898 resultados para Transfection transitoire
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Em estudos de terapia gnica e vacinao por DNA, a eficincia e a segurana dos vetores que transportam o material gentico teraputico possuem papel fundamental. Vetores no virais so considerados mais seguros, mas menos eficientes em relao aos vetores virais. Em parte, isso se deve falta de estudos sistemticos e comparativos no que diz respeito s caractersticas fsico-qumicas desses vetores quando em solues biolgicas e o efeito delas sobre a eficincia de entrega gnica. O objetivo deste trabalho avaliar o efeito do pH, da fora inica e do tipo tampo de complexao sobre as caractersticas fsico-qumicas de nanopartculas pDNA-protamina e pDNA-protamina-lipofectamina, visando entrega gnica para diferentes linhagens celulares. Para isso, nanopartculas formadas em diferentes condies foram caracterizadas atravs de ensaios de espalhamento dinmico de luz (DLS) e potencial zeta. Os estudos indicaram que o pH, a fora inica, o tipo de tampo e a presena de meio de cultura e soro no ambiente de complexao alteram significativamente o tamanho, a polidispersidade e o potencial zeta das partculas formadas. Finalmente, buscou-se avaliar o efeito dessas caractersticas sobre a eficincia de transfeco in vitro de clulas de macrfagos IC21 e clulas HeLa. Os estudos de transfeco em clulas Hela indicam que tanto a composio como as condies de formao das partculas influenciam significativamente a eficincia de transfeco.
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Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2014
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Il est reconnu que la protine filamenteuse intermdiaire Nestine est exprime lors du processus de cicatrisation et du remodelage fibrotique. De plus, nous avons identifi lexpression de la Nestine au sein de deux populations distinctes qui sont directement impliques dans les rponses de fibroses rparative et ractive. Ainsi, une population de cellules souches neurales prognitrices rsidentes du coeur de rat adulte exprime la Nestine et a t identifie titre de substrat de langiogense et de la neurogense cardiaque. galement, la Nestine est exprime par les myofibroblastes cicatriciels cardiaques et il a t tabli que la protine filamenteuse intermdiaire joue un rle dans la prolifration de ces cellules. Ainsi, lobjectif gnral de cette thse tait de mieux comprendre les vnements cellulaires impliqus dans la rponse neurognique des cellules souches neurales prognitrices rsidentes cardiaques Nestine(+) (CSNPRCN(+)) lors de la fibrose rparative cardiaque et dexplorer si lapparition de fibroblastes Nestine(+) est associe avec la rponse de fibrose ractive secondaire du remodelage pulmonaire. Une premire publication nous a permis dtablir quil existe une rgulation la hausse de lexpression de la GAP43 (growth associated protein 43) et que cet vnement transitoire prcde lacquisition dun phnotype neuronal par les CSNPRCN(+) lors du processus de cicatrisation cardiaque chez le rat ayant subi un infarctus du myocarde. De plus, la surimposition de la condition diabtique de type 1, via linjection unique de Streptozotocine chez le rat, abolit la rponse neurognique des CSNPRCN(+), qui est normalement induite la suite de lischmie cardiaque ou de ladministration de 6-hydroxydopamine. Le second article a dmontr que le dveloppement aigu de la fibrose pulmonaire secondaire de linfarctus du myocarde chez le rat est associ avec une augmentation de lexpression protique de la Nestine et de lapparition de myofibroblastes pulmonaires Nestine(+). galement, le traitement de fibroblastes pulmonaires avec des facteurs de croissances peptidiques pro-fibrotiques a augment lexpression de la Nestine par ces cellules. Enfin, le dveloppement initial de la condition diabtique de type 1 chez le rat est associ avec une absence de fibrose ractive pulmonaire et une rduction significative des niveaux protiques et dARN messager de la Nestine pulmonaire. Finalement, la troisime tude reprsentait quant elle un prolongement de la deuxime tude et a alors examin le remodelage pulmonaire chronique chez un modle tabli dhypertension pulmonaire. Ainsi, les poumons de rats adultes mles soumis lhypoxie hypobarique durant 3 semaines prsentent un remodelage vasculaire, une fibrose ractive et une augmentation des niveaux dARN messager et de la protine Nestine. De plus, nos rsultats ont dmontr que la Nestine, plutt que lalpha-actine du muscle lisse, est un marqueur plus appropri des diverses populations de fibroblastes pulmonaires activs. galement, nos donnes suggrent que les fibroblastes pulmonaires activs proviendraient en partie de fibroblastes rsidents, ainsi que des processus de transition pithlio-msenchymateuse et de transition endothlio-msenchymateuse. Collectivement, ces tudes ont dmontr que des populations distinctes de cellules Nestine(+) jouent un rle majeur dans la fibrose rparative cardiaque et la fibrose ractive pulmonaire.
