将Angrp-1基因的启动子缺失片段1020bp、941bp、568bp和182bp分别与GUS基因融合，得到pGRP6-121、pGRP7-121、pGRP8-121和pGRP9-121等4个克隆，进行烟草转化，获得转基因植株。GUS活性测定表明在－1020到－568之间，随缺失增多，启动子活性下降。当缺失至－182时，182bp的启动子片段活性高于568bp片段。因此，Angrp-1基因5'端－1020到－568之间存在正调控序列，在－568至－182之间存在负调控序列。对pGRP6-121的烟草转基因植株进行GUS组织染色和活性测发现，GUS基因在维管组织优先表达。在根、茎、叶三种器官中，叶和茎的表达量最高。营养生长期的表达量高于生殖生长期。用2283bp和1020bp的启动子片段分别与GUS基因融合，转化水稻，转化体的GUS组织学染色表明Gus基因具有维管束优先表达特性。因此，Angrp-1基因的表达具有较明显的组织、器官和发育特异性。 水稻AnGRP-1蛋白的免疫组织定位分析表明，Angrp-1基因产物主要定位于水稻的维管组织。利用免疫金方法对AnGRP-1蛋白进行超微结构定位，发现金颗粒主要分布于水稻细胞的细胞壁中。因此，可基本确定AnGRP-1蛋白为细胞壁蛋白。在细胞内的内质网和高尔基体上面或附近也有金颗粒的分布，表明至少有部分AnGRP-1蛋白经过内质网－高尔基体－质膜途径，最终达到细胞壁。 为研究Angrp-1基因编码的信号肽功能，将其信号肽与GUS的氨基端融合，分别置于35S启动子和Angrp-1基因1020bp启动子片段控制之下，得到克隆p35s-SP-GUS-121和pGRP6-SP-GUS-121，分别以pBI121和pGRP6-121作对照，进行烟草基因转化。转化体的GUS活性分析表明，在35S启动子控制下，加与不加信号肽对GUS活性影响不大。但是，在Angrp-1基因的1020bp启动子片段作用下，信号肽与GUS融合后的转化体中其本不表现GUS活性。利用免疫金方法进行的超微结构定位表明，在p35S-SP-GUS-121和pGRP6-SP-GUS-121转化的烟草植株中，均可在细胞壁中检测室GUS产物的存在，因此AnGRP-1的信号肽能引导GUS从细胞质分泌细胞壁中。 以Angrp-1基因5'端的－568到＋1作探针，发现Angrp-1基因以在水稻窄叶青和京系17两个亲本中存在多态性，并进一步将Angrp-1基因定位于水稻第10号染色体上。

水稻颖花开裂突变体的鉴定及颖花开裂基因srs-1的定位

　　水稻(Oryza sativa L.) 颖花开裂 (split rice spikelet，SRS) 突变体是从水稻品系 8902s 花药培养得到的双单倍体群体中筛选出的同源异型突变体。以窄叶青8号为母本，SRS突变体为父本配制杂交组合，其F2群体中正常植株和突变植株的分离比例符合3:1，说明颖花突变性状是由单隐性基因决定的。 利用扫描电镜观察 SRS突变体花器官形态发生过程。其性状表现为内外稃变软变长，不抱合，在外稃基部又着生一朵花，两浆片基部融合，质地呈稃片状，雄蕊和雌蕊形态正常，且可育。该突变体的突变性状与拟南芥APETALA1的突变表现相似，说明两者在形态建成方面具有相似之处。由于 SRS 突变体第一轮和第二轮花器官发生了变化，根据 ABC 模型，srs-l基因应属于同源异型 A 组基因。 采用BSA法在F2群体中建立DNA正常池和突变池，利用RAPD技术筛选与突变基因srs-l连锁的分子标记。从520条随机引物中筛选出了引物S465能在两池间扩增出分子量为900 bp的差异片段，并证明其在F2群体中表现共分离。将此DNA片段克隆后作为RFLP探针pS465A，该探针与srs-l基因紧密连锁，在DH群体的RFLP分子连锁图谱上成功地将它们定位于第三染色体上。 本研究是利用水稻同源异型突变体为材料，研究水稻花器官发育基因的首例报道。