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La dficience intellectuelle est la cause dhandicap la plus frquente chez lenfant. De nombreuses vidences convergent vers lide selon laquelle des altrations dans les gnes synaptiques puissent expliquer une fraction significative des affections neurodveloppementales telles que la dficience intellectuelle ou encore lautisme. Jusqu rcemment, la majorit des mutations associes la dficience intellectuelle a t lie au chromosome X ou la transmission autosomique rcessive. Dun autre ct, plusieurs tudes rcentes suggrent que des mutations de novo dans des gnes transmission autosomique dominante, requis dans les processus de la plasticit synaptique peuvent tre la source dune importante fraction des cas de dficience intellectuelle non syndromique. Par des techniques permettant la capture de lexome et le squenage de lADN gnomique, notre laboratoire a prcdemment report les premires mutations pathogniques dans le gne transmission autosomique dominante SYNGAP1. Ces dernires ont t associes des troubles comportementaux tels que la dficience intellectuelle, linattention, des problmes dhumeur, dimpulsivit et dagressions physiques. Dautres patients sont diagnostiqus avec des troubles autistiques et/ou des formes particulires dpilepsie gnralise. Chez la souris, le knock-out constitutif de Syngap1 (souris Syngap1+/-) rsulte en des dficits comme lhyperactivit locomotrice, une rduction du comportement associe lanxit, une augmentation du rflexe de sursaut, une propension lisolation, des problmes dans le conditionnement la peur, des troubles dans les mmoires de travail, de rfrence et social. Ainsi, la souris Syngap1+/- reprsente un modle appropri pour ltude des effets dltres causs par lhaploinsuffisance de SYNGAP1 sur le dveloppement de circuits neuronaux. Dautre part, il est de premire importance de statuer si les mutations humaines aboutissent lhaploinsuffisance de la protine. SYNGAP1 encode pour une protine activit GTPase pour Ras. Son haploinsuffisance entrane laugmentation des niveaux dactivit de Ras, de phosphorylation de ERK, cause une morphogense anormale des pines dendritiques et un excs dans la concentration des rcepteurs AMPA la membrane postsynaptique des neurones excitateurs. Plusieurs tudes suggrent que laugmentation prcoce de linsertion des rcepteurs AMPA au sein des synapses glutamatergiques contribue certains phnotypes observs chez la souris Syngap1+/-. En revanche, les consquences de lhaploinsuffisance de SYNGAP1 sur les circuits neuronaux GABAergiques restent inconnues. Les enjeux de mon projet de PhD sont: 1) didentifier limpact de mutations humaines dans la fonction de SYNGAP1; 2) de dterminer si SYNGAP1 contribue au dveloppement et la fonction des circuits GABAergiques; 3) de rvler comment lhaploinsuffisance de Syngap1 restreinte aux circuits GABAergiques affecte le comportement et la cognition. Nous avons publi les premires mutations humaines de type faux-sens dans le gne SYNGAP1 (c.1084T>C [p.W362R]; c.1685C>T [p.P562L]) ainsi que deux nouvelles mutations tronquantes (c.2212_2213del [p.S738X]; c.283dupC [p.H95PfsX5]). Ces dernires sont toutes de novo lexception de c.283dupC, hrite dun pre mosaque pour la mme mutation. Dans cette tude, nous avons confirm que les patients pourvus de mutations dans SYNGAP1 prsentent, entre autre, des phnotypes associs des troubles comportementaux relatifs la dficience intellectuelle. En culture organotypique, la transfection biolistique de lADNc de Syngap1 wild-type dans des cellules pyramidales corticales rduit significativement les niveaux de pERK, en fonction de lactivit neuronale. Au contraire les constructions plasmidiques exprimant les mutations W362R, P562L, ou celle prcdemment rpertorie R579X, nengendre aucun effet significatif sur les niveaux de pERK. Ces rsultats suggrent que ces mutations faux-sens et tronquante rsultent en la perte de la fonction de SYNGAP1 ayant fort probablement pour consquences daffecter la rgulation du dveloppement crbral. Plusieurs tudes publies suggrent que les dficits cognitifs associs lhaploinsuffisance de SYNGAP1 peuvent merger daltrations dans le dveloppement des neurones excitateurs glutamatergiques. Toutefois, si, et auquel cas, de quelle manire ces mutations affectent le dveloppement des interneurones GABAergiques rsultant en un dsquilibre entre lexcitation et linhibition et aux dficits cognitifs restent sujet de controverses. Par consquent, nous avons examin la contribution de Syngap1 dans le dveloppement des circuits GABAergiques. A cette fin, nous avons gnr une souris mutante knockout conditionnelle dans laquelle un allle de Syngap1 est spcifiquement excis dans les interneurones GABAergiques issus de lminence ganglionnaire mdiale (souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+). En culture organotypique, nous avons dmontr que la rduction de Syngap1 restreinte aux interneurones inhibiteurs rsulte en des altrations au niveau de leur arborisation axonale et dans leur densit synaptique. De plus, raliss sur des coupes de cerveau de souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+, les enregistrements des courants inhibiteurs postsynaptiques miniatures (mIPSC) ou encore de ceux voqus au moyen de loptogntique (oIPSC) dvoilent une rduction significative de la neurotransmission inhibitrice corticale. Enfin, nous avons compar les performances de souris jeunes adultes Syngap1+/-, Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+ celles de leurs congnres contrles dans une batterie de tests comportementaux. linverse des souris Syngap1+/-, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+ ne prsentent pas dhyperactivit locomotrice, ni de comportement associ lanxit. Cependant, elles dmontrent des dficits similaires dans la mmoire de travail et de reconnaissance sociale, suggrant que lhaploinsuffisance de Syngap1 restreinte aux interneurones GABAergiques drivs de lminence ganglionnaire mdiale rcapitule en partie certains des phnotypes cognitifs observs chez la souris Syngap1+/-. Mes travaux de PhD tablissent pour la premire fois que les mutations humaines dans le gne SYNGAP1 associs la dficience intellectuelle causent la perte de fonction de la protine. Mes tudes dvoilent, galement pour la premire fois, linfluence significative de ce gne dans la rgulation du dveloppement et de la fonction des interneurones. Dadmettre latteinte des cellules GABAergiques illustre plus ralistement la complexit de la dficience intellectuelle non syndromique cause par lhaploinsuffisance de SYNGAP1. Ainsi, seule une comprhension raffine de cette condition neurodveloppementale pourra mener une approche thrapeutique adquate.