青蒿异源基因的遗传转化及青蒿生物合成相关基因的克隆

本论文由三部分内容组成，一、药用青蒿的遗传转化，即根癌农杆菌和发 根农杆菌介导的转化系统的建立及其影响参数的研究。二、青蒿素生物合成的 分子调控。三、倍半萜生物合成相关基因的克隆。 一、药用青蒿的遗传转化。建立了Ri质粒介导和Ti质粒介导的两种转基因系统， 其中Ri质粒介导青蒿转基因系统的建立是国际上首次报道;以GFP基因为报 告基因，首次获得高效表达的青蒿转绿色荧光蛋白基因的丛生芽，并对GFP基 因的表达进行了组织和细胞水平的定位。此外，对影响两种转基因系统的主要 参数进行了较为详细的研究。上述研究为青蒿素生物合成的分子调控奠定了坚 实的基础。 二、青蒿素生物合成的分子调控。为探索提高青蒿植株或组织和器官中的青蒿 素含量，首次以棉花中克隆的杜松烯合成酶和法呢基焦磷酸合成酶的 cDNA 为 目的基因导入青蒿，对青蒿中青蒿素的生物合成进行了分子调控研究的尝试。 通过已建立的两种转基因系统，将从棉花中克隆的杜松烯合成酶和法呢基焦磷 酸合成酶的 cDNA 导入青蒿，获得转基因发根和转基因植株。结果表明，外源 基因的表达能够影响青蒿素的生物合成，其中法呢基焦磷酸合成酶基因的过量 表达能够促进青蒿素的生物合成，提高转基因发根和植株中的青蒿素的含量。 转基因发根F-26系中青蒿素含量最高达3.01 mg/g.DW，与对照相比青蒿素含量 提高3～4倍;转基因植株的青蒿素含量最高达10.08 mg/g.DW，与对照相比， 转基因植株的青蒿素产物提高2～3倍。此外，研究还表明，在转基因的发根C -37株系中，外源杜松烯合成酶基因的导入和表达可能相应地促进青蒿转基因 发根自身的法昵基焦磷酸基因的表达。 三、倍半萜生物合成相关基因的克隆。采用 RT-PCR 技术，从马铃薯 (Solanum tuberosum L.) 幼叶中克隆了 HMGRII 亚基因家族的一个新的成员 HMGR-c2（GenBank accession No．AF 096838Southem）;杂交分析表明，该基因至少以 两个拷贝以上形式存在于马铃薯基因组中;RT-PCR分析表明，HMGR -c2的 表达在幼苗期无组织特异性，广泛地存在于根、茎、叶等组织中。以青蒿001 株系的苗期叶片为材料，构建了青蒿苗期的λgtll cDNA文库，以PCR筛库方 法从青蒿中克隆一个法呢基焦磷酸合成酶cDNA (Artfps2 GenBank accession No． AF136602)和一个HMGR cDNA(GenBank accession No．AF142473);以青蒿 025株系的苗期叶片为材料，构建了青蒿苗期部分质粒文库以 PCR 筛库方法从 青蒿中克隆一个法昵基焦磷酸合成酶 cDNA (Artfpsl GenBank accession No.AF112881);此外，还从青蒿中克隆了倍半萜合成酶的 cDNA 片段(GenBank accession No.AF156854)。其中青蒿倍半萜合成酶基因的克隆是目前国际上本研 究领域最受关注的焦点和难点之一。至此，本研究已将与青蒿素生物合成相关 的三个重要的关键酶基因基本克隆，这无疑将加速青蒿素生物合成的基础和应 用研究的进程。