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Le co-transporteur KCC2 spcifique au potassium et chlore a pour rle principal de rduire la concentration intracellulaire de chlore, entranant lhyperpolarisation des courants GABAergic lautorisant ainsi devenir inhibiteur dans le cerveau mature. De plus, il est aussi impliqu dans le dveloppement des synapses excitatrices, nommes aussi les pines dendritiques. Le but de notre projet est dtudier leffet des modifications concernant l'expression et la fonction de KCC2 dans le cortex du cerveau en dveloppement dans un contexte de convulsions prcoces. Les convulsions fbriles affectent environ 5% des enfants, et ce ds la premire anne de vie. Les enfants atteints de convulsions fbriles prolonges et atypiques sont plus susceptibles dvelopper lpilepsie. De plus, la prsence dune malformation crbrale prdispose au dveloppement de convulsions fbriles atypiques, et dpilepsie du lobe temporal. Ceci suggre que ces pathologies nonatales peuvent altrer le dveloppement des circuits neuronaux irrversiblement. Cependant, les mcanismes qui sous-tendent ces effets ne sont pas encore compris. Nous avons pour but de comprendre l'impact des altrations de KCC2 sur la survenue des convulsions et dans la formation des pines dendritiques. Nous avons tudi KCC2 dans un modle animal de convulsions prcdemment valid, qui combine une lsion corticale P1 (premier jour de vie postnatale), suivie d'une convulsion induite par hyperthermie P10 (nomms rats LHS). la suite de ces insultes, 86% des rats mles LHS dveloppent lpilepsie lge adulte, au mme titre que des troubles dapprentissage. P20, ces animaux presentent une augmentation de l'expression de KCC2 associe une hyperpolarisation du potentiel de rversion de GABA. De plus, nous avons observ des rductions dans la taille des pines dendritiques et l'amplitude des courants post-synaptiques excitateurs miniatures, ainsi quun dficit de mmoire spatial, et ce avant le dveloppement des convulsions spontanes. Dans le but de rtablir les dficits observs chez les rats LHS, nous avons alors ralis un knock-down de KCC2 par shARN spcifique par lectroporation in utero. Nos rsultats ont montr une diminution de la susceptibilit aux convulsions due la lsion corticale, ainsi qu'une restauration de la taille des pines. Ainsi, laugmentation de KCC2 la suite d'une convulsion prcoce, augmente la susceptibilit aux convulsions modifiant la morphologie des pines dendritiques, probable facteur contribuant latrophie de lhippocampe et loccurrence des dficits cognitifs. Le deuxime objectif a t d'inspecter leffet de la surexpression prcoce de KCC2 dans le dveloppement des pines dendritiques de lhippocampe. Nous avons ainsi surexprim KCC2 aussi bien in vitro dans des cultures organotypiques dhippocampe, qu' in vivo par lectroporation in utero. l'inverse des rsultats publis dans le cortex, nous avons observ une diminution de la densit dpines dendritiques et une augmentation de la taille des pines. Afin de confirmer la spcificit du rle de KCC2 face la rgion nocorticale tudie, nous avons surexprim KCC2 dans le cortex par lectroporation in utero. Cette manipulation a eu pour consquences daugmenter la densit et la longueur des pines synaptiques de larbre dendritique des cellules glutamatergiques. En consquent, ces rsultats ont dmontr pour la premire fois, que les modifications de lexpression de KCC2 sont spcifiques la rgion affecte. Ceci souligne les obstacles auxquels nous faisons face dans le dveloppement de thrapie adquat pour lpilepsie ayant pour but de moduler lexpression de KCC2 de faon spcifique.
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Problmatique : L'allergie au lait de vache (ALV) est reconnue comme une condition transitoire qui disparat chez la majorit des enfants avant lge de 3-5 ans, mais des donnes rcentes rvlent une persistance de lALV. Les enfants souffrant dune ALV sont risque dapports insuffisants en calcium et en vitamine D, deux nutriments impliqus dans la sant osseuse. Une premire tude transversale portant sur la sant osseuse denfants prpubres ALV a observ que la densit osseuse (DMO) lombaire tait significativement infrieure celle denfants sans allergie au lait de vache (SALV). Objectifs : Sur la base de ces rsultats, nous dsirons documenter lvolution longitudinale de la sant osseuse, du statut en vitamine D, des apports en calcium et en vitamine D et de ladhrence la supplmentation des enfants ALV (n=36) et de comparer ces donnes aux enfants SALV (n=19). Rsultats : Le gain annualis de la DMO lombaire est similaire entre les enfants ALV et SALV. Bien quil ny ait pas de diffrence significative entre les deux groupes, la DMO lombaire des enfants ALV demeure cependant infrieure celle des tmoins. Qui plus est, le score-Z de la DMO du corps entier tend tre infrieur chez les enfants-cas compar aux tmoins. Au suivi, la concentration de 25OHD et le taux dinsuffisance en vitamine D sont similaires entre les deux groupes tout comme les apports en calcium et en vitamine D. Davantage denfants ALV prennent un supplment de calcium au suivi comparativement au temps initial (42% vs. 49%, p<0,05), mais le taux dadhrence la supplmentation a diminu 4 jours/semaine. Conclusion : Une valuation plus prcoce ainsi quune prise en charge de la sant osseuse des enfants ALV pourraient tre indiques afin de modifier lvolution naturelle de leur sant osseuse. Les rsultats justifient aussi le suivi troit des apports en calcium et vitamine D par une nutritionniste et la ncessit d'intgrer la supplmentation dans le plan de traitement de ces enfants et dassurer une surveillance de ladhrence la supplmentation.
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Background. Low back pain is an increasing global health problem, which is associated with intervertebral disc (IVD) damage and degeneration. Major changes occur in the nucleus pulposus (NP), with the degradation of the extracellular matrix (ECM).1 Further studies showed that growth factors from transforming growth factor (TGF) and bone morphogenic proteins (BMP) family may induce chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells (MSC).2 Focusing on non-viral gene therapies and their possible translation into the clinics, we investigated if GDF6 (syn. BMP13 or CDMP2) can induce regeneration of degraded NP. We hypothesized that IVD transfected with plasmid over-expressing GDF6 also up-regulates other NP- and chondrogenic cell markers and enhances ECM deposition. Methods. Bovine nucleus pulposus (bNPC) and annulus fibrosus cells (bAFC) were harvested from bovine coccygeal IVD. Primary cells were then electroporized with plasmid GDF6 (Origene, vector RG211366) by optimizing parameters using the Neon Transfection system (Life Technologies, Basel). After transfection, cells were cultured in 2D monolayer or 3D alginate beads for 7, 14 or 21 days. Transfection efficiency of pGDF6 was analyzed by immunohistochemistry and fluorescent microscopy. Cell phenotype was quantified by real-time RT-PCR. To test a non-viral gene therapy applied directly to 3D whole organ culture, coccygeal bovine IVDs were harvested as previously described. Bovine IVDs were transfected by injection of plasmid GDF6 into the center. Electroporation was performed with ECM830 Square Wave Electroporation System (Harvard Apparatus, MA) using 2-needle array electrode or tweezertrodes. 72 h after tranfection discs were fixed and cryosectioned and analyzed by immunofluorescence against GDF6. Results. RT-PCR and immunohistochemistry confirmed up-regulation of GFP and GDF6 in the primary bNPC/bAFC culture. The GFP-tagged GDF6 protein, however, was not visible, possibly due to failure of dimer formation as a result of fusion structure. Organ IVD culture transfection revealed GDF6 positive staining in the center of the disc using 2-needle array electrode. Results from tweezertrodes did not show any GDF6 positive cells. Conclusion. Non-viral transfection is an appealing approach for gene therapy as it fulfills the translational safety aspects of transiency and lacks the toxic effects of viral transduction. We identified novel parameters to successfully transfect primary bovine IVD cells. For transfection of whole IVD explants electroporation parameters need to be further optimized. Acknowledgements. This project was funded by the Lindenhof Foundation (Funds Research & Teaching) Project no. 13-02-F. The imaging part of this study was performed with the facility of the Microscopy Imaging Center (MIC), University of Bern. References. Roughly PJ (2004): Spine (Phila), 29:2691-2699 Clarke LE, McConell JC, Sherratt MJ, Derby B, Richardson SM, Hoyland JA (2014), Arthritis Research & Therapy, 16:R67
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The pre-erythrocytic (PE) phase of malaria infection, which extends from injection of sporozoites into the skin to the release of the first generation of merozoites, has traditionally been the 'black box' of the Plasmodium life cycle. However, since the advent of parasite transfection technology 13 years ago, our understanding of the PE phase in cellular and molecular terms has dramatically improved. Here, we review and comment on the major developments in the field in the past five years. Progress has been made in many diverse areas, including identifying and characterizing new proteins of interest, imaging parasites in vivo, understanding better the cell biology of hepatocyte infection and developing new vaccines against PE stages of the parasite.
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Le co-transporteur KCC2 spcifique au potassium et chlore a pour rle principal de rduire la concentration intracellulaire de chlore, entranant lhyperpolarisation des courants GABAergic lautorisant ainsi devenir inhibiteur dans le cerveau mature. De plus, il est aussi impliqu dans le dveloppement des synapses excitatrices, nommes aussi les pines dendritiques. Le but de notre projet est dtudier leffet des modifications concernant l'expression et la fonction de KCC2 dans le cortex du cerveau en dveloppement dans un contexte de convulsions prcoces. Les convulsions fbriles affectent environ 5% des enfants, et ce ds la premire anne de vie. Les enfants atteints de convulsions fbriles prolonges et atypiques sont plus susceptibles dvelopper lpilepsie. De plus, la prsence dune malformation crbrale prdispose au dveloppement de convulsions fbriles atypiques, et dpilepsie du lobe temporal. Ceci suggre que ces pathologies nonatales peuvent altrer le dveloppement des circuits neuronaux irrversiblement. Cependant, les mcanismes qui sous-tendent ces effets ne sont pas encore compris. Nous avons pour but de comprendre l'impact des altrations de KCC2 sur la survenue des convulsions et dans la formation des pines dendritiques. Nous avons tudi KCC2 dans un modle animal de convulsions prcdemment valid, qui combine une lsion corticale P1 (premier jour de vie postnatale), suivie d'une convulsion induite par hyperthermie P10 (nomms rats LHS). la suite de ces insultes, 86% des rats mles LHS dveloppent lpilepsie lge adulte, au mme titre que des troubles dapprentissage. P20, ces animaux presentent une augmentation de l'expression de KCC2 associe une hyperpolarisation du potentiel de rversion de GABA. De plus, nous avons observ des rductions dans la taille des pines dendritiques et l'amplitude des courants post-synaptiques excitateurs miniatures, ainsi quun dficit de mmoire spatial, et ce avant le dveloppement des convulsions spontanes. Dans le but de rtablir les dficits observs chez les rats LHS, nous avons alors ralis un knock-down de KCC2 par shARN spcifique par lectroporation in utero. Nos rsultats ont montr une diminution de la susceptibilit aux convulsions due la lsion corticale, ainsi qu'une restauration de la taille des pines. Ainsi, laugmentation de KCC2 la suite d'une convulsion prcoce, augmente la susceptibilit aux convulsions modifiant la morphologie des pines dendritiques, probable facteur contribuant latrophie de lhippocampe et loccurrence des dficits cognitifs. Le deuxime objectif a t d'inspecter leffet de la surexpression prcoce de KCC2 dans le dveloppement des pines dendritiques de lhippocampe. Nous avons ainsi surexprim KCC2 aussi bien in vitro dans des cultures organotypiques dhippocampe, qu' in vivo par lectroporation in utero. l'inverse des rsultats publis dans le cortex, nous avons observ une diminution de la densit dpines dendritiques et une augmentation de la taille des pines. Afin de confirmer la spcificit du rle de KCC2 face la rgion nocorticale tudie, nous avons surexprim KCC2 dans le cortex par lectroporation in utero. Cette manipulation a eu pour consquences daugmenter la densit et la longueur des pines synaptiques de larbre dendritique des cellules glutamatergiques. En consquent, ces rsultats ont dmontr pour la premire fois, que les modifications de lexpression de KCC2 sont spcifiques la rgion affecte. Ceci souligne les obstacles auxquels nous faisons face dans le dveloppement de thrapie adquat pour lpilepsie ayant pour but de moduler lexpression de KCC2 de faon spcifique.
Function and Regulation of Cytochrome P450 4V2 and the Implications in Biettis Crystalline Dystrophy
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Thesis (Ph.D.)--University of Washington, 2016-06
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To increase transient expression of recombinant proteins in Chinese hamster ovary cells, we have engineered their protein synthetic capacity by directed manipulation of mRNA translation initiation. To control this process we constructed a nonphosphorylatable Ser51Ala site-directed mutant of eIF2, a subunit of the trimeric eIF2 complex that is implicated in regulation of the global rate of mRNA translation initiation in eukaryotic cells. Phosphorylation of eIF2 by protein kinases inhibits eIF2 activity and is known to increase as cells perceive a range of stress conditions. Using single-and dual-gene plasmids introduced into CHO cells by electroporation, we found that transient expression of the eIF2 Ser51Ala mutant with firefly luciferase resulted in a 3-fold increase in reporter activity, relative to cells transfected with reporter only. This effect was maintained in transfected cells for at least 48 h after transfection. Expression of the wild-type eIF2 protein had no such effect. Elevated luciferase activity was associated with a reduction in the level of eIF2 phosphorylation in cells transfected with the mutant eIF2 construct. Transfection of CHO cells with the luciferase-only construct resulted in a marked decrease in the global rate of protein synthesis in the whole cell population 6 h post-transfection. However, expression of the mutant Ser51Ala or wild-type eIF2 proteins restored the rate of protein synthesis in transfected cells to a level equivalent to or exceeding that of control cells. Associated with this, entry of plasmid DNA into cells during electroporation was visualized by confocal microscopy using a rhodamine-labeled plasmid construct expressing green fluorescent protein. Six hours after transfection, plasmid DNA was present in all cells, albeit to a variable extent. These data suggest that entry of naked DNA into the cell itself functions to inhibit protein synthesis by signaling mechanisms affecting control of mRNA translation by eIF2. This work therefore forms the basis of a rational strategy to generically up-regulate transient expression of recombinant proteins by simultaneous host cell engineering.
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Ataxia-oculomotor apraxia (AOA1) is a neurological disorder with symptoms that overlap those of ataxia-telangiectasia, a syndrome characterized by abnormal responses to double-strand DNA breaks and genome instability. The gene mutated in AOA1, APTX, is predicted to code for a protein called aprataxin that contains domains of homology with proteins involved in DNA damage signalling and repair. We demonstrate that aprataxin is a nuclear protein, present in both the nucleoplasm and the nucleolus. Mutations in the APTX gene destabilize the aprataxin protein, and fusion constructs of enhanced green fluorescent protein and aprataxin, representing deletions of putative functional domains, generate highly unstable products. Cells from AOA1 patients are characterized by enhanced sensitivity to agents that cause single-strand breaks in DNA but there is no evidence for a gross defect in single-strand break repair. Sensitivity to hydrogen peroxide and the resulting genome instability are corrected by transfection with full-length aprataxin cDNA. We also demonstrate that aprataxin interacts with the repair proteins XRCC1, PARP-1 and p53 and that it co-localizes with XRCC1 along charged particle tracks on chromatin. These results demonstrate that aprataxin influences the cellular response to genotoxic stress very likely by its capacity to interact with a number of proteins involved in DNA repair.
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We have previously developed replicon vectors derived from the Australian flavivirus Kunjin that have a unique noncytopathic nature and have been shown to direct prolonged high-level expression of encoded heterologous genes in vitro and in vivo and to induce strong and long-lasting immune responses to encoded immunogens in mice. To facilitate further applications of these vectors in the form of virus-like particles (VLPs), we have now generated a stable BHK packaging cell line, tetKUNCprME, carrying a Kunjin structural gene cassette under the control of a tetracycline-inducible promoter. Withdrawal of tetracycline from the medium resulted in production of Kunjin structural proteins that were capable of packaging transfected and self-amplified Kunjin replicon RNA into the secreted VLPs at titers of up to 1.6 x 10(9) VLPs per ml. Furthermore, secreted KUN replicon VLPs from tetKUNCprME cells could be harvested continuously for as long as 10 days after RNA transfection, producing a total yield of more than 1010 VLPs per 106 transfected cells. Passaging of VLPs on Vero cells or intracerebral injection into 2- to 4-day-old suckling mice illustrated the complete absence of any infectious Kunjin virus. tetKUNCprME cells were also capable of packaging replicon RNA from closely and distantly related flaviviruses, West Nile virus and dengue virus type 2, respectively. The utility of high-titer KUN replicon VLPs was demonstrated by showing increasing CD8(+)-T-cell responses to encoded foreign protein with increasing doses of KUN VLPs. A single dose of 2.5 x 10(7) VLPs carrying the human respiratory syncytial virus M2 gene induced 1,400 CD8 T cells per 10(6) splenocytes in an ex vivo gamma interferon enzyme-linked immunospot assay. The packaging cell line thus represents a significant advance in the development of the noncytopathic Kunjin virus replicon-based gene expression system and may be widely applicable to the basic studies of flavivirus RNA packaging and virus assembly as well as to the development of gene expression systems based on replicons from different flaviviruses.
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Exogenous transfer RNAs (tRNAs) favor translation of bovine papillomavirus 1 wild-type (wt) L1 mRNA in in vitro translation systems (Zhou et al. 1999, J. Virol., 73, 4972-4982). We, therefore, investigated whether papillomavirus (PV) wt L1 protein expression could be enhanced in eukaryotic cells following exogenous tRNA supplementation. Both Chinese hamster ovary (CHO) and Cos1 cells, transfected with PV1 wt L1 genes, effectively transcribed the genes but did not translate them. However, L1 protein translation was demonstrated following co-transfection with the L1 gene and a gene expressing tRNA(Ser)(CGA). Cell lines, stably transfected with a bovine papillomavirus 1 (BPV1) wt L1 expression construct, produced L1 protein after the transfection of the tRNA(Ser)(CGA) gene, but not following the transfection with basal vectors, suggesting that tRNA(Ser)(CGA) gene enhanced wt L1 translation as a result of endogenous tRNA alterations and phosphorylation of translation initiation factors elF4E and elF2alpha in the tRNA(Ser)(CGA) transfected L1 cell lines. The tRNA(Ser)(CGA) gene expression significantly reduced translation of L1 proteins expressed from codon-modified (HB) PV L1 genes utilizing mammalian preferred codons, but had variable effects on translation of green fluorescent proteins (GFPs) expressed from six serine GFP variants. The changes of tRNA pools appear to match the codon composition of PV wt and HB L1 genes and serine GFP variants to regulate translation of their mRNAs. These findings demonstrate for the first time in eukaryotic cells that translation of the target genes can be differentially influenced by the provision of a single tRNA expression construct.
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Cultivation technologies promoting organization of mammalian cells in three dimensions are essential for gene-function analyses as well as drug testing and represent the first step toward the design of tissue replacements and bioartificial organs. Embedded in a three-dimensional environment, cells are expected to develop tissue-like higher order intercellular structures (cell-cell contacts, extracellular matrix) that orchestrate cellular functions including proliferation, differentiation, apoptosis, and angiogenesis with unmatched quality. We have refined the hanging drop cultivation technology to pioneer beating heart microtissues derived from pure primary rat and mouse cardiomyocyte cultures as well as mixed populations reflecting the cell type composition of rodent hearts. Phenotypic characterization combined with detailed analysis of muscle-specific cell traits, extracellular matrix components, as well as endogenous vascular endothelial growth factor (VEGF) expression profiles of heart microtissues revealed (1) a linear cell number-microtissue size correlation, (2) intermicrotissue superstructures, (3) retention of key cardiomyocyte-specific cell qualities, (4) a sophisticated extracellular matrix, and (5) a high degree of self-organization exemplified by the tendency of muscle structures to assemble at the periphery of these myocardial spheroids. Furthermore (6), myocardial spheroids support endogenous VEGF expression in a size-dependent manner that will likely promote vascularization of heart microtissues produced from defined cell mixtures as well as support connection to the host vascular system after implantation. As cardiomyocytes are known to be refractory to current transfection technologies we have designed lentivirus-based transduction strategies to lead the way for genetic engineering of myocardial microtissues in a clinical setting.
